Ekspresja białek fluorescencyjnych w Branchiostoma lanceolatum przez wstrzyknięcie mRNA do niezapłodnionych oocytów

Podsumowanie

Informujemy tutaj o solidnej i efektywnej ekspresji białek fluorescencyjnych po wstrzyknięciu mRNA do niezapłodnionych oocytów Branchiostoma lanceolatum. Opracowanie techniki mikroiniekcji w tym podstawowym strunacie utoruje drogę dla dalekosiężnych innowacji technicznych w tym powstającym systemie modelowym, w tym obrazowania in vivo i manipulacji specyficznych dla genów.

Streszczenie

Przedstawiamy tutaj solidny i skuteczny protokół ekspresji białek fluorescencyjnych po wstrzyknięciu mRNA do niezapłodnionych oocytów głowostrunowca amfioksusa, Branchiostoma lanceolatum. Używamy konstruktów dla błonowych i jądrowych ukierunkowanych mCherry i eGFP, które zostały zmodyfikowane w celu dostosowania do użycia kodonów amfioksusa i sekwencji konsensusu Kozaka. Opisujemy rodzaj igieł do wstrzykiwań, które należy zastosować, protokół unieruchomienia niezapłodnionych oocytów oraz ogólną konfigurację iniekcji. Technika ta pozwala na uzyskanie znakowanych fluorescencyjnie zarodków, w których dynamika zachowań komórek we wczesnym okresie rozwoju może być analizowana przy użyciu najnowszych strategii obrazowania in vivo. Opracowanie techniki mikroiniekcji u tego gatunku amfioksus pozwoli na obrazowanie na żywo analiz zachowań komórek w zarodku, a także manipulacje specyficzne dla genów, w tym nadekspresję genów i knockdown. Podsumowując, protokół ten jeszcze bardziej skonsoliduje podstawową strunowcę amphioxus jako model zwierzęcy do rozwiązywania problemów związanych z mechanizmami rozwoju embrionalnego i, co ważniejsze, z jego ewolucją.

Wprowadzenie

Podczas rozwoju, pojedyncza komórka daje początek całemu organizmowi w bardzo złożonym procesie, który obejmuje zarówno podziały, jak i ruchy komórek. Aby lepiej zrozumieć biologiczne zasady leżące u podstaw dynamiki zachowania komórek, biolodzy rozwojowi zaczęli stosować techniki obrazowania in vivo oparte na fluorescencji. Specyficzne przedziały komórek, takie jak błony komórkowe, mogą być albo znakowane przez leczenie barwnikami fluorescencyjnymi, co jest podejściem utrudnionym przez brak swoistości i penetracji tkanki1^{, albo} przez specyficzne wprowadzenie do zarodka egzogennych mRNA kodujących białka fluorescencyjne². Do efektywnego dostarczania związków egzogennych, takich jak mRNA, można stosować różne techniki. Należą do nich między innymi mikroiniekcja, elektroporacja, bombardowanie mikrocząstkami, lipofekcja i transdukcja^3,4. Chociaż wszystkie te podejścia mogą być wykorzystane do wprowadzenia związków egzogennych do rozwijającego się zarodka, tylko mikroiniekcja pozwala na zastosowanie wcześniej zdefiniowanych i precyzyjnych ilości do każdej komórki³. Techniki mikroiniekcji opisano dla wszystkich głównych modelowych systemów rozwojowych⁴ (np. muszki owocowe, nicienie, danio pręgowany, żaby, myszy), a także dla niektórych modeli^{alternatywnych4}, w tym modeli stosowanych w badaniach porównawczych mających na celu zrozumienie ewolucji mechanizmów rozwojowych (np. ukwiałów, pierścienic, jeżowców, osłonic puchatych, głowostrunowca amfioksusa).

Cephalochordates, które razem z osłonicami i kręgowcami tworzą gromadę strunowców, są szczególnie dobrze przystosowanymi modelami do badania ewolucji strunowców i różnicowania kręgowców od przodka bezkręgowców^5-8. Linia głowostrunowców rozdzieliła się bardzo wcześnie podczas ewolucji strunowców; i współcześnie żyjące głowostrunowce, które dzielą się na trzy rodzaje (Branchiostoma, Asymmetron i Epigonichthys), przypominają kręgowce zarówno pod względem ogólnej anatomii, jak i architektury genomu^5-8. Spośród około 30 gatunków głowostrunowców, które zostały opisane do tej pory, pięć jest dostępnych do badań embriologicznych i rozwojowych^6,9: Asymmetron lucayanum (lancet Bahama), Branchiostoma floridae (amfioxus z Florydy), Branchiostoma lanceolatum (amfioks europejski), Branchiostoma belcheri (amfioksus chiński) i Branchiostoma japonicum (amfioksus japoński). Dojrzałe dorosłe osobniki trzech z tych gatunków (B. lanceolatum, B. belcheri i B. japonicum) mogą zostać nakłonione do tarła na żądanie w sezonie lęgowym^10,11. Ponadto, przynajmniej w przypadku B. lanceolatum, efektywne tarło można również wywołać w sztucznej wodzie morskiej^{12 ,} dzięki czemu ten konkretny gatunek głowostrunowca jest dostępny dla laboratoriów, które nie mają dostępu do naturalnej wody morskiej. Połączenie u B. lanceolatum wygodnego i niezawodnego dostępu do zarodków z efektywną metodą dostarczania, taką jak mikroiniekcja, jak dotąd jedyna technika dostarczania opracowana u amfioksusa (zarówno u B. floridae, jak i B. belcheri)^13-15, umożliwi opracowanie nowego zestawu technik manipulacyjnych, w tym podejść opartych na śledzeniu linii i dynamicznym zachowaniu komórek.

W ten sposób opracowano protokół efektywnej mikroiniekcji mRNA w celu ekspresji białek fluorescencyjnych w zarodku B. lanceolatum. Ponadto, aby zapewnić podstawowy zestaw narzędzi do obrazowania na żywo zarodków B. lanceolatum, opracowano systemy wektorowe, które umożliwiają ekspresję białek fluorescencyjnych związanych z błoną i jądrem. W celu celowania błonowego wzmocnione białko zielonej fluorescencji (eGFP) zostało połączone z ludzkim pudełkiem HRAS CAAX, a lokalizację jądrową mCherry i eGFP uzyskano przez fuzję z eksonem histonu 2B (H2B) danio pręgowanego (Figura 1, plik uzupełniający 1). Ponadto, w celu optymalizacji translacji białek, sekwencje Kozaka i kodony konstruktów zostały zmodyfikowane i przystosowane do użycia u B. lanceolatum. Podsumowując, przedstawiona tu metoda iniekcji i wektory ekspresji posłużą jako podstawa do opracowania nowych podejść eksperymentalnych dla głowostrunowców, w szczególności analiz z wykorzystaniem najnowszych technik obrazowania in vivo opartych na fluorescencji.

Protokół

1. Przygotowanie instrumentów i odczynników

1. Pipety transferowe Pasteura
   1. Wygeneruj serię pipet transferowych Pasteura o różnych średnicach końcówek, przeciągając pipety Pasteura o długości 230 mm nad płomieniem z różnymi prędkościami. Upewnij się, że stożek jest tak długi, jak to możliwe, aby zapewnić płynną i precyzyjną kontrolę zasysania.
   2. Rysownikiem diamentowym podrap pipetę wzdłuż linii prostopadłej do długości pipety. Obiema rękami pociągnij pipetę równolegle do jej długości, aby uzyskać cięcie. Szybko wypoleruj pipetę płomieniowo, nie uszczelniając końcówki.
   3. Zmieniaj średnicę końcówki w zależności od stadium oocytów/zarodków, które mają być pipetowane: 300-400 μm dla oocytów niezapłodnionych (około 150 μm średnicy), 600 μm dla zapłodnionych jaj (około 500 μm średnicy), 200-400 μm dla wyklutych neuruli. Użyj pipet z rurką aspiracyjną monitorowaną przez jamę ustną, aby przenieść oocyty/zarodki z jednej szalki do drugiej.
2. Igły iniekcyjne
   1. Manipuluj naczyniami włosowatymi w rękawiczkach, aby zapewnić warunki wolne od RNaz. Stosować szkło borokrzemianowe z kapilarami z żarnikiem o wymiarach OD 1,20 mm, ID 0,94 mm, długości 10 mm.
   2. Jeśli kapilary są naciągane na typ ściągacza igłowego z filamentem grzewczym opisany na liście materiałów, użyj następujących ustawień: Ciepło 600, Ciągnięcie 50, Prędkość 80, Czas 60, Ciśnienie 200 lub 300. W przeciwnym razie należy upewnić się, że kształt, który ma kluczowe znaczenie dla udanych wstrzyknięć, jest taki, jak pokazano na rysunku 2 z następującymi właściwościami: zewnętrzna średnica końcówki 4-8 μm, długość stożka 2 cm.
      UWAGA: Igły można wyciągać przed sezonem tarła i używać przez cały sezon.
3. 5% roztwór podstawowy czerwieni fenolowej (4x)
   1. Przygotuj świeże przed każdym sezonem tarłowym.
   2. W probówce filtracyjnej o wielkości 0,22 μm odważyć 25 mg proszku czerwieni fenolowej.
   3. Dodać 0,5 ml wody wolnej od DNaz i RNaz do probówki zawierającej proszek.
   4. Wirować przez 3-5 minut w temperaturze 18 000 x g w temperaturze pokojowej, aby przefiltrować i wysterylizować roztwór i usunąć kryształy, które mogłyby zatkać igłę do wstrzykiwań.
   5. Przechowywać w temperaturze 4 °C lub 250 μl porcji w temperaturze -20 °C.
4. 0,25 mg/ml roztwór polilizyny
   1. Przygotuj świeże przed każdym sezonem tarłowym.
   2. Rozpuścić 5 mg poli-L-lizyny w 20 ml wody destylowanej. Przechowywać 5 ml porcji w temperaturze -20 °C.
   3. Natychmiast i tylko raz użyć rozmrożonej podwielokrotności, aby zapewnić powtarzalne i solidne przyleganie oocytów do naczynia pokrytego polilizyną.
5. Synteza mRNA
   1. Przygotuj świeże przed każdym sezonem tarłowym.
   2. Linearyzować 5 μg DNA będącego przedmiotem zainteresowania odpowiednim enzymem (zwykle przez 2 godziny, w temperaturze 37 °C). Aby sprawdzić kompletność trawienia, należy przez 20 minut przepuszczać 2% objętości mieszanki mineralizacyjnej na 1% żelu agarozowo-TBE w buforze TBE o mocy 150 W.
   3. Ekstrahuj zlinearyzowane DNA za pomocą fenolu 25:24:1 (pH 8,0):chloroform:alkohol izoamylowy. Wirować przez 20 sekund, odwirować 10 minut przy 18 000 x g i zebrać fazę wodną (górną).
   4. Ponownie wyekstrahować fazę wodną chloroformem 24:1: alkohol izoamylowy. Wirować przez 20 sekund, odwirować 10 minut przy 18 000 x g i zebrać fazę wodną.
   5. Wytrącić zlinearyzowane DNA za pomocą 100:10:300 zlinearyzowanego DNA: 3 M octanu sodu (pH 5,2): 100% etanolu przez noc w temperaturze -20 °C.
   6. Wirować 20 minut przy 18 000 x g w temperaturze 4 °C. Wypłukać w 70% etanolu.
   7. Wirować 10 minut przy 18 000 x g w temperaturze 4 °C. Pozostawić do wyschnięcia i ponownie zawiesić w wodzie wolnej od RNaz o końcowym stężeniu 0,5 μg/μl.
   8. Transkrybuj 1 μg zlinearyzowanego DNA za pomocą zestawu do syntezy mRNA z odpowiednią polimerazą, zgodnie z instrukcjami producenta.
   9. Ekstrahuj mRNA za pomocą fenolu 5:1 (pH 4,7): roztworu zatrzymującego chloroform i octan amonu dostarczony z zestawem.
   10. Wirować przez 20 sekund, odwirować 10 minut przy 18 000 x g i zebrać fazę wodną.
   11. Ponownie wyekstrahować fazę wodną chloroformem 24:1: alkohol izoamylowy. Wirować przez 20 sekund, odwirować 10 minut przy 18 000 x g i zebrać fazę wodną.
   12. Wytrącić mRNA 100% izopropanolem przez noc w temperaturze -20 °C.
   13. Wirować 20 minut przy 18 000 x g w temperaturze 4 °C. Wypłukać w 80% etanolu.
   14. Wirować 10 minut przy 18 000 x g w temperaturze 4 °C. Pozostaw granulat do wyschnięcia w temperaturze pokojowej nie dłużej niż 5-10 minut, ponieważ wtedy trudno będzie go ponownie zawiesić. Zawiesić w wodzie wolnej od DNaz i RNaz do końcowego stężenia co najmniej 2 μg/μl, aby zapewnić przyzwoite końcowe stężenie mRNA w mieszance iniekcyjnej.
   15. Aby sprawdzić jakość i wielkość produktu transkrypcji, należy umieścić 0,5 μl mRNA w wolnym od RNaz 1% żelu agarozowo-TBE w buforze TBE o mocy 150 W przez 20 minut. Przechowywać 2 μl podwielokrotności w temperaturze -80 °C.
6. Naczynia pokryte polilizyną
   UWAGA: Naczynia pokryte polilizyną służą do unieruchamiania oocytów podczas iniekcji.
   1. Dla każdej płytki Petriego o średnicy 35 mm (w sumie 5) należy przykryć dno płytki Petriego 1 ml rozmrożonego roztworu polilizyny o stężeniu 0,25 mg/ml. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
   2. Dla każdej płytki Petriego z 35 mm hodowli komórkowej (w sumie 5) przenieść 0,25 mg/ml roztworu polilizyny do innej płytki Petriego z 35 mm hodowli komórkowej. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
   3. Odrzucić 0,25 mg/ml roztworu polilizyny.
   4. Pozostaw szalki Petriego do wyschnięcia, do góry nogami w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.
   5. Naczynia pokryte polilizyną należy przechowywać zawinięte w folię spożywczą w temperaturze 4 °C, aby uniknąć zanieczyszczenia, maksymalnie przez tydzień.
7. Potrawy w panierce agarozowej
   UWAGA: Służą do hodowli zarodków z iniekcjami. Agaroza zapewnia poduszkę dla wstrzykniętych zarodków i zapobiega ich przywieraniu do dna naczynia.
   1. Wytwarzaj sztuczną wodę morską (ASW) przy użyciu 37-38 g/l soli komercyjnych + 0,25 mM NaHCO₃ w wodzie z odwróconej osmozy.
   2. Rozpuścić agarozę do stężenia 1% w ASW przefiltrowanym przez 0,22 μm, podgrzewając roztwór w kuchence mikrofalowej.
   3. Szybko przelej ciepły roztwór agarozy z jednej szalki Petriego o średnicy 35 mm do drugiej, aby uzyskać bardzo cienką warstwę agarozy na naczyniu.
   4. Naczynia pokryte agarozą zawinięte w folię Saran należy przechowywać w temperaturze 4 °C, aby uniknąć zanieczyszczenia, maksymalnie przez tydzień.
8. Mieszanka iniekcyjna i ładowanie igieł iniekcyjnych
   1. Na około 2 godziny przed rozpoczęciem iniekcji należy przygotować mieszaninę iniekcji o objętości 2 μl w wodzie wolnej od RNaz i DNaz o końcowym stężeniu 1-1,8 μg/μl mRNA, 15% glicerolu, 1,25% czerwieni fenolowej.
      UWAGA: Czerwień fenolowa barwi roztwór, co umożliwia monitorowanie skuteczności iniekcji i identyfikację pomyślnie wstrzykniętych zarodków. Glicerol sprzyja dyfuzji mRNA w oocycie.
   2. Wirować 4 minuty przy 18 000 x g do osadzania kryształów. Trzymaj na lodzie do czasu użycia.
   3. Za pomocą pipety o pojemności 10 μl zebrać 0,5 μl mieszanki iniekcyjnej, omijając dno probówki, gdzie kryształy zostały osadzone.
   4. Wypełnić co najmniej dwie igły do wstrzykiwań (w przypadku gdyby jedna z nich pękła podczas wstrzykiwania), pipetując 0,5 μl kropli mieszanki iniekcyjnej do dużego otworu igły.
   5. Umieścić igły w słoiku do przechowywania z płynem na dnie w temperaturze 4 °C, aby zapobiec odparowaniu mieszanki do wstrzykiwań. Pozostaw mieszaninę do wstrzykiwań powoli przemieszczającą się do końcówki igły do wstrzykiwań przez co najmniej 1 godzinę, aby zminimalizować tworzenie się pęcherzyków.
   6. Dodatkową mieszankę do wstrzykiwań należy przechowywać w temperaturze -80 °C przez maksymalnie trzy dodatkowe użycia, po których jakość mRNA ulega pogorszeniu (dane nie pokazane).

2. Pobieranie materiału biologicznego, mikroiniekcja i hodowla zarodków

1. Pobieranie komórek jajowych i plemników
   UWAGA: Patrz Theodosiou et al.¹² dla szczegółowego protokołu indukowania tarła i zbierania gamet.
   1. Szokować samce i samice w ASW w temperaturze 23 °C przez 24 godziny.
   2. Na jedną do dwóch godzin przed zachodem słońca przenieś dorosłe osobniki do osobnych kubków w ASW w temperaturze 19 °C, ponieważ większość dorosłych osobników składa tarło 1-2 godziny po zachodzie słońca.
   3. Opłucz szalki Petriego o średnicy 35 mm w przefiltrowanym ASW i pozwól im wyschnąć do góry nogami, aby zapobiec przywieraniu oocytów do dna naczynia.
   4. Po tarle natychmiast zbierz plemniki i oocyty za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl.
      1. Trzymaj plemniki i oocyty oddzielnie od dorosłego amfioksusa, ponieważ kontakt z nimi jest szkodliwy dla zdrowia gamet (dane nie pokazane).
      2. Ponadto unikaj zaskakiwania dorosłych, co prowadzi do ruchów, które rozpraszają, a tym samym rozcieńczają zarówno plemniki, jak i oocyty. Aby plemniki były aktywne tak długo, jak to możliwe i zoptymalizować tempo zapłodnienia, należy zebrać plemniki tak skoncentrowane, jak to możliwe.
   5. Trzymaj nasienie na lodzie w probówce o pojemności 1,5 ml.
   6. Przenieść oocyty w przefiltrowanym ASW do wstępnie wypłukanych szalek Petriego o średnicy 35 mm.
   7. Przenieść 100-500 oocytów za pomocą wcześniej pobranej pipety Pasteura o średnicy 300-400 μm na inną szalkę Petriego o średnicy 35 mm w celu wykonania iniekcji.
   8. Pozostałą część lęgu należy zapłodnić jako kontrolę jakości plemników i oocytów lub do innych eksperymentów.
2. Iniekcja do oocytów
   1. Zamontować igłę iniekcyjną na mikromanipulatorze pod kątem 50° w stosunku do płaszczyzny poziomej.
      UWAGA: Kąty mniejsze niż 50° będą popychać oocyty na szalce, podczas gdy kąty większe niż 50° nie pozwolą na odpowiednie monitorowanie położenia igły względem oocytu.
   2. Pod fluorescencyjną lunetą sekcyjną z okularami 25X przenieś 30 oocytów za pomocą pipety Pasteura o średnicy 300-400 μm na naczyniu pokrytym polilizyną zawierającym przefiltrowany ASW.
   3. Umieść oocyty wzdłuż linii, aby wykonać wstrzyknięcia w uporządkowany sposób i odróżnić oocyty wstrzyknięte od niewstrzykniętych. Wstrzyknąć małą liczbę (30 oocytów), aby zminimalizować czas ekspozycji oocytów na polilizynę, która ma tendencję do deformacji rozwijających się zarodków (dane nie pokazane).
   4. Użyj oświetlenia ciemnego pola, aby oocyty były jak najbardziej przezroczyste.
   5. Za pomocą pokrętła ruchu zgrubnego mikromanipulatora zbliżyć igłę do komórki jajowej.
   6. Za pomocą cienkich kleszczyków rozetnij igłę na poziomie, na którym końcówka zaczyna być zakrzywiona. Pulsując wtryskiwaczem, sprawdź, czy czerwona mieszanka iniekcyjna rzeczywiście wypływa z igły.
   7. Przy 200-krotnym powiększeniu i za pomocą precyzyjnego pokrętła ruchu mikromanipulatora delikatnie przesunąć igłę do wstrzykiwania wewnątrz rdzenia oocytu.
      UWAGA: W przypadku włożenia zbyt powierzchownie, wstrzyknięty roztwór nie pozostanie w oocycie. Jeśli zostanie włożony zbyt głęboko, oocyt zostanie zniszczony.
   8. Wstrzykiwać za pomocą 1-3 impulsów o czasie trwania 120 ms i ciśnieniu 1-10 psi. Jeśli igła jest wystarczająco cienka, wstrzykiwać ją z ciągłym przepływem pod stałym ciśnieniem. Upewnij się, że objętość wstrzyknięcia odpowiada 1/5 do 1/3 objętości pojedynczego oocytu.
   9. Po wstrzyknięciu należy szybko wyciągnąć igłę, aby uniknąć wycieku z komórki jajowej.
   10. Sprawdzić, czy wstrzyknięty roztwór pozostaje w oocycie i czy po kilku sekundach wstrzyknięty roztwór rozprzestrzenia się po oocycie.
   11. Przejdź do następnego oocytu w linii.
   12. Zachowaj kilka niewstrzykniętych zarodków z każdej serii jako kontrolę ujemną w celu oszacowania fluorescencji tła podczas skanowania w poszukiwaniu wstrzykniętych zarodków.
3. Zapłodnienie, selekcja wstrzykniętych zarodków i hodowla zarodków
   1. Zapłodnić oocyty zaraz po wstrzyknięciu serii. Ponieważ jakość oocytów pogarsza się z czasem, wstrzyknij i zapłodnij oocyty w ciągu 1 godziny po tarle¹².
   2. W zależności od stężenia plemników dodaj 1-5 kropli plemników do oocytów i zamieszaj naczynie.
      UWAGA: Otoczka zapłodnienia powinna stać się widoczna na zarodkach po około 1 minutach.
   3. Pozwól zarodkom oderwać się od naczynia pokrytego polilizyną, jednocześnie wstrzykując kolejną serię oocytów.
   4. Przenieść zarodki za pomocą pipety Pasteura o wielkości 600 μm do płytki Petriego pokrytej agarozą. Wyjąć zarodki z naczynia pokrytego polilizyną tak szybko, jak to możliwe, jeśli to w ogóle możliwe, przed etapem 2-komórkowym.
      UWAGA: W przypadku długotrwałej ekspozycji na polilizynę, zarodki mają tendencję do przekształcania się w gęsto upakowane blastule, spłaszczone po stronie dotykającej dna naczynia.
   5. Na etapie od 2 do 4 komórek wybierz za pomocą fluorescencyjnej lunety preparacyjnej z filtrem DSR pomyślnie wstrzyknięte zarodki, tj. te o normalnej morfologii, które wykazują sygnał czerwonej fluorescencji pochodzący z czerwieni fenolowej.
   6. Przechowywać zarodki w kulturze w przefiltrowanym ASW na pokrytych agarozą płytkach Petriego w temperaturze 19 °C do pożądanego etapu obrazowania in vivo.

Wyniki

Opisany powyżej protokół stanowi podstawę do mikroiniekcji oocytów B. lanceolatum, a tym samym do wprowadzania do rozwijających się embrionów B. lanceolatum mRNA kodującego białka fluorescencyjne do obrazowania in vivo. Chociaż technika ta jest niewątpliwie solidna i niezawodna, odsetek udanych iniekcji przy zastosowaniu tego protokołu pozostaje zmienny (Tabela 1). Bardzo prawdopodobnym wyjaśnieniem tego intrygującego faktu jest ogromna zmienność partii oocytów: różne partie ja...

Dyskusja

W tym artykule po raz pierwszy przedstawiamy szczegółowy i powtarzalny protokół wstrzykiwania oocytów B. lanceolatum , które po B. floridae^13,14 i B. belcheri¹⁵ są tym samym trzecim gatunkiem amfioksusa, dla którego opisano taką technikę. Co istotne, opisany tu protokół zawiera również opis układów wektorowych przystosowanych do wytwarzania białek fluorescencyjnych u B. lanceolatum z wstrzykniętego mRNA wytworzonego in vitro (opisanego poniżej). Razem te ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Materiały eksploatacyjne
35 mm Szalki Petriego	Falcon	353001	poddana kulturze
(Stericup 1 L)	Fisher	W21719	0.22 μ m
Rurki Spin-X	Costar	8160	0.22 μ m
Słoik do przechowywania igieł do kapilar o średnicy 1,2 mm	WPI	E212
Pipety			o długości 230 mm
Rurka aspiracyjna	Dutscher	75056
Kapilary do igieł iniekcyjnych	Sutter	BF 120-94-10	Szkło borokrzemianowe z żarnikiem, OD 1,20 mm, ID 0,94 mm, długość 10 mm
Odczynniki
Niskotopliwa agaroza	Sigma	A9414
Phenol Red	Sigma	114537
Glycerol	Sigma	G2025
Bromowodorek poli-L-lizyny	Sigma	P9155
H2O, bez DNaz/RNaz	Gibco	10977-035
mMessage mMachine SP6 Zestaw	do transkrypcjiZestaw	do syntezy mRNA	AM1340
Phenol pH 8	Sigma	P4557
24:1 chloroform: alkohol izoamyliowy	Sigma	C0549
5:1 fenol pH 4,7: chloroform	Sigma	P1944
Sole kryształów rafy (200 kg)	Europrix		Sole handlowe
NaHCO3	Sigma	S6014
Equipment
Fluorescencyjna luneta prosektoryjna z 200-krotnym powiększeniem	Lornetka Leica	MZ16F	25X, filtry DSR i GFP2
Mikromanipulator	Marzhauzer	M-33
Wtryskiwacz	Picospritzer	model II lub III
Ściągacz igieł	Sutter	P97	Ściągacz igieł z żarnikiem grzewczym
Szczypce drobnoziarniste	Fine Science Tools GmbH	11252-30	Dumont #5

Jednostka filtrująca Pasteura Ambion