Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wstrzyknięcia dożylne u nowonarodzonych myszy

61.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52037

⸱

11 listopada 2014

 ,  , 
1Department of Neuroscience, Ohio State University, 2Center for Gene Therapy, Nationwide Children's Hospital Research Institute, Ohio State University

W tym artykule

Podsumowanie

Zwierzęce modele chorób dziecięcych mogą doświadczyć wczesnego początku i agresywnego postępu choroby. Klinicznie istotne podanie terapii młodym modelom myszy może być technicznie trudne. Protokół ten opisuje nieinwazyjną metodę wstrzykiwań dożylnych dla nowonarodzonych myszy w ciągu pierwszych dwóch dni życia po urodzeniu.

Streszczenie

Wstrzyknięcie dożylne jest klinicznie stosowanym sposobem dostarczania leków. W przypadku dorosłych gryzoni i większych zwierząt wstrzyknięcia dożylne są technicznie wykonalne i rutynowe. Jednak niektóre modele mysie mogą mieć wczesny początek choroby z szybkim postępem, który utrudnia podawanie potencjalnych terapii. Żyła skroniowa (lub twarzowa) znajduje się tuż przed zatyczką uszną u myszy i jest wyraźnie widoczna przez pierwsze dwa dni po urodzeniu po obu stronach głowy przy użyciu mikroskopu preparacyjnego. W tym oknie można wstrzyknąć do żyły skroniowej objętość do 50 μl. Iniekcja jest bezpieczna i dobrze tolerowana zarówno przez młode, jak i matki. Typowa procedura iniekcji jest wykonywana w ciągu 1-2 minut, po czym szczenię wraca do klatki domowej. W trzeciej dobie po porodzie żyła jest trudna do uwidocznienia, a procedura iniekcji staje się technicznie zawodna. Technika ta została wykorzystana do dostarczania wektorów wirusa związanego z adenowirusem (AAV), które z kolei mogą zapewnić prawie całą cielesną, stabilną ekspresję transgenu przez całe życie zwierzęcia, w zależności od wybranego serotypu wirusa.

Wprowadzenie

Dostarczanie leków do ośrodkowego układu nerwowego (OUN) w mysich modelach chorób dziecięcych pozostaje wyzwaniem. Myszy, które modelują stany chorobowe noworodka, są niewymiarowe i niedojrzałe rozwojowo, a zatem mogą być trudne do bezpośredniego wstrzyknięcia w odpowiednie struktury w obrębie OUN. Donaczyniowe wstrzykiwanie środków leczniczych jest nieinwazyjną, dobrze tolerowaną metodą dostarczania komórek, leków lub wektorów wirusowych do całego organizmu, w tym do OUN1-5 i siatkówki3,5-9. Poprzednie publikacje opisywały iniekcję żyły skroniowej twarzy przy użyciu transiluminatora10,11, bez mikroskopu preparacyjnego11,12 lub wymagającą wstrzyknięcia10 przez dwie osoby. Technika wstrzykiwania opisana w tym protokole jest korzystna, ponieważ jedna osoba może wstrzykiwać młode, a źródło światła do oglądania żyły skroniowej nie dotyka szczeniaka, eliminując potrzebę stosowania taśmy chirurgicznej lub mocowania szczeniaka do stałej powierzchni, takiej jak transiluminator11. Dostarczenie wektora wirusowego związanego z adenowirusem serotypu 9 (AAV9) u myszy powoduje silną ekspresję w neuronach i astrocytach w całym mózgu i rdzeniu kręgowym (ryc. 1). Donaczyniowe dostarczanie wektorów wirusowych do powierzchownej żyły skroniowej twarzy było niezawodnie stosowane w różnych badaniach na nowonarodzonych myszach w leczeniu dziecięcego zaburzenia nerwowo-mięśniowego rdzeniowego zaniku mięśni (SMA)2,4,13,14 i ostatecznie wydłużyło życie leczonych myszy.

Wewnątrznaczyniowe wstrzyknięcie noworodkom myszy również skutecznie celuje w obwodowy układ nerwowy i narządy obwodowe (Rysunek 2). Po wstrzyknięciu AAV obserwowano transdukcję zwojów korzenia grzbietowego, wątroby, serca, mięśni szkieletowych, płuc i splotu mięśniowo-jelitowego1,3,6,7,15. Rozległa transdukcja OUN i obwodów sprawia, że ta metoda iniekcji jest idealna w chorobach wymagających globalnej ekspresji transgenu, takich jak choroba Gauchera16 i inne lizosomalne choroby spichrzeniowe17,18, choroba Battena i związane z nią neuronalne lipofuscynozy ceroidowe,19 oraz zespół Bardeta-Biedla - genetyczne zaburzenie wieloukładowe, którego objawy występują we wczesnym dzieciństwie20. Wstrzyknięcie donaczyniowe noworodkom myszy powinno być również uważane za nową metodę modelowania ogólnosystemowych chorób dziecięcych. Technika ta została przełożona na większe modele zwierzęce5,21, a wstrzyknięcie donaczyniowe już istnieje jako klinicznie akceptowalna metoda dostarczania leków.

Obecny protokół opisuje prostą, efektywną metodę dostarczania środków do noworodków myszy przez powierzchowną żyłę skroniową twarzy nie później niż w 2. dniu po urodzeniu. Wstrzyknięcie może być wykonane przez pojedynczego, doświadczonego osobnika i jest dobrze tolerowane zarówno przez młode, jak i matki. Szczenięta odczuwają minimalny stres i szybko wracają do zdrowia. Co ważne, udane wstrzyknięcie będzie skutkowało globalnym dostarczeniem podawanego środka. Protokół ten jest odpowiedni do dostarczania wektorów wirusowych, środków farmaceutycznych lub komórek nowonarodzonym myszom.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury wymienione w protokole zostały zatwierdzone przez Komitet Instytutu Użytkowania i Opieki nad Zwierzętami (IACUC) Uniwersytetu Stanowego Ohio.

1. Przygotowanie przestrzeni roboczej

  1. Zebrać mokry lód w celu znieczulenia młodych myszy, pustą klatkę w celu oddzielenia matki od ściółki, mikroskop preparacyjny, źródło światła, które można ustawić pod kątem do wstrzyknięcia (użycie źródła światła pod kątem 90° do miejsca wstrzyknięcia zasłania żyłę), czystą powierzchnię do umieszczenia zwierzęcia do wstrzyknięcia, bawełniane waciki, strzykawka insulinowa 3/10 cc z igłą 3/8" 30 G (jedna na zwierzę) i 1% roztworem Evans Blue Dye (wykonanym z roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS)) do treningu.
  2. Usuń zaporę do osobnej klatki podczas manipulowania szczeniętami.

2. Procedura iniekcji

  1. Umieść pojedynczego szczeniaka bezpośrednio na mokrym lodzie na 30-60 sekund, aby znieczulić zwierzę. Nie pozostawiaj zwierzęcia na lodzie zbyt długo ze względu na ryzyko powikłań związanych z hipotermią, w tym migotania komór, niedotlenienia tkanek i kwasicy metabolicznej.
    UWAGA: Z naszego doświadczenia wynika, że 30-60 sekund wystarczy, aby spowolnić ruchy szczeniaka i umożliwić wstrzyknięcie. Jeśli wymagane jest głębsze znieczulenie, odpowiednie mogą być leki wziewne, takie jak 1-2% izofluran.
  2. Gdy zwierzę znajduje się na lodzie, naładuj strzykawkę 30 μl niebieskiego barwnika Evans
    3. .
  3. Gdy zwierzę jest w pełni znieczulone, co potwierdza brak ruchu na lodzie podczas oddychania, przesuń je pod mikroskopem. W przypadku wstrzyknięcia praworęcznego należy skierować pysk zwierzęcia w prawo. Umieść lewy palec wskazujący na pysku, a lewy środkowy palec ogonowy na słuchawce dousznej, tak aby słuchawka znajdowała się między palcem wskazującym i środkowym (ryc. 1).
  4. Zbadaj tuż przed zatyczką uszną pod kątem powierzchownej naczynia włosowatego, która porusza się, gdy manipuluje się skórą. Ta kapilara NIE jest celem, jednak identyfikacja jest ważna dla identyfikacji żyły skroniowej. Następnie zlokalizuj ciemną, zacienioną żyłę poniżej naczynia włosowatego, która pozostaje nieruchoma niezależnie od ułożenia skóry. Żyła skroniowa wydaje się zacieniona, biegnie od grzbietu do brzusznej i zasila żyłę szyjną (ryc. 1).
  5. Wejdź do żyły skroniowej z igłą skośną do góry. Jeśli zostanie prawidłowo włożony, możliwe jest zobaczenie wypełnienia skosu igły krwią przez skórę. Następnie powoli wciśnij tłok i zwróć uwagę na blanszowanie żyły po boku twarzy.
  6. Pozwól, aby igła pozostała w żyle przez dodatkowe 10-15 sekund, aby zapobiec cofaniu się wstrzykiwanego środka.

3. Po wstrzyknięciu

  1. Po prawidłowym wstrzyknięciu szczenię powinno niemal natychmiast zmienić kolor na niebieski. Wyjąć igłę i delikatną siłą przyłożyć bawełniany wacik do miejsca wstrzyknięcia, aż krew zakrzepnie.
  2. Monitoruj szczeniaka pod kątem oznak niepokoju. Pozwól szczeniakowi na 2-3 minuty na regenerację i ponowne rozgrzanie, rozpoznaj, kiedy szczenię jest przytomne, wyprostowane i porusza się, zanim wróci do klatki. Umieść szczenięta w dłoniach badacza w rękawiczkach, aby zapewnić odpowiednie ciepło, które w razie potrzeby pomoże w powrocie do zdrowia. Alternatywnie, umieść poduszkę grzewczą pod klatką domową, aby ułatwić ogrzanie wstrzykniętego szczeniaka. Ogólnie rzecz biorąc, po wstrzyknięciu niebieskiego barwnika Evansa, należy poddać szczenięta eutanazji. Nie należy dodawać barwnika podczas wstrzykiwania badanego materiału.
  3. Umieść szczenię z powrotem w klatce domowej i upewnij się, że szczenię jest pokryte ściółką i/lub gniazdem, aby zapewnić ponowną akceptację przez matkę.
  4. Użyj nowej strzykawki i bawełnianego wacika dla każdego szczeniaka, aby zachować sterylność.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Podczas prawidłowej iniekcji żyła powinna na chwilę stać się przeźroczysta lub zblednąć. W przypadku wstrzykiwania barwnika całe szczenię powinno w ciągu kilku sekund stać się niebieskie. Jeśli doszło do nieprawidłowej iniekcji, często w okolicy głowy lub szyi pojawia się skoncentrowany bolus podskórny, a wstrzykiwana substancja może wyciekać z miejsca wkłucia. Nieprawidłowe iniekcje mogą również prowadzić do powstania siniaków wokół gardła. Szczenięta, które otrzymały zastrzyki podskórne (i.e. iniekcja nie zost...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Wewnątrznaczyniowe dostarczanie środków do OUN lub w całym ciele jest trudne w mysich modelach choroby u noworodków. Opisany protokół jest szybkim, stosunkowo nieinwazyjnym sposobem dożylnego podawania roztworów noworodkom myszy przy minimalnych wymaganiach sprzętowych. Chociaż żyła skroniowa twarzy może być oglądana gołym okiem, zastrzyki mogą mieć większą dokładność przy użyciu mikroskopu i światłowodowego źródła światła, szczególnie w przypadku niewprawnego wstrzykiwacza. Wstrzyknięcia donaczyniowe u nowonarodzonych m...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy pragną podziękować NINDS, FightSMA i Families of SMA za wsparcie finansowe. SEGL jest wspierany przez grant szkoleniowy NINDS #5T32NS077984-02.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Strzykawka insulinowa ThinproTerumoSS30M30093/10 cc, igła 3/8", 30 G, 1 na mysz
Niebieski barwnik EvansSigma-AldrichE2129Rozcieńczony do 1% z 1x aplikatory z bawełnianą końcówką buforowaną fosforanem
Fisher Scientific23-400-101
Światłowodowe źródło światłaFisher Scientific12-562-36
Sekcja mikroskop

Bibliografia

  1. Foust, K. D., et al. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nature. 27, 59-65 (2009).
  2. Dominguez, E., et al. Intravenous scAAV9 delivery of a codon-optimized SMN1 sequence rescues SMA mice. Human molecular genetics. 20, 681-693 (2011).
  3. Rahim, A. A., et al. Intravenous administration of AAV2/9 to the fetal and neonatal mouse leads to differential targeting of CNS cell types and extensive transduction of the nervous system. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 25, 3505-3518 (2011).
  4. Foust, K. D., et al. Rescue of the spinal muscular atrophy phenotype in a mouse model by early postnatal delivery of SMN. Nat Biotechnol. 28, 271-274 (2010).
  5. Duque, S., et al. Intravenous administration of self-complementary AAV9 enables transgene delivery to adult motor neurons. Mol Ther. 17, 1187-1196 (2009).
  6. Bostick, B., Ghosh, A., Yue, Y., Long, C., Duan, D. Systemic AAV-9 transduction in mice is influenced by animal age but not by the route of administration. Gene Ther. 14, 1605-1609 (2007).
  7. Miyake, N., Miyake, K., Yamamoto, M., Hirai, Y., Shimada, T. Global gene transfer into the CNS across the BBB after neonatal systemic delivery of single-stranded AAV vectors. Brain research. 1389, 19-26 (2011).
  8. Porensky, P. N., et al. A single administration of morpholino antisense oligomer rescues spinal muscular atrophy in mouse. Human molecular genetics. 21, 1625-1638 (2012).
  9. Hua, Y., et al. Peripheral SMN restoration is essential for long-term rescue of a severe spinal muscular atrophy mouse model. Nature. 478, 123-126 (2011).
  10. Kienstra, K. A., Freysdottir, D., Gonzales, N. M., Hirschi, K. K. Murine neonatal intravascular injections: modeling newborn disease. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science : JAALAS. 46, 50-54 (2007).
  11. Glascock, J. J., et al. Delivery of therapeutic agents through intracerebroventricular (ICV) and intravenous (IV) injection in mice. J. vis. Exp. (56), (2011).
  12. Sands, M. S., Barker, J. E. Percutaneous intravenous injection in neonatal mice. Laboratory animal science. 49, 328-330 (1999).
  13. Bevan, A. K., et al. Early heart failure in the SMNDelta7 model of spinal muscular atrophy and correction by postnatal scAAV9-SMN delivery. Human molecular genetics. 19, 3895-3905 (2010).
  14. Valori, C. F., et al. Systemic delivery of scAAV9 expressing SMN prolongs survival in a model of spinal muscular atrophy. Science translational medicine. 2, (2010).
  15. Foust, K. D., Poirier, A., Pacak, C. A., Mandel, R. J., Flotte, T. R. Neonatal intraperitoneal or intravenous injections of recombinant adeno-associated virus type 8 transduce dorsal root ganglia and lower motor neurons. Hum Gene Ther. 19, 61-70 (2008).
  16. Guggenbuhl, P., Grosbois, B., Chales, G. Gaucher disease. Joint, bone, spine : revue du rhumatisme. 75, 116-124 (2008).
  17. Daly, T. M., Vogler, C., Levy, B., Haskins, M. E., Sands, M. S. Neonatal gene transfer leads to widespread correction of pathology in a murine model of lysosomal storage disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 2296-2300 (1999).
  18. Daly, T. M., Ohlemiller, K. K., Roberts, M. S., Vogler, C. A., Sands, M. S. Prevention of systemic clinical disease in MPS VII mice following AAV-mediated neonatal gene transfer. Gene Ther. 8, 1291-1298 (2001).
  19. Wang, S. Juvenile neuronal ceroid lipofuscinoses. Advances in experimental medicine and biology. 724, 138-142 (2012).
  20. Forsythe, E., Beales, P. L. Bardet-Biedl syndrome. European journal of human genetics. 21, 8-13 (2013).
  21. Bevan, A. K., et al. Systemic gene delivery in large species for targeting spinal cord, brain, and peripheral tissues for pediatric disorders. Mol Ther. 19, 1971-1980 (2011).
  22. Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab animal. 40, 155-160 (2011).
  23. Saunders, N. R., Joakim Ek, C., Dziegielewska, K. M. The neonatal blood-brain barrier is functionally effective, and immaturity does not explain differential targeting of AAV9. Nature biotechnology. 27, 804-805 (2009).
  24. Foust, K. D., et al. Therapeutic AAV9-mediated suppression of mutant SOD1 slows disease progression and extends survival in models of inherited ALS. Mol Ther. 21, 2148-2159 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Iniekcja do ylnay a skroniowaszczeni ta mysiewektory AAVekspresja GFPmikroskop sekcyjnystrzykawka insulinowabarwnik b kit Evansapostnatalny dzie
Wstrzyknięcia dożylne u nowonarodzonych myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.