Prezentujemy metodę przygotowania dwuwarstwowych lipidów na podłożu miki do mikroskopii o wysokiej rozdzielczości. Mika jest przezroczysta i płaska w skali atomowej, ale rzadko stosowana w obrazowaniu ze względu na trudności w obsłudze; Nasze przygotowanie skutkuje równomiernym osadzaniem się arkusza miki i zmniejsza ilość materiału używanego do przygotowania dwuwarstwowego.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Przygotowanie dwuwarstw lipidowych na podłożu miki do obrazowania mikroskopii optycznej o wysokiej rozdzielczości
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Obsługiwane dwuwarstwy lipidowe (SLB) są powszechnie używane jako model do badania właściwości błony (separacja faz, grupowanie, dynamika) i jej interakcji z innymi związkami, takimi jak leki czy peptydy. Jednak charakterystyka SLB różni się w zależności od zastosowanego wsparcia.
Powszechnie stosowanymi technikami obrazowania i pomiarów SLB są mikroskopia fluorescencyjna pojedynczych cząsteczek, FCS i mikroskopia sił atomowych (AFM). Ponieważ większość badań obrazowania optycznego przeprowadza się na szklanym podłożu, podczas gdy AFM wymaga wyjątkowo płaskiej powierzchni (zwykle miki), wyników tych technik nie można bezpośrednio porównać, ponieważ właściwości ładunku i gładkości tych materiałów silnie wpływają na dyfuzję. Niestety, wysoki poziom zręczności manualnej wymagany do cięcia i przyklejania cienkich plasterków miki do szkiełka stanowi przeszkodę w rutynowym stosowaniu miki do przygotowania SLB. Chociaż byłaby to metoda z wyboru, tak przygotowane powierzchnie mikowe często okazują się nierówne (faliste) i trudne do zobrazowania, zwłaszcza przy małych odległościach roboczych, obiektywach o dużej aperturze numerycznej. W tym artykule przedstawiamy prostą i powtarzalną metodę przygotowania cienkich, płaskich powierzchni miki do osadzania pęcherzyków lipidowych i preparacji SLB. Dodatkowo, nasza wykonana na zamówienie komora wymaga tylko bardzo małych objętości pęcherzyków do tworzenia SLB. Cała procedura skutkuje wydajną, prostą i niedrogą produkcją wysokiej jakości dwuwarstwowych powierzchni lipidowych, które są bezpośrednio porównywalne z tymi stosowanymi w badaniach AFM.
Wprowadzenie
Ogólnym celem obecnego protokołu jest pokazanie metody przygotowania powierzchni miki do obrazowania w wysokiej rozdzielczości dwuwarstw lipidowych na podłożu miki (SLB) za pomocą optycznej mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRFM) lub mikroskopii konfokalnej, która mogłaby być również połączona z mikroskopią sił atomowych (AFM).
SLB są powszechnie używanym modelem do licznych badań nad grupowaniem lipidów, separacją faz, dynamiką składników dwuwarstwowych lub ich interakcjami z peptydami, białkami lub innymi związkami1-5. Do tworzenia SLB mogą być wykorzystywane różne podłoża (tj. szkło, mika, dwutlenek krzemu, polimery) w zależności od charakteru badania4,6-8. Typowe badania membranowe opierają się na technikach obrazowania opartych na mikroskopii, takich jak TIRFM i AFM. Tak więc w przypadku obrazowania TIRFM typowy wybór jest szklaną powierzchnią, ponieważ szkło jest przezroczyste. Przygotowanie szkła jest stosunkowo łatwe, a o jakości wyników decyduje przede wszystkim dokładne oczyszczenie powierzchni przed osadzaniem się pęcherzyków lipidowych. AFM ze względu na wysoką rozdzielczość osiową wymaga powierzchni mikowych. Mika jest minerałem krzemianowym, o prawie idealnej łupliwości podstawowej. Tak więc świeżo rozszczepiona mika jest atomowo płaska, co pozwala na obserwację różnic wysokości membrany nawet w skali subnanometrowej9.
Badania dyfuzji przy użyciu metod takich jak spektroskopia korelacji fluorescencji (FCS), śledzenie pojedynczych cząsteczek (SMT) i odzyskiwanie fluorescencji po fotowybielaniu (FRAP) wykazały jednak, że dynamika błon lipidowych zależy w dużej mierze od rodzaju powierzchni, na której są osadzone, przy czym szkło i mika mogą dawać bardzo zróżnicowane wyniki10,11. Różnice te obejmują nie tylko współczynniki dyfuzji sond membranowych, ale także wykrywanie oddzielnych populacji cząstek dyfundujących z różną szybkością i ewentualnie przełączających się między różnymi stanami.
Tak więc, bezpośrednie porównanie wyników uzyskanych przy użyciu technik TIRFM i AFM jest często problematyczne, chyba że ta sama powierzchnia (w tym przypadku mika) jest używana. Chociaż istnieją badania, w których obrazowanie dwuwarstwowe TIRFM i AFM przeprowadzono na tej samej powierzchni miki12,13, mika jest rzadko stosowana w mikroskopii optycznej, głównie z powodu problemów z obsługą. Przygotowanie miki wymaga ręcznego pokrojenia na cienkie listki, które następnie przykleja się do szkiełka nakrywkowego za pomocą kleju optycznego12. Ta metoda wymaga jednak pewnej wprawy, aby osiągnąć zadowalające rezultaty. Co więcej, uzyskane powierzchnie są często pofalowane i grube, co utrudnia ich użycie przy małych odległościach roboczych i dużych obiektywach o dużej przysłonie numerycznej.
Powierzchnie miki przygotowane zgodnie z opisem w tym protokole są bardzo cienkie (~220 μm, w tym grubość szkiełka nakrywkowego 170 μm) i ekstremalnie płaskie, unikając "falistości", która jest kluczowa dla udanego obrazowania w wysokiej rozdzielczości. Mogą być używane do konfiguracji TIRFM lub konfokalnych. Co więcej, te same próbki mogą być przenoszone do AFM, a nawet obrazowane jednocześnie za pomocą TIRFM/konfokalnego i AFM. Połączenie tych dwóch technik pozwala na bezpośrednią korelację zachowania dyfuzji ze strukturą błony dwuwarstwowej14. Ponieważ powierzchnie miki są świeżo rozłupane, są czyste i nie wymagają czasochłonnych, słabo powtarzalnych i potencjalnie niebezpiecznych procedur czyszczenia (protokoły czyszczenia szkła zwykle obejmują chemikalia, takie jak roztwór piranii, kwas siarkowy, wodorotlenek sodu/potasu). Zamontowanie małej komory, również opisanej w protokole, zmniejsza objętość pęcherzyków potrzebnych do skutecznego tworzenia dwuwarstw do mniej niż 50 μl. Wreszcie, cały proces montażu powierzchni nie jest czasochłonny (przygotowanie zajmuje mniej niż 30 min) i nie wymaga dużego stopnia umiejętności manualnych, jak ma to miejsce w przypadku konwencjonalnego łupania i klejenia miki.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie miki i preparatów
- Umieść szkiełka nakrywkowe nr 11/2 (0,17 mm) w stojaku do barwienia.
- Sonikować przez 30 minut w 2% detergencie w temperaturze 60 °C.
- Umyć 20 razy wodą dejonizowaną.
- Usuń szkiełka za pomocą kleszczy i wysusz suszarką za pomocą sprężonego powietrza lub azotu.
- Pokrój arkusz miki na kwadratowe kawałki o wymiarach 10 x 10 mm za pomocą nożyczek lub żyletki.
- Pokrój każdy kawałek miki na 2-3 cieńsze listki za pomocą żyletki.
UWAGA: Ten krok wymaga użycia ostrego ostrza.
2. Montaż miki i montaż komory
- Wyczyść mikroskopijne szkiełko szkiełkowe etanolem.
- Przyklej ulotkę z miki wyciętej w kroku 1.6 do szkiełka za pomocą kleju optycznego. Zaleca się stosowanie kleju o niskiej lepkości, aby lepiej rozprowadzić kroplę i przykleić mikę.
- Utwardzać w lampie UV, 10 min.
UWAGA: Klej jest utwardzany światłem UV z maksymalną absorpcją w zakresie od 350 do 380 nm, a zalecana energia wymagana do pełnego utwardzenia to 4,5 J/cm2. Na tym etapie można jednak użyć różnych źródeł światła (patrz materiały dostarczone przez dostawcę kleju). - Odsłoń czystą powierzchnię miki, usuwając kilka pierwszych warstw taśmą klejącą.
- Umieść małą kroplę (~20 μm) kleju optycznego na powierzchni miki.
UWAGA: Na tym etapie zaleca się klej o wysokiej lepkości i niskim poziomie autofluorescencji. Z naszego doświadczenia wynika, że stosowanie kombinacji klejów o niskiej (krok 2.2) i wysokiej lepkości znacznie zwiększa skuteczność rozszczepiania miki (krok 2.7). - Delikatnie umieść świeżo oczyszczone szkiełko nakrywkowe na kropli kleju, unikając pęcherzyków powietrza, pozostaw na 1 minutę.
- Utwardzać w lampie UV, 10 min.
UWAGA: po tym etapie kanapka ze szkiełka podstawowego, miki i szkiełka nakrywkowego może być przechowywana przez stosunkowo długi okres czasu (do kilku tygodni). Przejdź do następnego kroku tuż przed właściwym przygotowaniem SLB, aby upewnić się, że powierzchnia miki jest świeża.
UWAGA: Klej jest utwardzany światłem UV z maksymalną absorpcją w zakresie od 350 do 380 nm, a zalecana energia wymagana do pełnego utwardzenia to 4,5 J/cm2. Na tym etapie można jednak użyć różnych źródeł światła (patrz materiały dostarczone przez dostawcę kleju). - Za pomocą noża Exacto delikatnie zdemontuj szkiełko nakrywkowe z bocznego szkiełka podstawowego, jak pokazano na filmie. W większości przypadków cienka i płaska warstwa miki pozostanie przymocowana do szkiełka nakrywkowego. Mika przymocowana do szkiełka może być ponownie użyta (powtórz od kroku 2.4).
- Sprawdź jakość powierzchni gołym okiem lub pod mikroskopem preparacyjnym, aby upewnić się, że warstwa miki jest nadal przyklejona do szkiełka nakrywkowego i nie została całkowicie usunięta podczas rozłupywania w kroku 2.8. Wykonanie małego zadrapania za pomocą kleszczy lub igły preparacyjnej pomoże odróżnić klej, który ma zauważalnie inną konsystencję niż mika.
- Usuń gumową uszczelkę z nakrętki fiolki o pojemności 1,5 ml i przyklej nakrętkę do góry nogami do powierzchni za pomocą kleju optycznego lub lakieru do paznokci i utwardź lampą UV lub pozostaw do wyschnięcia na powietrzu odpowiednio 10 minut.
UWAGA: Jeśli próbka jest przygotowywana do jednoczesnego obrazowania optycznego (TIRFM lub konfokalnego) z AFM, nasadka na fiolkę o pojemności 1,5 ml może być zbyt mała, aby zamontować głowicę AFM na stoliku mikroskopu. W takim przypadku nasadkę można zastąpić dowolnym o-ringiem z tworzywa sztucznego o większej średnicy, odpowiednim do montażu na głowicy AFM. W przypadku, gdy eksperyment wymaga zdjęcia nakrętki bez uszkodzenia powierzchni miki, zamiast kleju lub lakieru do paznokci można użyć smaru silikonowego.
3. Wspomagane tworzenie dwuwarstwy lipidowej (SLB)
- Świeżo przygotowany roztwór liposomowy umieścić w komorze z powierzchnią. Minimalna objętość wymagana do utworzenia SLB to ~30 μl.
UWAGA: Aby uzyskać więcej informacji na temat tworzenia liposomów i SLB, zapoznaj się z opublikowanymi protokołami, takimi jak Bag i wsp., 201415. - Kontynuuj tworzenie SLB przy użyciu żądanego protokołu. Podczas inkubacji i obrazowania komora może być umieszczona w bloku grzewczym lub podgrzewanym stoliku mikroskopowym, aby utrzymać temperaturę wymaganą do utrzymania używanych lipidów powyżej ich temperatury topnienia.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Zachowanie dyfuzyjne fluorescencyjnych sond lipidowych w SLB różni się w zależności od podłoża. Metoda TIRFM w połączeniu z techniką SMT jest cennym sposobem wizualizacji ruchów cząsteczek i wyznaczania ich współczynników dyfuzji. Sygnały pojedynczych cząsteczek sondy Sphingomyelin-ATTO647N dyfundującej w dwuwarstwie DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) osadzonej na szkle i mice przedstawiono na załączonej animacji. Powierzchnia miki została przygotowana zgodnie z zaprezentowanym tutaj protokołem. Aby...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Protokół ten opisuje metodę przygotowania gładkich i cienkich powierzchni miki do osadzania dwuwarstwowego lipidów i obrazowania w wysokiej rozdzielczości. Technika ta wymaga minimalnych umiejętności manualnych, ograniczających się głównie do starannego demontażu kanapki szkło-mika-szkło (krok 2.8), co ma kluczowe znaczenie dla uzyskania wysokiej jakości powierzchni z miki. W tym momencie zawsze wymagana jest kontrola świeżo rozciętej miki, ponieważ mika może oderwać się od kleju optycznego bez rozszczepienia, pozostawia...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy nie mają żadnych podziękowań.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Szkiełka | Fisher Scientific Scientific | FB15051 | |
| 24 x 50 mm - Nie H1.5 | Marienfeld | 102222 | |
| DOPC | Avanti Polar Lipids | 850357 | |
| Hellmanex III (detergent) | Hellma Analytics | 320.003 | |
| Mica V-1 Klasa | SPI Dostawcy | 1872-CA | |
| Klej optyczny (wysoki lepkość) | Norland Products | NOA63 | |
| Klej optyczny (niska lepkość) | Norland Products | NOA60 | |
| Sphingomyelin-ATTO647N | Lampa UV AttoTec | AD 647N-171 | |
| Synoptics Ltd. | GelVue GVM20 | Lampa została ustawiona na 100% mocy |
Bibliografia
- Giocondi, M. -C., et al. Surface topography of membrane domains. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1798, 703-718 (2010).
- Garcia-Saez, A. J., Schwille, P. Surface analysis of membrane dynamics. Biochim Biophys Acta. 1798, 766-776 (2010).
- Plochberger, B., et al. Cholesterol slows down the lateral mobility of an oxidized phospholipid in a supported lipid bilayer. Langmuir. 26, 17322-17329 (2010).
- El Kirat, K., Morandat, S., Dufrêne, Y. F. Nanoscale analysis of supported lipid bilayers using atomic force microscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1798, 750-765 (2010).
- Szmodis, A. W., Blanchette, C. D., Longo, M. L., Orme, C. A., Parikh, A. N. Thermally induced phase separation in supported bilayers of glycosphingolipid and phospholipid mixtures. Biointerphases. 5, 120-130 (2010).
- Strulson, M. K., Maurer, J. A. Microcontact printing for creation of patterned lipid bilayers on tetraethylene glycol self-assembled monolayers. Langmuir. 27, 12052-12057 (2011).
- Satriano, C., et al. Plasma oxidized polyhydroxymethylsiloxane--a new smooth surface for supported lipid bilayer formation. Langmuir. 26, 5715-5725 (2010).
- Bag, N., Sankaran, J., Paul, A., Kraut, R. S., Wohland, T. Calibration and limits of camera-based fluorescence correlation spectroscopy: a supported lipid bilayer study. Chemphyschem: a European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 13, 2784-2794 (2012).
- Singh, S., Keller, D. J. Atomic force microscopy of supported planar membrane bilayers. Biophysical Journal. 60, 1401-1410 (1991).
- Przybylo, M., et al. Lipid Diffusion in Giant Unilamellar Vesicles Is More than 2 Times Faster than in Supported Phospholipid Bilayers under Identical Conditions. Langmuir. 22, 9096-9099 (2006).
- Scomparin, C., Lecuyer, S., Ferreira, M., Charitat, T., Tinland, B. Diffusion in supported lipid bilayers: influence of substrate and preparation technique on the internal dynamics. Eur Phys J E Soft Matter. 28, 211-220 (2009).
- Oreopoulos, J., Yip, C. M. Combined scanning probe and total internal reflection fluorescence microscopy. Methods. 46, 2-10 (2008).
- Shaw, J. E., Slade, A., Yip, C. M. Simultaneous in situ total internal reflectance fluorescence/atomic force microscopy studies of DPPC/dPOPC microdomains in supported planar lipid bilayers. J Am Chem Soc. 125, 11838-11839 (2003).
- Skaug, M. J., Faller, R., Longo, M. L. Correlating anomalous diffusion with lipid bilayer membrane structure using single molecule tracking and atomic force microscopy. J Chem Phys. 134, (2011).
- Bag, N., Yap, D. H., Wohland, T. Temperature dependence of diffusion in model and live cell membranes characterized by imaging fluorescence correlation spectroscopy. Biochimica et Biophysica Acta. , (2013).
- Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology. J Struct Biol. 151, 182-195 (2005).
- Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. J Cell Biol. 189, 777-782 (2010).
- Schutz, G. J., Schindler, H., Schmidt, T. Single-molecule microscopy on model membranes reveals anomalous diffusion. Biophys J. 73, 1073-1080 (1997).
- Matysik, A., Kraut, R. TrackArt: the user friendly interface for single molecule tracking data analysis and simulation applied to complex diffusion in mica supported lipid bilayers. BMC Research Notes. 7, (2014).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
