Ten protokół zawiera szczegółowe procedury izolacji komórek pochodzących z moczu od pacjentów z dystrofią mięśniową; ich skuteczne i szybkie przeprogramowanie poprzez transdukcję wirusa Sendai.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych od pacjentów z dystrofią mięśniową: skuteczne przeprogramowanie komórek pochodzących z moczu bez integracji
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Kardiomiopatia dystroficzna jest słabo poznaną konsekwencją dystrofii mięśniowej. Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) od pacjentów z dystrofią mięśniową jest nieocenionym źródłem komórkowym dla systemów modelowych chorób in vitro i może być wykorzystywane do badań przesiewowych leków. Komórki moczu pochodzące od pacjentów zostały wykorzystane w skutecznym przeprogramowaniu na indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste w celu modelowania kardiomiopatii dystroficznej1. Odnosząc się do obaw związanych z bezpieczeństwem integracji systemów wektorowych, przedstawiamy protokół wykorzystujący nieintegrujący wektor wirusa Sendai do transdukcji czynników Yamanaka do komórek moczu pobranych od pacjentów z dystrofią mięśniową. Protokół ten generuje w pełni przeprogramowane klony w ciągu 2-3 tygodni. Komórki pluripotencjalne są wolne od wektorów przez pasaż-13. Te dystroficzne iPSC mogą być różnicowane w kardiomiocyty i wykorzystywane do badania mechanizmów choroby lub do badań przesiewowych leków.
Wprowadzenie
Kardiomiopatia jest drugą najczęstszą przyczyną zgonów u pacjentów z dystrofią mięśniową Duchenne'a i Beckera (MD). Chociaż mutacje w genie dystrofiny sprzężonej z chromosomem X występują w stosunku 1:3500 urodzeń płci męskiej, bardzo niewiele wiadomo na temat zdarzeń molekularnych i komórkowych prowadzących do postępującego uszkodzenia mięśnia sercowego. Ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste pochodzące od pacjentów z dystrofią mięśniową stały się nowym narzędziem do badania mechanizmów leżących u podstaw choroby i do wykorzystania w badaniach przesiewowych leków1,2.
Przewidywany dyskomfort związany z biopsjami skóry lub próbkami krwi może zniechęcić młodych pacjentów i/lub ich opiekunów do wyrażenia zgody na udział w badaniu. Próbki moczu są nieinwazyjnym źródłem komórek somatycznych, które można poddać metodom przeprogramowania. Niedawno wykazaliśmy, że komórki moczu pobrane od pacjentów z dystrofią mięśniową mogą być hodowane i skutecznie przeprogramowywane do iPSC za pomocą transdukcji retrowirusowej z czynnikami Yamanaka (Oct3/4, Sox2, Klf4 i c-Myc; OSKM)1. Wadą retrowirusowego dostarczania genów jest losowa integracja genów przeprogramowujących z chromosomami gospodarza. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, użyliśmy nieintegrującego się wirusa Sendai do przeprogramowania komórek moczu.
Ten protokół szczegółowo opisuje przeprogramowanie wirusa Sendai izolowanych komórek moczu od pacjentów z dystrofią mięśniową, które następnie mogą być różnicowane w kardiomiocyty lub inne typy komórek do dalszych badań. Protokół ten można również dostosować do innych chorób specyficznych dla pacjenta.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
UWAGA: Pacjenci i/lub ich opiekunowie powinni wyrazić świadomą zgodę na udział w badaniu zatwierdzonym przez Institutional Review Board.
1. i preparaty pożywek
- Bufor do przemywania: Aby przygotować 100 ml buforu do mycia, dodać 1 ml 100x roztworu wstrzykiwacza/paciorkowca (100 j./ml penicyliny + 100 μg/ml streptomycyny) do 99 ml buforu fosforanowego soli fizjologicznej (PBS).
- Pożywka dla komórek progenitorowych moczu (UPC): Aby przygotować pożywkę UPC, wymieszaj równe objętości pożywki wolnej od keratynocytów (KSF) + pożywki z komórek progenitorowych.
- Pożywka KSF: Aby przygotować pożywkę keratynocytów, dodaj 5 ng/ml naskórkowego czynnika wzrostu (EGF), 50 ng/ml ekstraktu z przysadki bydlęcej (BPE), 30 ng/ml toksyny i roztwór wstrzykiwacza/paciorkowca (100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny) do 500 ml pożywki KSF.
- Pożywka z komórek progenitorowych: Dodaj trzy czwarte DMEM z jedną czwartą pożywki Ham-F12 i uzupełnij 10% FBS, 0,4 μg / ml hydrokortyzonu, 0,1 nM toksyny, 5 ng / ml insuliny, 1,8 x 10-4 M adenina, 5 μg / ml transferyny, 2 x 10-9 M trijodo tyroniny, 10 ng / ml EGF i roztwór pióra / paciorkowca.
- hES Medium: Dodaj 20% zamiennika surowicy KO (K-SR), 1x MEM aminokwasy endogenne, 2 mM l-glutaminy, 100 μM β-merkaptoetanolu, 20 ng/ml bFGF i długopis/paciorkowca do 400 ml pożywki DMEM/F12.
2. Pobieranie próbek moczu
- Poinstruuj pacjentów, aby pili płyny na 30 minut przed pobraniem moczu, aby upewnić się, że można zebrać odpowiednią ilość (~30-40 ml) moczu.
- Przekaż pacjentom i/lub ich opiekunom zestaw do pobierania moczu zawierający następujące elementy: (1) pisemne instrukcje dotyczące sposobu uzyskania sterylnej lub czystej próbki moczu, (2) wilgotne antybakteryjne toalety oraz (3) sterylny kubek do pobierania próbek o pojemności 100 ml. Poinstruuj pacjentów, aby pobrali próbkę.
- Próbki moczu należy natychmiast umieścić na lodzie i przenieść do laboratorium w chłodziarce. Natychmiast przetworzyć mocz w celu izolacji komórek. Jeśli opóźnienie jest nieuniknione, przechowuj próbkę na lodzie do 4 godzin przy minimalnej utracie żywotności komórek.
3. Izolacja i ekspansja komórek moczu
UWAGA: Wykonaj następujące kroki w sterylnych warunkach w Komorze Bezpieczeństwa Biologicznego BSL2.
- Za pomocą sterylnych pipet przenieś próbki moczu do sterylnych probówek wirówkowych o pojemności 50 ml. Wirować przy 400 × g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
- Odessać supernatant, pozostawiając 1 ml w probówce; należy uważać, aby nie naruszyć osadu komórkowego.
- Zawiesić i połączyć granulki z wielu probówek w 7 ml buforu płuczącego i powtórzyć wirowanie przy 400 × g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
- Ostrożnie odessać supernatant, pozostawiając osad komórkowy i ~0,2–0,5 ml supernatantu. Zawiesić ponownie w 2-3 ml pożywki z komórek progenitorowych moczu (UPC) i przenieść zawiesinę do 4-6 dołków niepowlekanej płytki 24-dołkowej.
- Po 72 godzinach uzupełnij pożywkę 0,5 ml świeżej pożywki UPC na studzienkę i zmieniaj pożywkę co 2-3 dni. Erytrocyty i komórki płaskonabłonkowe, które nie przyczepiają się do płytki, zostaną usunięte wraz ze zmianami pożywki.
- Monitoruj posiew po 4–6 dniach.
UWAGA: Zaczną pojawiać się małe kolonie po 2–4 komórki. Komórki będą zaokrąglone lub wydłużone, które reprezentują odpowiednio typ I lub typ II komórek nabłonka nerek (RE)3. - Zmieniaj pożywkę co 2-3 dni, ponieważ gdy komórki się pojawią, przejdą fazę szybkiej ekspansji.
- Gdy komórki osiągną 80-90% konfluencji, około 9-15 dni po posiewie, zdysocjuj i przejdź komórki (15 000-18 000 komórek/cm2) do 2-4 dołków z 24-dołkową płytką w celu dalszej ekspansji. Oznacz to jako przejście komórkowe 1 (P1).
- Scharakteryzuj komórki moczu pod kątem specyfikacji linii poprzez analizę cytometrii przepływowej, barwienie immunohistochemiczne lub reakcję łańcuchową odwrotnej transkryptazy-polimerazy (RT-PCR).
- Przeprogramuj wyizolowane komórki moczu (sekcja 4) lub zamroź je w pożywce zamrażającej (DMEM uzupełniony 10% surowicy i 10% DMSO) w celu długotrwałego krioprzechowywania.
4. Przeprogramowanie komórek moczowych za pomocą wirusa Sendai
UWAGA: Podczas manipulowania środkami transfekującymi zaleca się właściwe obchodzenie się i stosowanie środków ochrony osobistej (PPE). Wykonaj następujące czynności w sterylnych warunkach w komorze bezpieczeństwa biologicznego BSL2. Zaleca się właściwą utylizację czynnika transfekującego i/lub transfekowanych komórek, aby uniknąć ryzyka zagrożeń dla środowiska i zdrowia. Do przeprogramowania komórek moczu użyj zestawu do przeprogramowania Sendai z modyfikacjami protokołu zależnego od podajnika producenta, jak opisano poniżej.
- Aby zapewnić wysoką skuteczność przeprogramowania za pomocą wirusa Sendai, należy użyć pasaży 1-5 komórek moczu, które szybko się dzielą. Jeśli komórki nie replikują się dobrze lub starzeją się, wyrzuć je, ponieważ nie przeprogramują się skutecznie.
- Wysiej 60 000 komórek na studzienkę w dwóch dołkach na płytce 6-dołkowej. Oznacz to jako Dzień -2. Dostosuj gęstość wysiewu komórek (5 x 104 – 9 x 104 komórki na studzienkę) zgodnie z potrzebami, aby osiągnąć 80–90% konfluencji do dnia 0.
- W dniu 0 (48 godzin po posianiu komórek) przygotuj wektory przeprogramowania Sendai (SeV) zawierające każdy z czterech czynników OSKM. Dodaj każdy z wektorów do 1 ml wstępnie podgrzanej pożywki UPC. Użyj MOI 1-1,5 (5-7,5 x 105 CIU), który jest wystarczający do przeprogramowania komórek moczu. Odessać pożywkę i powoli dodawać 1 ml UPC + SeV do jednego dołka komórek moczu. Użyć drugiej studzienki jako kontroli ujemnej transdukcji.
- W dniu 1 wymień pożywkę UPC + SeV na nową pożywkę UPC. Pewną śmierć komórek obserwuje się po 24 godzinach z powodu cytotoksyczności wirusa.
- W zależności od wydajności przeprogramowanych formacji klonów i zwartej morfologii, należy zmieniać pożywkę codziennie do 6 lub 7 dnia.
- Na jeden dzień przed dysocjacją transdukowanych komórek (dzień 5 lub 6) należy przygotować płytki zasilające MEF, posiewając MEF-y poddane działaniu Mitomyciny-C (10 μg/ml przez 3 godziny) w gęstości 5 x 104 komórek/cm2, na 0,1% pokrytych żelatyną 100 mm2 szalkach hodowlanych.
- Następnego dnia (6 lub 7 dzień) zdysocjuj komórki za pomocą 0,25% trypsyny, ponownie zawieś komórki w pożywce UPC i płytce 5 x 104 – 2 x 105 komórek/100 mm2 MEF płytka zasilająca.
- Następnego dnia zmień pożywkę na pożywkę hES i zmieniaj pożywkę codziennie. Obserwuj komórki pod mikroskopem, aby monitorować przekształcone komórki.
UWAGA: Komórki tworzą agregaty klonalne o charakterystycznej morfologii brukowej i wyższym stosunku jądra do cytoplazmy (12–18 dni po transdukcji). - W ciągu dwóch do trzech tygodni po transdukcji zbierz kolonie i przenieś je na nowe płytki w celu ekspansji klonalnej.
- Przeprowadzić barwienie żywych komórek w celu wybrania klonów iPSC, inkubując komórki z przeciwciałem TRA-1-81 przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO2 , a następnie barwienie przeciw specyficznym przeciwciałem wtórnym sprzężonym z barwnikiem fluorescencyjnym przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO2 .
- Użyj igły 26 G 11/2 cala, aby kreskować większe klony TRA-1-81 z dodatnim iPSC na małe równe kawałki (4-6 sztuk na klon).
- Użyj sterylnej końcówki pipety, aby pobrać i przenieść 10–20 zakreskowanych kawałków z wielu klonów do każdego dołka 24-dołkowej płytki pokrytej Matrigelem (10 μg/cm2) z podłożem hES.
UWAGA: Kawałki z pojedynczego klonu posiane pojedynczo w jednym dołku nie rozszerzają się ani nie utrzymują pluripotencji. - Zmiana z pożywki hES na iPSC w ciągu 24–48 godzin po przymocowaniu przeprogramowanych klonów do powierzchni Matrigel.
- Podczas konserwacji na płytkach pokrytych Matrigelem należy ręcznie zeskrobać wszelkie zróżnicowane komórki lub zanieczyszczające komórki zasilające MEF za pomocą końcówki pipety, aby wzbogacić do w pełni przeprogramowanych i pluripotencjalnych dystroficznych klonów iPSC (MD-iPSC).
- Po osiągnięciu przez poszczególne klony wielkości ~100 μm, rozpręż klony, dysocjując z 0,48 mM roztworem EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy) przez 3 minuty i posiewając małe agregaty komórkowe MD-iPSC zawieszone w pożywce iPSC (uzupełnionej 5 μM Y27632, inhibitorem kinazy RhO) na świeżej matrygelu (10 μg / cm2) pokrytej 12-dołkową płytką. Codziennie zmieniaj pożywkę iPSC.
- Pełne przeprogramowanie każdego klonu można określić zarówno przez analizę ekspresji genów OSKM, jak i immunohistochemiczne barwienie markerów pluripotencji (Oct3/4 i TRA-1-81). Należy przeprowadzić rygorystyczną ocenę potencjału pluripotencji, aby potwierdzić, że w pełni przeprogramowane linie iPSC mogą różnicować się w trzy listki zarodkowe. Można to osiągnąć za pomocą testu tworzenia i różnicowania ciał zarodkowych (EB) lub testu tworzenia potworniaków.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Większość komórek progenitorowych wyizolowanych z ludzkiego moczu wykazuje pozytywny wynik w kierunku markerów progenitorów uroepithelialnych i perycytycznych, takich jak CD44, CD73 oraz CD146 (odpowiednio 97,37%, 97,09% i 97,3%; Rycina 1A i 1B). Komórki te wykazują również ekspresję innych markerów mezenchymalnych, takich jak alfa-aktyna mięśni gładkich oraz wimentyna (Rycyna 1B). Analiza RT-PCR dostarcza dowodów na obecność mieszanej populacji komórek w kulturach, o cz...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Modelowanie chorób sercowo-naczyniowych za pomocą iPSC staje się powszechnym podejściem do zrozumienia wkładu genetycznego4-6. Niektórych nieprzewidzianych trudności w pobieraniu próbek komórek od pacjentów, zwłaszcza małych dzieci, można uniknąć, oferując opcję nieinwazyjnego podejścia, takiego jak pobieranie moczu. W tej młodej populacji pacjentów często trudno jest zebrać wystarczającą ilość moczu, aby wytworzyć wystarczającą ilość komórek moczu do przeprogramowania. Szkolenie małych pacjentów, aby pili pły...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Rozwój tego protokołu był wspierany przez Advancing a Healthier Wisconsin i National Center for Advancing Translational Sciences, National Institutes of Health, poprzez grant numer 8UL1TR000055. Wyłączną odpowiedzialność za jego treść ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy NIH.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Materiały | |||
| 4 Oz. Kubek na próbki z pokrywką | STL Zaopatrzenie medyczne | M9AMSAS340 | do pobierania próbek moczu |
| 15 ml Probówki BD-Falcon | Fisher Scientific | 352097 | |
| 50 ml Rurki BD-Falcon | Fisher Scientific | 352098 | |
| Okrągłe szklane szkiełka nakrywkowe | Fisher Scientific | 12-545-81 | |
| Zestaw do przeprogramowania CytoTune-iPS Sendai Life Technologies | A1378-001 | ||
| PBS, pH 7,4 | Life Technologies | 10010-023 | |
| Pen-Strep bez glutaminy | Life Technologies | 15140-122 | Ciepły w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem |
| RPMI Medium 1640 | Life Technologies | 11875-093 | Ciepła w 37 stopniach; C Kąpiel wodna przed użyciem |
| B-27 Suplement z insuliną (50x) | Life Technologies | 17504-044 | Ciepły w 37 stopniach; C Kąpiel wodna przed użyciem |
| Suplement B-27 bez insuliny (50x) | Life Technologies | 0050129SA | Ciepły w 37 stopniach; C Kąpiel wodna przed użyciem |
| DMEM/F12 (1:1) | Life Technologies | 11330-032 | Ciepła w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem |
| Versene, 1:5,000 | Life Technologies | 15040066 | Warm in 37 ° C kąpiel wodna przed użyciem |
| bFGF (10 &mikro; g) | Life Technologies | 13256-029 | Ciepły w 37 & stopni; C kąpiel wodna przed użyciem |
| Wkłady do licznika komórek | Life Technologies | C10228 | |
| Knockout Serum (500 ml Butelka) | Life Technologies | 10828-028 | Ciepły w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Life Technologies | 12648-010 | |
| Keratynocyte-SFM (1x), Liquid | Life Technologies | 17005-042 | Ciepłe w 37 & stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem |
| DMEM, Wysoka Glukoza, Glutamax | Life Technologies | 10566-016 | Ciepły w 37 & stopni; C kąpiel wodna przed użyciem |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Life Technologies | 11765-054 | Ciepły w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem |
| EGF Rekombinowane białko ludzkie, Liquid Form | Life Technologies | PHG0311L | Warm in 37 & deg; C kąpiel wodna przed użyciem |
| Insulina, rekombinant ludzki, Soln | Life Technologies | 12585-014 | Ciepły w 37 & stopni; C kąpiel wodna przed użyciem |
| TeSR-E8 | Stem Cell Technologies | 5940 | Ciepła w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem |
| Inhibitor ROCK (Y-27632) | Selleck | S1049 | Ciepły w 37 stopniach; C Kąpiel wodna przed użyciem |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | Matryca z kwalifikacją hESC, LVED Free |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Zestaw do syntezy cDNA iScript | Bio-Rad | 170-8890 | |
| DreamTaq Green PCR Master Mix (2x) | Thermo-Scientific | K1081 | |
| Kwalifikowany FBS | Sigma Aldrich | F6178 | Ciepły w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem |
| Bioreagent adeninowy | Sigma Aldrich | A2786-5G | Ciepły w 37 stopniach; C Kąpiel wodna przed użyciem |
| Toksyna od Vibrio cholerae | Sigma Aldrich | C8052-.5MG | Ciepła w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem |
| Hydrokortyzon | Sigma Aldrich | H0888-1G | Ciepły w 37 & stopni; C kąpiel wodna przed użyciem |
| Holo-transferyna od człowieka | Sigma Aldrich | T0665-50MG | Ciepła w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem |
| 3,3',5-trijodo-L-tyronina sól sodowa | Sigma Aldrich | T6397-100MG | Ciepła w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem |
| DAPI | Santa Cruz Biotechnology | SC-3598 | |
| Fluoromount Aquous podłoże montażowe | Sigma Aldrich | F4680 | |
| 16% Paraformaldehyd | Alfa-Aesar | 43368 | |
| Przeciwciała | |||
| Mouse anty CD44 - oznaczone FITC | BD Biosciences | 560977 | |
| Mouse anty CD146 - oznaczone PE | BD Biosciences | 561013 | |
| Mouse anti CD73 - oznaczone PE | BD Biosciences | 561014 | |
| Mysia aktyna anty-&alfa;-mięśni gładkich | Sigma Aldrich | A2547 | |
| Mysz anty-Vimentin | Abcam ab8978-100 | ||
| Mysz Anti - TRA-1-81 | Life Technologies | 411100 | |
| Królik anty 3/4 października | Santa Cruz Biotechnology | SC-9081 | |
| Mysz Anti Dystrofin | Leica Biosystems | NCL-DYSB |
Bibliografia
- Guan, X., et al. Dystrophin-deficient cardiomyocytes derived from human urine: New biologic reagents for drug discovery. Stem Cell Research. 12 (2), 467-480 (2014).
- Dick, E., et al. Exon Skipping and Gene Transfer Restore Dystrophin Expression in Human Induced Pluripotent Stem Cells-Cardiomyocytes Harboring DMD Mutations. Stem Cells Dev. 22 (20), 2714-2724 (2013).
- Zhou, T., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples. Nat Protoc. 7 (12), 2080-2089 (2012).
- Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. Induced pluripotent stem cells: the new patient. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (11), 713-726 (2012).
- Carvajal-Vergara, X., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome. Nature. 465 (7299), 808-812 (2010).
- Sun, N., et al. Patient-Specific Induced Pluripotent Stem Cells as a Model for Familial Dilated Cardiomyopathy. Science Translational Medicine. 4 (130), 130ra147(2012).
- Zhang, Y., et al. Urine derived cells are a potential source for urological tissue reconstruction. J Urol. 180 (5), 2226-2233 (2008).
- Bayart, E., Cohen-Haguenauer, O. Technological overview of iPS induction from human adult somatic cells. Curr Gene Ther. 13 (2), 73-92 (2013).
- Malik, N., Rao, M. S. A review of the methods for human iPSC derivation. Methods Mol Biol. 997, 23-33 (2013).
- Nakanishi, M., Otsu, M. Development of Sendai virus vectors and their potential applications in gene therapy and regenerative medicine. Curr. Gene Ther. 12 (5), 410-416 (2012).
- González-Ramírez, R., Morales-Lázaro, S. L., Tapia-Ramírez, V., Mornet, D., Cisneros, B. Nuclear and nuclear envelope localization of dystrophin Dp71 and dystrophin-associated proteins (DAPs) in the C2C12 muscle cells: DAPs nuclear localization is modulated during myogenesis. J Cell Biochem. 105 (3), 735-745 (2008).
- Villarreal-Silva, M., Centeno-Cruz, F., Suárez-Sánchez, R., Garrido, E., Cisneros, B. Knockdown of dystrophin Dp71 impairs PC12 cells cycle: localization in the spindle and cytokinesis structures implies a role for Dp71 in cell division. PloS One. 6 (8), e23504(2011).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
