Artykuł metodologiczny

Zastosowanie nanocząstek fluorescencyjnych do badania przebudowy układu endolizosomalnego przez bakterie wewnątrzkomórkowe

DOI:

10.3791/52058

⸱

2 stycznia 2015

 ,  , 
1Abteilung Mikrobiologie, Fachbereich Biologie/Chemie, Universität Osnabrück

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł opisuje metody syntezy i fluorescencyjnego znakowania nanocząstek (NP). Nanocząsteczki zastosowano w eksperymentach z pogonią za impulsami w celu oznaczenia układu endolizosomalnego komórek eukariotycznych. Manipulację układu endo-lizosomalnego przez aktywność wewnątrzkomórkowego patogenu Salmonella enterica przeprowadzono następnie za pomocą obrazowania żywych komórek i określono ilościowo.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fluorescencyjne nanocząstki (NP) o pożądanych właściwościach chemicznych, optycznych i mechanicznych są obiecującymi narzędziami do oznaczania organelli wewnątrzkomórkowych. W tym miejscu wprowadzamy metodę wykorzystującą nanocząsteczki złoto-BSA-rodaminy do znakowania endo-lizosomalnego układu komórek eukariotycznych i monitorowania manipulacji szlakami komórkowymi gospodarza przez wewnątrzkomórkowy patogen Salmonella enterica. Nanocząsteczki były łatwo internalizowane przez komórki HeLa i lokalizowane w późnych endosomach / lizosomach. Zakażenie Salmonellą wywołało przegrupowanie pęcherzyków i akumulację NP w strukturach błonowych wywołanych przez Salmonellę. Wdrożyliśmy pakiet oprogramowania Imaris do analiz ilościowych obrazów z mikroskopii konfokalnej. Liczba obiektów i ich rozkład wielkości w komórkach niezakażonych różniły się od tych w komórkach zakażonych Salmonellą, co wskazuje na ekstremalną przebudowę układu endolizomalnego przez WT Salmonella.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fluorescencyjne nanocząstki (NPs), w tym nanocząsteczki metali, kropki kwantowe, NP-NP-y polimerowe, NP-y krzemionkowe, kropki węglowe, itd., przyciągnęły znaczną uwagę w ciągu ostatnich dziesięcioleci1,2. W porównaniu z tradycyjnymi barwnikami organicznymi, fluorescencyjne nanocząsteczki wykazują pożądane właściwości chemiczne, optyczne i mechaniczne, takie jak silna siła sygnału, odporność na fotowybielanie i wysoka biokompatybilność3,4. Te zalety sprawiają, że są one metodą z wyboru do wykrywania wewnątrzkomórkowego i obrazowania żywych komórek. Co więcej, za pomocą mikroskopii elektronowej (EM) można dostrzec różne gęste elektronowo nanocząsteczki, co ułatwia ich wykorzystanie do skorelowanej analizy mikroskopowej, co umożliwia połączenie śledzenia żywych komórek z mikroskopią świetlną (LM) i wyższą rozdzielczość na poziomie ultrastrukturalnym za pomocą EM5. Na przykład nanocząsteczki złota od dawna są skutecznie wykorzystywane jako bioczujniki w żywych komórkach do czułej diagnostyki, a także w dziedzinie znakowania immunologicznego6. Ostatnie badania wskazują, że nanocząsteczki złota o różnej wielkości i kształcie mogą być łatwo wchłaniane przez wiele różnych linii komórkowych i rutynowo transportowane przez szlak endosomalny, dlatego mają ogromny potencjał do zastosowania w śledzeniu transportu pęcherzyków wewnątrzkomórkowych i znakowaniu systemu endolizomalnego7,8.

Patogeny mikrobiologiczne, takie jak Salmonella enterica, Shigella flexneri i Listeria monocytogenes, rozwinęły różne mechanizmy inwazji na niefagocytarne komórki gospodarza9. Po internalizacji patogeny, zlokalizowane w cytozolu lub sekwestrowane w przedziałach związanych z błoną, intensywnie oddziałują ze środowiskiem gospodarza i modulują je, aby sprzyjać własnemu przetrwaniu10. Na przykład Salmonella enterica rezyduje i replikuje się w wewnątrzkomórkowym przedziale fagosomalnym zwanym wakuolą zawierającą Salmonellę (SCV) po zakażeniu11. Dojrzewający SCV przemieszcza się w kierunku aparatu Golgiego, przechodząc ciągłe interakcje ze szlakiem endocytarnym i indukuje tworzenie rozległych struktur kanalikowych, takich jak włókna indukowane przez Salmonellę (SIF), kanaliki sortujące nexiny, kanaliki wydzielnicze białka błony nośnej 3 indukowane przez Salmonellę (SCAMP3) itp.12-14. Badanie, w jaki sposób te patogeny bakteryjne manipulują szlakami komórkowymi gospodarza, jest niezbędne do zrozumienia chorób zakaźnych.

Tutaj NPs gold-BSA-rhodamine zostały użyte jako znaczniki płynów do oznaczania komórkowego systemu endo-lizosomalnego gospodarza, a ludzki patogen żołądkowo-jelitowy Salmonella enterica serowar Typhimurium (Salmonella) został użyty jako bakteria modelowa do badania interakcji patogenu ze szlakiem endocytarnym gospodarza. Wewnątrzkomórkowe nanocząsteczki złota-BSA-rodaminy w komórkach niezakażonych i komórkach zakażonych WT Salmonellą lub zmutowanymi szczepami obrazowano za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego (CLSM). Następnie wykorzystano oprogramowanie Imaris do ilościowego określenia rozmieszczenia nanocząsteczek, co wskazuje, że zakażenie Salmonellą wywołało ekstremalną rearanżację endosomów/lizosomów. Podążając za opisem tej metody, analogiczne eksperymenty można zaprojektować w celu śledzenia długoterminowych losów zinternalizowanych nanocząsteczek oraz zbadania wpływu różnych substancji egzogennych lub czynników endogennych na szlak endocytarny komórek eukariotycznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Synteza nanocząstek złota 10 nm (NPs złota)15

  1. Przygotować roztwór A: dodać 2 ml 1% wodnego roztworu chlorku złota do 160 ml Milli-Q lub podwójnie destylowanej wody.
  2. Przygotować roztwór B: dodać 8 ml 1% cytrynianu trisodowego x 2 H2O i 160 μl 1% kwasu garbnikowego do 32 ml Milli-Q lub podwójnie destylowanej wody.
  3. Podgrzej roztwór A i B do temperatury 60 °C i wymieszaj je, mieszając. Natychmiast obserwuj ciemnoniebieski kolor. Obserwuj czerwony kolor po około 15 minutach. Następnie podgrzej do 95°C, odtrzymaj 5 minut i schłodzić roztwór do temperatury RT.
  4. Dodaj kroplę zawiesiny NP na siatkę pokrytą węglem i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu. Sprawdź wielkość i morfologię nanocząsteczek za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

2. Powlekanie złotych nanocząsteczek BSA i etykietowanie estrem N-hydroksysukcynimidylu rodaminy (NHS)16

  1. Dodać 900 μl nanocząsteczek złota do probówki Eppendorfa o pojemności 1,5 ml, odwirować przy 15 000 x g przez 30 min. Opcjonalnie można przygotować wiele probówek jednocześnie.
  2. Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić osad w 900 μl wysterylizowanej wody Milli-Q i dodać 100 μl 2 mg/ml BSA/PBS, mieszać w Vortexie przy 800 obr./min przez 30 min.
  3. W celu usunięcia nadmiaru BSA należy odwirować preparat przy 15 000 x g przez 60 minut.
  4. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić nanocząsteczki gold-BSA w 125 μl PBS, dodać 12,5 μl 1 M wodorowęglanu.
  5. Bezpośrednio przed użyciem należy przygotować 10 mg/ml roztwór rodaminy NHS/DMSO, dodać 30 μl roztworu rodaminy NHS/DMSO do 1 ml zawiesiny gold-BSA NPs. Inkubować reakcję przez 2 godziny (lub O/N) w temperaturze pokojowej podczas mieszania z prędkością 800 obr./min, unikając ekspozycji na światło.
  6. Oczyścić NPs złota-BSA-rodaminy przez dializę przeciwko PBS w temperaturze 4 ºC z 5 zmianami buforu w okresie 36 - 48 godzin.
  7. Aby ustabilizować nanocząsteczki, dodać 10 μl 200 mg/ml BSA/PBS do każdego 1 ml nanocząsteczek złota-BSA-rodaminy. Aby usunąć wolną lub uwolnioną rodaminę BSA, należy odwirować przy 15 000 x g przez 60 minut. Zawiesić osad w 2 mg/ml BSA/PBS, zmierzyć OD520 i przechowywać w temperaturze 4 °C, unikając ekspozycji na światło.
  8. Rozcieńczyć NPs 10 razy Milli-Q lub wodą podwójnie destylowaną, dodać kroplę na siatkę pokrytą węglem i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu. Sprawdź rozmiar i morfologię nanocząsteczek za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM).
    UWAGA: Wszystkie materiały użyte do przygotowania NP zostały wysterylizowane, a operację przeprowadzono w kapturze do hodowli komórkowej lub na ławce obok płomienia.

3. Hodowla komórek HeLa

  1. Komórki HeLa trwale eksprymujące LAMP1-GFP są hodowane w DMEM z 10% płodową surowicą cielęcą (FCS) i hodowane w temperaturze 37 °C w atmosferze zawierającej 5% CO2 .
  2. Wysiewaj komórki o gęstości 50 000 na studzienkę w 8-dołkowym szkiełku komorowym (Ibidi) i inkubuj O/N.

4. Kultura bakterii

  1. Użyj szczepu serowara Salmonella enterica Typhimurium NCTC 12023 typu dzikiego (WT). Dla porównania, należy użyć zmutowanych szczepów ΔssaV wadliwych w SPI2-T3SS i ΔsifA bez kluczowego efektora SifA dla SIF. Użyj szczepów zawierających plazmid pFPV25.1 do konstytutywnej ekspresji wzmocnionego GFP.
    UWAGA: Szczepy bakteryjne są rutynowo hodowane w bulionie Luria-Bertani (LB) z dodatkiem 50 μg/ml karbenicyliny (WT) i LB z dodatkiem 50 μg/ml karbenicyliny i/lub 50 μg/ml kanamycyny (ΔssaV, ΔsifA) wymaganych do utrzymania plazmidów.
  2. Zaszczepić pojedynczą kolonię bakterii w 3 ml LB odpowiednimi antybiotykami i hodować O/N w temperaturze 37 ºC w warunkach wstrząsania w celu napowietrzenia, a następnie rozcieńczyć w stosunku 1:31 w świeżym LB i kontynuować wzrost przez 3,5 godziny. W tym momencie kultury osiągają późną fazę logarytmiczną, a bakterie są wysoce inwazyjne. "Bęben rolkowy" jest wygodny do inkubacji kultur w probówkach z napowietrzaniem.

5. Zakażenie komórek HeLa przez Salmonellę i Gold-BSA-Rhodamine NPs-Taging Pulse Chase (zobacz Rysunek 1 dla schematu)

  1. Zmierzyć OD600 subkulturowanych bakterii i rozcieńczyć do OD600 = 0,2 w 1 ml PBS (~3 × 108 jtk/ml), dodać odpowiednie ilości bakterii do komórek HeLa w 8-dołkowych szkiełkach komorowych, aby osiągnąć wielokrotność infekcji (MOI) 100.
  2. Inkubować przez 30 minut w inkubatorze komórkowym, przemyć 3 razy PBS w celu usunięcia niezinternalizowanych bakterii (ten punkt czasowy ustalono jako 0 godzin po zakażeniu lub 0 godzin p.i.). Dodać 300 μl świeżej pożywki zawierającej 100 μg/ml gentamycyny i przechowywać przez 1 godzinę. Następnie zastąpić pożywkę świeżą pożywką zawierającą 10 μg/ml gentamycyny na pozostałą część czasu inkubacji.
  3. Po inkubacji z pożywką zawierającą 100 μg/ml gentamycyny przez 1 godzinę, pożywkę zastępuje się pożywką do obrazowania (Eagles MEM bez FCS, L-glutaminy, czerwieni fenolowej i wodorowęglanu sodu, z 30 mM HEPES, pH 7,4) zawierającą 10 μg/ml gentamycyny. Nanocząsteczki złoto-BSA-rodaminy dodaje się do komórek HeLa w celu uzyskania końcowego stężenia OD520 = 0,1,
    UWAGA: Nanocząsteczki złota-BSA-rodaminy mogą być również dodawane do komórek przed zakażeniem lub w różnych punktach czasowych p.i.
  4. Po 1 godzinie inkubacji usunąć pożywkę, przemyć 3 razy PBS i dodać 300 μl świeżej pożywki do obrazowania zawierającej 10% FCS i 10 μg/ml gentamycyny na resztę czasu inkubacji.
    UWAGA: Czas trwania inkubacji może się różnić w zależności od stężenia nanocząsteczek i użytych linii komórkowych. W przypadku makrofagów RAW264.7 zaobserwowaliśmy, że 30-minutowa inkubacja z NP o stężeniu OD520 = 0,05 pozwoliła na wystarczającą internalizację.

6. Obrazowanie

  1. Użyj systemu obrazowania konfokalnego, takiego jak konfokalny skaning laserowy (CLSM) lub mikroskop z wirującym dyskiem (SD) z komorą nawilżanego środowiska, aby uzyskać obrazowanie w wysokiej rozdzielczości w różnych punktach czasowych.
  2. Włącz system kontroli temperatury i poczekaj, aż się ustabilizuje. Zoptymalizuj ustawienia obrazowania, takie jak powiększenie, szybkość skanowania, rozdzielczość, stos Z itp. Stosować odpowiednie ustawienia wzbudzenia/emisji dla NP GFP i nanocząsteczek złoto-BSA-rodaminy. W przypadku tego protokołu należy użyć prędkości skanowania 400 Hz, rozdzielczości 512 x 512 pikseli i rozmiaru kroku Z 0,25 μm. Wzbudz GFP i złoto-BSA-rodaminę odpowiednio za pomocą lasera Ar (488 nm) i lasera HeNe (543 nm). Dołącz kanał jasnego pola (BF) do obserwacji kształtu komórek. W przypadku innych systemów mikroskopowych i warunków infekcji ustawienie należy odpowiednio dostosować.
    UWAGA: Użyj tego samego lasera Ar, co źródło światła kanału BF, a sygnał został wykryty za pomocą detektora powielacza zdjęć (PMT).
  3. We wskazanych punktach czasowych zamontuj 8-dołkowe szkiełka komorowe zawierające zainfekowane komórki na stoliku mikroskopu i zapisz obrazy.

7. Analiza obrazów

  1. Użyj oprogramowania do analizy obrazów mikroskopowych (patrz tabela materiałów i sprzętu), aby przeanalizować przebudowę układu endo-lizosomalnego przez wewnątrzkomórkową Salmonellę. Otwórz dane, klikając "Otwórz" i wybierając plik.
    UWAGA: Alternatywnie do ilościowych analiz obrazów można używać pakietów oprogramowania typu open source, takich jak ImageJ lub FIJI.
  2. Na pasku narzędzi obiektów w widoku Surpass kliknij ikonęfigure-protocol-1, aby dodać nowy element powierzchni. Kliknij na figure-protocol-2 (Dalej).
  3. Aby przeanalizować obszar zainteresowania (ROI), wybierz segment ROI. W obszarze wyświetlania sekcja obramowana prostokątem nałożona na obraz reprezentuje ROI. Wprowadź wartości w odpowiednich polach x, y i z- lub bezpośrednio kliknij strzałki w prostokącie podglądu, aby zmienić rozmiar i położenie ROI. Następnie kliknij figure-protocol-3 (Dalej).
  4. Jako kanał źródłowy wybierz kanał 3 (sygnał dla NP Gold-BSA-Rhodamine). Zaznacz opcję wygładzania, aby ustawić gładkość powstałego obszaru. Zdefiniuj wartość ręcznie lub zaakceptuj wartość wygenerowaną automatycznie. W polu Próg wybierz opcję Intensywność bezwzględna.
  5. Aby dostosować próg, wybierz opcję ręczną i ustaw wartość. W obszarze wyświetlania podgląd progu powierzchni jest wyświetlany w kolorze szarym.
  6. Na karcie Klasyfikuj powierzchnie wynikową powierzchnię można filtrować według różnych kryteriów. Domyślnym filtrem jest "liczba wokseli >10", a inne filtry można również uwzględnić, klikając "dodaj". Jeśli filtrowanie nie jest konieczne, usuń wszystkie filtry, klikając przycisk usuwania. Kliknij figure-protocol-4 (Dalej).
  7. Aby zakończyć tworzenie powierzchni, kliknij na figure-protocol-5 (Zakończ). Na liście Obiekt usuń teraz zaznaczenie pola wyboru dla elementu Objętość, a nowo utworzona powierzchnia jest wyświetlana w obszarze wyświetlania.
  8. Eksportuj statystyki. Teraz w widoku Surpass kolor obiektów zmienia się od fioletowego do czerwonego w zależności od ich obszaru. Tabela "Obszar numerów działek" zawiera informacje statystyczne (np. numer identyfikacyjny i obszar obiektów). Wyeksportuj wszystkie statystyki powierzchni 1 do pliku Excel, klikając figure-protocol-6 (Zapisz).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Złote NP-y zostały wygenerowane za pomocą sprawdzonej metody poprzez redukcję kwasu chloroaurowego przez cytrynian i kwas garbnikowy. Jak pokazano na rysunku 2A, zsyntetyzowane nanocząsteczki złota miały kształt quasi-sferyczny i wielkość około 10 nm. Powlekanie BSA i znakowanie rodaminą nie wpłynęło na ich morfologię ani rozmiar (ryc. 2B).

Doniesiono, że nanocząsteczki złota mogą być łatwo pobierane przez różne komórki ssaków i trafiają do systemów endocytarn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Endolizosomalny układ komórek ssaków kontroluje ważne procesy fizjologiczne, w tym wchłanianie składników odżywczych, transdukcję sygnału za pośrednictwem hormonów, nadzór immunologiczny i prezentację antygenu17. Do tej pory do znakowania szlaku endocytarnego i śledzenia badań stosowano różne markery. Na przykład sondy LysoTracker to fluorescencyjne sondy acidotropowe opracowane przez Molecular Probes (Life Technologies, USA) do znakowania lizosomów, które mogą selektywnie gromadzić się w przedziałach komórkow...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Deutsche Forschungsgemeinschaft przez grant Z w ramach Sonderforschungsbereich 944 'Fizjologia i dynamika mikrokompartmentów komórkowych' oraz HE1964/18 w ramach programu priorytetowego 1580.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Chlorek złotaSigma-Aldrich520918
Kwas garbnikowySigma-Aldrich403040
Cytrynian trójsodowySigmaC8532
Albumina surowicy bydlęcejSigmaA2153
NHS-RhodaminePierce46406
DMSOSigmaD8418
HEPESSigmaH3375
GentamycynaApplichemA1492
KanamcyinRothT832
CarbenicillinRoth6344
8-dołkowe szkiełka komoroweIbidi80826poddane hodowli tkankowej, sterylne
oprogramowanie ImarisBitplanew wersji 7.6dostępne różne konfiguracje

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Coto-Garcia, A. M. Nanoparticles as fluorescent labels for optical imaging and sensing in genomics and proteomics. Anal. Bioanal. Chem. 399, 29-42 (2011).
  2. Xie, J., Lee, S., Chen, X. Nanoparticle-based theranostic agents. Adv. Drug Deliv. Rev. 62, 1064-1079 (2010).
  3. Ruedas-Rama, M. J., Walters, J. D., Orte, A., Hall, E. A. Fluorescent nanoparticles for intracellular sensing: a review. Anal. Chim. Acta. 751, 1-23 (2012).
  4. Wu, C., Chiu, D. T. Highly fluorescent semiconducting polymer dots for biology and medicine. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 52, 3086-3109 (2013).
  5. Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Smarr, B. L., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Correlated light and electron microscopic imaging of multiple endogenous proteins using Quantum dots. Nat. Methods. 2, 743-749 (2005).
  6. Kumar, D., Saini, N., Jain, N., Sareen, R., Pandit, V. Gold nanoparticles: an era in bionanotechnology. Expert Opin. Drug Deliv. 10, 397-409 (2013).
  7. Dykman, L. A., Khlebtsov, N. G. Uptake of engineered gold nanoparticles into mammalian cells. Chem. Rev. 114, 1258-1288 (2014).
  8. Chithrani, B. D., Ghazani, A. A., Chan, W. C. Determining the size and shape dependence of gold nanoparticle uptake into mammalian cells. Nano Lett. 6, 662-668 (2006).
  9. Finlay, B. B., Cossart, P. Exploitation of mammalian host cell functions by bacterial pathogens. Science. 276, 718-725 (1997).
  10. Bhavsar, A. P., Guttman, J. A., Finlay, B. B. Manipulation of host-cell pathways by bacterial pathogens. Nature. 449, 827-834 (2007).
  11. Malik-Kale, P., et al. Salmonella - at home in the host cell. Front. Microbiol. 2, 125(2011).
  12. Rajashekar, R., Liebl, D., Seitz, A., Hensel, M. Dynamic remodeling of the endosomal system during formation of Salmonella-induced filaments by intracellular Salmonella enterica. Traffic. 9, 2100-2116 (2008).
  13. Schroeder, N., Mota, L. J., Meresse, S. Salmonella-induced tubular networks. Trends Microbiol. 19, 268-277 (2011).
  14. Drecktrah, D., Knodler, L. A., Howe, D., Steele-Mortimer, O. Salmonella trafficking is defined by continuous dynamic interactions with the endolysosomal system. Traffic. 8, 212-225 (2007).
  15. Slot, J. W., Geuze, H. J. A new method of preparing gold probes for multiple-labeling cytochemistry. Eur. J. Cell Biol. 38, 87-93 (1985).
  16. Zhang, Y., Hensel, M. Evaluation of nanoparticles as endocytic tracers in cellular microbiology. Nanoscale. 5, 9296-9309 (2013).
  17. Pollard, T. D., Earnshaw, W. C., Lippincott-Schwartz, J. Chapter 22. Cell Biology. , (2007).
  18. LysoTracker and LysoSensor Probes. , Life Technologies Corporation. Carlsbad, CA. (2013).
  19. Shi, H., He, X., Yuan, Y., Wang, K., Liu, D. Nanoparticle-based biocompatible and long-life marker for lysosome labeling and tracking. Anal. Chem. 82, 2213-2220 (2010).
  20. Hensel, M. Genes encoding putative effector proteins of the type III secretion system of Salmonella pathogenicity island 2 are required for bacterial virulence and proliferation in macrophages. Mol. Microbiol. 30, 163-174 (1998).
  21. Beuzon, C. R., et al. Salmonella maintains the integrity of its intracellular vacuole through the action of SifA. EMBO J. 19, 3235-3249 (2000).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Zaka enie Salmonellamikroskopia konfokalnananocz steczki z ota z BSAkom rki HeLaprzebudowa p cherzyk wanaliza obrazuznakowanie nanocz steczkami

Powiązane artykuły