Opracowaliśmy model uszkodzenia płuc myszy poprzez wstrzyknięcie do tchawicy bakterii Pseudomonas aeruginosa. Model ten naśladuje uszkodzenie płuc podczas zapalenia płuc i ma znaczenie kliniczne.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Pseudomonas aeruginosa Model indukowanego uszkodzenia płuc
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Aby badać ostre uszkodzenia płuc i zapalenie płuc u ludzi, ważne jest opracowanie modeli zwierzęcych, które naśladowałyby różne patologiczne cechy tej choroby. Tutaj opracowaliśmy model uszkodzenia płuc myszy poprzez wstrzyknięcie do tchawicy bakterii Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa lub PA). Korzystając z tego modelu, udało nam się wykazać stan zapalny płuc we wczesnej fazie urazu. Ponadto zaobserwowano nieszczelność bariery nabłonkowej pęcherzyków płucnych, analizując płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe (BAL); i śmierć komórek wyrostka zębodołowego obserwowano za pomocą testu tunelowego z wykorzystaniem tkanki przygotowanej z uszkodzonych płuc. W późniejszej fazie po urazie zaobserwowaliśmy proliferację komórek niezbędną do procesu naprawy. Uraz ustąpił po 7 dniach od rozpoczęcia iniekcji P. aeruginosa. Model ten naśladuje sekwencyjny przebieg zapalenia płuc, urazu i naprawy podczas zapalenia płuc. Ten klinicznie istotny model zwierzęcy nadaje się do badania patologii, mechanizmu naprawy po ostrym uszkodzeniu płuc, a także może być wykorzystany do testowania potencjalnych środków terapeutycznych dla tej choroby.
Wprowadzenie
Płuca są narażone na patogeny środowiskowe i są podatne na stany zapalne i urazy1-3. W stanach patologicznych, takich jak zapalenie płuc lub zespół niewydolności oddechowej dorosłych (ARDS), patogeny, a także czynniki zapalne uwalniane przez leukocyty wywołują uszkodzenie i śmierć komórek pęcherzyków płucnych1-3. Ważne jest opracowanie modeli zwierzęcych ostrego uszkodzenia płuc, aby ułatwić badanie patologii urazu, a także mechanizmu naprawy.
Obecnie, większość ludzi korzysta z modeli uszkodzeń płuc myszywywołanych hiperoksją i bleomycyną 4. Jednak mechanizmy urazu spowodowanego hiperoksją nie są takie same, jak w przypadku najczęstszych urazów płuc, które występują podczas zapalenia płuc lub ARDS5. Ostre uszkodzenie wywołane bleomycyną jest rzadkie w kontekście klinicznym4. Tutaj przedstawiamy model uszkodzenia płuc myszy przy użyciu wstrzyknięcia dotchawniczego P. aeruginosa 6,7. Model ten jest istotny klinicznie i naśladuje procesy zachodzące po zapaleniu płuc8.
Jako oportunistyczny, szpitalny patogen osób z obniżoną odpornością, P. aeruginosa zazwyczaj infekuje drogi oddechowe, drogi moczowe, oparzenia, rany, a także powoduje inne infekcje krwi6. Bakterie uwalniają czynnik wirulencji egzotoksynę A, namnażają się i wywołują odpowiedź immunologiczną6. Dotchawicze podawanie P. aeruginosa do tchawicy odzwierciedla sytuację w narażeniu ludzi na bakterie wywołujące zapalenie płuc, a patologia prawdopodobnie różni się od niedawno zgłoszonego uszkodzenia płuc wywołanego wirusem grypy H1N1 model9. Ponieważ P. aeruginosa jest patogenem oportunistycznym, jest stosunkowo bezpieczny w obsłudze w porównaniu z niektórymi bardziej zjadliwymi patogenami. Tutaj zastosowaliśmy wstrzyknięcie dotchawicze do podania bakterii, ponieważ zaobserwowaliśmy, że ta metoda wprowadziła więcej bakterii do dystalnego obszaru pęcherzyków płucnych w porównaniu z niektórymi innymi procedurami, takimi jak użycie cewnika przez usta.
W porównaniu z innymi modelami ostrego uszkodzenia płuc, opisany tutaj model P. aeruginosa jest odpowiedni do badania uszkodzeń płuc wywołanych przez bakterie i nadmierny stan zapalny. W przeciwieństwie do innych modeli zwierzęcych, które wykorzystują P. aeruginosa do wywoływania sepsy10,11, tutaj używamy wstrzyknięcia tych bakterii do tchawicy w celu wywołania miejscowego ostrego uszkodzenia płuc.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami oraz Instytucjonalne Komitety Bezpieczeństwa Biologicznego Uniwersytetu Illinois w Chicago.
UWAGA: Wszystkie procedury z użyciem pseudomonas powinny być wykonywane zgodnie z praktykami poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL2), które obejmują między innymi: maskę, ochronę oczu, fartuch lub kombinezon oraz podwójne rękawice. Praca w certyfikowanym Gabinecie Bezpieczeństwa Biologicznego. Narzędzia mające kontakt z bakteriami należy traktować wybielaczem lub środkiem dezynfekującym na bazie dwutlenku chloru. Do transportu próbek należy używać zapieczętowanego pudełka.
1. P. aeruginosa Kultura i wzrost
- Przechowywać P. aeruginosa PA103 jako wywar bakteryjny w zakrętce kriowialnej w temperaturze -80 °C.
- Umieść fiolkę w stojaku w pudełku z ręcznikami papierowymi zwilżonymi 70% etanolem i zabierz do laboratorium poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL2).
- Umieść bakterie na płytkach agarowych z krwią owczą i hoduj w temperaturze 37 °C przez ~15 godzin w inkubatorze.
- W kapturze BSL2 zdrap bakterie z płytki za pomocą pętli na bakterie i ponownie zawieś w 5 ml PBS.
- Przechowywać wywar w temperaturze 4 °C przez okres do 3 miesięcy. Miano należy jednak ustalać co 2 tygodnie.
- Seryjnie rozcieńczyć bakterie w PBS (zwykle od 1:104 do 1:107) i usunąć znane rozcieńczenie na płytkach agarowych z krwią owczą.
- Inkubuj płytki przez ~ 15 godzin. Policz kolonie i oblicz jednostkę tworzącą kolonię (CFU), aby określić stężenie bakterii.
- Zawiesić odpowiednie stężenia (~5 x 103 jtk/μl) w 0,5 ml PBS w 1,5 ml sterylnych kriowialiach z zakrętką. Zapieczętuj kriowiale i umieść je w stojaku kriowialnym na ręcznikach papierowych zawierających środek dezynfekujący w pudełku z zatrzaskową pokrywą.
- Przetransportuj pudełko do zakładu dla zwierząt BSL2. Tam otwórz pudełko w szafce BSL2.
2. Wkraplanie P. aeruginosa
- Przeprowadzanie operacji przetrwania w sposób aseptyczny (sterylne rękawice, sterylne narzędzia i techniki aseptyczne). Użyj sterylnej serwety, aby zapewnić powierzchnię roboczą dla sterylnych (autoklawowanych) narzędzi chirurgicznych. Sterylizuj narzędzia za pomocą sterylizatora z gorącymi kulkami między każdą procedurą wkraplania tchawicy.
- Zważ myszy przed znieczuleniem. Znieczulić myszy ketaminą (100 mg / kg), ksylazyną (5 mg / kg), w 0,1 - 0,2 ml PBS dootrzewnowo (i.p.). Określ skuteczność środka znieczulającego na podstawie braku reakcji na szczypanie palca. Użyj maści weterynaryjnej na oczy, aby zapobiec wysuszeniu w znieczuleniu.
- Unieruchamiaj myszy na desce chirurgicznej w szafce BSL2.
- Zidentyfikuj obszar do wycięcia. Ogol ten obszar i przygotuj skórę za pomocą naprzemiennych wacików z alkoholem i jodopowidonem 3 razy.
- Obszar nacięcia należy potraktować środkiem znieczulającym miejscowo (lidokainą), ponieważ znieczulenie to jest wystarczające do wykonania drobnej operacji, takiej jak nacięcie skóry, aby uzyskać dostęp do tchawicy.
- Wykonaj małe nacięcie (około 5 mm) w linii środkowej szyi i użyj kleszczy, aby delikatnie przesunąć mięsień, aby uzyskać dostęp do tchawicy. Odsłoń tchawicę przez chirurgiczne rozwarstwienie.
- Pobrać roztwór bakterii do jednorazowej strzykawki o pojemności 1 ml z igłą 27 G. Na każdą mysz należy podać 20-30 μl bakterii w odpowiednim stężeniu (do 105 CFU na każdą mysz).
- Wbić igłę do tchawicy. Powoli wstrzykiwać roztwór do tchawicy.
- Upewnij się, że zwierzę sapie, co zwykle oznacza, że roztwór dotarł do płuc.
- Zamknąć ranę sterylnymi szwami (6-0 monofilament) w warunkach aseptycznych.
- Stosować 0,1 mg/kg buprenorfiny we wstrzyknięciu podskórnym jako analgezję pooperacyjną w celu opanowania bólu pooperacyjnego.
- Upewnij się, że czas wymagany od wstępnej indukcji znieczulenia do zamknięcia nacięcia jest krótszy niż 15 minut.
- Po wstrzyknięciu strzykawki i igły należy wyrzucić do odpowiedniego pojemnika na ostre przedmioty stanowiące zagrożenie biologiczne.
- Narzędzia chirurgiczne należy potraktować środkiem dezynfekującym na bazie dwutlenku chloru przez 15 minut, spłukać i wrócić do laboratorium w celu sterylizacji i ponownego użycia w razie potrzeby.
- Trzymaj myszy pojedynczo w czystych klatkach w ciepłym otoczeniu.
- Sprawdzaj stan zwierzęcia co 30 minut, aż odzyska przytomność i zacznie się poruszać, a później w odstępach 12-godzinnych przez pierwsze 3 dni po operacji.
- Trzymaj myszy w obiekcie BSL2 dla zwierząt przez cały czas trwania eksperymentu. Upewnij się, że tylko tkanka zawarta w szczelnie zamkniętym pudełku opuszcza zakład BSL2 dla zwierząt. Jeśli myszy wyrażają którekolwiek z konających zachowań (zdefiniowanych jako niewydolność oddechowa, letarg, brak poruszania się w odpowiedzi na delikatną stymulację) w dowolnym momencie badania, należy poddać myszy eutanazji przez wdychanie CO2 ze źródła w butelce, a następnie zwichnięcie szyjki macicy.
- Poddaj obiekt eksperymentalnemu eutanazji przez wykrwawienie w znieczuleniu.
- Zbierz tkankę płucną od myszy poddanych eutanazji. Wykonaj te procedury w okapie BSL2. W razie potrzeby przenieść próbkę za pomocą szczelnie zamkniętych probówek umieszczonych w stojaku na ręcznikach papierowych zawierających środek dezynfekujący w pudełku z zatrzaskową pokrywą w celu dalszego przetwarzania.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Od 24 do 72 h po iniekcji P. aeruginosa obserwowano zwiększoną komórkowość w przekrojach płuc (Rycina 1A-D). Płuca zaczęły regenerować się od 96 h po urazie (Rycina 1E). W 7. dniu po podaniu P. aeruginosa w dużej mierze przywrócono prawidłową morfologię pęcherzyków pęcherzyków płucnych (Rycina 1F). Barwienie metodą TUNEL w przekrojach płuc przygotowanych 24 h po podaniu P. aeruginosa wykazało śmierć komórek w pęcherzykach płucnych (Ryci...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Model uszkodzenia płuc myszy Pseudomonas, który tutaj opisujemy, naśladuje cały proces zapalenia, uszkodzenia płuc, naprawy i ustąpienia, które występują po ostrym uszkodzeniu płuc lub zapaleniu płuc. Ma wyjątkowe zalety w porównaniu z kilkoma innymi modelami urazów, ponieważ jest klinicznie istotny, stosunkowo bezpieczny i łatwy w obsłudze.
Krytycznym krokiem w procedurze jest to, że wstrzykiwanie roztworu bakteryjnego musi być bardzo powolne. Jeśli wstrzyknięcie jest zbyt szybkie, myszy praw...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez granty National Institutes of Health HL105947-01 (YL), HL07829-16 (AM), HL090152 (AM).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Środek znieczulający: ketamina, ksylazyna, lidokaina, buprenorfina | |||
| igła farmaceutyczna 27 G | Fisher 1482648 | ||
| Fisher | 14823434 | 1 ml | |
| Kleszcze do narzędzi | |||
| Fine Science Szycie narzędzi | |||
| Fisher | 19-037-526 | ||
| Miernik oczu, rękawica, fartuch | |||
| Gabinet bezpieczeństwa biologicznego Środek | |||
| dezynfekujący na bazie dwutlenku chloru | |||
| Płytki agarowe z krwią owczą Clidox | Zasilacz Medex | HL-1160 |
Bibliografia
- Ware, L. B., Matthay, M. A. The acute respiratory distress syndrome. N Engl J Med. 342, 1334-1349 (2000).
- Matthay, M. A., Ware, L. B., Zimmerman, G. A. The acute respiratory distress syndrome. J Clin Invest. 122, 2731-2740 (2012).
- Shimabukuro, D. W., Sawa, T., Gropper, M. A. Injury and repair in lung and airways. Crit Care Med. 31 (8), 524-531 (2003).
- Wansleeben, C., Barkauskas, C. E., Rock, J. R., Hogan, B. L. Stem cells of the adult lung: Their development and role in homeostasis, regeneration, and disease. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, 131-148 (2013).
- Singleton, P. A., et al. Dynamin 2 and c-abl are novel regulators of hyperoxia-mediated nadph oxidase activation and reactive oxygen species production in caveolin-enriched microdomains of the endothelium. J Biol Chem. 284, 34964-34975 (2009).
- Sadikot, R. T., Blackwell, T. S., Christman, J. W., Prince, A. S. Pathogen-host interactions in pseudomonas aeruginosa pneumonia. Am J Respir Crit Care Med. 171, 1209-1223 (2005).
- Liu, Y., et al. Foxm1 mediates the progenitor function of type ii epithelial cells in repairing alveolar injury induced by pseudomonas aeruginosa. J Exp Med. 208, 1473-1484 (2011).
- Kurahashi, K., et al. Pathogenesis of septic shock in pseudomonas aeruginosa pneumonia. J Clin Invest. 104, 743-750 (1999).
- Kumar, P. A., et al. Distal airway stem cells yield alveoli in vitro and during lung regeneration following h1n1 influenza infection. Cell. 147, 525-538 (2011).
- Delano, M. J., et al. Sepsis induces early alterations in innate immunity that impact mortality to secondary infection. J Immunology. 186, 195-202 (2011).
- Lange, M., et al. A murine model of sepsis following smoke inhalation injury. Biochem Biophys Res Commun. 391 (3), 1555-1560 (2010).
- Kobayashi, Y. The role of chemokines in neutrophil biology. Front Biosci. 13, 2400-2407 (2008).
- Matute-Bello, G., et al. Animal models of acute lung injury. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 295, L379-L399 (2008).
- Sadikot, R. T., et al. Targeted immunomodulation of the nf-kappab pathway in airway epithelium impacts host defense against pseudomonas aeruginosa. J Immunol. 176, 4923-4930 (2006).
- Pinto, I. L., et al. Development of an experimental model of neutrophilic pulmonary response induction in mice. J Pneumologia. 29, 213-214 (2003).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
