Oznaczanie stężenia wirusa za pomocą testów płytki nazębnej: przy użyciu tradycyjnych i nowatorskich systemów nakładek

Podsumowanie

Testy płytki nazębnej są złotym standardem w kwantyfikacji wirusa, wykorzystując nakładki pułapkowe na monowarstwy komórkowe gospodarza do określenia miana wirusa. Podczas gdy tradycyjnie stosuje się różne półstałe nakładki, tutaj demonstrujemy techniki płytki nazębnej, porównując półstałe nakładki z nową ciekłą celulozą mikrokrystaliczną wśród kilku rodzin wirusów.

Streszczenie

Testy płytki pozostają jedną z najdokładniejszych metod bezpośredniego oznaczania ilościowego zakaźnych wironów i substancji przeciwwirusowych poprzez liczenie dyskretnych blaszek (jednostek zakaźnych i martwych stref komórkowych) w hodowli komórkowej. Tutaj pokazujemy, jak wykonać podstawowy test płytki nazębnej oraz jak różne nakładki i techniki mogą wpływać na tworzenie i produkcję płytki nazębnej. Zazwyczaj stałe lub półstałe podłoża nakładkowe, takie jak agaroza lub karboksymetyloceluloza, były stosowane w celu ograniczenia rozprzestrzeniania się wirusa, zapobiegając masowemu zakażeniu przez płynną pożywkę wzrostową. Unieruchomione nakładki ograniczają infekcję komórkową do bezpośrednio otaczającej monowarstwy, umożliwiając tworzenie dyskretnych policzalnych ognisk i późniejsze tworzenie się blaszki miażdżycowej. Aby przezwyciężyć trudności związane ze stosowaniem tradycyjnych nakładek, nowatorska płynna nakładka wykorzystująca celulozę mikrokrystaliczną i sól sodową karboksymetylocelulozy jest coraz częściej stosowana jako zamiennik w standardowym teście płytki nazębnej. Testy płytki nazębnej z płynną powłoką można łatwo wykonać w standardowych formatach płytek 6- lub 12-dołkowych, zgodnie z tradycyjnymi technikami i nie wymagają specjalnego sprzętu. Ze względu na stan ciekły oraz późniejszą łatwość aplikacji i usuwania, formaty płytek do mikrokultur mogą być alternatywnie wykorzystywane jako szybka, dokładna i wysokowydajna alternatywa dla miareczkowania wirusów na większą skalę. Zastosowanie nieogrzewanego, lepkiego ciekłego polimeru daje możliwość usprawnienia pracy, oszczędza odczynniki, miejsce w inkubatorze i zwiększa bezpieczeństwo operacyjne w przypadku stosowania w tradycyjnych laboratoriach lub laboratoriach o wysokim stopniu hermetyzacji, ponieważ nie jest wymagane podgrzewanie odczynników ani szkło. Płynne nakładki mogą również okazać się bardziej wrażliwe niż tradycyjne nakładki na niektóre wirusy nieprzeporne.

Wprowadzenie

Dokładna izolacja i kwantyfikacja żywych próbek wirusów jest niezmiennie celem badawczym w wirusologii. Dopiero pojawienie się testu płytki nazębnej w 1952 r. po raz pierwszy opracowano sposób ilościowego i jakościowego obliczania miana wirusa zwierzęcego^1,2. Technika ta została po raz pierwszy zaadaptowana i zmodyfikowana na podstawie testów fagowych, które wcześniej były używane do obliczania mian podstawowych bakteriofagów w biologii roślin^1,2. Chociaż od tego czasu opracowano i dostosowano alternatywne metody oznaczania ilościowego wirusów, takie jak testy immunologiczne, mikroskopia elektronowa fluorescencyjna i transmisyjna, przestrajalne wykrywanie impulsów rezystancyjnych (TRPS), cytometria przepływowa, rekombinowane systemy reporterowe i ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją (qRT-PCR), metody te nie są w stanie zidentyfikować i określić ilościowo wironów kompetentnych do replikacji^1,3. Podczas gdy postęp w technologiach i technikach nadal udoskonala i zmienia krajobraz; Testy płytek nazębnych nadal stanowią złoty standard w określaniu stężeń wirusa dla zakaźnych wironów litycznych^1,4.

Podczas testu płytki nazębnej, zlewająca się monowarstwa komórek gospodarza jest infekowana wirusem litycznym o nieznanym stężeniu, który został seryjnie rozcieńczony do policzalnego zakresu, zazwyczaj między 5-100 wirionów. Zainfekowane monowarstwy są następnie pokrywane unieruchamiającą pożywką nakładkową, aby zapobiec masowemu rozprzestrzenianiu się infekcji wirusowej przez mechaniczny lub konwekcyjny przepływ płynnego podłoża podczas rozprzestrzeniania się wirusa. Podczas gdy tradycyjnie stosuje się stałe lub półstałe nakładki, takie jak agaroza, metyloceluloza lub karboksymetyloceluloza (CMC), płynne nakładki stają się coraz bardziej atrakcyjną alternatywą dzięki opracowaniu nowych płynnych nakładek, takich jak Avicel^5–7. Testy płytki nazębnej z wykorzystaniem płynu w porównaniu z tradycyjnymi nakładkami mają kilka zalet, ponieważ nakładkę można nakładać w temperaturze pokojowej, a nakładanie i usuwanie jest znacznie łatwiejsze. Ponieważ płynne nakładki nie wymagają podgrzewania, delikatne i labilne termicznie wirusy mogą również okazać się łatwiejsze do nazębienia.

Po początkowym zakażeniu i zastosowaniu nakładki unieruchamiającej, zaczną rozwijać się pojedyncze blaszki lub strefy śmierci komórki, ponieważ infekcja wirusowa i replikacja są ograniczone do otaczającej monowarstwy. Zainfekowane komórki będą kontynuować cykl replikacji-lizy-infekcji, dalej rozprzestrzeniając infekcję, co skutkuje coraz bardziej wyraźnymi i dyskretnymi blaszkami. W zależności od kinetyki wzrostu wirusa i użytej komórki gospodarza, widoczna płytka nazębna zwykle tworzy się w ciągu 2-14 dni. Monowarstwy komórkowe mogą być następnie liczone za pomocą standardowego mikroskopu jasnego pola lub, co bardziej typowe, utrwalane i wybarwiane przez neutralną czerwień lub kryształ gwałtowny, aby łatwo zidentyfikować blaszki gołym okiem. Dostępna jest szeroka gama plam z płytki nazębnej, z których każda ma swoje specyficzne zalety i wady. Fiolet krystaliczny jest zwykle dodawany w miejscu zbierania i po utrwaleniu/usunięciu nakładki, zapewniając szybkie i wyraźne barwienie przeciwstawne, które pozwala na identyfikację bardzo małych blaszek, gdy obecna jest morfologia mieszana. Neutralna czerwień ma tę zaletę, że wcześnie się nakłada i ma stały kontakt z nakładką, co pozwala na monitorowanie na żywo powstawania płytki nazębnej, co jest szczególnie przydatne podczas pracy z nieznanym wirusem lub kinetyką replikacji. Odkryliśmy jednak, że barwienie zazwyczaj nie jest tak wyraźne w przypadku stosowania neutralnej czerwieni. Bromek 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)-2,5-difenylotetrazolowy (MTT) ma kilka zalet, ponieważ żółty barwnik barwi żywe komórki na ciemnoniebiesko, a blaszki wirusowe można policzyć bez usuwania nakładki, jak w przypadku neutralnej czerwieni. Wysoki kontrast między żywymi i martwymi komórkami zapewniany przez MTT pozwala również na wykrycie małych blaszek we wcześniejszym momencie po zakażeniu, chociaż przechowywanie nadal wymagałoby usunięcia nakładki⁸. Ponieważ fiolet krystaliczny można po prostu wytworzyć w roztworze wody i alkoholu i zapewnia wysoki stopień czułości dla mieszanej morfologii płytki nazębnej, wybraliśmy go jako preferowany i uproszczony barwnik przeciw dla zademonstrowanego protokołu, ponieważ wykorzystujemy kilka rodzin dobrze scharakteryzowanych wirusów.

Po naprawieniu i zabarwieniu zainfekowanej monowarstwy komórkowej, płytki są zliczane w celu mianowania próbek wirusa pod względem jednostek tworzących płytki (pfu) na mililitr. Należy odnotować spadek logarytmu między seryjnymi rozcieńczeniami i, w zależności od wielkości płytki, między 5-100 zliczonymi płytkami, z kontrolą ujemną stosowaną jako odniesienie. Statystycznie próbki będą się różnić o 10% na każde 100 blaszek zliczonych podczas porównywania powtórzeń próbek³. Zaletą stosowania testów płytki nazębnej do określania miana wirusa jest ich zdolność do ilościowego określania rzeczywistej liczby zakaźnych cząstek wirusa w próbce. Ponieważ wiele wirionów może potencjalnie zainfekować pojedynczą komórkę, podczas miareczkowania płytki nazębnej stosuje się terminologię jednostek w porównaniu z wironami^1,2.

Morfologia blaszki może się znacznie różnić w różnych warunkach wzrostu i między gatunkami wirusów. Należy zwrócić uwagę na wielkość płytki nazębnej, przejrzystość, definicję granic i rozmieszczenie, ponieważ mogą one dostarczyć cennych informacji na temat czynników wzrostu i zjadliwości danego wirusa.

Podstawowe zasady testowania płytki nazębnej mogą być również dostosowywane i modyfikowane na wiele różnych sposobów, na przykład przy użyciu testów formowania ostrości (FFA). FFA nie polegają na lizie komórek i barwieniu przeciwstawnym w celu wykrycia tworzenia się płytki nazębnej, ale raczej wykorzystują techniki barwienia immunologicznego do bezpośredniego wykrywania wewnątrzkomórkowych białek wirusowych za pomocą znakowanych przeciwciał. Zwiększona czułość, skrócony czas inkubacji po zakażeniu, a co najważniejsze, zdolność do ilościowego oznaczania wirusów nielitycznych to wyraźne zalety przy stosowaniu FFA. Chociaż jest to szeroko stosowane, krytyczne czynniki ograniczające w FFA w porównaniu z tradycyjnym testem płytki miażdżycowej polegają na potrzebie odpowiednich przeciwciał i możliwości sondowania tylko podjednostek białka wirusa w porównaniu z rzeczywistymi zakaźnymi wironami^4.

Na potrzeby tego badania ograniczymy naszą dyskusję do klasycznych testów płytki nazębnej i opiszemy zastosowanie tradycyjnych nakładek z litego i półstałego materiału (agaroza i CMC), wraz z nowatorskimi nakładkami z ciekłej mikrokrystalicznej celulozy.

Protokół

1. Przygotowanie komórek i odczynników

1. Dzień przed badaniem należy umieścić na płytce odpowiednie komórki gospodarza dla danego wirusa (Tabela 1 i 2) przy 90 - 100% zbieżności.
2. Przygotować roztwór utrwalający 10% formaldehydu w_dH2O. Na przykład zmieszaj 5,56 ml 36% formaldehydu z 14,44 ml destylowanego_H2O(dH₂O).
   UWAGA: Podczas stosowania formaldehydu należy stosować odpowiednie praktyki bezpiecznego obchodzenia się z formaldehydem i wentylacji.
3. Przygotuj plamę fioletu krystalicznego: 1% fioletu krystalicznego (CV) w 20% etanolu i dH₂O.
4. Przygotować 2x pożywkę z płytką nazębną (typ komórek zależny od stężenia 2x; patrz Tabela 2). Przefiltrować za pomocą filtra 0,2 μm, jeśli jakiekolwiek odczynniki nie są sterylne.
5. Przygotowanie nakładek unieruchamiających (Tabela 3)
   1. W przypadku nakładek płynnych należy przygotować sterylny 2,4% roztwór leku Avicel w dH₂O. Aby zapobiec zbrylaniu, dodać proszek do kolby zawierającej wodę, która szybko miesza się z mieszadłem, powoli wlewać Avicel i szybko mieszać w temperaturze pokojowej (RT). Gdy roztwór okaże się zbyt lepki, aby mieszadło mogło się zhomogenizować, należy przełączyć się na wytrząsarkę kolby na >30 minut z silnym mieszaniem, aby zapewnić równomierną homogenizację.
      UWAGA: Roztwory podstawowe można sporządzać w niższych stężeniach, ale roztwory mogą się rozdzielić i będą musiały zostać ponownie wymieszane, aby zapewnić homogenizację. Roztwory robocze Avicel można stosować w zakresie od 0,6-3%.
   2. Po homogenizacji roztwór należy sterylizować w autoklawie i przechowywać szczelnie zamknięty w temperaturze pokojowej.
   3. W przypadku nakładek z agarozy i karboksymetylocelulozy (CMC) należy przygotować roztwór podstawowy w_dH2O o 2% CMC lub 0,6% agarozy. Wymieszaj z mieszadłem i autoklawem lub kuchenką mikrofalową, aby uzyskać do roztworu.

2. Rozcieńczenia i infekcje

1. Dzień po posiewie należy wizualnie sprawdzić zbieżność i żywotność komórek przed rozpoczęciem testu. Upewnij się, że występuje standardowa morfologia komórkowa i ~ 90% zlewającej się monowarstwy.
2. Wykonaj dziesięciokrotne seryjne rozcieńczanie zakaźnych próbek. Użyj pożywki komórkowej do rozmnażania wirusa jako rozcieńczalnika (Tabela 2). Zmieniaj liczbę wymaganych rozcieńczeń w zależności od oczekiwanego miana danego wirusa i zawsze używaj niezakażonej próbki kontrolnej, aby niezależnie zapewnić żywotność komórek i pomóc w identyfikacji płytki nazębnej.
3. Z seryjnych rozcieńczeń infekować komórki przez 45 minut do 1 godziny (Tabela 1). Użyj wystarczającej objętości inokulum, aby pokryć komórki, utrzymując objętość tak niską, jak to możliwe, aby zmaksymalizować kontakt wirusa z monowarstwą (Tabela 4). Delikatnie kołysz płytki co 20 minut, aby zapewnić równomierne pokrycie i zapobiec wysychaniu monowarstwy komórkowej.
4. Po zakażeniu nałożyć odpowiednią objętość pożywki unieruchamiającej bezpośrednio na inokulum w studzience (Tabela 2) przy użyciu mieszanki 1:1 2x pożywki z płytką nazębną i wybranej nakładki unieruchamiającej (CMC, agaroza lub Avicel). Delikatnie kołysz, aby wymieszać.
   1. W przypadku płynnych nakładek należy zmieszać 1:1 z podgrzanym 2x podłożem nazębnym i 1,2 - 2,4% RT stock Avicel, aby uzyskać roztwór roboczy 0,6-1,2% podłoża do nakładek Avicel.
   2. Do nakładki agarozowej należy użyć mieszaniny 1:1 podgrzanej pożywki 2x z płytką nazębną i roztworu podstawowego podgrzanej 0,6% agarozy, umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 56 °C na 30 minut, aby zrównoważyć temperaturę, uzyskując końcowe stężenie agarozy/nakładki 0,3%.
   3. W przypadku CMC należy przygotować 2% roztwór podstawowy i traktować zgodnie z opisem dla nakładki agarozowej.
   4. Podczas nakładania nakładki na monowarstwę należy zawsze równoważyć gorącą agarozę lub CMC w wodzie o temperaturze 56 °C, aby zapobiec uszkodzeniu monowarstwy. Upewnij się, że roztwór jest ciepły, ale nie gorący w dotyku, aby zapobiec śmierci komórek i zmniejszeniu miana wirusa. Większość nakładek agarozowych zaczyna krzepnąć w temperaturze poniżej 42 °C, działa szybko i/lub przygotowuje małe partie, aby zapobiec krzepnięciu podczas przenoszenia.
5. Po dodaniu nakładki inkubuj płytki, aby uzyskać wyraźne płytki, które można wyraźnie policzyć. Tworzenie się płytki nazębnej może trwać od 2 do 14 dni w zależności od analizowanego wirusa, Tabela 1.
   UWAGA: Po umieszczeniu w inkubatorze płytek nałożonych na płyn nie należy ich przesuwać. Przemieszczanie się nakładek płynu w okresie inkubacji spowoduje powstanie rozmazanych blaszek miażdżycowych. Nakładki z agarozy i CMC są półstałe i mogą być okresowo przesuwane lub sprawdzane pod mikroskopem świetlnym w celu monitorowania rozwoju płytki nazębnej.

3. Utrwalanie i barwienie komórek

1. Aby utrwalić komórki, wylej lub odessaj nakładkę Avicel i utrwal komórki za pomocą 10% roztworu formaldehydu przez 30 minut do nocy (<1 ml na studzienkę na płytkę 6-dołkową).
   1. W przypadku agarozy lub CMC bezpośrednio dodawać roztwór formaldehydu do nakładki na 1 godzinę do nocy.
      UWAGA: Próbki mogą być przechowywane przez dłuższy czas w utrwalaczu, pod warunkiem, że nie odparowują i nie wysychają, ponieważ może to zniekształcić monowarstwę.
2. Przed barwieniem i po utrwaleniu wyrzuć formaldehyd i usuń półstałe zatyczki agarozy i CMC pod bieżącą wodą lub ręcznie szpatułką. Spłucz płytki Avicel wodą, aby usunąć resztki nakładki/utrwalacza przed barwieniem.
3. W celu barwienia przykryj komórki minimalną ilością roztworu fioletu krystalicznego na ~15 min. W razie potrzeby płyty skalne, aby zapewnić równomierne pokrycie.
4. Delikatnie zmyj plamę z fioletu krystalicznego wodą. Po utrwaleniu, wybarwieniu i wysuszeniu przechowuj płytki nazębne na czas nieokreślony do przyszłej analizy.

4. Określanie mian wirusów

1. Policz blaszki w każdym studzince, biorąc średnią dla wszelkich kontrprób technicznych o tym samym rozcieńczeniu. W przypadku dużych formatów płyt należy dyskontować studzienki zawierające mniej niż 5 lub więcej niż 100 tabliczek. Zwróć uwagę na rozmiar i morfologię płytki. Kontrola ujemna powinna mieć jednolitą monowarstwę i może być stosowana jako kontrola referencyjna.
2. Określić miano wirusa w próbce podstawowej, biorąc średnią liczbę blaszek do rozcieńczenia i odwrotność całkowitego współczynnika rozcieńczenia.

UWAGA: Na przykład, 30 i 32 tabliczki policzone dla powtórzeń rozcieńczenia 1 x ^10-7 [31 (średnia)/^10-7 (rozcieńczenie) x 0,4 ml (inokulum)] dałyby miano 7,75 x 10⁸ pfu/ml.

Wyniki

Zdolność testów płytki do dokładnej oceny miana wirusa zależy od wielu czynników: odpowiedniego doboru komórek gospodarza, właściwej pożywki i warunków wzrostu dla żywotności komórkowej i wirusowej, unieruchomionej propagacji wirusa oraz dokładnego określenia okresu inkubacji wirusa, aby zapewnić odpowiedni czas na tworzenie się wyraźnych i policzalnych blaszek.

Do tego badania, wirusy z trzech reprezentatywnych rodzin zostały wybrane, aby wykazać różnice w: selekcji nakładek, okresach inkubacji i morfologii płytki w różnych typach próbek. Wenezuelskie zapalenie mózgu koni (VEEV) zostało wybrane jako model wirusa (+)ssRNA, który może powodować poważne choroby u gatunków koni i ludzi i reprezentuje rodzinę Togaviridae. Szczep Influenza B Taiwan, segmentowany wirus (-)ssRNA atakujący głównie ludzi, reprezentuje rodzinę Orthomyxoviridae. Wirus gorączki doliny Rift (RVFV), wirus stawonogów (-)ssRNA, atakujący głównie stawonogi, przeżuwacze i ludzi, został wybrany jako przedstawiciel rodziny Bunyaviridae.

Dla RVFV (Rysunek 1), miana zostały określone z podstawowego roztworu rekombinowanego, żywego, osłabionego szczepu MP12 RVFV w formacie 12-dołkowej płytki przy użyciu nakładek CMC, agarozy lub Avicel, które były inkubowane obok siebie przez 72 godziny po infekcji (hpi). Reprezentatywną płytkę pokazującą rozcieńczenia w zakresie od ^10-4 do ^10-7 można zobaczyć w Panelu A. Płytki z użyciem nakładek CMC i agarozy wykazały małe, wyraźne i wyraźne blaszki z dobrze zdefiniowaną okrągłą obwódką. Blaszki z płynną nakładką były nieco liczniejsze i większe w porównaniu z blaszkami agarozowymi i CMC oraz zapewniały mniej wyraźną obwódkę. Miana wirusów porównano w Panelu B, przy czym wszystkie nakładki działały porównywalnie.

W celu uzyskania wyraźniejszego wizualnego porównania między nakładkami dla MP12 wraz z większą wielkością próbki w celu określenia odtwarzalności, przetestowano również płytkę 6-dołkową w trzech egzemplarzach (Rysunek 2). W formacie płytki 6-dołkowej zastosowanie nakładki CMC wykazało mniejsze blaszki niż nakładki agarozowe lub płynne, które były porównywalne pod względem wielkości. Podczas gdy miana wirusa były podobne we wszystkich trzech nakładkach (Panel D), blaszki utworzone w nakładkach agarozowych i płynnych okazały się łatwiejsze do policzenia ze względu na ich zwiększony rozmiar.

W przeciwieństwie do RVFV, miana VEEV i morfologia płytki wśród różnych nakładek różniły się znacznie (Rysunek 3A). Blaszki utworzone w nakładkach CMC wykazały wyraźną i wyraźną morfologię przy użyciu formatu płytki 12-dołkowej, kosztem wielkości płytki i czułości (Panel B). W przeciwieństwie do CMC, zastosowanie nakładek agarozowych i płynnych skutkowało znacznie większymi blaszkami, co wskazuje na mniejsze hamowanie wirusa i zwiększoną wrażliwość na replikację VEEV. Zostało to wcześniej potwierdzone wyłącznie podczas porównywania agarozy z CMC w artykule opublikowanym przez Juarez i wsp.⁴. Podczas gdy nakładki agarozowe i cieczy wytwarzały większe blaszki niż CMC, płytki miały słabo zdefiniowane granice i były trudne do policzenia w formacie 12-dołkowym, przy czym płynne nakładki zapewniały największą dyfuzję granic. Kiedy płytki były testowane na płytkach 6-dołkowych (ryc. 4), większy format 6-dołkowy zanegował problem nadmiernie dużych blaszek, które były trudne do rozróżnienia w formacie 12-dołkowym, przy czym nakładki agarozowe i ciekłe okazały się lepsze od nakładek CMC pod względem definicji płytki nazębnej i wrażliwości (ryc. 4D).

W porównaniu do RVFV lub VEEV, grypa dostarcza kilku unikalnych wyzwań podczas plakacji, takich jak wymóg zewnętrznej proteazy. Wrażliwość wirusa grypy na różne rodzaje nakładek została również dobrze udokumentowana w przeszłości, ponieważ zauważono znaczące zmiany, gdy zastosowano modyfikacje tak niewielkie, jak różne marki agarozy⁹.

Co ciekawe, dla szczepu Influenza B Taiwan, użycie CMC jako nakładki skutkowało znacznie mniejszymi blaszkami, które były trudne do policzenia i okazały się trudne do wiarygodnego oceny (Rysunek 5A). Zastosowanie nakładki agarozowej zapewniło najlepsze płytki nazębne (Panel C) i spowodowało ciemniejsze zabarwienie tła (prawdopodobnie z powodu zwiększonej żywotności monowarstwy) oraz wykazało wyraźniejsze i ostrzejsze płytki w bezpośrednim porównaniu z zastosowaniem nakładki płynnej (Panel B).

Wyraźna przewaga płynnych polimerów nad stałymi i półstałymi nakładkami, takimi jak agaroza i CMC, polega na łatwości usuwania i aplikacji. Powłoki półstałe wymagają podgrzania, a krzepnięcie może okazać się problematyczne podczas przenoszenia i usuwania. Aby wykorzystać te zalety i określić praktyczność wykorzystania Avicel w sposób wysokoprzepustowy dla RVFV, przetestowano format płytki 96-dołkowej przy różnych stężeniach nakładki (ryc. 6). W przypadku RVFV MP-12 rozcieńczenia przeprowadzono czterokrotnie przy końcowych stężeniach 0,6 i 1,2% produktu Avicel. Nakładanie i usuwanie nakładek okazało się proste, nie odnotowano żadnych widocznych różnic między powtórzeniami ani między stężeniami, co świadczy o wysokim stopniu odtwarzalności. Podczas punktacji płytki były wyraźne i policzalne gołym okiem, co wykazało możliwość wykorzystania płynnych nakładek w sposób wysokoprzepustowy dla RVFV.

Rysunek 1: Porównanie nakładek płytki nazębnej RVFV z wykorzystaniem płytek 12-dołkowych. Veros posiano w 2,5 x 10⁵ komórek na płytkach 12-dołkowych i zainfekowano 200 μl przy użyciu tej samej seryjnie rozcieńczonej próbki wyjściowej MP12. Po zakażeniu nałożono 1,5 ml nakładek 0,3% agarozy, 0,6% Avicel lub 1% CMC (stężenia końcowe) w celu bezpośredniego porównania nakładek, jak pokazano w Panelu A. Płytki policzono i mianowano w Panelu B.

Rysunek 2: Porównanie nakładek płytki nazębnej RVFV z wykorzystaniem płytek 6-dołkowych. Veros posiano w^{5 x} 10 5 komórek na płytkach 6-dołkowych i zainfekowano 400 μl przy użyciu tej samej seryjnie rozcieńczonej próbki wyjściowej MP12. Zastosowano trzy ml nakładek 0,3% agarozy, 0,6% Avicel lub 1% CMC w celu bezpośredniego porównania nakładek, jak pokazano w Panelu A, B i C. Oddzielne eksperymenty przeprowadzono identycznie, jak opisano dla paneli A-C, z tabliczkami policzonymi i namiarowanymi w Panelu D (N = 3).

Rysunek 3: Porównanie nakładek płytki VEEV z wykorzystaniem płytek 12-dołkowych. Veros posiano w 2,5 x 10⁵ komórek na płytkach 12-dołkowych i zakażono 200 μl przy użyciu tej samej seryjnie rozcieńczonej próbki wyjściowej szczepu szczepionki VEEV TC-83. Po zakażeniu nałożono 1,5 ml nakładek zawierających 0,3% agarozy, 0,6% Avicel lub 1% CMC w celu bezpośredniego porównania nakładek, jak pokazano w Panelu A. Płytki zostały policzone i zniekształcone w Panelu B.

Rysunek 4: Porównanie nakładek płytki V EEV z wykorzystaniem płytek 6-dołkowych. Veros posiano w 5 x^{10 5} komórek na płytkach 6-dołkowych i zainfekowano 400 μl przy użyciu tej samej seryjnie rozcieńczonej próbki wyjściowej VEEV TC-83. Po zakażeniu nałożono 3 ml nakładek z 0,3% agarozy, 0,6% Avicel lub 1% CMC, w celu bezpośredniego porównania nakładek, jak pokazano w panelach A, B i C. Przeprowadzono oddzielne eksperymenty identycznie jak opisano dla paneli A - C, z tabliczkami policzonymi i nachylonymi w panelu D (N = 3).

Rycina 5: Porównanie nakładek na płytki przeciw grypie. Komórki MDCK posiano w 5 x 10^{5 komórek} na płytkach 6-dołkowych i zainfekowano 400 μl inokulum przy użyciu tej samej seryjnie rozcieńczonej próbki wyjściowej grypy B na Tajwanie. W pożywkach wzrostowych ani nakładkach nie stosowano płodowej surowicy bydlęcej (FBS), ponieważ FBS może hamować rozprzestrzenianie się grypy poprzez hamowanie niektórych proteaz, które są wymagane do fuzji wirusa. Trypsyna TPCK została dodana do wszystkich nakładek przed aplikacją, aby ułatwić fuzję wirusa i wnikanie do komórek gospodarza. Po zakażeniu nałożono 3 ml nakładek 0,3% agarozy, 0,6% Avicel lub 1% CMC w celu bezpośredniego porównania nakładek, jak pokazano w Panelu A, B i C. Oddzielne eksperymenty przeprowadzono identycznie, jak opisano w panelach A - C, z tabliczkami policzonymi i zbalansowanymi w Panelu D (N = 3). Podczas gdy dla tabliczek CMC przyjęto średnią, okazały się one trudne do wiarygodnego policzenia, ponieważ wykazywały rozproszone obrzeża i bardzo małe rozmiary płytek.

Rysunek 6: Nakładki płytek nazębnych o wysokiej przepustowości. 96-dołkową płytkę Veros posianą w proporcji 3 x 10⁴ komórki na studzienkę, zainfekowano 50 μl inokulum przy użyciu tej samej seryjnie rozcieńczonej próbki wyjściowej RVFV MP12 przez 1 godzinę, w poczwórnym powiększeniu. W przypadku nakładek przetestowano końcowe stężenia Avicel na poziomie 0,6 i 1,2% w celu określenia wykonalności i odtwarzalności wykorzystania płynnych nakładek w sposób wysokoprzepustowy, Panele A i B.

. .

	RVFV (Pojazd RVFV)	WIEJEW	Grypa B
Typ komórki	Vero powiedział:	Vero powiedział:	MDCK (Biblioteka MDCK
Okres infekcji	1 godz	1 godz	Czas trwania: 45 min
Czas inkubacji	3 dni	2 dni	3 dni

Tabela 1: Warunki inokulacji testu płytki nazębnej i typy komórek

	RVFV (Pojazd RVFV)	WIEJEW	Grypa B
Typ komórki	Vero powiedział:	Vero powiedział:	MDCK (Biblioteka MDCK
Typ wzrostu	DMEM1	DMEM1	DMEM2
Nośniki do płytki nazębnej	2xEMEMA	2xEMEMA	2xEMEMB

1. Zmodyfikowany Orzeł Dulbecco uzupełniony 10% płodową surowicą bydlęcą, 1% L-Glutaminą, 1% Peniclin/Streptomycyną.
2. Zmodyfikowane podłoże Eagle firmy Dulbecco uzupełnione 1% L-glutaminą, 1% Peniclin/Streptomycyną, 0,2% albuminą surowicy bydlęcej, 0,025% HEPES, DEAE-Dextran 50ug/ml.
A. 2x Minimal Essential Media (500 ml) uzupełnione o 5% FBS (25 ml), 1% Minimum Niezbędnych Aminokwasów (5 ml), 1% Pirogronian Sodu (5 ml), 1% L-Glutamina (5 ml), 2% Pen/Strep (10 ml).
B. 2x Minimal Essential Media (500 ml) uzupełnione 0,2% albuminą surowicy bydlęcej, 1% minimalnymi niezbędnymi aminokwasami (5 ml), 50ug/ml, 0,025% HEPES, DEAE-Dextran, Trypsin-TPCK*
*Tuż przed przygotowaniem dodaj 1 μl na 25 ml 2 μg/ml bulionu TPCK-Trypsyna do podwielokrotności, której będziesz używać do mieszania z agarozą w celu uzyskania blaszek miażdżycowych.

Tabela 2: Płytka nazębna i wirusowe/komórkowe pożywki wzrostu

. .

	RVFV (Pojazd RVFV)	WIEJEW	Grypa B
Typ komórki	Vero powiedział:	Vero powiedział:	MDCK (Biblioteka MDCK
Okres infekcji	1 godz	1 godz	Czas trwania: 45 min
Czas inkubacji	3 dni	2 dni	3 dni

Roztwory nakładek nie stracą ważności po ich wykonaniu, o ile zachowana jest sterylność.

Tabela 3: Nakładki Stock

szt. szt. Rozdział pkt.

	6 studni	12 studni	96 studnia
# komórek/studnia	5 x 105	2,5 x 105	3 x 104
Objętość innoculum (μl)	400	200	50
Objętość nakładki (ml)	3	1,5	0,100

Tabela 4: Formaty płyt

Dyskusja

Najważniejszym czynnikiem decydującym o udanym teście płytki miażdżycowej jest optymalizacja protokołu dla konkretnej hodowli wirusa, o której mowa, ponieważ warunki mogą się znacznie różnić. Kluczowe punkty, które należy wziąć pod uwagę, to: zgodność komórkowa gospodarza z danym wirusem, odpowiednie warunki wzrostu wirusa, wystarczające zakresy rozcieńczenia w celu wyraźnego rozróżnienia blaszek oraz prawidłowy dobór i barwienie nakładki dla danych komórek i wirusa.

Chociaż zarówno VEEV, jak i RVFV rosną w bardzo podobnych warunkach, wykorzystując wiele tych samych typów komórek gospodarza, różnice w morfologii płytki nazębnej i kinetyce wzrostu znacznie się różnią. W przypadku stosowania komórek Vero do testów płytkowych, które tradycyjnie były używane jako linia komórek rozmnażających i wskaźnikowych dla wirusów gorączki krwotocznej i alfawirusów, VEEV zwykle rośnie do wyższych mian niż RVFV i wykazuje zwiększoną kinetykę replikacji, rozwijając duże jednolite blaszki przy 48 hpi^4,10–12. W przeciwieństwie do VEEV, RVFV wymaga 72 hpi i wykazuje blaszki, które są zazwyczaj znacznie mniejsze i mają różną wielkość.

W przeciwieństwie do RVFV i VEEV, wirus grypy jest wysoce specyficzny dla komórek gospodarza i może być trudny do rozmnażania przez hodowlę tkankową. W przypadku wirusa grypy wnikanie i fuzja wirusa jest zwykle inicjowane przez wiązanie receptora na powierzchni komórki z wirusową glikoproteiną hamaglutyniną (HA), która pośredniczy w wnikaniu do komórki docelowej poprzez wiązanie się z receptorem powierzchniowym kwasu α-sjalowego komórki gospodarza. HA jest trimeryczną glikoproteiną, która jest obecna w otoczce błonowej wszystkich wirusów grypy i wymaga rozszczepienia na podjednostki HA1 i HA2 przez specyficzną proteazę komórki gospodarza. Aby jeszcze bardziej skomplikować sprawę, te miejsca rozszczepienia mogą się często różnić w zależności od szczepu wirusa¹³. Ponieważ ekspresja proteaz zdolnych do rozszczepiania HA jest ograniczona do określonych tkanek, proteazy są często dodawane do pożywek do hodowli komórkowych w celu ułatwienia fuzji wirusa i wejścia do wybranej komórki gospodarza¹³. Trypsyna TPCK jest jednym z przykładów powszechnie stosowanej proteazy, która jest stosowana w hodowli komórkowej zarówno z komórkami MDCK, jak i Vero: ułatwiając wielocyklową replikację (przy braku surowicy inaktywującej trypsynę) poprzez proteolityczną aktywację wirusowego HA^14,15.

Jak wykazano w tym i innych badaniach, różnice w cyklach życiowych wirusa mogą wpływać na wybór nakładek, formaty płytek i czas pobierania, ze znacznymi różnicami między różnymi klasami i gatunkami wirusów. W naszym badaniu nakładki agarozowe wykazały wyraźniejsze blaszki przy wyższych mianach niż CMC lub płynne nakładki zarówno dla RVFV, jak i wirusa grypy B, wzmacniając jego użyteczność wśród szerokiej gamy wirusów i typów komórek. Zastosowanie niskiego stężenia końcowego agarozy znacznie pomogło w usunięciu stałych zatyczek i uproszczonym barwieniu. CMC ogólnie wykazał najgorszą skuteczność jako nakładka dla wszystkich trzech testowanych wirusów i wytworzył bardzo małe i niewyraźne blaszki dla wirusa grypy B. Chociaż ogólnie CMC wykazywał najmniej pożądane cechy, jego zastosowanie w szybko rosnących i niezwykle zjadliwych wirusach może okazać się korzystne, ponieważ wydaje się, że zmniejsza rozmiar blaszki miażdżycowej przy minimalnym spadku miana. Płynna nakładka okazała się najbardziej uniwersalna, ponieważ była niezwykle prosta w przygotowaniu, zwiększona łatwość użycia i była porównywalna z agarozą we wszystkich wybranych wirusach. W przypadku bardziej przepustowej płytki 96-dołkowej nakładanie i usuwanie nie było hamowane z powodu krzepnięcia, jak w przypadku tradycyjnych nakładek, i zapewniało dokładne i spójne wyniki. Problemem przy stosowaniu płynnych nakładek jest nieprzezroczyste zabarwienie i niemożność monitorowania tworzenia się płytki nazębnej, ponieważ płytki nie mogą być przesuwane aż do punktu pobrania, co ogranicza tę adaptację do wirusów o wcześniej scharakteryzowanej kinetyce replikacji.

Niewielkie modyfikacje warunków oznaczania płytki nazębnej mogą znacząco zmienić wyniki, a ocena i wydajność każdego nowego systemu lub techniki jest zawsze uzasadniona. Chociaż zoptymalizowany i ustandaryzowany protokół oznaczania płytki nazębnej nie istnieje dla każdej sytuacji, nasz raport pokazuje wszechstronność i łatwość użycia zarówno w tradycyjnych, jak i nowatorskich płynnych nakładkach do testów płytki nazębnej, zapewniając jednocześnie wystarczające tło do dalszych modyfikacji przez użytkownika.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
6-dołkowa płytka CellStar do hodowli tkankowej	Greiner Bio-One	658 160
12-dołkowa płytka CellStar do hodowli tkankowej	Greiner Bio-One	665 180
96-dołkowa płytka CellStar do hodowli tkankowej	Greiner Bio-One	655 180
96-2ml płytka głębinowa	USA Scientific	C15046314	Do seryjnych rozcieńczeń
Jakość DMEM	Biologicals	112 013 101	Pożywka komórkowa/Rozcieńczalnik
2x EMEM do blaszek blaszkowych	Quality Biologicals	115 073 101	Ciepły do 37 ° C
MEM 100x	Cellgro	25 025 Cl
Pirogronian sodu	Cellgro	25 000 Cl
Penicylina Streptomycyna	Gibco	15140 122
L-Glutamina	Gibco	25030 081
HyClone FBS	Thermo Scientific	SH30910.03	Dezaktywować ciepło przed użyciem w 62 ° C przez 30 min
Surowica bydlęca Albumina	Sigma Aldritch	A7030-50G
Trypsyna TPCK	Sigma Aldritch	T1426-50mg	Zrób porcje/Unikaj zamrażania rozmrażanie
HEPES	Gibco	15630-080
DEAE-Dextran	Sigma Aldritch	D9885-10G
Crystal Violet	Sigma Aldritch	C3886-25G
Roztwór formaldehydu	Sigma Aldritch	F8775-500ml
Odczynnik denaturowany	klasy Sigma Aldritch	362808-1L
Avicel RC-591 NF	FMC BioPolymer USA	RC-591 NF	Wstrząsaj energicznie podczas mieszania  przez >30 min w celu homogenizacji
UltraPure Agarose	Invitrogen	16500-100
Karboksymetyloceluloza, sól sodowa o średniej lepkości	Sigma Aldrich	C4888