Oznaczanie stężenia wirusa za pomocą testów płytki nazębnej: przy użyciu tradycyjnych i nowatorskich systemów nakładek

Podsumowanie

Testy płytki nazębnej są złotym standardem w kwantyfikacji wirusa, wykorzystując nakładki pułapkowe na monowarstwy komórkowe gospodarza do określenia miana wirusa. Podczas gdy tradycyjnie stosuje się różne półstałe nakładki, tutaj demonstrujemy techniki płytki nazębnej, porównując półstałe nakładki z nową ciekłą celulozą mikrokrystaliczną wśród kilku rodzin wirusów.

Streszczenie

Testy płytki pozostają jedną z najdokładniejszych metod bezpośredniego oznaczania ilościowego zakaźnych wironów i substancji przeciwwirusowych poprzez liczenie dyskretnych blaszek (jednostek zakaźnych i martwych stref komórkowych) w hodowli komórkowej. Tutaj pokazujemy, jak wykonać podstawowy test płytki nazębnej oraz jak różne nakładki i techniki mogą wpływać na tworzenie i produkcję płytki nazębnej. Zazwyczaj stałe lub półstałe podłoża nakładkowe, takie jak agaroza lub karboksymetyloceluloza, były stosowane w celu ograniczenia rozprzestrzeniania się wirusa, zapobiegając masowemu zakażeniu przez płynną pożywkę wzrostową. Unieruchomione nakładki ograniczają infekcję komórkową do bezpośrednio otaczającej monowarstwy, umożliwiając tworzenie dyskretnych policzalnych ognisk i późniejsze tworzenie się blaszki miażdżycowej. Aby przezwyciężyć trudności związane ze stosowaniem tradycyjnych nakładek, nowatorska płynna nakładka wykorzystująca celulozę mikrokrystaliczną i sól sodową karboksymetylocelulozy jest coraz częściej stosowana jako zamiennik w standardowym teście płytki nazębnej. Testy płytki nazębnej z płynną powłoką można łatwo wykonać w standardowych formatach płytek 6- lub 12-dołkowych, zgodnie z tradycyjnymi technikami i nie wymagają specjalnego sprzętu. Ze względu na stan ciekły oraz późniejszą łatwość aplikacji i usuwania, formaty płytek do mikrokultur mogą być alternatywnie wykorzystywane jako szybka, dokładna i wysokowydajna alternatywa dla miareczkowania wirusów na większą skalę. Zastosowanie nieogrzewanego, lepkiego ciekłego polimeru daje możliwość usprawnienia pracy, oszczędza odczynniki, miejsce w inkubatorze i zwiększa bezpieczeństwo operacyjne w przypadku stosowania w tradycyjnych laboratoriach lub laboratoriach o wysokim stopniu hermetyzacji, ponieważ nie jest wymagane podgrzewanie odczynników ani szkło. Płynne nakładki mogą również okazać się bardziej wrażliwe niż tradycyjne nakładki na niektóre wirusy nieprzeporne.

Wprowadzenie

Dokładna izolacja i kwantyfikacja żywych próbek wirusów jest niezmiennie celem badawczym w wirusologii. Dopiero pojawienie się testu płytki nazębnej w 1952 r. po raz pierwszy opracowano sposób ilościowego i jakościowego obliczania miana wirusa zwierzęcego^1,2. Technika ta została po raz pierwszy zaadaptowana i zmodyfikowana na podstawie testów fagowych, które wcześniej były używane do obliczania mian podstawowych bakteriofagów w biologii roślin^1,2. Chociaż od tego czasu opracowano i dostosowano alternatywne metody oznaczania ilościowego wirusów, takie jak testy immunologiczne, mikroskopia elektronowa fluorescencyjna i transmisyjna, przestrajalne wykrywanie impulsów rezystancyjnych (TRPS), cytometria przepływowa, rekombinowane systemy reporterowe i ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją (qRT-PCR), metody te nie są w stanie zidentyfikować i określić ilościowo wironów kompetentnych do replikacji^1,3. Podczas gdy postęp w technologiach i technikach nadal udoskonala i zmienia krajobraz; Testy płytek nazębnych nadal stanowią złoty standard w określaniu stężeń wirusa dla zakaźnych wironów litycznych^1,4.

Podczas testu płytki nazębnej, zlewająca się monowarstwa komórek gospodarza jest infekowana wirusem litycznym o nieznanym stężeniu, który został seryjnie rozcieńczony do policzalnego zakresu, zazwyczaj między 5-100 wirionów. Zainfekowane monowarstwy są następnie pokrywane unieruchamiającą pożywką nakładkową, aby zapobiec masowemu rozprzestrzenianiu się infekcji wirusowej przez mechaniczny lub konwekcyjny przepływ płynnego podłoża podczas rozprzestrzeniania się wirusa. Podczas gdy tradycyjnie stosuje się stałe lub półstałe nakładki, takie jak agaroza, metyloceluloza lub karboksymetyloceluloza (CMC), płynne nakładki stają się coraz bardziej atrakcyjną alternatywą dzięki opracowaniu nowych płynnych nakładek, takich jak Avicel^5–7. Testy płytki nazębnej z wykorzystaniem płynu w porównaniu z tradycyjnymi nakładkami mają kilka zalet, ponieważ nakładkę można nakładać w temperaturze pokojowej, a nakładanie i usuwanie jest znacznie łatwiejsze. Ponieważ płynne nakładki nie wymagają podgrzewania, delikatne i labilne termicznie wirusy mogą również okazać się łatwiejsze do nazębienia.

Po początkowym zakażeniu i zastosowaniu nakładki unieruchamiającej, zaczną rozwijać się pojedyncze blaszki lub strefy śmierci komórki, ponieważ infekcja wirusowa i replikacja są ograniczone do otaczającej monowarstwy. Zainfekowane komórki będą kontynuować cykl replikacji-lizy-infekcji, dalej rozprzestrzeniając infekcję, co skutkuje coraz bardziej wyraźnymi i dyskretnymi blaszkami. W zależności od kinetyki wzrostu wirusa i użytej komórki gospodarza, widoczna płytka nazębna zwykle tworzy się w ciągu 2-14 dni. Monowarstwy komórkowe mogą być następnie liczone za pomocą standardowego mikroskopu jasnego pola lub, co bardziej typowe, utrwalane i wybarwiane przez neutralną czerwień lub kryształ gwałtowny, aby łatwo zidentyfikować blaszki gołym okiem. Dostępna jest szeroka gama plam z płytki nazębnej, z których każda ma swoje specyficzne zalety i wady. Fiolet krystaliczny jest zwykle dodawany w miejscu zbierania i po utrwaleniu/usunięciu nakładki, zapewniając szybkie i wyraźne barwienie przeciwstawne, które pozwala na identyfikację bardzo małych blaszek, gdy obecna jest morfologia mieszana. Neutralna czerwień ma tę zaletę, że wcześnie się nakłada i ma stały kontakt z nakładką, co pozwala na monitorowanie na żywo powstawania płytki nazębnej, co jest szczególnie przydatne podczas pracy z nieznanym wirusem lub kinetyką replikacji. Odkryliśmy jednak, że barwienie zazwyczaj nie jest tak wyraźne w przypadku stosowania neutralnej czerwieni. Bromek 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)-2,5-difenylotetrazolowy (MTT) ma kilka zalet, ponieważ żółty barwnik barwi żywe komórki na ciemnoniebiesko, a blaszki wirusowe można policzyć bez usuwania nakładki, jak w przypadku neutralnej czerwieni. Wysoki kontrast między żywymi i martwymi komórkami zapewniany przez MTT pozwala również na wykrycie małych blaszek we wcześniejszym momencie po zakażeniu, chociaż przechowywanie nadal wymagałoby usunięcia nakładki⁸. Ponieważ fiolet krystaliczny można po prostu wytworzyć w roztworze wody i alkoholu i zapewnia wysoki stopień czułości dla mieszanej morfologii płytki nazębnej, wybraliśmy go jako preferowany i uproszczony barwnik przeciw dla zademonstrowanego protokołu, ponieważ wykorzystujemy kilka rodzin dobrze scharakteryzowanych wirusów.

Po naprawieniu i zabarwieniu zainfekowanej monowarstwy komórkowej, płytki są zliczane w celu mianowania próbek wirusa pod względem jednostek tworzących płytki (pfu) na mililitr. Należy odnotować spadek logarytmu między seryjnymi rozcieńczeniami i, w zależności od wielkości płytki, między 5-100 zliczonymi płytkami, z kontrolą ujemną stosowaną jako odniesienie. Statystycznie próbki będą się różnić o 10% na każde 100 blaszek zliczonych podczas porównywania powtórzeń próbek³. Zaletą stosowania testów płytki nazębnej do określania miana wirusa jest ich zdolność do ilościowego określania rzeczywistej liczby zakaźnych cząstek wirusa w próbce. Ponieważ wiele wirionów może potencjalnie zainfekować pojedynczą komórkę, podczas miareczkowania płytki nazębnej stosuje się terminologię jednostek w porównaniu z wironami^1,2.

Morfologia blaszki może się znacznie różnić w różnych warunkach wzrostu i między gatunkami wirusów. Należy zwrócić uwagę na wielkość płytki nazębnej, przejrzystość, definicję granic i rozmieszczenie, ponieważ mogą one dostarczyć cennych informacji na temat czynników wzrostu i zjadliwości danego wirusa.

Podstawowe zasady testowania płytki nazębnej mogą być również dostosowywane i modyfikowane na wiele różnych sposobów, na przykład przy użyciu testów formowania ostrości (FFA). FFA nie polegają na lizie komórek i barwieniu przeciwstawnym w celu wykrycia tworzenia się płytki nazębnej, ale raczej wykorzystują techniki barwienia immunologicznego do bezpośredniego wykrywania wewnątrzkomórkowych białek wirusowych za pomocą znakowanych przeciwciał. Zwiększona czułość, skrócony czas inkubacji po zakażeniu, a co najważniejsze, zdolność do ilościowego oznaczania wirusów nielitycznych to wyraźne zalety przy stosowaniu FFA. Chociaż jest to szeroko stosowane, krytyczne czynniki ograniczające w FFA w porównaniu z tradycyjnym testem płytki miażdżycowej polegają na potrzebie odpowiednich przeciwciał i możliwości sondowania tylko podjednostek białka wirusa w porównaniu z rzeczywistymi zakaźnymi wironami^4.

Na potrzeby tego badania ograniczymy naszą dyskusję do klasycznych testów płytki nazębnej i opiszemy zastosowanie tradycyjnych nakładek z litego i półstałego materiału (agaroza i CMC), wraz z nowatorskimi nakładkami z ciekłej mikrokrystalicznej celulozy.

Protokół

1. Przygotowanie komórek i odczynników

1. Dzień przed przeprowadzeniem analizy, wysiej odpowiednie komórki gospodarza dla badanego wirusa (Tabela 1 oraz 2) przy 90–10% konfluencji.
2. Przygotować roztwór utrwalający z 10% formaldehydu w dH2O₂O. Na przykład zmieszaj 5,56 ml 36% roztworu początkowego formaldehydu z 14,44 ml destylowanej H₂O (dH2O)₂O).
   UWAGA: Podczas pracy z formaldehydem należy stosować odpowiednie zasady bezpiecznego obchodzenia się z odczynnikami oraz zapewnić właściwą wentylację.
3. Przygotuj barwnik z fioletem krystalicznym: 1% fioletu krystalicznego (CV) w 20% etanolu i wodzie destylowanej (dH2O)₂O.
4. Przygotować pożywkę do tworzenia plam (zależnie od typu komórek w stężeniu 2x; patrz Tabela 2). Przefiltrować za pomocą 0.2 µm należy sprawdzić, czy którekolwiek z odczynników nie są sterylne.
5. Przygotowanie warstw immobilizujących (Tabela 3)
   1. W przypadku nakładek ciekłych przygotować sterylny 2,4% roztwór Avicel w dH2O.₂O. Aby zapobiec grudkowaniu, dodaj proszek do kolby zawierającej wodę, która jest intensywnie mieszana za pomocą mieszadła magnetycznego; powoli wsyp Avicel i mieszaj szybko w temperaturze pokojowej (RT). Gdy roztwór stanie się zbyt lepki, aby mieszadło magnetyczne mogło go zhomogenizować, przełącz na wstrząsarkę do kolb w celu >30 min przy silnym mieszaniu w celu zapewnienia równomiernej homogenizacji.
      UWAGA: Roztwory zapasowe można przygotować w niższych stężeniach, jednak w takich roztworach mogą wystąpić rozwarstwienia, co będzie wymagało ponownego wymieszania w celu zapewnienia homogenizacji. Można stosować roztwory robocze Avicel w zakresie stężeń od 0,6% do 3%.
   2. Po homogenizacji roztwór należy wysterylizować w autoklawie i przechowywać w szczelnym zamknięciu w temperaturze pokojowej.
   3. W celu przygotowania warstw nakładkowych z agarozy i karboksymetylocelulozy (CMC), należy przygotować roztwór zapasowy w dH2O₂Dodaj 2% CMC lub 0,6% agarozy. Wymieszaj za pomocą mieszadła magnetycznego i poddaj autoklawowaniu lub ogrzej w mikrofalówce, aby uzyskać roztwór.

2. Rozcieńczenia i infekcje

1. Dzień po wysianiu, przed rozpoczęciem analizy, wizualnie sprawdź konfluencję i żywotność komórek. Upewnij się, że komórki wykazują standardową morfologię i tworzą monowarstwę o konfluencji ~90%.
2. Przeprowadź dziesięciokrotne rozcieńczenia seryjne próbek zakaźnych. Jako rozcieńczalnik wykorzystaj pożywkę do wzrostu komórek stosowaną do propagacji wirusa (Tabela 2). Dostosuj liczbę wymaganych rozcieńczeń do oczekiwanego miana analizowanego wirusa; zawsze stosuj niezakażoną próbkę kontrolną, aby niezależnie potwierdzić żywotność komórek i ułatwić identyfikację plamkowań.
3. Z rozcieńczeń seryjnych zakaź komórki na 45 min do 1 h (Tabela 1). Użyj wystarczającej objętości inokulum, aby przykryć komórki, zachowując jednocześnie jak najmniejszą objętość w celu zmaksymalizowania kontaktu wirusa z monowarstwą (Tabela 4). Delikatnie kołysz płytki co 20 min, aby zapewnić równomierne pokrycie i zapobiec wysychaniu monowarstwy komórkowej.
4. Po zakażeniu nałóż odpowiednią objętość pożywki immobilizującej bezpośrednio na inokuluma w dołkach (Tabela 2), używając mieszaniny 1:1 z 2x pożywki do plamkowań i wybranego overlayu immobilizującego (CMC, agarozy lub Avicel). Delikatnie zakołysz w celu wymieszania.
   1. W przypadku overlayów ciekłych zmieszaj 1:1 podgrzaną 2x pożywkę do plamkowań z roztworem stokowym Avicel 1,2 - 2,4% w temperaturze pokojowej, aby otrzymać roztwór roboczy pożywki overlay Avicel o stężeniu 0,6-1,2%.
   2. W przypadku overlayu z agarozy użyj mieszaniny 1:1 podgrzanej 2x pożywki do plamkowań i roztworu stokowego podgrzanej 0,6% agarozy; pozostaw w kąpieli wodnej o temperaturze 56 °C przez 30 min w celu wyrównania temperatury, uzyskując końcowe stężenie agarozy w overlayu 0,3%.
   3. W przypadku CMC przygotuj 2% roztwór stokowy i postęp zgodnie z opisem dla overlayu z agarozy.
   4. Podczas nakładania overlayu na monowarstwę, zawsze wyrównuj temperaturę gorącej agarozy lub CMC w kąpieli wodnej 56 °C, aby zapobiec uszkodzeniu monowarstwy. Upewnij się, że roztwór jest ciepły, ale nie gorący w dotyku, aby zapobiec śmierci komórek i obniżeniu mian wirusa. Większość overlayów z agarozy zaczyna twardnieć poniżej 42 °C; pracuj szybko i/lub przygotowuj małe partie, aby zapobiec krzepnięciu podczas manipulacji.
5. Po dodaniu overlayu inkubuj płytki do czasu powstania wyraźnych, łatwych do policzenia plamkowań. Tworzenie plamkowań może trwać od 2 do 14 dni w zależności od analizowanego wirusa, Tabela 1.
   UWAGA: Po umieszczeniu płytek z overlayem ciekłym w inkubatorze nie należy ich przesuwać. Poruszanie ciekimi overlayami w okresie inkubacji spowoduje rozmazanie plamkowań. Overlaye z agarozy i CMC są półstałe i mogą być przemieszczane lub okresowo sprawdzane pod mikroskopem świetlnym w celu monitorowania rozwoju plamkowań.

3. Fixowanie i barwienie komórek

1. Aby utrwalić komórki, odlać lub odessać warstwę Avicel, a następnie utrwalić komórki, stosując 10% roztwór formaldehydu przez 30 min do nocy (<1 ml na studzienkę dla płytki 6-dołkowej).
   1. W przypadku agarozy lub CMC dodać roztwór formaldehydu bezpośrednio do warstwy wierzchniej na 1 h do nocy.
      UWAGA: Próbki mogą być przechowywane przez dłuższy czas w utrwalaczu, pod warunkiem, że nie odparuje on i nie wyschnie, ponieważ może to zdeformować monowarstwę.
2. Przed barwieniem i po utrwaleniu usunąć formaldehyd i usunąć półstałe wkładki z agarozy i CMC, używając bieżącej wody lub ręcznie za pomocą szpatułki. Przepłukać plaki Avicel wodą w celu usunięcia pozostałości warstwy wierzchniej/utrwalacza przed barwieniem.
3. W celu barwienia pokryć komórki minimalną ilością roztworu fioletu krystalicznego przez ~15 min. W razie potrzeby kołysać płytkami, aby zapewnić równomierne pokrycie.
4. Delikatnie wypłukać barwnik fioletu krystalicznego wodą. Po utrwaleniu, zabarwieniu i wysuszeniu plaki można przechowywać bezterminowo do późniejszych analiz.

4. Wyznaczanie miana wirusa

1. Policz placki w każdej studni, wyciągając średnią dla powtórzeń technicznych tego samego rozcieńczenia. W przypadku dużych formatów płytek należy odrzucić studnie zawierające mniej niż 5 lub więcej niż 10 placków. Zwróć uwagę na wielkość i morfologię placków. Kontrola negatywna powinna wykazywać jednorodną monowarstwę i może służyć jako kontrola referencyjna.
2. Wyznacz miano wirusa w próbce zapasowej, przyjmując średnią liczbę placków dla danego rozcieńczenia oraz odwrotność całkowitego współczynnika rozcieńczenia.

UWAGA: Przykładowo, 30 i 32 plaki policzone dla powtórzeń rozcieńczenia 1 x 10^-7 [31 (średnia)/10^-7 (rozcieńczenie) x 0,4 ml (inokulum)] dałyby miano wynoszące 7,75 x 10⁸ pfu/ml.

Wyniki

Zdolność testów plackowych do dokładnego określania mian wirusa zależy od wielu czynników: odpowiedniego doboru komórek gospodarza, właściwych mediów i warunków hodowli zapewniających żywotność komórek i wirusów, unieruchomionej propagacji wirusa oraz dokładnego określenia okresu inkubacji wirusa, aby zapewnić wystarczający czas na utworzenie wyraźnych i mierzalnych placków.

Do niniejszego badania wybrano wirusy z trzech reprezentatywnych rodzin, aby wykazać różnice w: doborze warstwy overlay, okresach inkubacji oraz morfologii placków w zależności od różnych typów próbek. Wirus zapalenia mózgu koni wenezuelskiego (VEEV) został wybrany jako model wirusa (+)ssRNA, który może wywoływać ciężką chorobę u koni i ludzi i reprezentuje rodzinę Togaviridae. Szczep wirusa grypy B z Tajwanu, segmentowany wirus (-)ssRNA infekujący głównie ludzi, reprezentuje rodzinę Orthomyxoviridae. Wirus gorączki doliny Rift (RVFV), wirus (-)ssRNA przenoszony przez stawonogi, infekujący głównie stawonogi, przeżuwacze i ludzi, został wybrany jako reprezentant rodziny Bunyaviridae.

W przypadku RVFV (Rysunek 1) miana określono z roztworu zapasowego rekombinowanego, żywego, atenuowanego szczepu MP12 RVFV w formacie płytki 12-dołkowej, wykorzystując nakładki z CMC, agarozy lub Avicel, które inkubowano obok siebie przez 72 h po infekcji (hpi). Reprezentatywną płytkę z rozcieńczeniami w zakresie od 10^-4 do 10^-7 przedstawiono w Panelu A. Plaque z zastosowaniem nakładek z CMC i agarozy były małe, przejaśnione i wyraźne, z dobrze zdefiniowaną okrągłą krawędzią. Plaque z nakładką ciekłą były nieco liczniejsze i większe w porównaniu do plaque z agarozy i CMC, a ich krawędź była mniej wyraźna. Miana wirusa porównano w Panelu B, wykazując podobną skuteczność wszystkich rodzajów nakładek.

Aby uzyskać wyraźniejsze porównanie wizualne nakładek dla MP12 oraz większą próbę w celu określenia powtarzalności, przetestowano również płytkę 6-dołkową w trzech powtórzeniach (Rysunek 2). W formacie płytki 6-dołkowej zastosowanie nakładki CMC wykazało mniejsze plaki niż w przypadku nakładek agarozowych lub ciekłych, które były do siebie zbliżone pod względem wielkości. Choć miana wirusa były podobne dla wszystkich trzech rodzajów nakładek (Panel D), plaki utworzone w nakładkach agarozowych i ciekłych okazały się łatwiejsze do policzenia ze względu na ich większy rozmiar.

W przeciwieństwie do RVFV, miana VEEV oraz morfologia plamak przy zastosowaniu różnych nakładek różniły się znacząco (Rysunek 3A). Plamaki utworzone w nakładkach CMC wykazywały wyraźną i odrębna morfologię przy zastosowaniu formatu płytki 12-dołkowej, jednak kosztem wielkości plamaków i czułości (Panel B). W przeciwieństwie do CMC, zastosowanie nakładek agarozowych i ciekłych doprowadziło do powstania znacznie większych plamaków, co wskazuje na słabszą inhibicję wirusa i zwiększoną czułość na replikację VEEV. Zostało to wcześniej potwierdzone w pracy opublikowanej przez Juarez et al.⁴, w której porównywano wyłącznie agarozę z CMC. Choć nakładki agarozowe i ciekłe tworzyły większe plamaki niż CMC, plamaki te miały słabo zdefiniowane brzegi i były trudne do przeliczenia w formacie 12-dołkowym, przy czym nakładki ciekłe wykazywały największą dyfuzję brzegów. Podczas testowania plamaków w płytkach 6-dołkowych (Rysunek 4), większy format płytki 6-dołkowej wyeliminował problem nadmiernie dużych plamaków, które były trudne do rozróżnienia w formacie 12-dołkowym, a nakładki agarozowe i ciekłe okazały się lepsze od nakładek CMC pod względem definicji plamaków i czułości (Rysunek 4D).

W porównaniu z RVFV lub VEEV, wirus grypy stwarza kilka wyjątkowych trudności podczas tworzenia placków, takich jak konieczność zastosowania zewnętrznej proteazy. Czułość wirusa grypy na wybór różnych nakładek została również dobrze udokumentowana w przeszłości, ponieważ odnotowano istotne zmiany przy modyfikacjach tak niewielkich, jak zastosowanie agarozy różnych producentów⁹.

Co ciekawe, w przypadku szczepu wirusa grypy typu B z Tajwanu, zastosowanie CMC jako warstwy nakładkowej doprowadziło do powstania znacznie mniejszych plamkówek, które były trudne do policzenia i których wiarygodna ocena okazała się problematyczna (Rycina 5A). Zastosowanie agarozy w formie nakładki zapewniło najlepsze placki (Panel C), doprowadziło do uzyskania ciemniejszego zabarwienia tła (prawdopodobnie ze względu na zwiększoną żywotność monowarstwy) oraz pozwoliło uzyskać wyraźniejsze i ostrzejsze placki w bezpośrednim porównaniu z zastosowaniem nakładki w formie ciekłej (Panel B).

Wyraźną zaletą polimerów ciekłych w porównaniu z nakładkami stałymi i półpłynnymi, takimi jak agaroza i CMC, jest łatwość ich aplikacji i usuwania. Nakładki półpłynne wymagają podgrzewania, a proces krzepnięcia może utrudniać ich manipulację i usuwanie. Aby wykorzystać te zalety i ocenić praktyczność zastosowania Avicel w wysokoprzepustowym badaniu RVFV, przetestowano format płytki 96-dołkowej przy różnych stężeniach nakładki (Rysunek 6). W przypadku RVFV MP-12 rozcieńczenia przeprowadzono w czterech powtórzeniach, przy końcowych stężeniach Avicel wynoszących odpowiednio 0,6% i 1,2%. Nakładanie i usuwanie warstwy overlay okazało się proste, nie stwierdzono wyraźnych różnic pomiędzy powtórzeniami ani pomiędzy stężeniami, co wykazało wysoką powtarzalność. Podczas oceny plaki były wyraźne i możliwe do policzenia gołym okiem, co potwierdziło możliwość zastosowania płynnych warstw overlay w badaniach wysokoprzepustowych dla RVFV.

Rysunek 1: Porównania nakładki płytkowej RVFV z wykorzystaniem płytek 12-dołkowych. Komórki Vero wysiano w gęstości 2,5 x 10⁵ komórki w płytkach 12-dołkowych, a następnie zainfekowano je 200 µl wykorzystując tę samą próbkę początkową MP12 poddaną rozcieńczeniom seryjnym. Po infekcji naniesiono 1,5 ml warstw przypowierzchniowych składających się z 0,3% agarozy, 0,6% Avicel lub 1% CMC (stężenia końcowe), aby bezpośrednio porównać te warstwy, zgodnie z obrazem przedstawionym w Panelu A. Liczbę plamak obliczono i określono miano w Panelu B.

Rycina 2: Porównania nakładki płytkowej RVFV z wykorzystaniem płytek 6-dołkowych. Komórki Vero wysiano w zagęszczeniu 5 x 10⁵ komórki w płytkach 6-dołkowych i zainfekowane 400 µl przy użyciu tej samej serii rozcieńczeń próbki wyjściowej MP12. W celu bezpośredniego porównania warstw, zgodnie z Panelami A, B i C, nałożono 3 ml warstw 0,3% agarozy, 0,6% Avicelu lub 1% CMC. Oddzielne eksperymenty przeprowadzono w sposób identyczny z opisanym dla Paneli A-C, a liczbę plamków obliczono i wyznaczono miano w Panelu D (N = 3).

Rycina 3: Porównanie nakładki płytkowej VEEV z wykorzystaniem płytek 12-dołkowych. Komórki Vero wysiano w zagęszczeniu 2,5 x 10⁵ komórki w płytkach 12-dołkowych, a następnie zainfekowane przez 200 µl z zastosowaniem tej samej próbki wyjściowej szczepu szczepionkowego VEEV TC-83 poddanej rozcieńczalnikom seryjnym. Po infekcji naniesiono 1,5 ml nakładek z 0,3% agarozy, 0,6% Avicel lub 1% CMC, aby bezpośrednio porównać nakładki, zgodnie z prezentacją w Panelu A. Liczbę przejaśnień obliczono i mianowano w Panelu B.

Rysunek 4: VPorównania metody nakładania agaru w celu tworzenia placków EEV z wykorzystaniem płytek 6-dołkowych. Komórki Vero wysiano w zagęszczeniu 5 x 10⁵ komórki w płytkach 6-dołkowych i zainfekowane 400 µl przy użyciu tej samej serii rozcieńczeń próbki wyjściowej VEEV TC-83. Po infekcji nałożono 3 ml warstw przypuszczających (overlay) składających się z 0,3% agarozy, 0,6% Avicelu lub 1% CMC, w celu bezpośredniego porównania warstw, jak przedstawiono na panelach A, B i C. Oddzielne eksperymenty przeprowadzono w sposób identyczny z opisanym dla paneli A–C, a liczbę plamków obliczono i wyznaczono miano w panelu D (N = 3).

Rysunek 5: Porównanie metod nakładania agaru w teście tworzenia płytek wirusa grypy. Komórki MDCK wysiano w zagęszczeniu 5 x 10⁵ komórki w płytkach 6-dołkowych i zainfekowane 400 µl inakulum z wykorzystaniem tej samej próbki wyjściowej wirusa grypy B szczep Taiwan poddanej rozcieńczeniom seryjnym. W pożywkach wzrostowych ani w warstwach nakładkowych nie stosowano płodowej surowicy bydlęcej (FBS), ponieważ FBS może hamować propagację wirusa grypy poprzez inhibicję niektórych proteaz niezbędnych do fuzji wirusowej. Przed nałożeniem do wszystkich warstw nakładkowych dodano trypsynę TPCK, aby ułatwić fuzję wirusa i jego wniknięcie do komórek gospodarza. Po zakażeniu nałożono 3 ml warstw nakładkowych zawierających 0,3% agarozy, 0,6% Avicelu lub 1% CMC, w celu bezpośredniego porównania nakładek, jak pokazano w Panelach A, B i C. Oddzielne eksperymenty przeprowadzono w sposób identyczny z opisanym w Panelach A–C, a liczbę i miano placków obliczono w Panelu D (N = 3). Chociaż obliczono średnią dla placków w CMC, ich wiarygodne przeliczenie okazało się trudne ze względu na rozmyte krawędzie i bardzo mały rozmiar placków.

Rysunek 6: Wysokoprzepustowe nakładki płytkowe. Płytka 96-dołkowa z wysianymi komórkami Vero w zagęszczeniu 3 x 10⁴ komórek na dołek, zainfekowano przez 50 µl inakulatu z użyciem tej samej próbki wyjściowej RVFV MP12 poddanej rozcieńczeniom seryjnym przez 1 h, w czterech powtórzeniach. W przypadku nakładki przetestowano końcowe stężenia Avicel wynoszące 0,6% i 1,2%, aby określić wykonalność i powtarzalność stosowania nakładek ciekłych w systemach wysokoprzepustowych, panele A i B.

	RVFV	VEEV	Grypa typu B
Typ komórki	Vero	Vero	MDCK
Okres infekcji	1 godz.	1 godz.	45 min
Czas inkubacji	3 dni	2 dni	3 dni

Tabela 1: Warunki inokulacji w teście plackowym i typy komórek

	RVFV	VEEV	Grypa B
Typ komórki	Vero	Vero	MDCK
Typ wzrostu	DMEM1	DMEM1	DMEM2
Podłoże do hodowli placków	2xEMA	2xEMA	2xEMB

1. Pożywka Dulbecco's Modified Eagle Medium uzupełniona o 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1% L-glutaminy, 1% penicyliny/streptomycyny.
2. Pożywka Dulbecco's Modified Eagle Medium uzupełniona o 1% L-glutaminy, 1% penicyliny/streptomycyny, 0,2% albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 0,025% HEPES, DEAE-dekstran 50ug/ml.
A. Pożywka 2x Minimal Essential Media (500 ml) uzupełniona o 5% FBS (25 ml), 1% niezbędnych aminokwasów (5 ml), 1% pirogronianu sodu (5 ml), 1% L-glutaminy (5 ml), 2% pen/strep (10 ml).
B. Pożywka 2x Minimal Essential Media (50 ml) uzupełniona o 0,2% albuminy surowicy bydlęcej, 1% niezbędnych aminokwasów (5 ml), 50ug/ml, 0,025% HEPES, DEAE-dekstran, trypsynę-TPCK*
*Bezpośrednio przed przygotowaniem dodać 1 µl roztworu TPCK-trypsyny o stężeniu 2 µg/ml na każde 25 ml do części, która zostanie zmieszana z agarozą w celu tworzenia placków.

Tabela 2: Pożywki do tworzenia placków oraz do wzrostu wirusowego/komórkowego

	RVFV	VEEV	Grypa B
Typ komórki	Vero	Vero	MDCK
Okres zakaźności	1 godz.	1 godz.	45 min
Czas inkubacji	3 dni	2 dni	3 dni

Roztwory nakładkowe nie ulegną przeterminowaniu po przygotowaniu, pod warunkiem zachowania sterylności.

Tabela 3: Zapas nakładkek

	płytka 6-dołkowa	płytka 12-dołkowa	96-dołkowa
liczba komórek/dołek	5 x 105	2,5 x 105	3 x 104
Objętość inokulum (μl)	400	200	50
objętość warstwy wierzchniej (ml)	3	1.5	0.100

Tabela 4: Formaty płytek 

Dyskusja

Najważniejszym czynnikiem decydującym o udanym teście płytki miażdżycowej jest optymalizacja protokołu dla konkretnej hodowli wirusa, o której mowa, ponieważ warunki mogą się znacznie różnić. Kluczowe punkty, które należy wziąć pod uwagę, to: zgodność komórkowa gospodarza z danym wirusem, odpowiednie warunki wzrostu wirusa, wystarczające zakresy rozcieńczenia w celu wyraźnego rozróżnienia blaszek oraz prawidłowy dobór i barwienie nakładki dla danych komórek i wirusa.

Chociaż zarówno VEEV, jak i RVFV rosną w bardzo podobnych warunkach, wykorzystując wiele tych samych typów komórek gospodarza, różnice w morfologii płytki nazębnej i kinetyce wzrostu znacznie się różnią. W przypadku stosowania komórek Vero do testów płytkowych, które tradycyjnie były używane jako linia komórek rozmnażających i wskaźnikowych dla wirusów gorączki krwotocznej i alfawirusów, VEEV zwykle rośnie do wyższych mian niż RVFV i wykazuje zwiększoną kinetykę replikacji, rozwijając duże jednolite blaszki przy 48 hpi^4,10–12. W przeciwieństwie do VEEV, RVFV wymaga 72 hpi i wykazuje blaszki, które są zazwyczaj znacznie mniejsze i mają różną wielkość.

W przeciwieństwie do RVFV i VEEV, wirus grypy jest wysoce specyficzny dla komórek gospodarza i może być trudny do rozmnażania przez hodowlę tkankową. W przypadku wirusa grypy wnikanie i fuzja wirusa jest zwykle inicjowane przez wiązanie receptora na powierzchni komórki z wirusową glikoproteiną hamaglutyniną (HA), która pośredniczy w wnikaniu do komórki docelowej poprzez wiązanie się z receptorem powierzchniowym kwasu α-sjalowego komórki gospodarza. HA jest trimeryczną glikoproteiną, która jest obecna w otoczce błonowej wszystkich wirusów grypy i wymaga rozszczepienia na podjednostki HA1 i HA2 przez specyficzną proteazę komórki gospodarza. Aby jeszcze bardziej skomplikować sprawę, te miejsca rozszczepienia mogą się często różnić w zależności od szczepu wirusa¹³. Ponieważ ekspresja proteaz zdolnych do rozszczepiania HA jest ograniczona do określonych tkanek, proteazy są często dodawane do pożywek do hodowli komórkowych w celu ułatwienia fuzji wirusa i wejścia do wybranej komórki gospodarza¹³. Trypsyna TPCK jest jednym z przykładów powszechnie stosowanej proteazy, która jest stosowana w hodowli komórkowej zarówno z komórkami MDCK, jak i Vero: ułatwiając wielocyklową replikację (przy braku surowicy inaktywującej trypsynę) poprzez proteolityczną aktywację wirusowego HA^14,15.

Jak wykazano w tym i innych badaniach, różnice w cyklach życiowych wirusa mogą wpływać na wybór nakładek, formaty płytek i czas pobierania, ze znacznymi różnicami między różnymi klasami i gatunkami wirusów. W naszym badaniu nakładki agarozowe wykazały wyraźniejsze blaszki przy wyższych mianach niż CMC lub płynne nakładki zarówno dla RVFV, jak i wirusa grypy B, wzmacniając jego użyteczność wśród szerokiej gamy wirusów i typów komórek. Zastosowanie niskiego stężenia końcowego agarozy znacznie pomogło w usunięciu stałych zatyczek i uproszczonym barwieniu. CMC ogólnie wykazał najgorszą skuteczność jako nakładka dla wszystkich trzech testowanych wirusów i wytworzył bardzo małe i niewyraźne blaszki dla wirusa grypy B. Chociaż ogólnie CMC wykazywał najmniej pożądane cechy, jego zastosowanie w szybko rosnących i niezwykle zjadliwych wirusach może okazać się korzystne, ponieważ wydaje się, że zmniejsza rozmiar blaszki miażdżycowej przy minimalnym spadku miana. Płynna nakładka okazała się najbardziej uniwersalna, ponieważ była niezwykle prosta w przygotowaniu, zwiększona łatwość użycia i była porównywalna z agarozą we wszystkich wybranych wirusach. W przypadku bardziej przepustowej płytki 96-dołkowej nakładanie i usuwanie nie było hamowane z powodu krzepnięcia, jak w przypadku tradycyjnych nakładek, i zapewniało dokładne i spójne wyniki. Problemem przy stosowaniu płynnych nakładek jest nieprzezroczyste zabarwienie i niemożność monitorowania tworzenia się płytki nazębnej, ponieważ płytki nie mogą być przesuwane aż do punktu pobrania, co ogranicza tę adaptację do wirusów o wcześniej scharakteryzowanej kinetyce replikacji.

Niewielkie modyfikacje warunków oznaczania płytki nazębnej mogą znacząco zmienić wyniki, a ocena i wydajność każdego nowego systemu lub techniki jest zawsze uzasadniona. Chociaż zoptymalizowany i ustandaryzowany protokół oznaczania płytki nazębnej nie istnieje dla każdej sytuacji, nasz raport pokazuje wszechstronność i łatwość użycia zarówno w tradycyjnych, jak i nowatorskich płynnych nakładkach do testów płytki nazębnej, zapewniając jednocześnie wystarczające tło do dalszych modyfikacji przez użytkownika.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
6-dołkowa płytka CellStar do hodowli tkankowej	Greiner Bio-One	658 160
12-dołkowa płytka CellStar do hodowli tkankowej	Greiner Bio-One	665 180
96-dołkowa płytka CellStar do hodowli tkankowej	Greiner Bio-One	655 180
96-2ml płytka głębinowa	USA Scientific	C15046314	Do seryjnych rozcieńczeń
Jakość DMEM	Biologicals	112 013 101	Pożywka komórkowa/Rozcieńczalnik
2x EMEM do blaszek blaszkowych	Quality Biologicals	115 073 101	Ciepły do 37 ° C
MEM 100x	Cellgro	25 025 Cl
Pirogronian sodu	Cellgro	25 000 Cl
Penicylina Streptomycyna	Gibco	15140 122
L-Glutamina	Gibco	25030 081
HyClone FBS	Thermo Scientific	SH30910.03	Dezaktywować ciepło przed użyciem w 62 ° C przez 30 min
Surowica bydlęca Albumina	Sigma Aldritch	A7030-50G
Trypsyna TPCK	Sigma Aldritch	T1426-50mg	Zrób porcje/Unikaj zamrażania rozmrażanie
HEPES	Gibco	15630-080
DEAE-Dextran	Sigma Aldritch	D9885-10G
Crystal Violet	Sigma Aldritch	C3886-25G
Roztwór formaldehydu	Sigma Aldritch	F8775-500ml
Odczynnik denaturowany	klasy Sigma Aldritch	362808-1L
Avicel RC-591 NF	FMC BioPolymer USA	RC-591 NF	Wstrząsaj energicznie podczas mieszania  przez >30 min w celu homogenizacji
UltraPure Agarose	Invitrogen	16500-100
Karboksymetyloceluloza, sól sodowa o średniej lepkości	Sigma Aldrich	C4888

etanolem