Artykuł metodologiczny
Informujemy tutaj o solidnej i efektywnej ekspresji białek fluorescencyjnych po wstrzyknięciu mRNA do niezapłodnionych oocytów Branchiostoma lanceolatum. Opracowanie techniki mikroiniekcji w tym podstawowym strunacie utoruje drogę dla dalekosiężnych innowacji technicznych w tym powstającym systemie modelowym, w tym obrazowania in vivo i manipulacji specyficznych dla genów.
Przedstawiamy tutaj solidny i skuteczny protokół ekspresji białek fluorescencyjnych po wstrzyknięciu mRNA do niezapłodnionych oocytów głowostrunowca amfioksusa, Branchiostoma lanceolatum. Używamy konstruktów dla błonowych i jądrowych ukierunkowanych mCherry i eGFP, które zostały zmodyfikowane w celu dostosowania do użycia kodonów amfioksusa i sekwencji konsensusu Kozaka. Opisujemy rodzaj igieł do wstrzykiwań, które należy zastosować, protokół unieruchomienia niezapłodnionych oocytów oraz ogólną konfigurację iniekcji. Technika ta pozwala na uzyskanie znakowanych fluorescencyjnie zarodków, w których dynamika zachowań komórek we wczesnym okresie rozwoju może być analizowana przy użyciu najnowszych strategii obrazowania in vivo. Opracowanie techniki mikroiniekcji u tego gatunku amfioksus pozwoli na obrazowanie na żywo analiz zachowań komórek w zarodku, a także manipulacje specyficzne dla genów, w tym nadekspresję genów i knockdown. Podsumowując, protokół ten jeszcze bardziej skonsoliduje podstawową strunowcę amphioxus jako model zwierzęcy do rozwiązywania problemów związanych z mechanizmami rozwoju embrionalnego i, co ważniejsze, z jego ewolucją.
Podczas rozwoju, pojedyncza komórka daje początek całemu organizmowi w bardzo złożonym procesie, który obejmuje zarówno podziały, jak i ruchy komórek. Aby lepiej zrozumieć biologiczne zasady leżące u podstaw dynamiki zachowania komórek, biolodzy rozwojowi zaczęli stosować techniki obrazowania in vivo oparte na fluorescencji. Specyficzne przedziały komórek, takie jak błony komórkowe, mogą być albo znakowane przez leczenie barwnikami fluorescencyjnymi, co jest podejściem utrudnionym przez brak swoistości i penetracji tkanki1, albo przez specyficzne wprowadzenie do zarodka egzogennych mRNA kodujących białka fluorescencyjne2. Do efektywnego ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
1. Przygotowanie instrumentów i odczynników
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Opisany powyżej protokół stanowi podstawę do mikroiniekcji oocytów B. lanceolatum, a tym samym do wprowadzania do rozwijających się embrionów B. lanceolatum mRNA kodującego białka fluorescencyjne do obrazowania in vivo. Chociaż technika ta jest niewątpliwie solidna i niezawodna, odsetek udanych iniekcji przy zastosowaniu tego protokołu pozostaje zmienny (Tabela 1). Bardzo prawdopodobnym wyjaśnieniem tego intrygującego faktu jest ogromna zmienność partii oocytów: różne partie ja.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
W tym artykule po raz pierwszy przedstawiamy szczegółowy i powtarzalny protokół wstrzykiwania oocytów B. lanceolatum , które po B. floridae13,14 i B. belcheri15 są tym samym trzecim gatunkiem amfioksusa, dla którego opisano taką technikę. Co istotne, opisany tu protokół zawiera również opis układów wektorowych przystosowanych do wytwarzania białek fluorescencyjnych u B. lanceolatum z wstrzykniętego mRNA wytworzonego in vitro (opisanego poniżej). Razem te .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Autorzy pragną podziękować za wsparcie ze strony "Animalerie Centrale de Gif-sur-Yvette" dla hodowli zwierząt. Prace te były wspierane przez fundusze ANR (ANR-09-BLAN-0262-02 i ANR-11-JSV2-002-01) dla Michaela Schuberta, przez grant Unii Europejskiej 6PR "Embryomics" oraz przez grant ANR "ANR-10-BLAN-121801 Dev-Process" dla Jeana-François Nicolasa i Nadine Peyriéras. Stypendium doktoranckie im. João Emanuela Carvalho jest finansowane przez FCT (SFRH/BD/86878/2012).
Prośby o opisane tutaj wektory można kierować bezpośrednio do autorów.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Materiały eksploatacyjne | |||
| 35 mm Szalki Petriego | Falcon | 353001 | poddana kulturze |
| (Stericup 1 L) | Fisher | W21719 | 0.22 μ m |
| Rurki Spin-X | Costar | 8160 | 0.22 μ m |
| Słoik do przechowywania igieł do kapilar o średnicy 1,2 mm | WPI | E212 | |
| Pipety | o długości 230 mm | ||
| Rurka aspiracyjna | Dutscher | 75056 | |
| Kapilary do igieł iniekcyjnych | Sutter | BF 120-94-10 | Szkło borokrzemianowe z żarnikiem, OD 1,20 mm, ID 0,94 mm, długość 10 mm |
| Odczynniki | |||
| Niskotopliwa agaroza | Sigma | A9414 | |
| Phenol Red | Sigma | 114537 | |
| Glycerol | Sigma | G2025 | |
| Bromowodorek poli-L-lizyny | Sigma | P9155 | |
| H2O, bez DNaz/RNaz | Gibco | 10977-035 | |
| mMessage mMachine SP6 Zestaw | do transkrypcjiZestaw | do syntezy mRNA | AM1340 |
| Phenol pH 8 | Sigma | P4557 | |
| 24:1 chloroform: alkohol izoamyliowy | Sigma | C0549 | |
| 5:1 fenol pH 4,7: chloroform | Sigma | P1944 | |
| Sole kryształów rafy (200 kg) | Europrix | Sole handlowe | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| Equipment | |||
| Fluorescencyjna luneta prosektoryjna z 200-krotnym powiększeniem | Lornetka Leica | MZ16F | 25X, filtry DSR i GFP2 |
| Mikromanipulator | Marzhauzer | M-33 | |
| Wtryskiwacz | Picospritzer | model II lub III | |
| Ściągacz igieł | Sutter | P97 | Ściągacz igieł z żarnikiem grzewczym |
| Szczypce drobnoziarniste | Fine Science Tools GmbH | 11252-30 | Dumont #5 |
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE
Poproś o pozwolenie