Izolacja odrębnych populacji komórek od rozwijającego się móżdżku za pomocą mikrodysekcji

Podsumowanie

Progenitorzy wyrażający nestynę to nowo zidentyfikowana populacja neuronalnych komórek progenitorowych w rozwijającym się móżdżku. Korzystając z przedstawionej tutaj techniki mikrodysekcji w połączeniu z sortowaniem komórek aktywowanym fluorescencyjnie, ta populacja komórek może zostać oczyszczona bez zanieczyszczenia innymi obszarami móżdżku i może być hodowana do dalszych badań.

Streszczenie

Mikrodysekcja to nowatorska technika, która pozwala izolować określone obszary tkanki i eliminować zanieczyszczenia ze źródeł komórkowych w sąsiednich obszarach. Metoda ta została po raz pierwszy wykorzystana w badaniu progenitorów eksprymujących nestynę (NEP), nowo zidentyfikowanej populacji komórek w móżdżku zewnętrznym liście rozrodczym (EGL). Stosując mikrodysekcję w połączeniu z sortowaniem komórek aktywowanym fluorescencyjnie (FACS), pobrano czystą populację NEP-ów oddzielnie od konwencjonalnych prekursorów neuronów ziarnistych w EGL oraz od innych zanieczyszczających komórek wykazujących ekspresję nestyny w móżdżku. Bez mikrodysekcji analizy funkcjonalne NEP-ów nie byłyby możliwe przy użyciu obecnie dostępnych metod, takich jak wirowanie w gradiacji Percollu i mikrodysekcja z wychwytem laserowym. Technika ta może być również stosowana do stosowania z różnymi tkankami, które zawierają rozpoznawalne regiony lub komórki znakowane fluorescencyjnie. Co najważniejsze, główną zaletą tej techniki mikrodysekcji jest to, że izolowane komórki są żywe i mogą być hodowane do dalszych eksperymentów, co obecnie nie jest możliwe przy użyciu innych opisanych metod.

Wprowadzenie

Móżdżek składa się z wielu warstw komórek, z których każda zawiera różne typy komórek. Podczas rozwoju EGL zawiera proliferujące prekursory neuronów ziarnistych (GNP), podczas gdy warstwa molekularna i warstwa Purkinjego zawierają odpowiednio neurony glejowe Bergmanna i neurony Purkinjego. Głęboko w móżdżku znajduje się istota biała, która zawiera nerwowe komórki macierzyste (NSC) i oligodendrocyty¹.

Sonic hedgehog (Shh) odgrywa kluczową rolę w regulacji rozwoju móżdżku, a w szczególności promuje proliferację GNP poprzez wiązanie się ze swoim receptorem Patched (Ptc), negatywnym regulatorem sygnalizacji Shh^2-4. Nieprawidłowa aktywacja sygnalizacji Shh generuje rdzeniaka zarodkowego (MB), najczęstszy złośliwy nowotwór mózgu u dzieci^5,6.

Modele transgenicznych myszy MB z mutacją Ptc są potężnymi narzędziami do badania MB i rozwoju nowotworów przypominających ludzki MB^7,8. Korzystając z tych myszy, odkryto, że GNP są komórką pochodzenia MB⁷ typu jeżowego. Ponadto, oprócz PNB, niedawno zidentyfikowaliśmy unikalną populację neuronalnych komórek progenitorowych w obrębie EGL rozwijającego się móżdżku, które również mogą powodować MB. Komórki te wyrażają wysokie poziomy pośredniego białka filamentowego typu VI, Nestin, i są określane jako NEPs⁹. NEP są zlokalizowane w głębokiej części EGL i występują przejściowo tylko podczas rozwoju móżdżku noworodka. Są one zaangażowane w linię komórek ziarnistych jako GNP, ale różnią się, ponieważ są w stanie spoczynku i nie wyrażają Math1, dobrze ugruntowanego markera dla konwencjonalnych GNP¹⁰. Ponadto NEP powodują powstawanie MB skuteczniej niż GNP po aktywacji szlaku sygnałowego Shh⁹, co czyni je nowym źródłem nowotworzenia MB.

Wcześniej wyizolowaliśmy NEPy z EGL móżdżku w 4 dniu po urodzeniu (P4) za pomocą techniki mikrodysekcji opisanej tutaj⁹. Mikrodysekcja poprzez bezpośrednią wizualizację mikroskopową tkanki pozwala na specyficzne wypreparowanie móżdżku EGL. Jest to konieczne, ponieważ nestyna jest również wyrażana przez NSC w istocie białej móżdżku i przez glej Bergmanna w warstwie molekularnej^1,7,11,12 i ważne było, aby komórki te nie zostały uwzględnione, ponieważ zakłóciłoby to analizę. Komórki wyizolowane z mikrowypreparowanej tkanki mogą być natychmiast wykorzystane do analizy molekularnej lub mogą być hodowane do dalszych zastosowań.

Aby pomóc w szczegółowym mikrorosekcji EGL i dalszym oczyszczaniu NEP, myszy Math1-GFP (zielone białko fluorescencyjne) skrzyżowano z myszami Nestin-CFP (cyjan fluorescencyjne białko). Czynnik transkrypcyjny Math1 jest specyficznie wyrażany przez GNP, a ekspresja GFP jest wyraźnie widoczna w EGL^9,13. Myszy Nestin-CFP wyrażają jądrową formę CFP i można je łatwo uwidocznić w warstwie molekularnej^9,14. Ekspresja GFP i CFP razem tworzą granice dla mikrodysekcji EGL (patrz rysunek 1). CFP-dodatnie NEP-y zostały następnie wyizolowane przez FACS, po enzymatycznej dysocjacji rozpreparowanych EGL.

Obecnie, najczęściej stosowaną metodą izolowania komórek z EGL jest wirowanie w gradiorze Percoll całej tkanki móżdżku^15,16. Metoda ta nie jest jednak w stanie całkowicie wykluczyć populacji komórek Nestin+ z warstwy molekularnej i istoty białej, a zatem nie może być stosowana do badania NEP. Mikrodysekcja wychwytywania laserowego, która wykorzystuje transfer energii lasera do usuwania komórek będących przedmiotem zainteresowania, jest inną metodą stosowaną do izolowania określonych komórek w niejednorodnej tkance^17,18, ale przechwycone komórki mogą być używane tylko do odzyskiwania DNA, RNA i białka i nie mogą być hodowane.

Ten protokół umożliwia specyficzne odizolowanie żywej, czystej populacji NEP-ów od EGL. Technika ta może być również stosowana do różnych typów tkanek, które mają rozpoznawalną architekturę anatomiczną lub fluorescencyjnie znakowane komórki/regiony. Dlatego główną zaletą włączenia tej nowatorskiej techniki mikrodysekcji do protokołów izolacji komórek jest to, że komórki można izolować z określonych regionów tkanek w celu wyeliminowania zanieczyszczenia sąsiednich tkanek, a komórki można natychmiast pobrać do analizy lub hodować do innych zastosowań.

Protokół

Wykorzystanie zwierząt w tym protokole zostało przeprowadzone zgodnie z procedurami zatwierdzonymi przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Fox Chase Cancer Center.

1. Przygotowanie instrumentów, roztworów i szkiełek nakrywkowych

1. Wyczyść dwa zestawy drobnych kleszczyków #5, jeden zestaw cienkich zakrzywionych kleszczy #7, jedne duże nożyczki chirurgiczne, jedne nożyczki do mikropreparacji, jedną szpatułkę i jedną perforowaną łyżkę. Umieść narzędzia w samouszczelniającej się torbie sterylizacyjnej i autoklawie. Przechowuj instrumenty w woreczku, aż będą gotowe do użycia.
2. Przygotuj 3% roztwór agarozy o niskiej temperaturze topnienia.
   1. Dodaj 1,5 g agarozy do 50 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem Dulbecco (DPBS), a następnie umieść w kuchence mikrofalowej i podgrzewaj, aż pojawią się bąbelki. Zamieszaj kolbą i podgrzewaj ponownie, aż cała agaroza się rozpuści. Wymieszaj roztwór z mieszadłem przed podgrzaniem, jeśli pojawią się grudki.
   2. Przechowywać roztwór w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C do czasu, gdy będzie potrzebny.
   3. W przypadku długotrwałego przechowywania roztwór agarozy do wykorzystania w przyszłości należy przechowywać w temperaturze pokojowej lub w temperaturze 4 °C przez wiele miesięcy. Podgrzej w kuchence mikrofalowej do upłynnienia. W celu wielokrotnego podgrzewania roztworu agarozy, zważyć kolbę przed podgrzaniem, aby utrzymać jej początkową wagę ciepłą, sterylną wodą destylowaną.
3. Przygotuj następujące roztwory do dysocjacji komórek na bazie papainy, jak opisano wcześniej²:
   1. Roztwór papainy z papainą (100 j./ml), cysteiną (0,2 mg/ml) i DNazą (250 j./ml) w sterylnym DPBS zawierającym czerwień fenolową.
   2. Roztwór jajomkoidów z albuminą surowicy bydlęcej (BSA; 8 mg/ml), inhibitorem trypsyny sojowej (8 mg/ml)) i DNazą (250 U/ml) w sterylnym DPBS zawierającym czerwień fenolową.
      Przefiltruj, wysterylizuj oba roztwory i dostosuj pH, aby przywrócić oryginalny kolor DPBS zawierającego czerwień fenolową.
4. Przygotować pożywkę do hodowli komórkowych (NB/B27): uzupełnić podłoże podstawowe 1 mM pirogronianu sodu, 2 mM L-glutaminy, 1% penicyliny-streptomycyny (P/S) i suplementu B27. Filtruj, sterylizuj i chroń przed światłem. Przed użyciem wyrównać media w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
5. Przygotować bufor FACS: 5% płodowa surowica bydlęca (FBS) w DPBS. Dodaj 2,5 ml FBS do 47,5 ml DPBS.
6. Przygotować szkiełka nakrywkowe pokryte poli-D-lizyną (PDL).
   1. Autoklaw nowe szklane szkiełka nakrywkowe.
   2. Pokryć szkiełka nakrywkowe PDL (100 μg/ml w sterylnej wodzie destylowanej) i inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C lub pokojowej przez noc.
   3. Szkiełka nakrywkowe umyć sterylną wodą destylowaną. Umyć raz mediami NB/B27. Przed użyciem pozostaw szkiełka nakrywkowe do całkowitego wyschnięcia w kapturze do hodowli tkankowych.

2. Sekcja i przygotowanie wycinków tkanek

1. W dniu sekcji należy przetrzeć obszar sekcji 70% etanolem i przykryć wkładką chłonną.
2. Wyjmij narzędzia preparacyjne z woreczka do sterylizacji. Dodaj lodowaty, sterylny DPBS/1% P/S do małej szalki Petriego i umieść na lodzie.
3. Ścięć głowę szczeniąt myszy P4 Math1-GFP / Nestin-CFP dużymi nożyczkami chirurgicznymi, a następnie przytrzymać głowę za pomocą cienkich zakrzywionych kleszczy. Usuń skórę i delikatnie oderwij czaszkę za pomocą #5 cienkich kleszczy, a następnie wyjmij mózg z czaszki za pomocą szpatułki i przenieś go na szalkę Petriego zawierającą DPBS/1% P/S.
   1. Używając cienkich kleszczy #5, ostrożnie oddziel móżdżek od reszty mózgu. Pamiętaj, aby jak najszybciej przeciąć jedno szczenię na raz.
   2. Zbierz co najmniej 8 móżdżku, aby uzyskać wystarczającą ilość NEP-ów do analiz molekularnych i funkcjonalnych.
4. Napełnij formę do zatapiania o wymiarach 2 x 2 x 2 cm 3% roztworem agarozy o niskiej temperaturze topnienia. Upewnij się, że temperatura agarozy nie przekracza 37 °C.
5. Usuń nadmiar płynu z móżdżku, delikatnie wklepując w tkankę laboratoryjną. Umieść móżdżek w formie w pozycji pionowej. Umieść formę na lodzie, aby szybko się zestaliła. Użyj ~4 móżdżku na blok.
6. Uzyskaj żywe skrawki tkanek za pomocą wibrującego wibratomu ostrza. Przytnij blok agarozy zawierający mkreetellę żyletką. Przyklej blok agarozy do płytki wibratomu z móżdżkiem ustawionym w pozycji pionowej.
7. Napełnij tackę wibratomu lodowatym sterylnym DPBS/1% P/S i umieść pod spodem lód.
   1. Wytnij odcinki 600 μm na całej długości móżdżku. Zbierz kawałki z tacki na lód za pomocą perforowanej łyżki. Umieść skrawki na szalce Petriego wypełnionej DPBS/1% P/S na lodzie.

3. Mikrodysekcja i dysocjacja komórek

1. Umieścić szalkę Petriego zawierającą wycinki tkanek pod fluorescencyjnym mikroskopem preparacyjnym.
   1. Ostrożnie oddziel EGL od reszty odcinka móżdżku za pomocą cienkich kleszczy, preparując między warstwą molekularną CFP+ a GFP+ EGL (patrz linia przerywana na rysunku 1). Należy uważać, aby nie uwzględnić żadnej części warstwy molekularnej, co spowoduje zanieczyszczenie gleju Bergmanna wykazującego ekspresję Nestyny.
   2. Wykonaj ten krok tak szybko, jak to możliwe i utrzymuj tkankę na lodzie, aby uniknąć śmierci komórki.
   3. Usuń agarozę otaczającą tkankę przed przejściem do następnego kroku.
2. Strawić mikrowypreparowaną tkankę EGL przy użyciu protokołu opartego na papainie, jak opisano^{wcześniej 2}, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki.
   1. Ponownie zawieś komórki w buforze FACS w celu zebrania komórek CFP-dodatnich za pośrednictwem FACS.

4. Sortowanie i powlekanie komórek

1. Posortuj komórki pod kątem fluorescencji CFP za pomocą sterylnego, szybkiego cytometru przepływowego zawierającego odpowiedni filtr CFP i zbierz komórki w buforze FACS na lodzie. Uzyskaj około 100 000 NEP-ów z każdego móżdżku P4.
2. Odwirować komórki przy 300 x g przez 5 minut. Natychmiast użyć komórek do analizy molekularnej lub hodowli do dalszych eksperymentów.
3. Aby wyhodować komórki, ponownie zawiesić komórki we wstępnie ogrzanym podłożu NB/B27 i płytkę na szkiełkach nakrywkowych pokrytych PDL, jak opisano wcześniej².

Wyniki

Jak pokazano na rysunku 1A, wycinki móżdżku zostały przygotowane z myszy P4 Math1-GFP/Nestin-CFP, u których móżdżek EGL był zdominowany przez GNP wyrażające GFP, a warstwa molekularna została wzbogacona o komórki glejowe CFP-dodatnie. Aby wyizolować NEP-y, które znajdują się w głębokiej części EGL, plastry zostały poddane mikrodeparacji między EGL a warstwą molekularną (wzdłuż linii przerywanej; Rysunek 1A). Następnie pobrano wypreparowane EGL (ryc. 1B)...

Dyskusja

Opisana tutaj metoda mikrodysekcji jest pierwszą procedurą zdolną do wyizolowania czystej populacji żywych komórek do wykorzystania w analizach molekularnych i funkcjonalnych. Jak wykazano przez Li i wsp.⁹, NEP uzyskane tą metodą mogą być hodowane i włączane do różnych eksperymentów, a ze względu na ich wysoką czystość mogą być również wykorzystywane do analizy mikromacierzy.

Bardzo ważne jest, aby poświęcić trochę czasu, aby nabrać biegłości w tej technic...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Pożywka neuropodstawowa	Gibco	21103-049
PDL	Millipore	A-003-E
Ultra czysta agaroza o niskiej temperaturze topnienia	Invitrogen	16520-050
DPBS	Gibco	14190144