Artykuł metodologiczny

Immunoterapia podjęzykowa jako alternatywa dla indukowania ochrony przed ostrymi infekcjami dróg oddechowych

18.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52036

⸱

30 sierpnia 2014

 ,  ,  , 
1Departamento de Desarrollo Biotecnológico, Universidad de la República, 2Present Affiliation: Trinity Biomedical Science Institute, Trinity College Dublin

W tym artykule

Podsumowanie

Obecna praca ilustruje wygodę stosowania immunoterapii podjęzykowej w celu wzmocnienia wrodzonej odpowiedzi immunologicznej w płucach i zapewnienia ochrony przed ostrym pneumokokowym zapaleniem płuc u myszy.

Streszczenie

Droga podjęzykowa jest szeroko stosowana do dostarczania małych cząsteczek do krwiobiegu i modulowania odpowiedzi immunologicznej w różnych miejscach. Wykazano, że skutecznie indukuje odpowiedzi humoralne i komórkowe w miejscach ogólnoustrojowych i śluzówkowych, a mianowicie w płucach i drogach moczowo-płciowych. Szczepienie podjęzykowe może sprzyjać ochronie przed infekcjami dolnych i górnych dróg oddechowych; Może również promować tolerancję na alergeny i łagodzić objawy astmy. Modulacja odpowiedzi immunologicznej płuc za pomocą immunoterapii podjęzykowej (SLIT) jest bezpieczniejsza niż bezpośrednie podawanie preparatów drogą donosową, ponieważ nie wymaga dostarczania potencjalnie szkodliwych cząsteczek bezpośrednio do dróg oddechowych. W przeciwieństwie do dostarczania donosowego, skutki uboczne obejmujące toksyczność mózgu lub paraliż twarzy nie są promowane przez SLIT. Mechanizmy immunologiczne leżące u podstaw SLIT pozostają nieuchwytne, a jego zastosowanie w leczeniu ostrych infekcji płuc nie zostało jeszcze zbadane. W związku z tym konieczne jest opracowanie odpowiednich modeli zwierzęcych SLIT w celu dalszego zbadania jego potencjalnych zalet.

Ta praca pokazuje, jak wykonywać podjęzykowe podawanie środków terapeutycznych myszom, aby ocenić ich zdolność do ochrony przed ostrym pneumokokowym zapaleniem płuc. Przedstawiono techniczne aspekty postępowania z myszami podczas inokulacji podjęzykowej, precyzyjną identyfikację błony śluzowej podjęzykowej, drenaż węzłów chłonnych i izolację tkanek, płukania oskrzelowo-pęcherzykowego i płuc. Szczegółowo opisano protokoły przygotowania zawiesiny pojedynczej komórki do analizy FACS. Omówiono inne dalsze zastosowania do analizy odpowiedzi immunologicznej. Wyjaśniono również techniczne aspekty przygotowania inokulum Streptococcus pneumoniae i donosowego prowokacji myszy.

SLIT to prosta technika, która pozwala na badanie przesiewowe potencjalnych cząsteczek w celu modulacji odpowiedzi immunologicznej płuc. Parametry wpływające na powodzenie SLIT są związane z wielkością cząsteczki, podatnością na degradację i stabilnością wysoko skoncentrowanych formulacji.

Wprowadzenie

Ogólnym celem tej pracy jest zilustrowanie korzyści płynących z immunoterapii podjęzykowej w leczeniu ostrych infekcji dróg oddechowych (ARI) i przedstawienie zalet tej drogi dostarczania w porównaniu z innymi drogami podawania, a mianowicie donosowo.

ARI powoduje miliony zgonów każdego roku, zwłaszcza u dzieci poniżej piątego roku życia. Streptococcus pneumoniae pozostaje jednym z głównych czynników etiologicznych bakteryjnego zapalenia płuc u niemowląt i osób starszych1,2. Obecnie główne dostępne leczenie opiera się na stosowaniu antybiotyków, ale stale pojawiają się oporne szczepy3,4.

SLIT wywołuje szerokie reakcje na poziomie ogólnoustrojowym, a także śluzówkowym, szczególnie na drogach oddechowych5. Ma udowodnioną skuteczność w walce z infekcją grypą, promując długotrwałą ochronę poprzez wytwarzanie odpowiedzi humoralnych i komórkowych6,7. Ponadto wykazano, że profilaktyczne leczenie lizatami bakteryjnymi podawanymi drogą podjęzykową zmniejszało zaostrzenia przewlekłego obturacyjnego zapalenia oskrzeli u osóbstarszych8 i zapobiegało nawrotom infekcji dróg oddechowych u dzieci9. SLIT jest szeroko stosowany w leczeniu alergii i astmy. Badania kliniczne wykazały nie tylko jego skuteczność w modulowaniu odpowiedzi immunologicznej w drogach oddechowych, ale także jego bezpieczeństwo10. Pomimo rosnącego zainteresowania firm farmaceutycznych i badaczy SLIT, mechanizmy zaangażowane w indukcję odpowiedzi immunologicznej błony śluzowej po podjęzykowym podaniu związków pozostają niejasne. W ostatnim czasie zwrócono uwagę na mechanizmy promujące tolerancję związaną z odczulaniem alergenów. Zaproponowano, że komórki rezydentne i rekrutowane w błonie śluzowej podjęzykowej, takie jak komórki dendrytyczne i makrofagi, mogą promować tolerancję po SLIT11-13. Komórki dendrytyczne błony śluzowej jamy ustnej mogą promować komórki pomocnicze T wytwarzające IFN-gamma i IL-1011, a także recyrkulować do dystalnej błony śluzowej narządów płciowych i promować limfocyty T CD8 + 14. Jednak niewiele wiadomo na temat wpływu SLIT na komórki wrodzone lub jego zdolności do poprawy usuwania patogenów podczas ostrych infekcji dróg oddechowych.

Naturalna kontrola infekcji pneumokokowej w płucach w dużym stopniu zależy od skutecznej i szybkiej aktywacji lokalnych wrodzonych mechanizmów obronnych. Wcześniej wykazaliśmy, że wzmocnienie wrodzonej odporności płuc przez pojedynczą donosową dawkę flageliny (FliC), agonisty TLR5 i NLRC4, chroni 75-100% myszy poddanych śmiertelnej dawce klinicznego izolatu Streptococcus pneumoniae serotyp 1. Wykazano, że ochrona ta jest zależna od lokalnej rekrutacji komórek GR1 + (prawdopodobnie neutrofili wielojądrzastych, PMN) i nie jest zależna od przeciwciał, limfocytów B lub T15.

Witelina jest strukturalnym składnikiem wici bakteryjnej. W postaci monomerycznej jest rozpoznawany przez dwa receptory rozpoznawania patogenów (PRR), TLR5, który wyczuwa zewnątrzkomórkowy FliC16 i inflamasom NLRC4 / NAIP5, który wykrywa wewnątrzkomórkową flagelinę17,18. Kiedy FliC jest wykrywany przez PRR, wyzwalana jest ważna reakcja zapalna. My i inni wykazaliśmy, że wkroplenie oczyszczonego FliC z Salmonella enterica serowar Typhimurium do płuc napędza szybką produkcję chemokin i cytokin, zwłaszcza gdy są rozpoznawane przez nabłonek płuc, które z kolei koordynują rekrutację komórek odpornościowych do dróg oddechowych, głównie PMN15,19-21. Chociaż przemijające, znaczne naciek neutrofili, który ma miejsce w drogach oddechowych po dostarczeniu FliC do nosa, może stanowić problem w przypadku przejścia na terapie kliniczne do stosowania u ludzi. Nadmierny stan zapalny może być szkodliwy dla funkcji płuc. Ponadto wykazano, że donosowe dostarczanie cząsteczek immunostymulujących może powodować paraliż twarzy i/lub toksyczne działanie na mózg22-24.

Immunoterapia podjęzykowa oferuje bezpieczniejszą alternatywę dla modulacji odpowiedzi immunologicznej w drogach oddechowych w porównaniu do drogi donosowej. Jest nieinwazyjny, bezbolesny, prosty i dobrze przestrzega zaleceń pacjenta25. Ponadto, jak wspomniano wcześniej, może indukować reakcje ochronne w błonie śluzowej dróg oddechowych bez ryzyka związanego z bezpośrednim podawaniem preparatów donosowo lub dopłucnie. Droga podjęzykowa może być alternatywnie wykorzystana do dostarczania cząsteczek, które mają doskonały wpływ na układ odpornościowy płuc, ale udowodniono, że są toksyczne lub wywołują silny stan zapalny, gdy są podawane donosowo. Oprócz tych zalet, preparaty do immunoterapii podjęzykowej mają niższe koszty produkcji, ponieważ niesterylne produkty mogą być dostarczane tą drogą, a wstrząs endotoksyczny nie stanowi problemu dla SLIT. Z drugiej strony warto zauważyć, że do wywołania odpowiedzi immunologicznej w płucach konieczne są wyższe dawki związków immunostymulujących w porównaniu z tymi stosowanymi drogą donosową lub pozajelitową; również w przypadku korzystania z mysiego modelu SLIT potrzebne są wysoce skoncentrowane roztwory, ponieważ miejsce anatomiczne, w którym osadzane są preparaty, jest małe.

Na podstawie naszych wcześniej opublikowanych danych, opracowaliśmy model ochrony za pomocą immunoterapii podjęzykowej z flageliną jako modelowym immunostymulantem. Wykazaliśmy, że pojedyncza dawka flageliny indukowała 60% przeżycia przed inwazyjnym pneumokokowym zapaleniem płuc wywołanym przez szczep serotypu 1, podczas gdy wszystkie myszy w grupie kontrolnej zmarły z powodu infekcji w ciągu 5 dni. Analiza cytometrii przepływowej wykazała, że większa liczba PMN jest rekrutowana do dróg oddechowych zwierząt chronionych po podjęzykowym leczeniu flageliną, co sugeruje, że komórki te mogą być zaangażowane w mechanizm ochrony indukowany przez immunoterapię podjęzykową.

Ten film pokazuje szczegółowo, jak przeprowadzić immunoterapię podjęzykową, a także jak odzyskać odpowiednią tkankę z błony śluzowej podjęzykowej, drenując węzły chłonne, a także płuca i drogi oddechowe w celu przeprowadzenia dalszej analizy. Dodatkowo ilustruje ogólną technikę przygotowania komórek do analizy FACS i pokrótce pokazuje, jak przygotować zawiesiny Streptococcus pneumoniae oraz jak przeprowadzić infekcje donosowe u myszy w celu skonfigurowania modelu ostrej infekcji.

Protokół

Procedury na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami nr 071140-000821-12 i 08052010 zatwierdzone przez Honorową Komisję ds. Doświadczeń na Zwierzętach oraz Radę Dyrektywną Szkoły Medycznej, Universidad de la República – Urugwaj.

1. Podjęzykowe podawanie środka terapeutycznego

  1. Przygotować roztwór zawierający środek terapeutyczny, który ma być poddany badaniu. Dostosuj stężenie, aby podać maksymalną objętość 10 μl na mysz.
    UWAGA: Dla oczyszczonej flageliny z Salmonella enterica serotyp Typhimurium optymalna dawka do wywołania ochrony u myszy zakażonej pierwszą śmiertelną dawką S. pneumoniae serotyp 1 E1586, powodująca 100% śmiertelność wynosi 10 μg/mysz. Roztwór flageliny musi być podgrzewany w temperaturze 65 °C przez 5 minut, aby zapewnić uwolnienie monomerów. Więcej informacji na temat oczyszczania witelliny można znaleźć w odnośniku26.
    1. Różnicuj skuteczne stężenie różnych środków immunomodulujących w zależności od wielkości cząsteczki, czystości, podatności na proteolizę i stosowania środków mukoadhezyjnych. Dostosuj optymalne stężenie dla każdego testowanego związku, aby zmaksymalizować jego działanie. Jeśli wcześniej przeprowadzono badania po podaniu donosowym określonego związku, należy zastosować dawkę początkową od 5 do 10 razy wyższą, aby sprawdzić jego skuteczność po podaniu podjęzykowym.
  2. Znieczulić myszy, wstrzykując koktajl zawierający 110 mg/kg ketaminy z 5,5 mg/kg ksylakatyny i pozwól zwierzętom odpocząć przez 7 do 10 minut.
  3. Potwierdź prawidłowe znieczulenie, delikatnie naciskając opuszkę jednej z tylnych nóg; jeśli zwierzę jest odpowiednio znieczulone, nie będzie się poruszać w odpowiedzi na bodziec.
  4. Rozprowadź cienką warstwę maści weterynaryjnej na oczach każdej myszy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.
    UWAGA: Wziewne środki znieczulające, takie jak izofluoran, mogą być również stosowane zamiast ketaminy/ksylacyny, jeśli dostępny jest system wyposażony w komorę indukcyjną i stożki nosowe. Za pomocą komory indukcyjnej należy znieczulić zwierzęta i podać immunostymulant drogą podjęzykową. Natychmiast podłącz zwierzę do stożka nosowego na co najmniej 15 minut, aby utrzymać je pod narkozą, aby uniknąć połknięcia i umożliwić wchłonięcie związku terapeutycznego.
  5. Odpipetować roztwór zawierający immunostymulant lub roztwór do kontroli nośnika; używając kciuka i palca wskazującego ręki niedominującej, wziąć mysz i trzymać ją w pozycji pionowej.
  6. Używając dominującej ręki, umieść parę zamkniętych kleszczy pod językiem i przytrzymaj go na miejscu za pomocą palca środkowego i serdecznego, lekko otwórz kleszcze, aby podnieść język.
  7. Weź pipetę i nanieś roztwór na dno jamy ustnej i grzbietową stronę języka.
  8. Usuń kleszcze i pozwól myszy odpocząć przez 3 do 5 minut przed włożeniem jej z powrotem do klatki. Aby zapewnić utrzymanie normotermii u znieczulonych myszy, należy podłączyć klatki do systemu podgrzewania klatek. Jeśli taki system nie jest dostępny, umieść myszy należące do tej samej grupy leczonej z powrotem w odpowiedniej klatce, jedna obok drugiej, nad ściółką i częściowo przykryj je czystymi arkuszami bibuły, aby pomóc im utrzymać temperaturę ciała.
  9. Pobrać próbki tkanek w dowolnym momencie po wkropleniu środka immunomodulującego, aby przeanalizować zmiany w populacjach komórek wywołane przez leczenie.
    UWAGA: W tym konkretnym protokole podawanie flageliny odbywało się 2 godziny przed prowokacją. Określ optymalny czas między leczeniem a prowokacją dla każdego konkretnego czynnika terapeutycznego i patogenu, który ma być testowany.

2. Przygotowanie zawiesiny bakteryjnej i prowokacji donosowej ze Streptococcus pneumoniae

UWAGA: S. pneumoniae to naturalny ludzki patogen, który może powodować choroby zagrażające życiu, takie jak inwazyjne zapalenie płuc, sepsa i zapalenie opon mózgowych. Do przeniesienia może dojść podczas wdychania lub w kontakcie z błoną śluzową. W związku z tym wszystkie próbki, które mogły mieć kontakt z S. pneumoniae, muszą być obsługiwane w odpowiednim obiekcie bezpieczeństwa biologicznego II poziomu przy użyciu komory bezpieczeństwa biologicznego klasy II. Zapoznaj się ze standardowymi procedurami operacyjnymi swojej instytucji dotyczącymi postępowania z patogenami typu II w odzieży ochronnej, utylizacji odpadów i dodatkowych środków bezpieczeństwa, które mogą mieć zastosowanie. Zakażone zwierzęta powinny być trzymane w indywidualnie wentylowanych klatkach w izolatorach wyposażonych w filtry HEPA. Dostępne są szczepionki przeciw pneumokokom i antybiotykoterapia. Więcej informacji można znaleźć w bibliografiach27 i 1.

  1. Rozmrozić podwielokrotność zawiesiny roboczej Streptococcus pneumoniae o znanym bakteryjnym numerze CFU, przygotowaną w sposób opisany wpkt 15.
  2. Wirować przez 5 minut przy 2 500 x g i RT.
  3. Odrzucić sklarowany osad i przemyć osad bakteryjny, zawieszając go w 1 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej. Używaj końcówek filtrujących podczas przygotowywania zawiesiny bakteryjnej, rozcieńczeń lub do prowokacji zwierząt.
  4. Ponownie odwirować zgodnie z opisem w kroku 2.2.
  5. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w odpowiedniej objętości sterylnego roztworu soli fizjologicznej, aby uzyskać zawiesinę 4x105 jtk/50 μl. Dawka ta odpowiada minimalnej dawce bakteryjnej S. pneumoniae serotyp 1 E1586, która powoduje 100% śmiertelność u myszy BALB/c zgodnie z wcześniejszymi badaniami15,
    UWAGA: Przy ustalaniu modelu pneumokokowego zapalenia płuc u myszy, minimalna dawka bakteryjna powodująca 100% śmiertelności musi być określona dla każdej konkretnej kombinacji szczepu bakteryjnego, serotypu i szczepu myszy.
  6. Homogenizuj zawiesinę bakteryjną, wirując lub pipetując w górę iw dół 5 razy.
  7. Załaduj 50 μl zawiesiny bakteryjnej za pomocą sterylnej końcówki filtra i wlej całkowitą objętość do nozdrzy znieczulonej myszy. Trzymaj mysz pionowo przez 2 minuty i pozwól jej spoczywać w pozycji grzbietowej przez kolejne 2 minuty. Nałóż maść weterynaryjną na oczy i włóż zwierzęta z powrotem do klatki; Upewnij się, że normotermia jest utrzymywana w znieczuleniu.
    UWAGA: W tym badaniu prowokację bakteryjną przeprowadzono w objętości 50 μl, aby zapewnić dostarczenie co najmniej 90% całkowitego CFU do płuc, jak określono wcześniej w15,28. Aby zminimalizować niepokój zwierzęcia, można użyć mniejszych objętości (np. 20 μl). Należy jednak sprawdzić, czy skuteczne dostarczanie bakterii do płuc jest skuteczne; można to zrobić, pobierając płuca 5 minut po prowokacji i licząc CFU w homogenatach płuc poprzez posiewanie seryjnych rozcieńczeń na płytkach z krwią.
  8. Potwierdzić numery CFU w zawiesinie bakteryjnej używanej do infekcji poprzez posiew seryjnych 10-krotnych rozcieńczeń na płytkach z agarem z krwią. Inkubować O/N w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i policzyć liczbę kolonii śluzowatych prezentujących zieloną aureolę charakterystyczną dla bakterii alfa hemolitycznych.

3. Pobieranie tkanek i przygotowanie próbek do analizy metodą cytometrii przepływowej (FACS)

3.1) Pobieranie tkanek

  1. Poddać zwierzę eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy lub użycie komory CO2; otworzyć klatkę piersiową aż do szyi i wykonać nacięcie wzdłuż przednich nóg, aby odsłonić brzuszną stronę szyi i obszar podżuchwowy.
  2. Za pomocą zakrzywionych kleszczyków z cienką końcówką delikatnie podciągnij gruczoły ślinowe i przylegające tkanki miękkie, aby odsłonić grzbietową stronę dna jamy ustnej. Za pomocą zakrzywionych szczypiec z cienką końcówką pobrać węzły chłonne żuchwy i dodatkowej żuchwy, delikatnie pociągając do góry i umieścić je w probówce zawierającej pełne RPMI (cRPMI, dla 500 ml – 10% płodowej surowicy bydlęcej, 5 ml roztworu zawierającego 10 000 U/ml penicyliny i 10 mg/ml roztworu streptomycyny i 5 ml L-glutaminy 200 mM) lub roztworu konserwującego kwasy nukleinowe zgodnie z dalszą procedurą, która zostanie przeprowadzona później.
  3. Aby otworzyć klatkę piersiową, wykonaj nacięcie w przeponie; za pomocą pary kleszczy o zębach szczura zaciśnij chrząstkę ksyloidalną mostka i ostrożnie przetnij żebra po obu stronach grzbietu, zaczynając od fałszywych żeber aż do punktu, w którym prawdziwe żebra spotykają się z rękojeścią mostka.
  4. Trzymając chrząstkę ksyloidalną mostka kleszczami, delikatnie pociągnij do góry, aby odsłonić narządy klatki piersiowej.
  5. Całkowicie usuń żebra, przecinając pierwsze żebra i obojczyk. Grasica pojawi się jako biała struktura dwóch płatów znajdujących się w przednio-brzusznej części klatki piersiowej w pobliżu podstawy serca.
  6. Weź jeden z płatów, zaciskając go kleszczami i użyj nożyczek, aby usunąć więzadła między dolną powierzchnią a osierdziem. Przystąp do usunięcia drugiego płata.
  7. Zidentyfikuj jamę brzuszną i otwórz ją, przecinając wzdłuż środkowej osi ściany mięśniowej, aby odsłonić narządy. Za pomocą kleszczy przeciąć tylną żyłę główną i aortę piersiową; Usunąć nadmiar krwi za pomocą tkanki chłonnej.
  8. Aby przeanalizować populacje komórek rezydentnych i naciekających pęcherzyków płucnych, należy wykonać płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe (BAL). Przetnij mięśnie w brzusznej części szyi, aby odsłonić tchawicę i przełyk; Aby je rozdzielić, wykonaj nacięcia po bocznej i grzbietowej stronie konstrukcji.
  9. Podnieś tchawicę kleszczami i wykonaj małe nacięcie skalpelem, aby wprowadzić cienką końcówkę pipety transferowej wypełnionej 1 ml PBS bez Ca2 + / Mg2 + plus 1 mM EDTA. Wkroplić i zassać całkowitą objętość co najmniej trzy razy; Odessać i przenieść zawiesinę komórkową do sterylnej probówki o pojemności 1,5 ml i umieścić ją na lodzie.
  10. Aby przeanalizować populacje komórek obecnych w miąższu płuc, najpierw wykonaj perfuzję płuc, wstrzykując 5 ml PBS bez Ca2+/Mg2+ plus 1 mM EDTA do prawej komory serca.
    UWAGA: Spowoduje to wyeliminowanie większości czerwonych krwinek i komórek odpornościowych obecnych w naczyniach krwionośnych płuc. Jeśli perfuzja została przeprowadzona prawidłowo, kolor płuc zmieni się z różowego na biały.
  11. Odizoluj serce od płuc, zaciskając je od podstawy lewej komory i delikatnie przeciąć naczynia krwionośne nożyczkami, aby całkowicie je usunąć. Weź perfundowane płuca i umieść je w cRPMI lub roztworze konserwującym kwas nukleinowy, w zależności od dalszej analizy, która ma być przeprowadzona.
  12. W celu analizy populacji komórek w błonie śluzowej podjęzykowej należy odizolować głowę zwierzęcia i usunąć gruczoły ślinowe oraz przyległe tkanki miękkie, jeśli nie zostało to wykonane w kroku 3.2.1.
  13. Wykonaj nacięcie po każdej stronie jamy ustnej, aż dojdziesz do stawu żuchwowego i oddziel dolną szczękę wraz z językiem i dnem jamy ustnej, za pomocą szpilek przymocuj ją do deski preparcyjnej. Podciągnij język; Za pomocą skalpela wykonaj nacięcie w miejscu, w którym podstawa języka styka się z dnem jamy ustnej, aż dotrze do trzecich zębów trzonowych, aby odsłonić błonę śluzową podjęzyka.
  14. Całkowicie usuń język; weź stempel do biopsji 0,5 mm i umieść go obok dolnych siekaczy. Wyciąć od wprowadzenia dziąsła tkanki podjęzykowej i delikatnie dociskać, aż dno jamy ustnej zostanie całkowicie wycięte.
  15. Powtórz jeszcze raz, umieszczając stempel biopsyjny w pobliżu trzecich zębów trzonowych, aby całkowicie usunąć tkankę podjęzykową. Umieść na czystej probówce zawierającej cRPMI lub środek konserwujący kwas nukleinowy.

3.2) Przygotowanie próbki do analizy FACS.

  1. Przenieść tkankę płuc wyizolowaną od każdej myszy na 24-dołkową płytkę i zmielić ją czystymi nożyczkami, aż uzyska małe kawałki tkanki o wielkości około 2 mm. Dodać 1 ml na studzienkę pożywki trawiącej zawierającej 30 mg kolagenazy typu II, 50 μg DNAse-I w 1 ml RPMI bez FBS. Pipetować w górę i w dół pięć razy i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 40 minut.
    1. W celu analizy populacji komórek w tkance podjęzykowej, należy zastąpić pożywkę trawiącą opisaną w ppkt 3.2.1 pożywką zawierającą 2 jednostki Dyspazy, 30 mg kolagenazy typu II, 50 μg DNAse-I w 1 ml RPMI. Inkubować tkankę pobraną od jednej myszy w 500 μl pożywki wytrawiającej przez 20 minut w temperaturze 37 °C w wytrząsarce orbitalnej z prędkością 50 obr./min.
  2. Po inkubacji pipetuj w górę i w dół do 10 razy lub 30 sekund, aż większość tkanki zostanie przerwana. Przefiltrować zawiesinę komórek przez sterylne sitko o wielkości 40 μm i przemyć 5 ml PBS uzupełnionego 5 mM EDTA.
    UWAGA: Nie zostanie osiągnięte całkowite trawienie macierzy zewnątrzkomórkowej i tkanki włóknistej. Jednak dłuższe czasy inkubacji w obecności kolagenazy i/lub dypazy lub agresywnego rozcierania nie są zalecane, ponieważ spowoduje to zwiększoną śmierć komórek i zniszczenie białek zewnątrzkomórkowych, wpływając na ogólny wynik analizy FACS.
  3. Odwirować przy 400 x g, 5 min, 4 °C.
    1. W celu analizy populacji komórek w BAL, odwirować komórki w temperaturze 400 x g, 5 minut, w temperaturze 4 °C i kontynuować do kroku 3.2.4.
    2. W celu analizy populacji komórek w węzłach chłonnych należy umieścić sitko o wielkości 70 μm na sterylnej szalce Petriego i umieścić węzły chłonne razem z 1 ml cRPMI w sitku. Wyjmij zanurzenie sterylnej strzykawki o pojemności 2 ml i użyj jej jako tłuczka do zmiażdżenia węzłów chłonnych o siatkę sitka. Przepłukać sitko komórkowe 1 ml świeżego cRPMI i przenieść komórki z szalki Petriego do sterylnej probówki.
  4. Pobrać reprezentatywną porcję każdej próbki i wybarwić ją błękitem trypanowym w celu określenia liczby żywotnych komórek.
  5. Ponownie zawiesić komórki w FACS-EDTA: PBS-5 mM EDTA-1% albumina surowicy bydlęcej- aby utworzyć zawiesinę 2x107 komórek/ml i dodać 50 μl do probówki cytometru.
  6. Przygotować mieszaninę przeciwciał 2X zawierającą odpowiednie kombinacje przeciwciał przeciwko markerom powierzchniowym i fluorochromom zgodnie z dostępnym instrumentem FACS. Dodać 50 μl mieszaniny przeciwciał 2X do każdej probówki zawierającej zawiesinę komórkową.
    UWAGA: Miareczkować każde przeciwciało znakowane fluorochromem w celu określenia optymalnej ilości, która ma być użyta, szczegółowy protokół znajduje się w odnośniku29.
  7. Inkubuj 30 minut na lodzie w ciemności.
  8. Przemyć jednokrotnie 3 ml FACS-EDTA i odwirować komórki przez odwirowanie przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4°C, zawiesić komórki w 200 μl tego samego buforu i przeanalizować w cytometrze przepływowym.
    UWAGA: W przypadku pracy z dużą liczbą próbek, opisany powyżej protokół barwienia do analizy FACS można przeprowadzić na 96-dołkowych płytkach z dnem w kształcie litery U zamiast w probówkach cytometru. Jednakże w przypadku stosowania płytek 96-dołkowych etapy mycia należy przeprowadzić, dodając do 200 μl FACS-EDTA i powtarzając to 4 razy, wirując komórki przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C między każdym etapem mycia.
  9. W tym momencie należy później utrwalić próbki do analizy w cytometrze przepływowym (do 72 godzin po utrwaleniu).
    1. Aby utrwalić komórki, po znakowaniu przeciwciałami FACS umyj komórki w PBS nr Ca2 + / Mg2 +, 1 mM EDTA bez FBS. Zawiesić komórki w 50 μl tego samego buforu i dodać 50 μl świeżo przygotowanego 4% roztworu paraformaldehydu w hipertonicznym (2X) PBS nr Ca2+/Mg2+.
    2. Inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej i przemyć 3 razy w FACS-EDTA.
    3. Ponownie zawiesić komórki w 200 μl FACS-EDTA i przechowywać w temperaturze 4 °C i chronić przed światłem do 72 godzin
      UWAGA: Fiksacja może mieć wpływ na FSC-SSC. W przypadku utrwalania próbek należy sprawdzić zgodność przeciwciał znakowanych fluorescencyjnie z producentem, ponieważ barwniki tandemowe mogą ulegać degradacji w obecności środków utrwalających. Jeśli próbki pochodzą od zakażonych zwierząt, zdecydowanie zaleca się fiksację w celu zapewnienia, że podczas analizy próbek w urządzeniu FACS nie będą obecne żadne żywe patogeny, ponieważ podczas pobierania próbki mogą powstawać mikroaerozole.

4. Całkowita ekstrakcja RNA, synteza cDNA i PCR w czasie rzeczywistym.

4.1) Ekstrakcja RNA i synteza cDNA.

  1. Homogenizować tkankę w wybranym roztworze konserwującym kwas nukleinowy przez mechaniczne rozerwanie (np. za pomocą homogenizatora wirnik-stojan, wytrząsającego o dużej prędkości tkanki i kulek itp.). Wirować przy 12 600 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia resztek tkanki. Przenieść supernatant do czystej probówki.
  2. Ekstrahować RNA wybraną metodą zgodnie z instrukcjami producenta.
    UWAGA: RNA jest bardzo podatne na degradację, jeśli nie ma być użyte od razu po izolacji, należy zrobić porcje i przechowywać je w probówkach wolnych od RNAzy w temperaturze -80 °C. Unikać wielokrotnego zamrażania i rozmrażania. Z rurkami należy zawsze obchodzić się w rękawiczkach. Po rozmrożeniu próbki należy zawsze przechowywać na lodzie.
  3. Zmierzyć absorbancję kwasów nukleinowych przy 260 nm i obliczyć stężenie w μg/μl.
  4. Przygotować mieszaninę DNAse-I przez dodanie (dla 1 próbki): 7,6 μl ultraczystej wody, 1 μl 10X buforu DNAse-I, 0,4 μl DNAse-I (stopień amplifikacji) 1 U/μl i dodać 8,4 μl mieszanki DNAse-I do każdej próbki zawierającej 1 μg całkowitego RNA.
    1. Użyć RNA w stężeniu 1 μg/μl i przeprowadzić reakcję retrotranskrypcji (RT-PCR), dodając 1 μl całkowitego RNA jako matrycę. Jeśli próbki są zbyt rozcieńczone, a stężenie jest niższe niż oczekiwano, dodaj większe objętości całkowitego RNA zamiast wody. Nie należy przekraczać 20% końcowej objętości reakcji podczas dodawania RNA, zwłaszcza jeśli wybrany protokół ekstrakcji RNA obejmował mieszaninę fenolu i chloroformu, ponieważ śladowe ilości fenolu mogą wpływać na wydajność RT-PCR.
  5. Inkubować 15 minut w temperaturze pokojowej, a następnie 10 minut w temperaturze 4 °C lub w lodzie. (Nie przekraczaj czasu inkubacji!!)
  6. Dodać 1 μl EDTA 25 mM (klasa biologii molekularnej) do każdej probówki i inkubować w temperaturze 65 °C przez 10 minut w celu inaktywacji DNAse-I.
  7. Przygotuj mieszaninę retrotranskrypcji (RT) w następujący sposób (dla 1 reakcji): 1 μl losowych starterów heksamerowych 0,2 mg / ml, 1 μl dNTP zapas 10 mM, 4 μl 5 M-MLV-RT, 2 μl DTT 0,1 M, 1 μl RNAse OUT stock 40 U/μl i 1 μl zapas retrotranskryptazy M-MLV 200 U/μl.
  8. Dodać 10 μl mieszaniny RT-PCR do probówki reakcyjnej 10 μl DNAse-I.
  9. Przeprowadzić reakcję PCR w termocyklerze zgodnie z następującym programem:
    1X cykl: 10 min, 25 °C; 50 min, 37 °C; 15 min, 70 °C
  10. Rozcieńczyć cDNA w stosunku 1:5, dodając 80 μl ultraczystej wody. Przechowywać w temperaturze -20 °C.

4.2) PCR w czasie rzeczywistym (qPCR).

  1. Przygotować mieszaninę reakcyjną qPCR w następujący sposób (dla 1 reakcji): 5 μl mieszaniny głównej zawierającej polimerazę DNA Taq, zielony barwnik SYBR, bufor PCR, mieszaninę dNTP i MgCl2 (patrz 4.2.2 poniżej); 0,9 μl 10 μM roztworu podstawowego startera do przodu, 0,9 μl 10 μM roztworu podstawowego startera odwrotnego, 1,2 μl ultraczystej wody i 2 μl matrycy cDNA uprzednio rozcieńczone, jak wskazano w kroku 4.1.10.
    UWAGA: Stężenie odczynnika i protokoły cykliczne stosowane w tej sekcji zostały zoptymalizowane pod kątem przeprowadzania specjalnie z odczynnikami i przyrządami opisanymi w "Tabeli materiałów i odczynników", można używać innych marek, ale objętości reakcji, stężenie odczynnika i protokół cykliczny mogą się różnić. Przed wykonaniem RT-qPCR należy zapoznać się z instrukcjami producenta.
  2. Skonfiguruj urządzenie qPCR w następujący sposób:
    1X cykl: 15 min, 95 °C
    Cykle 40X: 15 sek., 95 °C, a następnie 1 min, 60 °C (w tym momencie uzyskuje się fluorescencję).
    UWAGA: Do względnej kwantyfikacji mRNA zgodnie z metodą Ct30 należy wybrać gen referencyjny do normalizacji wartości Ct. Wybrany gen referencyjny powinien być badany w określonych warunkach testu, ponieważ jego ekspresja może się różnić; Actb, Gapdh lub 18S to tylko niektóre z genów zwykle wybieranych jako odniesienia.
  3. Skonfiguruj wartość progową i przeanalizuj dane.

Wyniki

Immunoterapię podjęzykową można z sukcesem wykorzystać do modulowania odpowiedzi immunologicznej płuc. Wykazaliśmy, że pojedyncza dawka flagelliny, agonisty TLR5 i NLRC4, może indukować znaczący wzrost poziomu mRNA kodującego chemokiny CXCL1, CCL20 oraz cytokinę IL-6 w porównaniu z kontrolami traktowanymi solą fizjologiczną. Krotność indukcji poziomów mRNA osiągnęła szczyt 8 h po SLIT i powróciła do poziomów podstawowych po 20 hr (Rycina 1). Jednakże, gdy SLIT przeprowadzono 2 hr przed infekcją donosową S. pneumoniae, poziomy mRNA Cxcl1 i Il6 pozostawały znacząco podwyższone nawet 24 hr po SLIT w porównaniu z zwierzętami nieleczonymi (Rycina 2).

Analiza populacji komórek w BAL i tkance płucnej za pomocą FACS wykazała, że u zwierząt leczonych FliC podawanym drogą podjęzykową zwiększona była liczba neutrofili w drogach oddechowych, ale nie w tkance płuc (Rycina 3).

Na koniec porównano przeżywalność po ekspozycji na pneumokoki u zwierząt, którym wcześniej podano FliC drogą podjęzykową, oraz w grupie kontrolnej otrzymującej sól fizjologiczną. Jak pokazano na Rysunku 4, podjęzykowa immunoterapia swoista (SLIT) z użyciem flagelliny zwiększyła ochronę oraz przeżywalność w przebiegu ostrego pneumokokowego zapalenia płuc.

figure-results-1
Rycina 1. Kinetyka profilu transkrypcyjnego płuc po podjęzykownej immunoterapii flagelliną. Myszy BALB/c w wieku od 8 do 10 tygodni (n=4) poddano leczeniu 10 µg flagelliny lub solą fizjologiczną drogą podjęzykową w znieczuleniu. Płuca pobrano w różnych punktach czasowych i umieszczono w konserwancie do kwasów nukleinowych. Przeprowadzono ekstrakcję całkowitego RNA i zsyntetyzowano cDNA. Poziomy mRNA oceniono za pomocą RT-PCR z wykorzystaniem specyficznych starterów wymienionych w Tabeli 1. Kwantyfikację względną wykonano metodą ΔCt, wykorzystując poziomy mRNA Actb do normalizacji. Wyniki przedstawiono jako krotność wzrostu w porównaniu z grupą leczoną solą fizjologiczną jako mediana±SEM. Gwiazdki oznaczają różnice statystycznie istotne (p < 0.05) obliczone zgodnie z testem Mann-Whitneya. Wyniki są reprezentatywne dla 2 niezależnych eksperymentów.

figure-results-2
Rycina 2. Profil transkrypcyjny płuc podczas zapalenia płuc wywołanego przez pneumokoki po podjęzykowej immunoterapii flagelliną. Myszy BALB/c w wieku od 8 do 10 tygodni (n=4 dla grupy kontrolnej i n=7 dla grupy leczonej) otrzymywały 10 µg flagelliny lub soli fizjologicznej drogą podjęzykową w znieczuleniu. 2 hr później myszy zostały poddane ekspozycji drogą donosową na minimalną dawkę śmiertelną (MLD), powodującą 100% śmiertelność, izolat kliniczny S. pneumoniae serotypu 1 E1585, odpowiadający 4x105 CFU/50 µl. Płuca pobrano 24 hr po ekspozycji i przechowywano w konserwancie do kwasów nukleinowych do czasu przeprowadzenia ekstrakcji RNA i syntezy cDNA. Wykonano PCR w czasie rzeczywistym (zob. lista starterów w Tabeli 1), a kwantyfikację względną przeprowadzono zgodnie z metodą ΔCt, wykorzystując poziomy mRNA Actb do normalizacji. Wyniki przedstawiono jako krotność wzrostu w porównaniu z grupą leczoną solą fizjologiczną jako mediana±SEM. Gwiazdki oznaczają różnice istotne statystycznie (p < 0.05) obliczone zgodnie z testem Mann-Whitneya.

figure-results-3
Rysunek 3. Analiza rekrutacji neutrofili polimorfojądrowych (PMN) do tkanki płuc i dróg oddechowych po SLIT. Myszy BALB/c w wieku od 8 do 10 tygodni (n=4) poddano podjęzykownej aplikacji 10 µg flagelliny lub soli fizjologicznej w znieczuleniu. Po 2 hr myszy poddano wyzwaniu drogą donosową przy użyciu MLD S. pneumoniae serotypu 1 E1585. 24 hr po wyzwaniu przeprowadzono BAL, a płuca przygotowano do analizy FACS. PMN zidentyfikowano jako komórki Ly6Ghigh/CD11bhigh/CD11cnegative oraz na podstawie profilu FCS-SSC. Wyniki przedstawiono jako procent PMN w stosunku do całkowitej liczby komórek w BAL lub płucach. Słupki reprezentują medianę±SEM. Gwiazdki oznaczają różnice istotne statystycznie (p < 0.05) obliczone zgodnie z jednoczynnikowym testem Manna-Whitneya.

figure-results-4
Rycina 4. SLIT z użyciem flagelliny chroni myszy przed ostrą pneumokokowym zapaleniem płuc. Myszy BALB/c w wieku od 8 do 10 tygodni (n = 8) poddano leczeniu podjęzykowemu z zastosowaniem 10 µg flagelliny lub soli fizjologicznej w znieczuleniu. Po 2 h myszy zainfekowano donosowo dawką MLD S. pneumoniae serotypu 1 E1585. Przeżywalność oceniano codziennie. Krzywe Kaplana-Meiera porównano za pomocą testu Log-rank (Mantel-Cox). Gwiazdki oznaczają różnice istotne statystycznie (p < 0.05). Wyniki są reprezentatywne dla 2 niezależnych eksperymentów.

NazwaSekwencja 5’-3’Długość produktu PCR (bp)
mB-actin_FGCTTCTTTGCAGCTCCTTCGT68
mB-actin_RCGTCATCCATGGCGAACTG
mCCL20_FTTTTGGGATGGAATTGGACAC69
mCCL20_RTGCAGGTGAAGCCTTCAACC
mCXCL1_FCTTGGTTCAGAAAATTGTCCAAAA84
mCXCL1_RACGGTGCCATCAGAGCAGTCT
mIL-6_FGTTCTCTGGGAAATCGTGGAAA78
mIL-6_RAAGTGCATCATCGTTGTTCATACA
mTNFalpha_FCATCTTCTCAAAATTCGAGTGACAA63
mTNFalpha_RCCTCCACTTGGTGGTTTGCT
mCxcl2_FCCCTCAACGGAAGAACCAAA72
mCxcl2_RCACATCAGGTACGATCCAGGC

Tabela 1. Lista starterów użytych do analizy real-time PCR. Specyficzne sekwencje starterów użyte do analizy qPCR. Startery forward i reverse dla mysich genów actb, Cccl20, Cxcl1, Il6, Tnfa oraz Cxcl1 przedstawiono jako sekwencje 5’-3’, a oczekiwana długość produktu została podana w parach zasad (bp).

Dyskusja

Udowodniono, że podjęzykowe podawanie środków terapeutycznych jest użytecznym sposobem modulowania odpowiedzi immunologicznej w drogach oddechowych. Główną zaletą SLIT w leczeniu chorób układu oddechowego jest to, że nie wiąże się z bezpośrednim dostarczaniem związków do płuc lub nozdrzy, dzięki czemu jest bezpieczniejszy niż leczenie oparte na podawaniu donosowym31.

Immunoterapia podjęzykowa może być stosowana do modulowania odpowiedzi immunologicznej na różne sposoby, albo w celu indukcji odpowiedzi regulatorowych, które mogą złagodzić objawy alergicznego zapalenia i astmy32 , albo w celu wywołania przejściowej aktywacji wrodzonych mechanizmów odpornościowych w leczeniu ostrych infekcji płuc, jak pokazano tutaj.

Model myszy przedstawiony w tym filmie jest wygodną metodą badań przesiewowych różnych związków jako środków terapeutycznych dla SLIT.

Ten model zwierzęcy stanowi użyteczny sposób określania wpływu SLIT na odpowiedź immunologiczną płuc, a także na inne narządy (np. drenujące węzły chłonne lub dystalne miejsca błony śluzowej), których nie można naśladować za pomocą modeli in vitro . Chociaż istnieje kilka prac, które opisują wyniki uzyskane przy użyciu immunoterapii podjęzykowej, szczegółowe metody postępowania w zakresie podawania podjęzykowego nie zostały jeszcze udostępnione. Ponadto model może być wykorzystany do oceny szczepionek podjęzykowych mających na celu zapewnienie ogólnoustrojowej i miejscowej ochrony dróg oddechowych.

Jak pokazano na załączonym filmie, podjęzykowe podawanie związków jest prostą procedurą, którą można łatwo wykonać bez konieczności intensywnego szkolenia. Zazwyczaj osoba biegła w obchodzeniu się ze zwierzętami będzie potrzebować 1 godziny na wykonanie SLIT w grupie 10 myszy przy użyciu środków znieczulających do wstrzykiwań, jak opisano w tym protokole. Jeśli wykonywana jest również prowokacja pneumokokowa, potrzeba dodatkowych 90 minut na przygotowanie zawiesiny bakteryjnej i przeprowadzenie prowokacji donosowej zwierząt.

Przedstawione tu protokoły FACS pozwalają na wygodną charakterystykę wpływu SLIT na lokalne miejsce podania, drenaż węzłów chłonnych, a także ich wpływ na dynamikę komórek płuc.

Oddzielna analiza treści oskrzelowo-pęcherzykowej i miąższu płuc jest ważna dla odróżnienia typów komórek immunologicznych rezydujących i naciekających drogi oddechowe od tych, które pozostają w tkance. Analiza zawartości BAL pozwala na badanie obrotu makrofagów pęcherzykowych, a także dynamiki rekrutacji komórek do przestrzeni pęcherzykowych indukowanej różnymi zabiegami, np. PMN, eozynofilami, monocytami. BAL może być również stosowany do oceny obecności wydzielanych cytokin i chemokin za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA) lub wykrywania wydzielanych przeciwciał IgA wywołanych po szczepieniu podjęzykowym. Badania tkanki płuc pozwolą na scharakteryzowanie innych typów komórek, klasycznie komórek dendrytycznych, limfocytów T i limfocytów B.

Przygotowanie próbek BAL i węzłów chłonnych do analizy FACS jest proste. Po pobraniu próbki zwykle potrzeba 60 minut, aby wypełnić protokół barwienia dla 10-20 próbek. Natomiast izolacja komórek z płuc lub tkanki podjęzykowej będzie wymagała więcej czasu, ponieważ wymagane jest trawienie macierzy zewnątrzkomórkowej. Wchłanianie środka terapeutycznego dostarczanego drogą podjęzykową można rozwiązać poprzez śledzenie cząsteczek znakowanych fluorescencyjnie lub radioaktywnie za pomocą systemów obrazowania in vivo .

Immunoterapia podjęzykowa jest atrakcyjną metodą skutecznego wywoływania odpowiedzi immunologicznej w drogach oddechowych, a także ogólnoustrojowo, która może być stosowana w leczeniu lub zapobieganiu chorobom układu oddechowego. Wyjaśnienie mechanizmów determinujących aktywację i tolerancję odpowiedzi immunologicznej w drogach oddechowych po SLIT ma kluczowe znaczenie dla racjonalnego projektowania nowych strategii terapeutycznych, które mogłyby być stosowane samodzielnie lub w połączeniu z dostępnymi terapiami przeciwko różnym chorobom układu oddechowego.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Dr. Jean-Claude Sirardowi z Centrum Infekcji i Odporności w Lille, Instytutu Pasteura de Lille-Francja, za uprzejme dostarczenie oczyszczonej flageliny oraz dr Teresie Camou, Dyrektorowi Narodowego Laboratorium Referencyjnego, Ministerstwo Zdrowia Urugwaju za uprzejme dostarczenie szczepu pneumokoków.

Autorzy chcieliby wyrazić swoje podziękowania dla Pana Diego Acosty i Pana Ignacio Turela z BichoFeo Producciones-Urugwaj za ich zaangażowanie i ciężką pracę podczas całej produkcji i edycji filmu.

Ta praca była wspierana przez granty PR_FCE_2009_1_2783 i BE_POS_2010_1_2544 z Narodowej Agencji Badań i Innowacji, ANII z Urugwaju, Programu Rozwoju Nauk Podstawowych, PEDECIBA Urugwaju oraz Sektorowej Komisji Badań Naukowych, CSIC-Universidad de la República, Urugwaj.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Roztwór ketaminy (50 mg/ml)Pharma Service, Urugwaj
Roztwór Xilacine (2%)Portinco S.A., Urugwaj
Sterylna strzykawka 1 mlModern, Urugwaj
Sterylna igła 27 GNowoczesna, Urugwaj
RPMI 1640General Electric Health CareE15885
Surowica bydlęca płoduATCC302020
Roztwór penicyliny/streptomycynySIGMAP4333
Sterylny PBS bez Ca2+/Mg2+PAAH21002
Type-I CollagenaseLife Technologies/Gibco17100017
Deoksyrybonukleaza I (DNAse-I)SIGMAD4513
DispazaLife Technologies/Gibco17105041
PerCP-Cy5.5 sprzężony szczur anty mysz IgG2b anty CD11b550993Clone M1/70
APC sprzężony chomik anty mysz IgG1 anty CD11cBD550261Klon HL3 
APC-Cy7 sprzężony szczur anty mysi IgG2a anty Ly6GBD560600Klon 1A8
Sterylny roztwór solifizjologicznej Laboratorio Farmaco Urugwaj, Urugwaj
Tryptyczny agar sojowyBD Difco, Francja236950
Defibrynowana krew owczaBiokey, Urugwaj
Sterylne szalki PetriegoGreiner633180
p10 PipetaGilsonF144802
p20 PipetaEppendorf3120000097
p200 PipetaGilsonF123601
p200 PipetaCappC200
p200 PipetaEppendorf3120000054
p1000 PipetaEppendorf3120000062
sterylne końcówki filtrujące p10Greiner771288
Sterylne końcówki filtrujące p200Greiner739288
Sterylne końcówki filtrujące p1000Greiner750288
VortexBIOSANV1-plus
Szczypce z cienką końcówką ze stali nierdzewnej SIGMAZ168785/Z168777Zakrzywione i proste
Kleszczyki do tkanek opatrunkowychSIGMAF4392Długość 8 cali
Kleszcze do mikropreparacjiSIGMAF4017Proste 
Kleszczyki mikropreparacyjneSIGMAF4142 zakrzywiony
Nożyczki majonezoweSIGMAZ265993 
SkalpelSAKIRA MEDICAL
Sterylny dziurkacz do biopsji i Oslash; 3mmStiefel Laboratories Ltd.2079DŚrednica 5 mm może być również używana
Sterylne probówki 1,5 mlDeltalab200400P
Sterylne 15 ml ProbówkiGreiner188271
Sterylne 50 ml ProbówkiGreiner227261
Sterylne pipety serologiczne 5 mlGreiner606160
Sterylne pipety serologiczne 10 mlGreiner607160
Sterylne pipety serologiczne 25 mlGreiner760180
Szafa bezpieczeństwa biologicznego, klasa IIThermo Scientificseria 1300, typ A2
Mikroizolator  StojakRAIR  IsoSystem 76144WSuper  Mysz  1800 Strefa AllerZone 
Mikrowirówka z chłodzeniemMikrowirówka EppendorfLegend Micro 21R
HeraeusBiofuge-pico
TermoScientificSorval ST40R
Inkubator CO2 Model Thermo Scientific  3111
Sterylne Pipety Pasteura z cienką końcówkąDeltalabD210022
Sterylne pipety PasteuraDeltalab200007
Sterylna płytka 24-dołkowaGreiner662160
Roztwór błękitu trypanowego Life TechnologiesT10282
Automatyczny licznik komórek - CountessLife TechnologiesC10227 
Szkiełka komory do liczenia komórek CountessTechnologiesC10312
Probówki do cytometrii przepływowejBD343675
Cytometr przepływowy - FACS Canto-IIBD
Instrument do PCR w czasie rzeczywistym - Rotor Gene Q lub ABI 7900Qiagen / Applied Biosystems
Trizol ReagentLife Technologies15596-026Molekularny Biologia klasy
DNAse-ILife Technologies18068-015Biologia molekularna klasy
DNAse-I Bufor 10XLife Technologies18068015Biologia molekularna Klasa
EDTA 25 mMLife Technologies18068015Biologia molekularna klasy
Ultra-Pure WaterTechnologies10977Biologia molekularna klasy
RNAse OutLife Technologies100000840Biologia molekularna
Klasyfikacja Losowe startery heksameroweLife TechnologiesN8080127Biologia molekularna Klasa
M-MLV-RT buforLife Technologies18057-018Biologia molekularna Klasa
M-MLV-RT enzimeLife Technologies28025-021Biologia molekularna Grade
QuantiTect Syber Green PCR KitQiagen204143Podstawy specyficzne dla klasy z biologii molekularnej
 TechnologieBiologia molekularna Klasa
Wirówka Life Life życiowe

Bibliografia

  1. Pneumococcal vaccines WHO position paper--2012. Weekly Epidemiological Record. 14, 129-144 (2012).
  2. Pneumonia - Facts Sheet N°331. , WHO. Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs331/en (2013).
  3. Appelbaum, P. C., et al. Carriage of antibiotic-resistant Streptococcus pneumoniae by children in eastern and central Europe-a multicenter study with use of standardized methods. Clin Infect Dis. 23, 712-717 (1996).
  4. Ramirez, J. A., Anzueto, A. R. Changing needs of community-acquired pneumonia. J Antimicrob Chemother. 66, 3-9 (2011).
  5. Cuburu, N., et al. Sublingual immunization induces broad-based systemic and mucosal immune responses in mice. Vaccine. 25, 8598-8610 (2007).
  6. Pedersen, G. K., et al. Evaluation of the sublingual route for administration of influenza H5N1 virosomes in combination with the bacterial second messenger c-di-GMP. PLoS One. 25, 1-12 (2011).
  7. Song, J. H., et al. Sublingual vaccination with influenza virus protects mice against lethal viral infection. Proc Natl Acad Sci USA. 105, 1644-1649 (2008).
  8. Cogo, R., Ramponi, A., Scivoletto, G., Rippoli, R. Prophylaxis for acute exacerbations of chronic bronchitis using an antibacterial sublingual vaccine obtained through mechanical lysis: a clinical and pharmacoeconomic study. Acta Biomed. 74, 76-87 (2003).
  9. Rosaschino, F., Cattaneo, L. Strategies for optimizing compliance of paediatric patients for seasonal antibacterial vaccination with sublingually administered Polyvalent Mechanical Bacterial Lysates (PMBL). Acta Biomed. 75, 171-178 (2004).
  10. Senna, G., Caminati, M., Canonica, G. W. Safety and tolerability of sublingual immunotherapy in clinical trials and real life. Curr Opin Allergy Clin Immunol. 13, 656-662 (2013).
  11. Mascarell, L., et al. Oral dendritic cells mediate antigen-specific tolerance by stimulating TH1 and regulatory CD4+ T cells. J Allergy Clin Immunol. 122, 603-609 (2008).
  12. Mascarell, L., et al. Mapping of the lingual immune system reveals the presence of both regulatory and effector CD4+ T cells. Clin Exp Allergy. 39, 1910-1919 (2009).
  13. Mascarell, L., et al. Oral macrophage-like cells play a key role in tolerance induction following sublingual immunotherapy of asthmatic mice. Mucosal Immunology. 4, 638-647 (2011).
  14. Hervouet, C., et al. Antigen-bearing dendritic cells from the sublingual mucosa recirculate to distant systemic lymphoid organs to prime mucosal CD8 T cells. Mucosal Immunology. 7, 280-291 (2014).
  15. Munoz, N., et al. Mucosal administration of flagellin protects mice from Streptococcus pneumoniae lung infection. Infect Immun. 78, 4226-4233 (2010).
  16. Hayashi, F., et al. The innate immune response to bacterial flagellin is mediated by Toll-like receptor 5. Nature. 410, 1099-1103 (2001).
  17. Lightfield, K. L., et al. Critical function for Naip5 in inflammasome activation by a conserved carboxy-terminal domain of flagellin. Nature Immunology. 9, 1171-1178 (2008).
  18. Lightfield, K. L., et al. Differential requirements for NAIP5 in activation of the NLRC4 inflammasome. Infect Immun. 79, 1606-1614 (2011).
  19. Honko, A. N., Mizel, S. B. Mucosal administration of flagellin induces innate immunity in the mouse lung. Infect Immun. 72, 6676-6679 (2004).
  20. Janot, L., et al. Radioresistant cells expressing TLR5 control the respiratory epithelium's innate immune responses to flagellin. Eur J Immunol. 39 (6), 1587-1596 (2009).
  21. Van Maele, L., et al. TLR5 signaling stimulates the innate production of IL-17 and IL-22 by CD3(neg)CD127+ immune cells in spleen and mucosa. J Immunol. 185, 1177-1185 (2010).
  22. Lee, S. J., et al. Neurologic adverse events following influenza A (H1N1) vaccinations in children. Pediatrics international: official journal of the Japan Pediatric Society. 54, 325-330 (2012).
  23. Lewis, D. J., et al. Transient facial nerve paralysis (Bell's palsy) following intranasal delivery of a genetically detoxified mutant of Escherichia coli heat labile toxin. PLoS One. 4, e6999(2009).
  24. Mutsch, M., et al. Use of the inactivated intranasal influenza vaccine and the risk of Bell's palsy in Switzerland. N Engl J Med. 350, 896-903 (2004).
  25. Kuo, C. H., Wang, W. L., Chu, Y. T., Lee, M. S., Hung, C. H. Sublingual immunotherapy in children: an updated review. Pediatr Neonatol. 50, 44-49 (2009).
  26. Nempont, C., Cavet, D., Rumbo, M., Bompard, C., Villeret, V., Sirard, J. C. Deletion of flagellin's hypervariable region abrogates antibody-mediated neutralization and systemic activation of TLR5-dependent immunity. J. Immunol. 181, 2036-2043 (2008).
  27. Pathogen Regulation Directorate, Public Health Agency of Canada . Streptococcus pneumoniae: Pathogen Safety Data Sheet - Infectious Substances. , Available from: http://www.phac-aspc.gc.ca/lab-bio/res/psds-ftss/streptococcus-pneumoniae-eng.php (2011).
  28. Marques, J. M., et al. Protection against Streptococcus pneumoniae serotype 1 acute infection shows a signature of Th17- and IFN-gamma-mediated immunity. Immunobiology. 217, 420-429 (2012).
  29. Stewart, C. C., Stewart, S. J., et al. Titering antibodies. Current Protocols in Cytometry. 4, Unit 4.1(2001).
  30. Kubista, M., et al. The real-time polymerase chain reaction. Molecular Aspects of Medicine. 27, 95-125 (2006).
  31. Pedersen, G., Cox, R. The mucosal vaccine quandary: intranasal vs. sublingual immunization against influenza. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 8, 689-693 (2012).
  32. Vitaliti, G., et al. Mucosal immunity and sublingual immunotherapy in respiratory disorders. Journal of Biological Regulators and Homeostatic Agents. 26, S85-S93 (2012).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Zapalenie p uc wywo ane przez pneumokokimodel mysicytometria przep ywowap ukanie oskrzelowo p cherzykowezawiesina pojedynczych kom rekStreptococcus pneumoniaeagoni ci TLRodpowied immunologicznaizolacja w z w ch onnych
Immunoterapia podjęzykowa jako alternatywa dla indukowania ochrony przed ostrymi infekcjami dróg oddechowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.