Prezentujemy metodę przygotowania dwuwarstwowych lipidów na podłożu miki do mikroskopii o wysokiej rozdzielczości. Mika jest przezroczysta i płaska w skali atomowej, ale rzadko stosowana w obrazowaniu ze względu na trudności w obsłudze; Nasze przygotowanie skutkuje równomiernym osadzaniem się arkusza miki i zmniejsza ilość materiału używanego do przygotowania dwuwarstwowego.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Przygotowanie dwuwarstw lipidowych na podłożu miki do obrazowania mikroskopii optycznej o wysokiej rozdzielczości
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Obsługiwane dwuwarstwy lipidowe (SLB) są powszechnie używane jako model do badania właściwości błony (separacja faz, grupowanie, dynamika) i jej interakcji z innymi związkami, takimi jak leki czy peptydy. Jednak charakterystyka SLB różni się w zależności od zastosowanego wsparcia.
Powszechnie stosowanymi technikami obrazowania i pomiarów SLB są mikroskopia fluorescencyjna pojedynczych cząsteczek, FCS i mikroskopia sił atomowych (AFM). Ponieważ większość badań obrazowania optycznego przeprowadza się na szklanym podłożu, podczas gdy AFM wymaga wyjątkowo płaskiej powierzchni (zwykle miki), wyników tych technik nie można bezpośrednio porównać, ponieważ właściwości ładunku i gładkości tych materiałów silnie wpływają na dyfuzję. Niestety, wysoki poziom zręczności manualnej wymagany do cięcia i przyklejania cienkich plasterków miki do szkiełka stanowi przeszkodę w rutynowym stosowaniu miki do przygotowania SLB. Chociaż byłaby to metoda z wyboru, tak przygotowane powierzchnie mikowe często okazują się nierówne (faliste) i trudne do zobrazowania, zwłaszcza przy małych odległościach roboczych, obiektywach o dużej aperturze numerycznej. W tym artykule przedstawiamy prostą i powtarzalną metodę przygotowania cienkich, płaskich powierzchni miki do osadzania pęcherzyków lipidowych i preparacji SLB. Dodatkowo, nasza wykonana na zamówienie komora wymaga tylko bardzo małych objętości pęcherzyków do tworzenia SLB. Cała procedura skutkuje wydajną, prostą i niedrogą produkcją wysokiej jakości dwuwarstwowych powierzchni lipidowych, które są bezpośrednio porównywalne z tymi stosowanymi w badaniach AFM.
Wprowadzenie
Ogólnym celem obecnego protokołu jest pokazanie metody przygotowania powierzchni miki do obrazowania w wysokiej rozdzielczości dwuwarstw lipidowych na podłożu miki (SLB) za pomocą optycznej mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRFM) lub mikroskopii konfokalnej, która mogłaby być również połączona z mikroskopią sił atomowych (AFM).
SLB są powszechnie używanym modelem do licznych badań nad grupowaniem lipidów, separacją faz, dynamiką składników dwuwarstwowych lub ich interakcjami z peptydami, białkami lub innymi związkami1-5. Do tworzenia SLB mogą być wykorzystywane różne podłoża (tj. szkło, mik....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie miki i preparatów
- Umieść szkiełka nakrywkowe nr 11/2 (0,17 mm) w stojaku do barwienia.
- Sonikować przez 30 minut w 2% detergencie w temperaturze 60 °C.
- Umyć 20 razy wodą dejonizowaną.
- Usuń szkiełka za pomocą kleszczy i wysusz suszarką za pomocą sprężonego powietrza lub azotu.
- Pokrój arkusz miki na kwadratowe kawałki o wymiarach 10 x 10 mm za pomocą nożyczek lub żyletki.
- Pokrój każdy kawałek miki na 2-3 cieńsze listki za pomocą żyletki.
UWAGA: Ten krok wymaga użycia ostrego ostrza.
2. Montaż miki i montaż komory
- Wyczyść mikroskopijne szkie....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Zachowanie dyfuzyjne fluorescencyjnych sond lipidowych w SLB różni się w zależności od podłoża. Metoda TIRFM w połączeniu z techniką SMT jest cennym sposobem wizualizacji ruchów cząsteczek i wyznaczania ich współczynników dyfuzji. Sygnały pojedynczych cząsteczek sondy Sphingomyelin-ATTO647N dyfundującej w dwuwarstwie DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) osadzonej na szkle i mice przedstawiono na załączonej animacji. Powierzchnia miki została przygotowana zgodnie z zaprezentowanym tutaj protokołem. Aby.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Protokół ten opisuje metodę przygotowania gładkich i cienkich powierzchni miki do osadzania dwuwarstwowego lipidów i obrazowania w wysokiej rozdzielczości. Technika ta wymaga minimalnych umiejętności manualnych, ograniczających się głównie do starannego demontażu kanapki szkło-mika-szkło (krok 2.8), co ma kluczowe znaczenie dla uzyskania wysokiej jakości powierzchni z miki. W tym momencie zawsze wymagana jest kontrola świeżo rozciętej miki, ponieważ mika może oderwać się od kleju optycznego bez rozszczepienia, pozostawia.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy nie mają żadnych podziękowań.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Szkiełka | Fisher Scientific Scientific | FB15051 | |
| 24 x 50 mm - Nie H1.5 | Marienfeld | 102222 | |
| DOPC | Avanti Polar Lipids | 850357 | |
| Hellmanex III (detergent) | Hellma Analytics | 320.003 | |
| Mica V-1 Klasa | SPI Dostawcy | 1872-CA | |
| Klej optyczny (wysoki lepkość) | Norland Products | NOA63 | |
| Klej optyczny (niska lepkość) | Norland Products | NOA60 | |
| Sphingomyelin-ATTO647N | Lampa UV AttoTec | AD 647N-171 | |
| Synoptics Ltd. | GelVue GVM20 | Lampa została ustawiona na 100% mocy |
Bibliografia
- Giocondi, M. -C., et al. Surface topography of membrane domains. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1798, 703-718 (2010).
- Garcia-Saez, A. J., Schwille, P. Surface analysis of membrane dynamics. Biochim Biophys Acta. 1798, 766-776 (2010)....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
