Zastosowanie nanocząstek fluorescencyjnych do badania przebudowy układu endolizosomalnego przez bakterie wewnątrzkomórkowe

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje metody syntezy i fluorescencyjnego znakowania nanocząstek (NP). Nanocząsteczki zastosowano w eksperymentach z pogonią za impulsami w celu oznaczenia układu endolizosomalnego komórek eukariotycznych. Manipulację układu endo-lizosomalnego przez aktywność wewnątrzkomórkowego patogenu Salmonella enterica przeprowadzono następnie za pomocą obrazowania żywych komórek i określono ilościowo.

Streszczenie

Fluorescencyjne nanocząstki (NP) o pożądanych właściwościach chemicznych, optycznych i mechanicznych są obiecującymi narzędziami do oznaczania organelli wewnątrzkomórkowych. W tym miejscu wprowadzamy metodę wykorzystującą nanocząsteczki złoto-BSA-rodaminy do znakowania endo-lizosomalnego układu komórek eukariotycznych i monitorowania manipulacji szlakami komórkowymi gospodarza przez wewnątrzkomórkowy patogen Salmonella enterica. Nanocząsteczki były łatwo internalizowane przez komórki HeLa i lokalizowane w późnych endosomach / lizosomach. Zakażenie Salmonellą wywołało przegrupowanie pęcherzyków i akumulację NP w strukturach błonowych wywołanych przez Salmonellę. Wdrożyliśmy pakiet oprogramowania Imaris do analiz ilościowych obrazów z mikroskopii konfokalnej. Liczba obiektów i ich rozkład wielkości w komórkach niezakażonych różniły się od tych w komórkach zakażonych Salmonellą, co wskazuje na ekstremalną przebudowę układu endolizomalnego przez WT Salmonella.

Wprowadzenie

Fluorescencyjne nanocząstki (NPs), w tym nanocząsteczki metali, kropki kwantowe, NP-NP-y polimerowe, NP-y krzemionkowe, kropki węglowe, itd., przyciągnęły znaczną uwagę w ciągu ostatnich dziesięcioleci^1,2. W porównaniu z tradycyjnymi barwnikami organicznymi, fluorescencyjne nanocząsteczki wykazują pożądane właściwości chemiczne, optyczne i mechaniczne, takie jak silna siła sygnału, odporność na fotowybielanie i wysoka biokompatybilność^3,4. Te zalety sprawiają, że są one metodą z wyboru do wykrywania wewnątrzkomórkowego i obrazowania żywych komórek. Co więcej, za pomocą mikroskopii elektronowej (EM) można dostrzec różne gęste elektronowo nanocząsteczki, co ułatwia ich wykorzystanie do skorelowanej analizy mikroskopowej, co umożliwia połączenie śledzenia żywych komórek z mikroskopią świetlną (LM) i wyższą rozdzielczość na poziomie ultrastrukturalnym za pomocą EM⁵. Na przykład nanocząsteczki złota od dawna są skutecznie wykorzystywane jako bioczujniki w żywych komórkach do czułej diagnostyki, a także w dziedzinie znakowania immunologicznego⁶. Ostatnie badania wskazują, że nanocząsteczki złota o różnej wielkości i kształcie mogą być łatwo wchłaniane przez wiele różnych linii komórkowych i rutynowo transportowane przez szlak endosomalny, dlatego mają ogromny potencjał do zastosowania w śledzeniu transportu pęcherzyków wewnątrzkomórkowych i znakowaniu systemu endolizomalnego^7,8.

Patogeny mikrobiologiczne, takie jak Salmonella enterica, Shigella flexneri i Listeria monocytogenes, rozwinęły różne mechanizmy inwazji na niefagocytarne komórki gospodarza⁹. Po internalizacji patogeny, zlokalizowane w cytozolu lub sekwestrowane w przedziałach związanych z błoną, intensywnie oddziałują ze środowiskiem gospodarza i modulują je, aby sprzyjać własnemu przetrwaniu¹⁰. Na przykład Salmonella enterica rezyduje i replikuje się w wewnątrzkomórkowym przedziale fagosomalnym zwanym wakuolą zawierającą Salmonellę (SCV) po zakażeniu¹¹. Dojrzewający SCV przemieszcza się w kierunku aparatu Golgiego, przechodząc ciągłe interakcje ze szlakiem endocytarnym i indukuje tworzenie rozległych struktur kanalikowych, takich jak włókna indukowane przez Salmonellę (SIF), kanaliki sortujące nexiny, kanaliki wydzielnicze białka błony nośnej 3 indukowane przez Salmonellę (SCAMP3) ^itp.12-14. Badanie, w jaki sposób te patogeny bakteryjne manipulują szlakami komórkowymi gospodarza, jest niezbędne do zrozumienia chorób zakaźnych.

Tutaj NPs gold-BSA-rhodamine zostały użyte jako znaczniki płynów do oznaczania komórkowego systemu endo-lizosomalnego gospodarza, a ludzki patogen żołądkowo-jelitowy Salmonella enterica serowar Typhimurium (Salmonella) został użyty jako bakteria modelowa do badania interakcji patogenu ze szlakiem endocytarnym gospodarza. Wewnątrzkomórkowe nanocząsteczki złota-BSA-rodaminy w komórkach niezakażonych i komórkach zakażonych WT Salmonellą lub zmutowanymi szczepami obrazowano za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego (CLSM). Następnie wykorzystano oprogramowanie Imaris do ilościowego określenia rozmieszczenia nanocząsteczek, co wskazuje, że zakażenie Salmonellą wywołało ekstremalną rearanżację endosomów/lizosomów. Podążając za opisem tej metody, analogiczne eksperymenty można zaprojektować w celu śledzenia długoterminowych losów zinternalizowanych nanocząsteczek oraz zbadania wpływu różnych substancji egzogennych lub czynników endogennych na szlak endocytarny komórek eukariotycznych.

Protokół

1. Synteza 10 nm nanocząsteczek złota (Au NPs)¹⁵

1. Przygotować roztwór A: dodać 2 ml 1% wodnego chlorku złota do 160 ml wody Milli-Q lub wody dwukrotnie destylowanej.
2. Przygotować roztwór B: dodać 8 ml 1% cytrynianu trisodowego x 2 H₂O oraz 160 µl 1% kwasu taninowego do 32 ml wody Milli-Q lub wody dwukrotnie destylowanej.
3. Podgrzać roztwory A i B do 60 °C, a następnie zmieszać je podczas mieszania. Natychmiast pojawi się ciemnoniebieski kolor. Po około 15 min zaobserwować kolor czerwony. Następnie podgrzać do 95 °C, utrzymać przez 5 min i schłodzić roztwór do RT.
4. Nanieść kroplę zawiesiny NP na siatkę pokrytą węglem i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu. Sprawdzić wielkość i morfologię NP za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

2. Powlekanie nanocząsteczek złota BSA i znakowanie rhodaminą z estrem N-hydroksysuccynimidylowym (NHS)¹⁶

1. Do probówki Eppendorf o pojemności 1,5 ml dodać 900 μl nanocząsteczek (NPs) złota, a następnie wirować przy 15 000 x g przez 30 min. Opcjonalnie można przygotować kilka probówek jednocześnie.
2. Odlać nadsącz, zawiesić osad w 900 μl sterylnej wody Milli-Q i dodać 100 μl roztworu BSA/PBS o stężeniu 2 mg/ml, a następnie mieszać na vortexie przy 800 rpm przez 30 min.
3. Aby usunąć nadmiar BSA, wirować preparat przy 15 000 x g przez 60 min.
4. Odlać nadsącz i ponownie zawiesić nanocząsteczki złota-BSA w 125 μl PBS, dodając 12,5 µl wodorowęglanu 1 M.
5. Bezpośrednio przed użyciem przygotować roztwór rhodamine NHS/DMSO o stężeniu 10 mg/ml, a następnie dodać 30 µl roztworu rhodamine NHS/DMSO do 1 ml zawiesiny nanocząsteczek złota-BSA. Inkubować reakcję przez 2 h (lub przez noc) w temperaturze pokojowej (RT), mieszając przy 800 rpm i unikając ekspozycji na światło.
6. Oczyścić nanocząsteczki złota-BSA-rhodamine poprzez dializę przeciwko PBS w temperaturze 4 ºC z 5-krotną wymianą buforu w okresie od 36 do 48 h.
7. Aby ustabilizować nanocząsteczki, dodać 10 μl BSA/PBS o stężeniu 200 mg/ml do każdego 1 ml nanocząsteczek złota-BSA-rhodamine. Aby usunąć wolną lub uwolnioną BSA-rhodamine, wirować przy 15 000 x g przez 60 min. Zawiesić osad w BSA/PBS o stężeniu 2 mg/ml, zmierzyć OD₅₂₀ i przechowywać w temperaturze 4 °C, unikając ekspozycji na światło.
8. Rozcieńczyć nanocząsteczki 10-krotnie wodą Milli-Q lub wodą dwukrotnie destylowaną, nanieść kroplę na siatkę pokrytą węglem i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu. Sprawdzić rozmiar i morfologię nanocząsteczek za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM).
   UWAGA: Wszystkie materiały użyte do przygotowania nanocząsteczek zostały wysterylizowane, a operację przeprowadzono w komorze do hodowli komórek lub na blacie obok płomienia.

3. Hodowla komórek HeLa

1. Komórki HeLa trwale eksponujące LAMP1-GFP hoduje się w pożywce DMEM z 10% płodowej surowicy cielęcej (FCS) w temperaturze 37 °C w atmosferze zawierającej 5% CO₂.
2. Komórki wysiewa się w gęstości 50 000 na dołek w 8-dołkowej szkiełku z komorami (Ibidi) i inkubuje przez noc (O/N).

4. Hodowla bakterii

1. Użyć szczepu dzikiego (WT) Salmonella enterica serowaru Typhimurium NCTC 12023. Do porównania należy użyć szczepów mutantów ΔssaV z defektem w SPI2-T3SS oraz ΔsifA pozbawionych kluczowego efektora SifA dla SIF. Należy wykorzystać szczepy zawierające plazmid pFPV25.1 do konstytutywnej ekspresji ulepszonego GFP.
   UWAGA: Szczepy bakteryjne są rutynowo hodowane w bulionie Luria-Bertani (LB) z dodatkiem 50 µg/ml karbenicyliny (WT) oraz LB z dodatkiem 50 µg/ml karbenicyliny i/lub 50 µg/ml kanamycyny (ΔssaV, ΔsifA) w celu utrzymania plazmidów.
2. Pojedynczą kolonię bakterii zaszczepić w 3 ml LB z odpowiednimi antybiotykami i inkubować przez noc (O/N) w temperaturze 37 ºC w warunkach wytrząsania w celu napowietrzania, a następnie rozcieńczyć 1:31 w świeżym LB i kontynuować hodowlę przez 3,5 hr. W tym punkcie czasowym kultury osiągają późną fazę logarytmiczną, a bakterie wykazują wysoką inwazyjność. Do inkubacji kultur w probówkach z napowietrzaniem wygodne jest zastosowanie „walca do inkubacji” (roller drum).

5. Infekcja komórek HeLa bakteriami Salmonella oraz znakowanie metodą pulse-chase z użyciem nanocząsteczek Gold-BSA-Rhodamine (schemat przedstawiono na Rysunku 1)

1. Zmierz OD₆₀₀ subkultur bakterii i rozcieńcz do OD₆₀₀ = 0.2 w 1 ml PBS (~3 × 10⁸ cfu/ml), a następnie dodaj odpowiednią ilość bakterii do komórek HeLa w szkiełkach komorowych 8-dołkowych, aby uzyskać wielokrotność infekcji (MOI) równą 100.
2. Inkubuj przez 30 min w inkubatorze do hodowli komórkowej, przemyj 3 razy PBS w celu usunięcia bakterii niezinternalizowanych (ten punkt czasowy wyznaczono jako 0 h po infekcji, lub 0 h p.i.). Dodaj 300 µl świeżej pożywki hodowlanej zawierającej 100 µg/ml gentamycyny i utrzymuj przez 1 h. Następnie wymień pożywkę na świeżą pożywkę zawierającą 10 µg/ml gentamycyny na pozostały czas inkubacji.
3. Po 1-godzinnej inkubacji w pożywce zawierającej 100 µg/ml gentamycyny, pożywkę wymienia się na pożywkę do obrazowania (Eagles MEM bez FCS, L-glutaminy, czerwieni fenolowej i wodorowęglanu sodu, z 30 mM HEPES, pH 7.4) zawierającą 10 µg/ml gentamycyny. Do komórek HeLa dodaje się NP Gold-BSA-rhodamine, aby uzyskać stężenie końcowe OD₅₂₀ = 0.1.
   UWAGA: NP Gold-BSA-rhodamine można dodać do komórek również przed infekcją lub w różnych punktach czasowych p.i.
4. Po 1 h inkubacji usuń pożywkę, przemyj 3 razy PBS i dodaj 300 µl świeżej pożywki do obrazowania zawierającej 10% FCS i 10 µg/ml gentamycyny na pozostały czas inkubacji.
   UWAGA: Czas inkubacji może się różnić w zależności od stężenia NP i użytych linii komórkowych. W przypadku makrofagów RAW264.7 zaobserwowano, że 30-minutowa inkubacja z NP w stężeniu OD₅₂₀ = 0.05 pozwoliła na wystarczającą internalizację.

6. Obrazowanie

1. Do obrazowania o wysokiej rozdzielczości w różnych punktach czasowych należy użyć systemu obrazowania konfokalnego, takiego jak konfokalny mikroskop skanujący (CLSM) lub mikroskop z dyskiem obrotowym (SD), wyposażonego w komorę z kontrolowaną wilgotnością środowiska.
2. Włączyć system kontroli temperatury i odczekać do momentu jej stabilizacji. Zoptymalizować ustawienia obrazowania, takie jak powiększenie, prędkość skanowania, rozdzielczość, stos Z (Z-stack) itp. Zastosować odpowiednie ustawienia wzbudzenia/emisji dla GFP oraz nanocząsteczek złoto-BSA-rodamina. W niniejszym protokole należy zastosować prędkość skanowania 400 Hz, rozdzielczość 512 x 512 pikseli oraz wielkość kroku Z wynoszącą 0.25 µm. GFP oraz złoto-BSA-rodaminę należy wzbudzać odpowiednio laserem Ar (488 nm) oraz laserem HeNe (543 nm). Należy dołączyć kanał w świetle przechodzącym (BF) w celu obserwacji kształtu komórek. W przypadku innych systemów mikroskopowych i warunków infekcji ustawienia należy odpowiednio dostosować.
   UWAGA: Jako źródło światła dla kanału BF zastosowano ten sam laser Ar, a sygnał był wykrywany za pomocą detektora z fotopowielaczem (PMT).
3. W wyznaczonych punktach czasowych po infekcji (p.i.) należy umieścić na stole mikroskopu szkiełka z komorami 8-dołkowymi zawierającymi zainfekowane komórki i zarejestrować obrazy.

7. Analiza obrazów

1. Użyj oprogramowania do analizy obrazów mikroskopowych (patrz Tabela Materiały i Sprzęt), aby przeanalizować przebudowę systemu endo-lizosomalnego wywołaną przez wewnątrzkomórkowe Salmonella. Otwórz dane, klikając „Open” i wybierając odpowiedni plik.
   UWAGA: Do ilościowej analizy obrazów można alternatywnie wykorzystać otwarte pakiety oprogramowania, takie jak ImageJ lub FIJI.
2. W pasku narzędzi obiektów w widoku Surpass kliknij ikonę, aby dodać nowy element powierzchni. Kliknij (Dalej).
3. Aby przeanalizować obszar zainteresowania (ROI), wybierz segmentację ROI. W obszarze podglądu ROI jest reprezentowane przez zaznaczony prostokątem fragment nałożony na obraz. Wprowadź wartości w odpowiednie pola x, y i z lub kliknij bezpośrednio strzałki w prostokącie podglądu, aby zmienić rozmiar i położenie ROI. Następnie kliknij (Dalej).
4. Jako kanał źródłowy wybierz Kanał 3 (sygnał dla NP Gold-BSA-Rhodamine). Zaznacz opcję „smooth”, aby ustawić wygładzenie wynikowego obszaru. Zdefiniuj wartość ręcznie lub zaakceptuj wartość wygenerowaną automatycznie. W przypadku Progu (Threshold) wybierz opcję Intensywności Bezwzględnej (Absolute Intensity).
5. W celu dostosowania progu wybierz opcję ręczną i ustaw wartość. W obszarze podglądu podgląd progu powierzchni jest wyświetlany w kolorze szarym.
6. W zakładce Klasyfikuj Powierzchnie (Classify Surfaces) wynikową powierzchnię można filtrować według różnych kryteriów. Domyślnym filtrem jest „number of voxels >10”; inne filtry można dodać, klikając „add”. Jeśli filtrowanie nie jest konieczne, usuń wszystkie filtry, klikając przycisk usuwania. Kliknij (Dalej).
7. Aby zakończyć tworzenie Powierzchni, kliknij (Zakończ). W liście Obiektów odznacz teraz pole elementu Volume, a nowo utworzona powierzchnia zostanie wyświetlona w obszarze podglądu.
8. Wyeksportuj statystyki. Teraz w widoku Surpass kolor obiektów zmienia się od fioletowego do czerwonego w zależności od ich powierzchni. Tabela „Plot Numbers Area” wyświetla informacje statystyczne (np. numer ID i powierzchnię obiektów). Wyeksportuj wszystkie statystyki powierzchni 1 do pliku Excel, klikając (Zapisz).

Wyniki

Nanocząstki złota (Au NPs) zostały wytworzone przy użyciu sprawdzonej metody redukcji kwasu chloroaurowego cytrynianem i kwasem taninowym. Jak pokazano na Rysunku 2A, zsyntetyzowane nanocząstki złota miały kształt quasi-sferyczny o rozmiarze około 10 nm. Powlekanie BSA i znakowanie rodaminą nie wpłynęło na ich morfologię ani rozmiar (Rysunek 2B).

Doniesiono, że nanocząsteczki (NP) złota mogą być łatwo pobierane przez różne komórki ssaków i trafiać do systemów ...

Dyskusja

Endolizosomalny układ komórek ssaków kontroluje ważne procesy fizjologiczne, w tym wchłanianie składników odżywczych, transdukcję sygnału za pośrednictwem hormonów, nadzór immunologiczny i prezentację antygenu¹⁷. Do tej pory do znakowania szlaku endocytarnego i śledzenia badań stosowano różne markery. Na przykład sondy LysoTracker to fluorescencyjne sondy acidotropowe opracowane przez Molecular Probes (Life Technologies, USA) do znakowania lizosomów, które mogą selektywnie gromadzić się w przedziałach komórkow...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Chlorek złota	Sigma-Aldrich	520918
Kwas garbnikowy	Sigma-Aldrich	403040
Cytrynian trójsodowy	Sigma	C8532
Albumina surowicy bydlęcej	Sigma	A2153
NHS-Rhodamine	Pierce	46406
DMSO	Sigma	D8418
HEPES	Sigma	H3375
Gentamycyna	Applichem	A1492
Kanamcyin	Roth	T832
Carbenicillin	Roth	6344
8-dołkowe szkiełka komorowe	Ibidi	80826	poddane hodowli tkankowej, sterylne
oprogramowanie Imaris	Bitplane	w wersji 7.6	dostępne różne konfiguracje