Identyfikacja radiowa i wideo wrażliwe na ruch skutecznie automatyzują rejestrowanie nienagradzanych zachowań wybranych przez trzmiele

Podsumowanie

Ten film opisuje Radio-Frequency Identification (RFID) i metody nagrywania wideo wrażliwe na ruch w celu monitorowania zachowań trzmieli.

Streszczenie

Prezentujemy dwie metody obserwacji wyboru wyboru trzmieli w zamkniętej przestrzeni testowej. Pierwsza metoda składa się z czytników identyfikacji radiowej (RFID) wbudowanych w sztuczne kwiaty, które wyświetlają różne sygnały wizualne, oraz tagów RFID (tj. transponderów pasywnych) przyklejonych do klatki piersiowej trzmieli. Nowością w naszej implementacji jest to, że czytniki RFID są wbudowane bezpośrednio w sztuczne kwiaty, które są w stanie wyświetlać kilka różnych właściwości wizualnych, takich jak kolor, typ wzoru, częstotliwość przestrzenna (tj. "zajętość" wzoru) i symetria (częstotliwość przestrzenna i symetria nie były manipulowane w tym eksperymencie). Dodatkowo, te wizualne wyświetlacze w połączeniu ze zautomatyzowanymi systemami są w stanie rejestrować nienagradzane i niewytrenowane zachowania związane z wyborami. Druga metoda polega na rejestrowaniu zachowań związanych ze sztucznymi kwiatami za pomocą czułych na ruch kamer o wysokiej rozdzielczości. Trzmiele mają plakietki z numerami przyklejone do klatki piersiowej w celu unikalnej identyfikacji. Przewagą tej implementacji nad RFID jest to, że oprócz obserwacji zachowania podczas lądowania, można również zaobserwować alternatywne miary preferencji, takie jak zawis i antenowanie. Obie metody automatyzacji zwiększają kontrolę eksperymentalną i trafność wewnętrzną, umożliwiając badania na większą skalę, które uwzględniają różnice indywidualne. Poprawiono również trafność zewnętrzną, ponieważ pszczoły mogą swobodnie wchodzić i wychodzić ze środowiska testowego bez ograniczeń, takich jak dostępność asystenta badawczego na miejscu. W porównaniu z obserwacją przez człowieka w czasie rzeczywistym, zautomatyzowane metody są bardziej opłacalne i prawdopodobnie mniej podatne na błędy.

Wprowadzenie

Kluczowym problemem w badaniu niewyuczonych zachowań wyborczych trzmieli i pszczół miodnych jest to, że niedoświadczeni pracownicy, niedoświadczeni w kwestii kwiatów, niechętnie wchodzą w przestrzeń testową, gdzie można mierzyć preferencje. W rezultacie, wielu badaczy polega na mniej niż idealnej technice: wstępnym szkoleniu pracowników, aby karmili się w przestrzeni testowej pozornie neutralnymi bodźcami, które naukowcy uważają za różne od bodźców eksperymentalnych. Jednak ostatnie eksperymenty wykazały, że bodźce, które uważano za neutralne (tj. bodźce, które nie wpływają na późniejsze zachowania związane z wyborami podczas sesji testowej) wpłynęły na preferencje w nieoczekiwany^sposób1. Zautomatyzowane systemy, które obejmują identyfikację radiową (RFID)² i nagrania wideo wrażliwe na ruch, mogą zaoferować możliwość rozwiązania tego problemu. Cel badania był dwojaki: (1) po pierwsze przyczynienie się do wzbogacenia literatury na temat niewyuczonych preferencji kwiatowych trzmieli, (2) a po drugie, ocena dwóch systemów pomiaru wyboru, zarejestrowanych przez dwa różne automatyczne urządzenia rejestrujące.

Dwa zautomatyzowane systemy³ zostały zaimplementowane w niniejszym badaniu, aby obserwować niewyuczone zachowania związane z wyborami: RFID i wrażliwe na ruch nagrania wideo. Dwa kluczowe elementy obu systemów to to, że wybory nie są nagradzane, a wyświetlanie różnych wskazówek wizualnych może być manipulowane. Obraz wizyjny wrażliwy na ruch (wysoka rozdzielczość, nagrywanie w rozdzielczości 1 MP) nie tylko umożliwia ciągłą obserwację swobodnie eksplorujących pracowników w pomieszczeniu lotniczym, ale ma kluczowe znaczenie dla efektywnej obserwacji stosunkowo rzadkich zdarzeń⁴.

Pytanie badawcze w eksperymencie 1 dotyczy tego, jak różne właściwości wizualne współgrają ze sobą, gdy są wyświetlane razem. Niniejsze badanie ma na celu zbadanie względnego znaczenia pozycjonowania wzorca w odniesieniu do typu wzorca. Stosując konstrukcję 2 x 2, typy wzorów radialnych (tj. sunburst) i koncentrycznych (tj. oko) są umieszczane centralnie lub obwodowo na sztucznym kwiatu (patrz rysunek 1, aby zapoznać się z przykładami bodźców). Czytniki RFID są wbudowane w te specjalnie zaprojektowane sztuczne bodźce kwiatowe, a trzmiele otrzymują znaczniki obsługujące RFID, które pozwalają nam rejestrować każdego oznaczonego pracownika, który wchodzi w bodziec sztucznych kwiatów. Obserwacja RFID działa na zasadzie mechanizmu czytnika (wbudowanego w sztuczne kwiaty) wysyłającego sygnały na częstotliwościach radiowych (w tym przypadku 13,56 MHz), które są modulowane przez obecność pasywnych tagów. Czytnik może wykrywać i rejestrować te modulacje sygnału, które różnią się nieznacznie w zależności od tagu, umożliwiając unikalną identyfikację tagu.

Pytania w Eksperymencie 2 są trojakie. Po pierwsze, czy wejście w kwiaty, mierzone za pomocą RFID, i lądowanie, mierzone za pomocą nagrań wideo, są równoważnymi kryteriami wyboru? Wybór jest mierzony w różnych punktach (lądowanie w przypadku wideo i wejście kwiatu w przypadku RFID), co może przekładać się na różne miary preferencji. Po drugie, jaki jest efekt pozycjonowania centralnego i peryferyjnego? Nie wiadomo, czy pracownicy wybraliby wzór centralny, gdyby przedstawiono kombinację składającą się z dwóch wzorów promieniowych w różnych pozycjach (zob. rysunek 4b). Po trzecie, jakie jest względne znaczenie pozycji wzoru w porównaniu z typem wzorca? Innymi słowy, czy trzmiele wylądują na wzorcach preferowanego typu wzoru lub preferowanej pozycji wzorca? Pszczoły mogą preferować wzór centralno-promieniowy od obwodowo-koncentrycznego, ale preferencja może wynikać z typu wzoru lub jego centralnego położenia. W tym eksperymencie dwie zmienne zostały zestawione ze sobą⁵ (patrz Rysunek 4c, d).

W eksperymencie 2 użyliśmy nagrań wideo wrażliwych na ruch na bodźcach przypominających kwiaty. Sztuczne kwiaty umieszczono w klatce lotniczej, a czułe na ruch kamery o wysokiej rozdzielczości zostały skierowane na te kwiaty z przodu i z góry. Dokładniej rzecz ujmując, dwie kamery zostały ustawione w taki sposób, aby uchwycić widok z przodu każdego z dwóch bodźców w przestrzeni testowej. Dodatkowa kamera została umieszczona pomiędzy bodźcami, aby zarejestrować zachowanie unoszące się w powietrzu z góry i uchwycić zachowanie obu sztucznych kwiatów. Trzmiele zostały zidentyfikowane za pomocą znaczników numerycznych, które można było odczytać z klipów wideo w wysokiej rozdzielczości. Zaobserwowano zachowania związane z zawisem, antenowaniem i lądowaniem.

Protokół

Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu w Ottawie zatwierdził nasz protokół eksperymentalny, który określa procedury bezpieczeństwa dla personelu pracującego z pszczołami.

1. Przygotowanie środowiska testowego

1. Przygotować pustą przestrzeń (izolowany pokój lub klatkę lotną osłoniętą metalową siatką) o wymiarach 2 m x 2 m x 2 m.
   UWAGA: Jeśli jako przestrzeń testową wybrano pokój, należy upewnić się, że pszczoły nie mogą uciec przez okna, szczeliny pod drzwiami oraz kanały wymiany powietrza.
2. W klatce lotnej należy wykonać niewielkie otwory wejściowe (np. otwory o średnicy ok. 2 cm), przez które pszczoły będą mogły swobodnie wchodzić i wychodzić z przestrzeni testowej. Należy zaprojektować mechanizm blokujący punkty dostępu, aby zapobiec dostawaniu się pszczół do przestrzeni testowej w okresach zarezerwowanych na konserwację i konfigurację sprzętu.
   UWAGA: W badaniu wykorzystano robotnice Bombus impatiens Cresson.
3. Podłączyć jedno lub dwa gniazda kolonii do przestrzeni testowej za pomocą łącznika. Należy upewnić się, że martwa pszczoła nie może zablokować łącznika.
   UWAGA: Zastosowano tu dwa rodzaje struktur łączących: drewniany „most” ze szklaną pokrywą górną oraz rurkę z drucianej siatki. Są one łatwe do czyszczenia i zapewniają pszczołom przyczepność.
4. Umieścić dwa uchwyty sztucznych kwiatów wewnątrz przestrzeni testowej.
   1. Umieścić uchwyty kwiatów w centrum przestrzeni testowej lub przymocować je do ściany.
   2. Do górnej części cylindrycznej sztucznego kwiatu przymocować za pomocą taśmy maskującej czytnik RFID „2k6 head” (pozycjonowanie przedstawiono na Rysunku 1). Do zamocowania sztucznych kwiatów należy użyć drewnianego stojaka o wysokości 1,2 m.
      UWAGA: Góra stojaka powinna posiadać mechanizm mocowania, do którego można podłączyć sztuczne kwiaty. Schemat rysunku znajduje się na Rysunku 2
5. Zainstalować wysokoczęstotliwościowe (min. 200 Hz) oprawy świetlne z lampami fluorescencyjnymi, aby odpowiednio oświetlić przestrzeń testową. Należy użyć elektronicznego dławika wysokiej częstotliwości, aby zapewnić, że migotanie światła znajduje się powyżej progu fuzji migotania wizualnego trutni⁶.
   UWAGA: W tym przypadku dla przestrzeni o wymiarach 2 x 2 x 2 m zastosowano 12 świetlówek światła dziennego, które generują natężenie światła wynoszące około 1 200 Lux.

Rycina 1. Projekt sztucznego kwiatu RFID. Schemat sztucznego kwiatu z funkcją RFID użytego w Eksperymencie 1. Czytnik RFID spoczywał na górze otwartego cylindra przechodzącego przez środek kwiatu. Wzory i pozycje bodźców: a. peryferyjnie-koncentryczne, b. centralnie-koncentryczne, c. peryferyjnie-radialne oraz d. centralnie-radialne. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Orbán et al.¹¹.

Rycina 2. Statyw do prezentacji bodźców. Schemat przedstawiający konstrukcję statywu do sztucznych kwiatów pełniących rolę bodźców oraz klips mocujący. Klips mocujący jest przyklejony do sztucznego kwiatu i służy do szybkiego mocowania i odłączania bodźców od statywów. Taka konfiguracja została zastosowana w eksperymencie wideo z analizą ruchu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

2. Przygotowanie kolonii trutni

1. Po otrzymaniu zamówionych komercyjnie kolonii, połącz pudełko z kolonią z klatką lotną.
2. Zapewnij pyłek (zebrany przez pszczoły miodne z różnych roślin) oraz wodę z cukrem (w stosunku 1:1 objętościowo) ad libitum aż do rozpoczęcia sesji testowych.
   1. Zagotuj 1 L wody i wymieszaj z taką samą objętością cukru, aby przygotować roztwór wody z cukrem.
   2. Zakup pyłek u pszczelarza lub od komercyjnego dostawcy kolonii trutni. Rozetrzyj pyłek w moździerzu i wymieszaj z miodem oraz wodą (w razie potrzeby), aby uzyskać wilgotną pastę.
3. Po rozpoczęciu eksperymentu podawaj codziennie 15–40 ml wody z cukrem (ilość proporcjonalna do wielkości kolonii). Kontynuuj podawanie pyłku ad libitum. Dostosuj ilość wody z cukrem w zależności od poziomu zapasów w komórkach z miodem.
   UWAGA: Utrzymywanie niskiego poziomu zapasów żywności motywuje robotnice do opuszczania gniazda w celu poszukiwania pożywienia.
4. Umożliw pszczołom wejście do środowiska testowego poprzez strukturę łączącą, zgodnie z opisem w kroku 1.3.
   UWAGA: Pszczoły swobodnie przemieszczają się między gniazdem a środowiskiem testowym przez cały czas trwania eksperymentu.

3. Przygotowanie do obserwacji za pomocą identyfikacji radiowej (RFID)

1. Rozpocznij przyklejanie tagów RFID do przedplecza robotnic niezwłocznie po przybyciu kolonii i kontynuuj ten proces przez cały okres trwania eksperymentu, w miarę pojawiania się nowych robotnic.
2. Technika przyklejania
   1. Podczas wstępnego znakowania umieść wszystkie robotnice w oddzielnych pojemnikach. Schłodź robotnice przez około 1 hr w lodówce (około 7 °C), aby spowolnić ich aktywność.
      UWAGA: Wcześniejsze schłodzenie robotnic przed znakowaniem pomaga w opanowaniu agresywnych kolonii. Minimalizuje to ryzyko użądleń.
   2. Używając aparatury do znakowania i nietoksycznego kleju (dostarczonego przez producenta tagów), przymocuj tag RFID do przedplecza robotnicy. Przyklejaj tagi RFID do robotnic w momencie ich wyjścia, gdy są jeszcze w stadium callow (przed uzyskaniem zdolności do lotu).
   3. Odczekaj minimum 10 min przed ponownym umieszczeniem robotnicy w kolonii, aby upewnić się, że tag RFID nie zostanie przez nią usunięty. 
3. Usuń robotnice, które nie zostały oznakowane w stadium callow, lub robotnice, które utraciły tagi RFID (co można rozpoznać po pozostałościach kleju lub łysinie na przedpleczu).
   UWAGA: Pszczoły te mogły mieć doświadczenia poza kolonią.
4. Oprogramowanie czytnika RFID
   1. Użyj komputera osobistego (PC) do skonfigurowania oprogramowania czytnika RFID. Zmień format daty w systemie operacyjnym na yyyy-mm-dd hh:mm:ss, aby zapewnić poprawne kodowanie pobranych danych RFID. Zmodyfikuj program dostarczony z czytnikami RFID, używając języka programowania C++, aby umożliwić eksport danych z czytnika RFID w formacie wartości rozdzielanych przecinkami (CSV).
   2. Podłącz czytnik RFID do komputera za pomocą łącznika RS-232 na USB. Pobieraj dane z czytnika RFID okresowo, zanim urządzenie osiągnie maksymalną pojemność pamięci (do 32,000 rekordów). Używaj czytników RFID do rejestracji daty, godziny oraz unikalnego trzynastoznakowego ciągu znaków przypisanego do każdego tagu. Zaimportuj pobrany plik CSV do relacyjnego systemu zarządzania bazami danych (RDBMS).

4. Przygotowanie sztucznych kwiatów dla czytników RFID

1. Należy zakupić niebieską i żółtą glinę polimeryczną w lokalnym sklepie z artykułami plastycznymi.
2. Uformuj niebieski cylinder o średnicy 1,5 cm i wytnij w jego boku otwór o wymiarach 1,5 cm x 3 cm.
   UWAGA: Otwór z boku cylindra będzie służył jako gniazdo dla czytnika RFID.
3. Uformuj niebieski stożek o średnicy 8 cm u podstawy i 1,5 cm u wierzchołka.
4. Połącz cylinder ze stożkiem.
5. Uformuj z żółtej gliny pasmo o długości 20 cm i szerokości 0,5 cm.
6. Przytnij żółte pasmo na odpowiednią długość i wprasuj je w niebieski stożek oraz cylinder.
   UWAGA: Do kształtów promieniowych będą potrzebne proste linie o długości 5 cm, a do kształtów koncentrycznych linie okrągłe o długości 4–8 cm.
7. Wypal glinę w temperaturze 130 °F do całkowitego utwardzenia.

5. Przygotowanie do obserwacji za pomocą rejestracji wideo czułej na ruch

1. Zacznij przyklejać kolorowe plastikowe znaczniki numerowe do tułowia pszczół robotnic natychmiast po przybyciu kolonii i kontynuuj ten proces w trakcie trwania eksperymentu, gdy pojawiają się nowe robotnice.
2. Podczas pierwszej sesji znakowania usuń wszystkie robotnice, aby upewnić się, że każda osobnik otrzymała znacznik numerowy. Natychmiast po oznakowaniu umieść robotnice z powrotem w kolonii.
   UWAGA: W przeciwieństwie do znaczników RFID, znaczniki numerowe są trudniejsze do usunięcia przez robotnice.
3. W miarę pojawiania się nowych robotnic, znakuj je, gdy są jeszcze w stadium callow (nowo wyklute). Częstotliwość znakowania zmienia się w zależności od etapu cyklu kolonii, ale średnio wynosi około 7–10 robotnic co 2–3 dni. Usuń robotnice, które nie zostały oznakowane w stadium callow, ponieważ mogą one nie być już naiwne względem kwiatów.
4. System znakowania większej liczby robotnic niż dostępnych numerów znaczników
   UWAGA: Jeśli eksperyment trwa przez wiele miesięcy i obejmuje wiele kolonii, istnieje duże prawdopodobieństwo wyczerpania dostępnych numerów znaczników. Istnieje około 7 rozróżnialnych kolorów znaczników, z których każdy jest numerowany od 1 do 99, co pozwala na jednoczesne oznakowanie do 693 robotnic. Eksperyment trwający 3 miesiące z udziałem 3–4 kolonii obejmie łącznie znacznie więcej niż 693 robotnice, ale nigdy nie będą one żyły jednocześnie.
   1. Upewnij się, że znaczniki numerowe są rozmieszczone systematycznie (np. górna strona numeru znacznika jest zawsze skierowana w stronę głowy pszczoły), szczególnie w przypadku następujących numerów: 6, 9, 66, 69, 99.
   2. Usuwaj martwe robotnice i zapisuj ich numery znaczników jako „zwolnione”. Prowadź bazę danych numerów i kolorów znaczników, które są „dostępne” lub „w użyciu”, aby upewnić się, że unikalny znacznik nie zostanie przypisany do wielu pszczół w tym samym czasie.
      UWAGA: Dodatkowe kombinacje znaczników można stworzyć poprzez dodawanie kolorów do już istniejących. Na przykład dodanie żółtej kropki do niebieskiego znacznika za pomocą pisaka permanentnego może stworzyć nowe kombinacje.
5. Przetwarzanie danych wideo
   1. Umieść dwie kamery IP (minimalna rozdzielczość obrazu 1 mp) przed każdą ekspozycją kwiatową, poza środowiskiem testowym (patrz Rysunek 3).
      
      Rysunek 3. Środowisko testowe. Fotografia środowiska testowego przedstawiająca dwie przednie kamery na pierwszym planie, kamerę sufitową pomiędzy oprawami oświetleniowymi oraz statywy ze stymulacją i próbkami bodźców w środku pomieszczenia.
      UWAGA: Szklana przegroda między kamerami IP a sztucznymi kwiatami zapewnia ich wyraczną widoczność. Kamery IP mogą znajdować się w odległości do 5 m od bodźców. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
   2. Zastąp standardowe obiektywy obiektywami warioplanowymi 1.8 mm. Obiektywy te zapewniają odpowiedni zoom i możliwość skupienia ostrości na sztucznych kwiatach.
   3. Umieść dodatkową kamerę IP bezpośrednio nad sztucznym kwiatem, ustawiając ostrość na obszar 1–2 m przed sztucznymi kwiatami. Ta kamera rejestruje zachowania związane z zawisaniem w powietrzu i badaniem antenami.
   4. Podłącz kamery IP do komputera PC poprzez wtórny kontroler interfejsu sieciowego (NIC) oraz koncentrator Ethernet.
   5. Skonfiguruj protokół dynamicznej konfiguracji hosta (DHCP) w komputerze PC, aby dynamicznie przydzielać adresy IP kamerom IP.
   6. Skonfiguruj serwer protokołu przesyłania plików (FTP) na komputerze PC.
   7. Skonfiguruj proces klienta FTP do automatycznego zapisywania klipów wideo na komputerze PC.
   8. Skonfiguruj kamerę IP tak, aby nagrywała 10-sekundowy klip wideo za każdym razem, gdy zostanie wykryty ruch.
6. Analiza klipów wideo
   1. Otwórz klip wideo i przeglądaj jego zawartość klatka po klatce za pomocą wybranego programu do odtwarzania wideo.
   2. Zapisz numer plastikowego znacznika pszczoły, datę i godzinę nagrania w arkuszu kalkulacyjnym lub relacyjnej bazie danych (RDBMS). W tym miejscu zdefiniuj lądowanie jako moment, w którym nogi pszczoły stykają się ze sztucznym kwiatem.
      UWAGA: Odrzuć wybory będące wynikiem wpływów społecznych (lądowanie, gdy inna pszczoła znajduje się na bodźcu).

6. Przygotowanie sztucznego kwiatu do obserwacji wideo

1. Zaprojektuj właściwości wizualne za pomocą oprogramowania do edycji grafiki.
   UWAGA: Upewnij się, że wydrukowany wzór można wyciąć i złożyć w stożek. Wykorzystaj obliczenia geometryczne, aby uzyskać kształt wycięcia, który po złożeniu stworzy stożek o średnicy 8 cm.
2. Wydrukuj, wytnij i złóż element wizualny w stożek.
3. Przyklej klipsy mocujące do bodźca (patrz Rysunek 2).

7. Analiza statystyczna

1. W obu eksperymentach oblicz proporcję wyborów dla każdej pszczoły (np. konkretna pszczoła dokonała x wyborów jednego kwiatu z łącznej liczby y).
2. Przeanalizuj te proporcje za pomocą powtórzonego testu dobroci dopasowania⁷.
   UWAGA: Powtórzony test G oblicza wartość heterogeniczności (G_h), która wskazuje stopień zmienności powtórzeń (t.j. każdej pszczoły), oraz wartość zbiorczą (G_p), która wskazuje ogólną istotność wszystkich proporcji wyborów. Wartości G są porównywane z wartościami χ² w testach istotności.

8. Sekwencja prezentacji bodźców

1. Przymocuj sztuczne kwiaty do stojaków na kwiaty wewnątrz przestrzeni testowej. Zmieniaj kombinację i rozmieszczenie prezentowanych bodźców w regularnych odstępach czasu (np. codziennie), aby uniknąć efektu lokalizacji.

9. Zakończenie badania

1. Umieścić kolonie w zamrażarce w temperaturze -10 °C na 3 dni, aby uśmiercić pszczoły.

Wyniki

Eksperyment 1: Dane RFID

Wszystkie 375 robotnic w kolonii zostało oznakowane tagami RFID, z czego 318 z nich (85%) w pewnym momencie podczas badania wleciało do klatki lotnej. Łącznie 197 osobników (62% pszczół, które opuściły kolonię) odwiedziło przynajmniej jeden z czterech sztucznych bodźców w postaci kwiatów.

Definicja wyboru

Za wybór uznano wlot robotnicy do sztucznego kwiatu (patrz Rycina 1). Zachowanie to określiliśmy jako „eksploracja kwiatowa”. Ta definicja wyboru jest bardziej rygorystyczna niż te stosowane w literaturze, które w zależności od badania wykorzystują kombinację zawisania, dotykania czułkami lub lądowania. Eksploracja kwiatowa stanowi ściślejszą definicję wyboru, ponieważ wymaga od pszczół nie tylko reakcji na bodziec poprzez zawisanie, dotykanie czułkami i lądowanie na nim, ale także jego eksplorowania.

Zarządzanie danymi

Techniki RFID mają zdolność gromadzenia ogromnej ilości danych w porównaniu z innymi metodami. W tym eksperymencie uzyskano 310 221 rekordów. Program bazodanowy, taki jak MySQL, jest niezbędnym narzędziem do przechowywania tak dużej ilości danych; równie ważne są zapytania SQL wykorzystywane do wypracowania odpowiedzi na pytania badawcze. Przykładowo, jedną z kwestii jest definicja wyboru. Czytniki RFID zostały skonfigurowane tak, aby rejestrować obecność tagu co 1 msec, co w przypadku pszczół pozostających wewnątrz sztucznych kwiatów przez minuty, a nawet godziny, może przełożyć się na kilka tysięcy zapisów. Naszą definicją wyboru była wizyta trwająca co najmniej 1 msec, jednak nowa wizyta nie była liczona do momentu, aż obecny ciąg zapisów został przerwany przerwą trwającą co najmniej 1 min.

Podsumowanie eksperymentu

Wszystkie wybory dokonane przez pszczoły podczas „sesji naiwnej” poddano czterokrotnym testom dobroci dopasowania, aby porównać proporcje wyborów z teoretyczną wartością przypadkowości⁷. Sesja naiwna pszczoły odnosi się do pierwszego warunku testowego, w którym pszczoła „uczestniczyła”. Testy G wykazały preferencję dla centralnego rozmieszczenia (zob. Tabela 1) oraz radialnego typu wzoru. Rysunek 4b pokazuje, że preferencja wzoru ulega odwróceniu, gdy wzór koncentryczny znajduje się w centrum, a wzór radialny na peryferiach. Jednakże, jeśli rozmieszczenie pozostaje stałe, jak na Rysunku 4a i d, preferencja wzoru ukierunkowana jest na wzór radialny. Rysunek 4 pokazuje, że względne proporcje pierwszych wyborów dla każdego wzoru w każdej kombinacji były porównywalne z proporcjami przedstawionymi dla wszystkich wyborów.

Rysunek 4. Wyniki eksperymentalne RFID. Częstotliwości wyborów dla czterech różnych kombinacji kwiatów w Eksperymencie 1. Ciemnobrązowe wykresy słupkowe przedstawiają wszystkie wybory z naiwnej sesji pszczół (oś y po lewej stronie), a jasnobrązowe słupki wskazują pierwszy wybór każdej robotnicy (oś y po prawej stronie). „Wszystkie wybory” wykazują wzorce porównywalne do „pierwszego wyboru”, ale z większą mocą statystyczną. Wykresy słupkowe pokazują, że rozmieszczenie wzorów jest ważniejsze niż typ wzoru. Preferowany był wzór umieszczony centralnie, nawet jeśli typ wzoru przedstawiał w innym przypadku mniej preferowany wzór koncentryczny. Gwiazdki oznaczają proporcję wyboru, która różni się istotnie od przypadku. Uwaga. * p < .05, ** p < .01, *** p < .001. Rysunek zmodyfikowano na podstawie pracy Orbán et al.¹¹.

Warunki	Zagregowane			Heterogeniczność
	Gp	df	p	Gh	df	p
Centralno-radialne vs centralno-koncentryczne	3.96	1	0.047	197.55	41	0.000
Obwodowo-radialne vs centralno-koncentryczne	33.77	1	0.000	210.81	42	0.000
Centralno-radialne vs obwodowo-koncentryczne	508.31	1	0.000	345.78	30	0.000
Obwodowo-radialne vs obwodowo-koncentryczne	7.42	1	0.000	84.06	24	0.000

Tabela 1. Statystyka indukcyjna danych RFID. Eksperyment 1. Tabela została zmodyfikowana na podstawie pracy Orbán et al. (2013)¹¹. G_p odnosi się do istotnego odchylenia proporcji w grupie od wartości przypadkowej, a G_h odnosi się do testów różnic indywidualnych (tj. heterogeniczności). Pełne szczegóły dotyczące testów statystycznych znajdują się w manuskrypcie.

Eksperyment 2: Dane wideo

W ciągu trzech sesji testowych odnotowano łącznie 264 wybory w czterech warunkach. Tabela 2 przedstawia liczbę robotnic oraz liczbę wyborów dokonanych przez przedstawicieli każdej kolonii.

Definicja wyboru

Dane wideo umożliwiają rejestrację trzech rodzajów zachowań związanych z wyborem: zawisania, dotykania czułkami oraz lądowania. Choć można zaobserwować wszystkie trzy rodzaje zachowań, zawisanie i dotykanie czułkami są trudne do powiązania z numerem znacznika ze względu na szybkie ruchy, których kamery o niskiej rozdzielczości lub niskiej częstotliwości odświeżania nie są w stanie zarejestrować. Kluczowe jest użycie kamery wysokiej rozdzielczości (choć nie była ona dla nas dostępna, idealnie byłoby zastosować kamerę o wysokiej liczbie klatek na sekundę, aby zminimalizować rozmycie), aby zapewnić możliwość odczytania numerów znaczników, które mogą pojawić się tylko na niewielkiej liczbie klatek. Metoda ta została również wykorzystana do porównania wzorców wyboru z techniką RFID, która wykrywa eksplorację kwiatów.

Kwestie dotyczące czułości na ruch

Jednym z kluczowych problemów przy realizacji udanego eksperymentu jest konfiguracja kamcorderów z czujnikiem ruchu. Kamcorder o zbyt wysokiej czułości zarejestruje zbyt wiele niepraktycznych danych, których przetwarzanie może stać się bardzo kosztowne. Na przykład początkowo nasz kamcorder był aktywowany przez regularne wibracje w budynku (np. osoby przechodzące korytarzem, klimatyzator itp.), co skutkowało uzyskaniem 1–2 istotnych punktów danych na każde 150–200 zarejestrowanych klipów wideo. Z drugiej strony, jeszcze poważniejszym błędem jest konfiguracja o niskiej czułości, która może doprowadzić do pominięcia kluczowych danych. Niezwykle ważne jest skonfigurowanie wszystkich kamcorderów w ten sam sposób, w przeciwnym razie błędy próbkowania mogą zniekształcić wyniki.

Podsumowanie eksperymentu

Cztery powtórzone testy dobroci dopasowania wykazały, że trzy proporcje grup różniły się znacząco od przypadku, a jedna ogólna proporcja nie była istotna statystycznie (patrz Tabela 3 i Rysunek 5). (1) Wzór jest istotny: stwierdzono znaczącą preferencję wzoru centralno-radialnego nad centralno-koncentrycznym (patrz Tabela 3). (2) Położenie wzoru radialnego jest mniej istotne: prezentacja kombinacji centralno-radialnej i peryferyjno-radialnej nie wykazała znaczącej różnicy w stosunku do przypadku. (3) Kombinacja centralno-radialna i peryferyjno-koncentryczna doprowadziła do silnej preferencji wzoru centralno-radialnego. Kombinacja centralno-koncentryczna i peryferyjno-radialna wywołała znaczącą preferencję wzoru peryferyjno-radialnego. Wzór przeważył nad lokalizacją. Różnice indywidualne były nieistotne we wszystkich czterech kombinacjach (patrz Tabela 3).

Rysunek 5. Wyniki analizy wideo z detekcją ruchu. Częstość wyborów dla czterech różnych kombinacji kwiatów w Eksperymencie 2. Wyniki wskazują na większe znaczenie rodzaju wzoru niż jego rozmieszczenia: wzory radialne były preferowane nawet wtedy, gdy były rozmieszczone peryferyjnie. Wartości wskazują liczbę wyborów wyświetlonego wzoru. Gwiazdki oznaczają proporcję wyborów, która różni się istotnie od poziomu przypadkowego. Uwaga. ** p < 0.01, *** p < 0.001. Rysunek zmodyfikowany na podstawie pracy Orbána¹¹.

Warunki	Sesja 1	Sesja 2		Sesja 3
	Kolonia 1	Kolonia 2	Kolonia 3	Kolonia 4	Kolonia 5
Liczba robotnic	45	7	2	8	23
Liczba wyborów	151	25	2	20	65

Tabela 2. Statystyka opisowa danych wideo z analizy ruchu. Całkowita liczba wyborów zarejestrowanych przy sztucznych kwiatach w Eksperymencie 2 dla każdej kolonii oraz liczba robotnic dokonujących tych wyborów. Tabela została zmodyfikowana na podstawie pracy Orbán et al.¹¹. Pełne szczegóły znajdują się w manuskrypcie.

Warunki	Połączone			Heterogeniczność
	Gp	df	p	Gh	df	p
Centralno-promieniste vs centralno-koncentryczne	17.98	1	0.000	40.72	29	0.073
Centralno-promieniste vs obwodowo-promieniste	1.85	1	0.173	53.63	39	0.060
Obwodowo-promieniste vs centralno-koncentryczne	6.57	1	0.010	26.31	27	0.500
Centralno-promieniste vs obwodowo-koncentryczne	18.18	1	0.000	41.92	37	0.256

Tabela 3. Statystyka inferencyjna dla danych z wideo reagujących na ruch. Eksperyment 2. Tabela ta została zmodyfikowana na podstawie pracy Orbán et al.¹¹. G_p odnosi się do istotnego odchylenia proporcji grupy od poziomu przypadku, a G_h odnosi się do testów różnic indywidualnych (t.j. heterogeniczności). Pełne szczegóły dotyczące testów statystycznych znajdują się w tekście publikacji.

Dyskusja

Technologia RFID umożliwia badanie setek pojedynczych pracowników z łatwością i dużą precyzją, ale charakterystyka rejestrowanego zachowania różni się od obserwacji dokonywanych przez ludzi i nagrań wideo. Zachowanie wyboru zarejestrowane przez RFID można opisać jako eksplorację kwiatów. Jest to bardzo ścisłe kryterium preferencji w porównaniu z kryteriami stosowanymi w innych badaniach, takich jak podejście⁸, wejście w ramię labiryntu^9,10, reakcja czułkowa⁸ lub lądowanie na wzorcu^11,12. W celu porównania trafności definicji zachowań związanych z wyborem i walidacji nowej metody RFID dla zachowań bez nagrody, w eksperymencie 2 zaobserwowano nagrania wideo z lądowania. Nie wszystkie miary wyboru są sobie równe: kryterium RFID mierzone za pomocą wpisu kwiatowego wykazało, że wizualna właściwość pozycjonowania wzoru jest ważniejsza dla wyboru pszczoły, podczas gdy dane wideo wskazały, że właściwość wizualna typu wzoru jest ważniejsza dla wyboru pszczoły.

Jednym z ogólnych wyzwań w badaniu niewyuczonych zachowań związanych z wyborami jest to, że bardzo trudno jest przyciągnąć naiwne, niewyszkolone pszczoły do sztucznych kwiatów, które nie oferują żadnego pyłku ani nektaru. Rzeczywiście, wiele z poprzednich eksperymentów uciekało się do szkolenia pszczół w środowisku testowym na bodźce, które uważa się za nieistotne dla zachowań związanych z wyborem bodźców testowych. RFID i nagrania wideo wrażliwe na ruch pokonują tę przeszkodę, umożliwiając ciągłe nagrywanie, 24 godziny na dobę, bez stałego nadzoru badacza, oraz zwiększając wielkość próby z 15–20 pszczół do kilkuset pszczół. Podczas gdy nienagradzane wybory dokonywane przez niewyszkolone pszczoły pozostają rzadkim zjawiskiem, te nowe eksperymentalne parametry projektowe umożliwiają obserwację.

Inne ulepszenia oferowane przez te dwie techniki obejmują eliminację błędu systematycznego próby, poprawę trafności zewnętrznej i śledzenie indywidualnych różnic. Błąd systematyczny próbki może zostać wprowadzony, gdy bada się tylko kilkanaście pszczół w rodzinie. Istnieją znaczące różnice w idiosynkrazjach behawioralnych między poszczególnymi robotnicami, nawet w obrębie tej samej kolonii, które prawdopodobnie są pomijane, ponieważ obserwuje się tylko te robotnice, które "współpracują" z badaczem w danym momencie. Badanie 15-20 pszczół w kolonii liczącej 300 lub więcej pszczół stanowi zaledwie 5% całej kolonii, w którym to przypadku błąd systematyczny w próbkowaniu może być znaczący. Tagowanie i obserwowanie zachowania wszystkich pracowników całkowicie eliminuje ten problem. Można również manipulować liczbą jednoczesnych wyborów bodźców. W naszym eksperymencie zaproponowaliśmy opcje binarne ze względów technicznych, ale możliwe są również projekty jednokrotnego wyboru lub kilku wyborów.

Jeśli chodzi o trafność zewnętrzną, badanie pszczół w środowisku laboratoryjnym było tradycyjnie wysoce sztuczne, co utrudniało uogólnianie wyników. Na przykład badacze musieli być obecni przy zbieraniu danych, pszczoły musiały żerować w środowisku testowym jedna po drugiej, a testy były ograniczone do krótkiego okna czasowego. Nowe techniki opisane w tym artykule usuwają te sztuczne ograniczenia, sprawiając, że obserwacja odbywa się bez nadzoru i ograniczeń. Wreszcie, indywidualne różnice w zachowaniu mogą być udokumentowane, ponieważ możemy ustalić, czy były to powtarzające się wybory jednej pszczoły, czy kilku pszczół.

Wrażliwe na ruch kamery o wysokiej rozdzielczości przestrzennej mają przewagę nad technikami RFID pod względem elastyczności projektowania bodźców: wygląd bodźca wizualnego może mieć niemal dowolny kształt lub formę, o ile identyfikacja obiektu może zostać uchwycona na co najmniej kilku klatkach. Przetwarzanie filmów jest nieco bardziej czasochłonne niż przetwarzanie danych RFID, ponieważ identyfikacja musi zostać odczytana przez badacza, co wymaga ręcznej kontroli każdego klipu wideo. Jeśli projekt bodźca wizualnego może sprostać ograniczeniom czytnika RFID (tj. znaczniki RFID na pszczole muszą znajdować się na co najmniej 3-4 mm czytnika RFID), to technologia RFID ma przewagę nad zautomatyzowanym gromadzeniem danych na dużą skalę. Badania jakościowe prawdopodobnie nadal będą faworyzowane przez analizę wideo. Jak pokazano w tym eksperymencie, czytniki RFID mogą gromadzić bardzo duże zestawy danych, które nie wymagają ręcznego kodowania. Nieco odmienne zalety związane z każdą techniką sugerują, że w przyszłości mogą być one wykorzystywane w sposób komplementarny.

Przyszłość obu technologii może leżeć w precyzyjnej kwantyfikacji rzadko występujących zachowań. Na przykład, jedną z wyraźnych możliwości przyszłych zastosowań jest zastosowanie tych technik w szklarniach i innych, bardziej naturalistycznych środowiskach. Połączenie naturalizmu i kontroli eksperymentalnej pozwoliłoby odpowiedzieć na pytania, na które wcześniej nie można było odpowiedzieć. Ogólnie rzecz biorąc, techniki te oferują dwa nowe sposoby obserwacji zachowania w rygorystyczny i skuteczny sposób. RFID i wideo wrażliwe na ruch są znaczącym krokiem naprzód nie tylko dla naukowców badających zapylacze lub owady, ale techniki te mogą również spodobać się innym naukowcom behawioralnym.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zminiaturyzowane tagi mic3	Microsensys	mic3 TAG 64-bitowe	tagi RFID RO do przyklejenia do pszczoły
Czytnik RFID 2k6 głowica	Czytniki RFID Microsensys	2k6	wbudowane w sztuczne kwiaty
Kamery IP	Vivotek	IP8161	Magnetowidy wrażliwe na ruch
Plalith Plattchen i nietoksyczny klej	Beeworks.com	nie dotyczy	Plakietki numeryczne do przyklejenia do pszczół
Kolonia trzmieli do badań	Koppert Kanada
Sztuczne kwiaty	Nie		Opracowane przez kampusowy sklep biologiczny
Sztuczny stojak na kwiaty	Nie		Opracowane przez kampusowy sklep biologiczny
Sala lotów	Nie dotyczy		Opracowane przez kampusowy sklep biologiczny
Laptop z systemem Windows	Ogólny sprzęt / oprogramowanie Microsoft		Służy do pobierania danych RFID
Konwerter RS 232 na USB	Ogólny		Podłącz czytnik RFID do komputera
Komputer stacjonarny	IBM		Służy do przesyłania danych wideo
Druga karta sieciowa	Generic	10/100M NIC PCI	Służy do przesyłania danych wideo
Hub sieciowy	Ogólny	4-portowy	Służy do przesyłania danych wideo
Pęseta o wysokiej precyzji	SPI		Służy do przyklejania tagów numerycznych i RFID do pszczół
Cukier	Ogólny		Służy do mieszania z wodą w celu wytworzenia wody z cukrem
Pyłek	Każdy lokalny pszczelarz		Karmiony trzmielami
Klatka do znakowania z tłokiem	Beeworks.com		Wspomaga proces znakowania
Miód	Ogólny		Służy do mieszania z wodą w celu stworzenia pasty pyłkowej
Glina	do pieczeniaSculpey		Stimulus dla RFID
Narzędzia do formowania gliny	Ogólny		bodziec dla RFID
Biała księga	Ogólny		bodziec dla wideodrukarki
laserowej	Ogólny		bodziec dla wideo Ogólny bodziec dla wideo
	Ogólny		bodziec dla wideo - klips mocujący

dotyczy dotyczy