Uszkodzenie balonu naczyniowego i podanie śródświetlne w tętnicy szyjnej szczura

Podsumowanie

Ten protokół wykorzystuje cewnik balonowy do spowodowania uszkodzenia śródświetlnego tętnicy szyjnej szczura i wywołania przerostu neointimalu. Jest to dobrze ugruntowany model do badania mechanizmów przebudowy naczyń krwionośnych w odpowiedzi na uraz. Jest również szeroko stosowany do określania ważności potencjalnych podejść terapeutycznych.

Streszczenie

Model uszkodzenia balonu tętnicy szyjnej u szczurów jest dobrze znany od ponad dwóch dekad. Pozostaje ważną metodą badania mechanizmów molekularnych i komórkowych zaangażowanych w dedyferencjację naczyń gładkich, tworzenie neointima i przebudowę naczyń. Samce szczurów Sprague-Dawley są najczęściej wykorzystywanymi zwierzętami w tym modelu. Samice szczurów nie są preferowane, ponieważ hormony żeńskie chronią przed chorobami naczyniowymi, a tym samym wprowadzają odmianę do tej procedury. Lewa tętnica szyjna jest zwykle uszkodzona, a prawa tętnica szyjna służy jako kontrola negatywna. Uraz lewej tętnicy szyjnej jest spowodowany przez napompowany balon, który obnaża śródbłoneki rozszerza ścianę naczynia. Po urazie można ocenić potencjalne strategie terapeutyczne, takie jak stosowanie związków farmakologicznych i transfer genów lub shRNA. Zazwyczaj w przypadku transferu genów lub shRNA, uszkodzona część światła naczynia jest lokalnie transdukowana przez 30 minut za pomocą cząsteczek wirusa kodujących białko lub shRNA w celu dostarczenia i ekspresji w uszkodzonej ścianie naczynia. Pogrubienie neointymalne reprezentujące proliferacyjne komórki mięśni gładkich naczyń krwionośnych zwykle osiąga szczyt po 2 tygodniach od urazu. W tym momencie naczynia są najczęściej pobierane w celu analizy komórkowej i molekularnej szlaków sygnalizacji komórkowej, a także ekspresji genów i białek. Naczynia mogą być również zbierane we wcześniejszych punktach czasowych w celu określenia początku ekspresji i/lub aktywacji określonego białka lub szlaku, w zależności od zamierzonych celów doświadczalnych. Naczynia można scharakteryzować i ocenić za pomocą barwienia histologicznego, immunohistochemii, testów białek/mRNA i testów aktywności. Nienaruszona prawa tętnica szyjna tego samego zwierzęcia jest idealną kontrolą wewnętrzną. Wywołane urazem zmiany parametrów molekularnych i komórkowych można ocenić, porównując uszkodzoną tętnicę z wewnętrzną prawą tętnicą kontrolną. Podobnie, metody terapeutyczne można ocenić, porównując uszkodzoną i leczoną tętnicę z kontrolną tylko uszkodzoną tętnicą.

Wprowadzenie

Cewniki balonowe są urządzeniami medycznymi używanymi w procedurze angioplastyki, w celu poszerzenia niedrożnego miejsca (miejsc) miażdżycy lub skrzepliny w naczyniu krwionośnym. Zwężone światło naczynia jest zmuszane do otwarcia się przez napompowany balon, a dopływ krwi zostanie przywrócony sekwencyjnie, aby złagodzić objawy niedokrwienia, takie jak dławica piersiowa, zawał mięśnia sercowego i ból nóg. Niemniej jednak wielki sukces angioplastyki został zniweczony przez powikłania pooperacyjne, takie jak wynik siły powodującej barotraumę naczyniową (uszkodzenie balonu), a mianowicie przebudowę ściany naczynia i w wielu przypadkach ponowne zwężenie światła naczynia (restenoza)¹.

Opracowano wiele modeli zwierzęcych naśladujących procedurę angioplastyki, aby pomóc badaczom zrozumieć mechanizmy leżące u podstaw przebudowy ścian naczyń związanych z uszkodzeniem balonu². Spośród wszystkich gatunków zwierząt wykorzystywanych do modelowania, szczur jest najczęściej wykorzystywany. W porównaniu z królikami, psami i świniami, zaletami szczurów są ich niski koszt, względna łatwość użycia i obecna wiedza na temat fizjologii szczurów. Chociaż myszy mają dodatkową przewagę w szerokim zakresie genetycznie modyfikowanych szczepów, naczynie myszy jest zbyt małe, aby wprowadzić cewnik balonowy. W ciągu ostatnich trzech dekad eksperymentalne badania na szczurach pozwoliły naukowcom lepiej zrozumieć mechanizmy molekularne i komórkowe leżące u podstaw powstawania neointima i przebudowy naczyń krwionośnych^3-6. Oprócz uszkodzenia balonu, przebudowa naczyń krwionośnych jest również zaangażowana w większość głównych chorób naczyniowych, takich jak miażdżyca^7,8, nadciśnienie⁹ i tętniak¹⁰. W związku z tym wiedza uzyskana dzięki modelowi uszkodzenia balonu jest ogólnie korzystna dla ogólnych badań nad chorobami ściany naczyniowej.

Ogólnym celem modelu uszkodzeń balonów szczurów jest nie tylko dalsze zrozumienie chorób naczyniowych, ale także przetestowanie siły działania nowych środków do kontroli chorób^11,12. Obecne kliniczne leczenie farmakologiczne restenozy jest stosowane za pomocą stentów uwalniających lek umieszczanych przez światło naczynia zaraz po angioplastyce. W modelach zwierzęcych skutecznym, a jednocześnie bardziej ekonomicznym sposobem testowania nowych czynników jest dobrze opracowana metoda lokalnej perfuzji śródświetlnej. Czynniki kandydujące, które zostały przetestowane za pomocą tej metody, obejmują leki małocząsteczkowe^13,14, cytokiny lub czynniki wzrostu^15,16, środki manipulujące genami (klony cDNA, siRNA itp.)^17-20 oraz nowe preparaty farmaceutyczne^21,22.

Jak dotąd, model uszkodzenia balonu szczura pozostaje jednym z najbardziej użytecznych modeli do badania chorób/zaburzeń naczyniowych. Jest to podstawowy krok od łóżka do łóżka pacjenta, zwykle jako pierwszy krok przejścia od in vitro do in vivo, ale nie powinien być ostatnim. Wyniki eksperymentów na szczurach muszą zostać rozważone i dokładniej scharakteryzowane przed translacją do użytku klinicznego u ludzi, ze względu na różnice w łożyskach naczyniowych i anatomii naczyń, a także wewnętrzne różnice gatunkowe między człowiekiem a szczurem^23-26. Niemniej jednak jest to nadal niezbędne narzędzie w translacyjnych badaniach medycznych. Podczas gdy takie badania były kiedyś ograniczone przez brak genetycznie modyfikowanych szczurów, nie stanowią już problemu, odkąd nowe podejścia genomiczne, takie jak nukleazy palców cynkowych²⁷,^TALEN-28 i CRISPR-Cas²⁹, sprawiły, że szczury z nokautem stały się łatwo dostępne.

Protokół

UWAGA: Wykorzystanie zwierząt do następujących eksperymentów zostało zweryfikowane i zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Wykorzystywania (IACUC).

1. Procedury przedoperacyjne

1. Wysterylizuj narzędzia chirurgiczne przed użyciem.
   1. Wszystkie narzędzia chirurgiczne należy sterylizować w autoklawie 24 godziny lub krócej przed zabiegiem. Jeśli tego samego dnia przeprowadza się wiele operacji, należy wysterylizować narzędzia za pomocą suchego sterylizatora kulkowego między operacjami.
2. Przefiltruj i wysterylizuj roztwór soli fizjologicznej przed użyciem.
3. Zważyć szczura i obliczyć dawkę leków znieczulających (ketamina 80 mg/kg i ksylazyna 7 mg/kg).
4. Leki znieczulające należy podawać dootrzewnowo (i.p.).
   1. Sprawdź adekwatność sedacji przez uszczypnięcie palca u nogi w ciągu 5-10 minut. Podać dodatkową małą dawkę leków (ketamina 7 mg/kg i ksylazyna 0,6 mg/kg), jeśli sedacja nie jest pełna.
   2. Upewnij się, że igła jest wystarczająco głęboka, aby dostarczyć leki dootrzewnowo, ponieważ niedostarczenie całego roztworu leku do jamy otrzewnej spowoduje nieodpowiednią sedację.
      UWAGA: Owrzodzenia i wypadanie włosów na skórze w miejscu wstrzyknięcia będą widoczne kilka dni po zabiegu, z powodu niezamierzonego podskórnego (s.c.) wstrzyknięcia roztworu leku.
5. Wstrzyknąć podskórnie 3 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej (s.c.). Za pomocą sterylnego bawełnianego wacika nałóż niewielką ilość maści okulistycznej na oba oczy, aby zapobiec wysuszeniu rogówki.
6. Przygotuj sprzęt grzewczy. Wstępnie podgrzej poduszki grzewcze w kuchence mikrofalowej lub łaźni wodnej.
7. Połóż zwierzę na wznak na platformie chirurgicznej.
   1. Usuń włosy w brzusznej okolicy szyi. Nałóż depilator za pomocą bawełnianego wacika, odczekaj 30 sekund i całkowicie zetrzyj gazą.
   2. Przetrzyj szyję peelingiem powidonowo-jodowym i 70% etanolem.
8. Załóż środki ochrony osobistej, w tym fartuch, osłonę włosów, maskę chirurgiczną i okulary. Na koniec załóż sterylne rękawice chirurgiczne przed przystąpieniem do pracy ze sterylnymi narzędziami chirurgicznymi i materiałami.
9. Ułóż szczura sterylnym prześcieradłem chirurgicznym, pozostawiając odsłonięty tylko obszar szyi.

2. Zabiegi chirurgiczne

1. Podczas zabiegu chirurgicznego należy sprawdzać głębokość sedacji zwierzęcia poprzez uszczypnięcie palca u nogi co 15 minut. Jeśli zwierzę zareaguje na uszczypnięcie palca, dodaj dodatkową małą dawkę (10% dawki początkowej) ketaminy i ksylazyny.
2. Wypreparuj lewą tętnicę szyjną wspólną (CCA)
   1. Za pomocą skalpela wykonaj proste podłużne nacięcie na środku szyi. Przybliżona długość nacięcia skóry wynosi 1,5-2 cm, w celu wyizolowania 1,5-2 cm części tętnicy. Długość może się różnić w zależności od celu badania.
   2. Tępo wypreparuj tkankę łączną ze skóry. Trzymaj końcówki kleszczy w górze i upewnij się, że nie przekłuwasz skóry ani tkanki znajdującej się pod spodem.
   3. Wypreparuj warstwy mięśni wzdłuż lewej strony tchawicy.
   4. Otwierając warstwę mięśniową, wizualizuj lewe CCA z ściśle przyczepionym nerwem błędnym. Tępo wypreparuj wzdłuż lewej tętnicy szyjnej z najwyższą ostrożnością, aby oddzielić nerw błędny przy minimalnym rozciąganiu.
   5. Rozciąć CCA dystalnie aż do rozwidlenia. Ostrożnie wypreparuj rozwidlenie i dwie gałęzie - tętnicę szyjną wewnętrzną (ICA) i tętnicę szyjną zewnętrzną (ECA).
   6. Kontynuuj sekcję wokół CCA, aż około część 1,5-2 cm tętnicy zostanie odizolowana od otaczających tkanek.
3. Kontuzja balonu
   1. Na stałe wykonać ligaturę na ECA w odległości około 5 mm od rozwidlenia. Trwale podwiązuje się gałąź potyliczna ECA, która jest zbliżona do rozwidlenia ECA i ICA. Również trwale podwiązują inne gałęzie, jeśli występują, znajdujące się między rozwidleniem a ligaturą ECA – na przykład gałąź tarczycy górnej. Szew używany do wszystkich ligatur to jedwab 4-0. Zatrzask na bliższym końcu CCA i dystalnym końcu ICA.
      UWAGA: Teraz przepływ krwi został zatrzymany na stałe przez podwiązanie (w ECA) lub tymczasowo przez przycinanie (w CCA i ICA). Zawartość światła w obszarze bifurkacji została odizolowana od krążenia ogólnoustrojowego.
   2. Wykonaj nacięcie arteriotomii na ECA za pomocą małych mikro nożyczek. Upewnij się, że nacięcie znajduje się blisko dystalnego węzła szwu. Oczyść krew solą fizjologiczną i wacikami.
   3. Wprowadzić nienapompowany cewnik balonowy 2F do światła ECA. Przesunąć cewnik balonowy proksymalnie do światła CCA. Przesuwaj cewnik proksymalnie, aż jego końcówka dotrze do miejsca, w którym pozostaje klips.
   4. Podłącz urządzenie do pompowania balonów do żeńskiej blokady typu luer na 3-kierunkowym kurku i podłącz męską blokadę typu luer 3-kierunkowego kranu do cewnika balonowego.
   5. Powoli napompuj balon pod ciśnieniem około 1,5 atm, aby rozszerzyć tętnicę szyjną do 1,5-krotności średnicy.
   6. Delikatnie pociągnij balon obrotowo z powrotem do rozwidlenia.
   7. Opróżnij balon i przesuń go z powrotem do bliższego końca. Napompuj go ponownie i powtórz procedurę odciągania jeszcze dwa razy.
   8. Wyjmij cewnik balonowy ze światła tętnicy.
4. Doświetlne podawanie odczynników (np. siRNA, leków)
   UWAGA: W tym przypadku użytym odczynnikiem był roztwór zawierający cząsteczki lentiwirusa kodujące albo shRNA ukierunkowane na cząsteczkę interakcji zrębowej 1 (STIM1), albo nieukierunkowaną kontrolę shRNA. STIM1 jest pojedynczym transbłonowym białkiem retikulum endoplazmatycznego (ER), które jest czujnikiem ER Ca^{2 +} kontrolującym aktywację kanałów Ca^{2 +} błony komórkowej i jest regulowane w górę podczas dedyferencjacji naczyń mięśni gładkich do proliferacyjnego fenotypu^{migracyjnego 12,30-33}.
   1. Podłączyć wewnątrznaczyniowy cewnik naigłowy do strzykawki (24 G, 1,6 cm). Odessać 30 μl roztworu odczynników do testowania. Wprowadzić cewnik do tego samego nacięcia w ECA.
   2. Wsuń końcówkę cewnika do CCA i zawiąż kawałek szwu pojedynczym węzłem na ECA, aby zamocować cewnik i tymczasowo zamknąć nacięcie.
   3. Wstrzyknąć roztwór odczynnika testowego do światła CCA. Roztwór należy przechowywać w świetle naczynia przez 30 minut. Utrzymuj odsłoniętą tkankę wilgotną solą fizjologiczną i przykryj ją kawałkiem mokrej gazy.
   4. Po inkubacji odessać pozostały roztwór. Poluzuj ten pojedynczy węzeł i wyjmij cewnik.
   5. Przywiąż ECA kawałkiem szwu proksymalnie do nacięcia arteriotomii. Spraw, aby węzeł był jak najbliżej rozwidlenia.
5. Zamknij ranę.
   1. Ponieważ uraz balonu i wprowadzenie cewnika może spowodować wyciek lub przebicie naczynia krwionośnego, zdejmij zacisk z ICA i sprawdź, czy nie ma wycieku. Jeśli zaobserwuje się krwawienie, nałóż kawałek gazy i delikatnie dociśnij, aby zatrzymać krwawienie.
   2. Zdejmij drugi zacisk z CCA.
   3. Upewnij się, że nie ma śladów krwawienia, a następnie usuń wszystkie zaciski i inne narzędzia chirurgiczne. Odetnij nadmiar szwów.
   4. Zamknij ranę za pomocą szwów skórnych (4-0 jedwab). Wymaz ze wszystkich stron zamkniętej rany za pomocą Povidon-Jodine lub innego środka antyseptycznego/bakteriobójczego/wirusobójczego. Wstrzyknąć 3 ml jałowego roztworu soli fizjologicznej s.c.

3. Zabiegi pooperacyjne

1. Trzymaj szczura na poduszce grzewczej po operacji. Należy podać szczurowi jedną dawkę 0,05 mg/kg buprenorfiny we wstrzyknięciu domięśniowym (i.m.). Podczas procedury rekonwalescencji należy utrzymywać wilgotność oczu i pyska zwierząt. Monitoruj zwierzę, dopóki się nie obudzi i nie zacznie poruszać.
2. Umieść zwierzę w czystej klatce bez ściółki, aż w pełni wyzdrowieje. Po wyzdrowieniu zwierzę zostanie zwrócone do pomieszczenia dla zwierząt i umieszczone indywidualnie.

Wyniki

Dwa tygodnie po urazie pobiera się tętnice szyjne, wykonuje ich przekroje i poddaje analizie morfologicznej. Tętnice są przecinane w poprzek i barwione H&E (Ryciny 1, 2B, C oraz 3). Ściana tętnicy szyjnej szczura zawiera cztery warstwy błony sprężystej, które widoczne są jako różowe linie. Obszar między najbardziej zewnętrzną błoną, błoną sprężystą zewnętrzną (EEL), a najbardziej wewnętrzną błoną, błoną sprężystą wewnętrzną (IEL), stanowi warstwa mięśni gładkich błony środkowej (Rycina 1

Dyskusja

Uraz balonika szyjnego szczura został dobrze opisany przez Tulisa w 2007 roku^{, 34}. Wszystkie szczegóły tej procedury zostały kompleksowo omówione przez dr Tulisa. Czytelnikom, którzy są zainteresowani wykonaniem tej procedury, zdecydowanie zaleca się zapoznanie się z protokołem Tulisa. Jest jednak jedna rzecz, z którą się nie zgadzamy z dr Tulisem: zamiast napełniać balon solą fizjologiczną lub jakimkolwiek płynem, zasugerowaliśmy, aby napompować go powietrzem. Zgodnie z naszym osobistym doświadczeniem, pompowanie płynem z trudem ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Cewniki do embolektomii balonowej Fogarty'ego, 2 francuskie	Edwards Lifesciences, Niemcy	120602F Płytka
operacyjna Deltaphase - Zawiera 2 pady i 2 izolatory	Braintree Scientific, Inc.	Źródło światła LED 39OP
	Fisher Scientific	12-563-501
Kleszczyki do komarów Hartmann 4" zakrzywiona	pasieka Medical, Inc. San Diego, CA	gS 22.1670
Zwijacz Crile 4" dwustronna	pasieka Medical, Inc.	gS 34.1934
Inne narzędzia chirurgiczne	Roboz Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg, MD
Dożylne obwodowe (IV) Kaniula, 24 G	BD	381312
Ketamina HCl, 100 mg/ml, 10 ml	Ketaset- Patterson Vet	07-803-6637
Ksylazyna (AnaSed), 20 mg / ml, 20 ml	Ketaset- Patterson Vet	07-808-1947
Buprenex, 0,3 mg / 1 ml (5 ampułek / pudełko)	Ketaset - Patterson Vet	07-850-2280
Balsam do depilacji olejkiem Nair - 9 uncji	Amazon/Walmart/CVS	N/A
Urządzenie do pompowania	Demax Medical	DID30
D300 3-kierunkowy kran	B.Braun Medical Inc.
Maść na sztuczne łzy	Rugby Laboratories, Duluth, GA	N/A

4599543