W tym artykule pokazujemy metodę przygotowania ostrych wycinków mózgu w temperaturze fizjologicznej, przy użyciu konwencjonalnego roztworu fizjologicznego bez specjalnych modyfikacji krojenia (takich jak dodanie sacharozy) i bez wewnątrzsercowej perfuzji zwierzęcia przed przygotowaniem plastrów.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Slice It Hot: Ostre cięcie mózgu dorosłego w temperaturze fizjologicznej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Tutaj prezentujemy protokół przygotowania ostrych wycinków mózgu. Procedura ta jest kluczowym elementem w elektrofizjologicznych eksperymentach z zaciskiem krosowym, który w dużej mierze decyduje o jakości wyników. Wykazano, że pominięcie etapu chłodzenia podczas procedury krojenia jest korzystne w uzyskiwaniu zdrowych plastrów i komórek, zwłaszcza w przypadku silnie zmielinizowanych struktur mózgu dojrzałych zwierząt. Chociaż dokładny mechanizm, dzięki któremu podwyższona temperatura wspiera zdrowie neuronów, może być tylko spekulowany, ma się rozumieć, że jeśli to możliwe, temperatura, w której odbywa się krojenie, powinna być zbliżona do warunków fizjologicznych, aby zapobiec artefaktom związanym z temperaturą. Kolejną ważną zaletą tej metody jest prostota zabiegu, a co za tym idzie krótki czas przygotowania. W zademonstrowanej metodzie wykorzystuje się dorosłe myszy, ale tę samą procedurę można zastosować zarówno u młodszych myszy, jak i szczurów. Również poniższy eksperyment z zaciskiem łatkowym jest wykonywany na poziomych wycinkach móżdżku, ale ta sama procedura może być również stosowana w innych płaszczyznach, a także w innych tylnych obszarach mózgu.
Wprowadzenie
Celem prezentowanej metody jest uzyskanie wysokiej jakości ostrych wycinków mózgu do eksperymentów elektrofizjologicznych in vitro, zwłaszcza przy użyciu dorosłych lub nawet starych zwierząt.
Metoda ostrego cięcia mózgu, opisana przez Skrede i Westgaarda1 w dwóch eleganckich zdaniach, stała się jednym z fundamentów współczesnych badań neurobiologicznych i jest stosowana w niezliczonych odmianach na całym świecie. Jakość wycinków znajduje odzwierciedlenie w liczbie żywych neuronów w wycinku, okresie czasu, w którym komórki zachowują swoje właściwości elektrofizjologiczne i morfologiczne, a także w integralności tkanki. Co więcej, maksymalny czas trwania stabilnych nagrań zależy od jakości plastrów. W związku z tym na przestrzeni dziesięcioleci oryginalna metoda krojenia była dalej rozwijana przez poszczególne grupy badawcze w celu zwiększenia regeneracji plastrów po pokrojeniu2-10, często poprzez złożone modyfikacje składu roztworów do krojenia lub odzyskiwania (takie jak dodanie askorbinianu, tiomocznika, a nawetH2O2), a także wstępną perfuzję wewnątrzsercową zwierzęcia za pomocą schłodzonych roztworów fizjologicznych.
Jak ostatnio wykazano11, temperatura fizjologiczna podczas krojenia wydaje się być bardziej korzystna dla zdrowia neuronów niż chłodzenie; poprawa jest najbardziej uderzająca podczas pracy z dorosłymi (2-8 miesięcy) gryzoniami. Unikanie dramatycznych zmian temperatury zapobiega powstawaniu artefaktów spowodowanych procesami zależnymi od temperatury w komórkach, takimi jak plastyczność13 i kinetyka kanałów jonowych13,14. Takie zmiany mogą wpływać na napięcie błony i wewnątrzkomórkową sygnalizację wapnia, próg kolca i kształt kolca.
Przedstawiona tutaj metoda przygotowania "gorącego" ostrego plastra to ogólna procedura uzyskiwania wysokiej jakości ostrych wycinków mózgu z dowolnego obszaru mózgu, w tym móżdżku, kory mózgowej i hipokampa, jąder pnia mózgu16, jak również opuszki węchowej, zarówno u szczurów, jak i myszy.
Zauważ, procedura krojenia temperatury fizjologicznej wymaga, aby ostrze tnące wibrowało prawie idealnie poziomo i było pozbawione żadnych wad strukturalnych. Taka precyzja może nie być osiągalna w przypadku starszych modeli krajalnicy; W takich przypadkach zalecamy wykonanie preparatu plastra w warunkach mroźno-zimnych, ponieważ niska temperatura wydaje się uodparniać tkankę na uszkodzenia mechaniczne, nawet jeśli odbywa się to kosztem aberracji metabolicznych.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury eksperymentalne opisane w tym protokole zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Hebrajskiego.
1. Przygotowanie rozwiązań i narzędzi do krojenia
- Przygotować 1 l wzorcowego roztworu fizjologicznego (SPS) zawierającego jony opisane w Tabeli 1.
- Przygotować wcześniej roztwór podstawowy zawierający sole o stężeniu 10-krotnie wyższym od końcowego w szklanej butelce wypełnionej 1 000 ml wody dejonizowanej (przewodność 0,055 μS/cm). Dodaj sole (NaCl, KCl, KH,2, PO4 iMgSO4) i mieszaj aż do całkowitego rozpuszczenia. Przechowywać roztwór podstawowy w temperaturze 4 °C.
- Przygotuj końcowy roztwór SPS w dniu eksperymentu. Dodać 100 ml roztworu podstawowego do 700 ml oczyszczonej wody, rozpuścić glukozę (3,6 g) i NaHCO3 (2,18 g) za pomocą mieszadła magnetycznego, a następnie dodać oczyszczoną wodę do 1 l.
- Wyrównać roztwór, gazując go 95%O2 / 5% CO2 przez ~20 min. Następnie dodać 2 ml 1 M roztworu CaCl2 .
- Zmontuj następujące narzędzia (Rysunek 1).
- Przygotuj duże nożyczki lub inne narzędzie do dekapitacji, małe nożyczki chirurgiczne do otwierania czaszki, kleszcze z cienką końcówką do podnoszenia czaszki w celu odsłonięcia mózgu, skalpel z ostrzem do wypreparowania żądanej części mózgu do pokrojenia i małą szpatułkę do manipulowania wypreparowanymi częściami mózgu.
- Ponadto przygotuj małe kawałki bibuły filtracyjnej do usunięcia nadmiaru płynu z mózgu, dwie małe szalki Petriego do wypreparowania mózgu w dwóch szklanych zlewkach o pojemności 500 ml do przechowywania podgrzanej oczyszczonej wody i SPS oraz kleju cyjanoakrylowego do sklejenia mózgu do etapu krojenia.
- Przygotuj małą szczoteczkę do obchodzenia się z plastrami podczas krojenia oraz szklaną pipetę Pasteura z szerokim otworem do przenoszenia plastrów z kąpieli krojącej do komory regeneracyjnej. Zdezynfekuj narzędzia, aby zapobiec rozwojowi bakterii w ciepłych kąpielach w plastrach. Ponadto należy używać czystych rękawic laboratoryjnych.
- Przygotuj zanurzoną komorę odzyskiwania plastrów, taką jak opisana przez Gibba i Edwardsa15. Stale gazuj SPS w nim 95% O2 / 5% CO2 i utrzymuj w temperaturze 36 °C. Upewnij się, że gazowanie nie powoduje uwięzienia w kąpieli małych pęcherzyków, które mogłyby uszkodzić plastry.
- Podgrzać ~300 ml SPS do temperatury 36 °C na grzałce z mieszadłem magnetycznym lub w łaźni wodnej. Jeśli używana jest płyta grzewcza, należy uważać, aby nie dopuścić do przegrzania roztworu, co może spowodować wytrącanie się jonów. W takim przypadku ogrzej świeży SPS zamiast chłodzić stary.
- Doprowadź ~500 ml oczyszczonej wody do wrzenia za pomocą czajnika elektrycznego i w zlewce połącz 300 ml z zimną wodą, aby uzyskać nieco cieplejszą wodę niż temperatura krojenia. Użyj tej podgrzanej, oczyszczonej wody podczas dekapitacji, a pozostałą część przegotowanej wody wykorzystaj później do utrzymania fizjologicznej temperatury kąpieli krojącej.
- Znieczulić mysz, wstrzykując dootrzewnowo 0,1 ml pentobarbitalu (60 mg/ml). Po kilku minutach sprawdź, czy zwierzę nie reaguje na silne szczypanie palca u nogi lub ogona, aby upewnić się, że nie ma czucia.
2. Sekcja mózgu
- Szybko odetnij głowę myszy, przecinając szyję dużymi nożycami z tyłu czaszki i pozwól, aby głowa wpadła do zlewki z podgrzaną oczyszczoną wodą, aby spłukać nadmiar krwi.
- Odsłoń otwór wielki w czaszce pod mięśniami szyi i skórą, ewentualnie usuwając większą część szyi małymi nożyczkami.
- Pociągnij skórę na szczycie czaszki, aby móc wyraźnie zobaczyć szwy czaszki, aby pokierować otwarciem czaszki.
- Rozetnij czaszkę, wkładając dolną końcówkę małych nożyczek przez otwór wielki i natychmiast obracając je w kierunku bocznej strony. Delikatnie przeciąć wzdłuż bocznej krawędzi kości ciemieniowej do miejsca za oczami i szwem czołowo-ciemieniowym; następnie obróć się w kierunku środka czaszki i przetnij linię środkową na drugą stronę czaszki (patrz zielona przerywana linia na rysunku 2A).
- Za pomocą kleszczyków z cienką końcówką podnieś czaszkę z narożnika czołowo-ciemieniowego i pociągnij ją po przekątnej w górę i na boki, aby odsłonić mózg (patrz żółta przerywana strzałka na rycinie 2A). Upewnij się, że czaszka nie jest przymocowana do żadnej kości ani skóry głowy, tak aby mózg pozostał na swoim miejscu, gdy czaszka zostanie podniesiona. W przypadku, gdy mózg porusza się wraz z czaszką, użyj małych nożyczek, aby usunąć tkankę łączną między czaszką a mózgiem.
- Kiedy mózg jest odsłonięty, nie pozwól, aby mózg był suchy. Wykonuj więc kolejne kroki, trzymając czaszkę i mózg na szalce Petriego wypełnionej podgrzanym, zagazowanym SPS.
- Odłącz część mózgu używaną do eksperymentu od reszty mózgu za pomocą skalpela i szpatułki. W przypadku korzystania z móżdżku, należy odłączyć go od przodomózgowia za pomocą pojedynczego nacięcia przez śródmózgowie i most (wzdłuż czerwonych linii na rysunkach 2B-D) i przenieść go na małą szalkę Petriego, która zawiera świeże, zagazowane SPS.
- Usuń pień mózgu, aby utworzyć prostą i szeroką podstawę do przyklejenia mózgu do etapu cięcia podczas krojenia móżdżku w płaszczyźnie poziomej. Na krótko umieść móżdżek na mokrym kawałku bibuły filtracyjnej tak, aby strona odcięta od przodomózgowia była skierowana w dół.
- Przeciąć pień mózgu skalpelem, aby utworzyć podstawę (jak pokazano niebieską linią na rysunku 2B) i przywrócić móżdżek do SPS. Gdy potrzebne są inne płaszczyzny cięcia, należy odpowiednio przyciąć blok móżdżku (niebieskie linie na rysunkach 2C i D).
3. Cięcie mózgu
- Przygotuj etap cięcia, upewniając się, że jest suchy, a następnie nałożyć niewielką kroplę kleju superglue na środek etapu.
- Podnieś blok mózgu z SPS za pomocą szpatułki właściwą stroną do góry i usuń nadmiar płynu z mózgu za pomocą małych kawałków bibuły filtracyjnej. Następnie, jednym ruchem, wsuń mózg ze szpatułki na kroplę kleju na scenie.
- Aby zapobiec wysuszeniu mózgu i spływaniu kleju po bokach tkanki, nałóż kilka kropli SPS za pomocą pipety Pasteura i umieść etap cięcia w komorze krojenia. Ustaw blok mózgowy tak, aby obszary zainteresowania (np. kora móżdżku) były skierowane w stronę ostrza, a zatem były poddawane najmniejszemu naciskowi mechanicznemu przed pocięciem.
- Pokrój każdy plasterek zgodnie z instrukcjami producenta, stale gazując SPS w komorze krojenia, a także utrzymując temperaturę na poziomie 34-37 °C. Utrzymuj temperaturę komory krojenia w tym zakresie, napełniając zewnętrzną komorę krajalnicy podgrzaną, oczyszczoną wodą i wymieniając wodę, gdy temperatura spadnie zbyt nisko.
UWAGA: Parametry krojenia muszą być eksperymentalnie znalezione dla każdego rodzaju badanej tkanki i neuronów. W przypadku krajalnicy Campden SMZ 700 z ceramicznymi ostrzami i komórkami Golgiego móżdżku należy zastosować amplitudę drgań 0,75 mm przy 65 Hz i prędkość posuwu 0,05 mm/s; w przypadku neuronów jądrowych móżdżku zalecana jest wyższa amplituda i częstotliwość (odpowiednio 1 mm i 90 Hz) oraz wolniejsza prędkość postępu (0,01-0,02 mm/s). Zarówno w przypadku neuronów jądrowych Golgiego, jak i móżdżku, grubość warstwy powinna wynosić 300 μm. - Podczas krojenia nie pozwól, aby plastry same się złożyły. Zapobiegnij temu, delikatnie podpierając je miękką szczoteczką, najlepiej dotykając plasterka tylko w miejscach, które nie są interesujące dla eksperymentu. Uważaj, aby szczoteczka nie dotykała ostrza wibratomu; Szczególnie w przypadku ostrzy ceramicznych nawet lekki kontakt może uszkodzić ostrze.
- Przenieś każdą kromkę z komory krojenia do komory odzyskiwania/przytrzymywania za pomocą pipety Pasteura z szerokimi otworami, polerowanego ogniowo.
- Pozostaw plastry w komorze na co najmniej 1 godzinę przed rozpoczęciem eksperymentu. Pozwala to na degradację uszkodzonych lub umierających tkanek i komórek, a tym samym skutkuje czystszą powierzchnią plastru. Przez pierwszą godzinę utrzymywać temperaturę SPS w komorze w zakresie 34-36 °C; Upewnij się, że plastry nie są dotykane przez pęcherzyki powietrza, które mogą je uszkodzić lub sprawić, że będą unosić się na wodzie.
4. Eksperyment
- Po upływie 1 godziny odczekać, aż temperatura komory rekuperacji ostygnie do temperatury RT (17-25 °C).
UWAGA: Może to wydłużyć okres, w którym plastry mogą być używane, spowalniając wzrost bakterii, a także metabolizm komórkowy. Okres ten zależy od regionu mózgu i typu komórki. Na przykład niektóre typy komórek Golgiego można uznać za zdrowe w plasterkach 8 godzin po pokrojeniu, podczas gdy inne typy trwają tylko 6 godzin. - Po upływie 1 godziny od krojenia użyj plastrów do różnych eksperymentów elektrofizjologicznych.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Platki przygotowane w opisany sposób mogą być wykorzystane w różnych eksperymentach elektrofizjologicznych i optogenetycznych. Na Rysunku 3A i 3C przedstawiono odpowiednio reprezentatywny przykład poziomego plastra móżdżku oraz coronalnego plastra kory mózgowej, widziane w optyce kontrastu interferencyjnego (DIC). W plastrze móżdżku kilka typów neuronów móżdżkowych można łatwo rozpoznać po ich lokalizacji i kształcie ciała komórkowego, co umożliwia celowane rejestracje elektrofizjologicz...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Demonstrujemy metodę przygotowywania ostrych wycinków mózgu myszy w temperaturze fizjologicznej, a nie lodowatej.
Wykazano11 , że jakość plastrów uzyskanych w ciepłych warunkach jest lepsza w porównaniu z tymi przygotowanymi w zimnych warunkach, pod warunkiem, że ostrze krajalnicy ma minimalne wibracje pionowe. Krojenie w temperaturze fizjologicznej może zapobiec artefaktom fizjologicznym spowodowanym niską temperaturą, takim jak te związane ze zmianami w procesach metabolicznych
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Chcielibyśmy podziękować za znaczący wkład dr Shiwei Huang (Australian National University) w walidację metody. Ponadto chcielibyśmy podziękować Pani Kasi Pietrajtis za pomocne uwagi dotyczące komórek Golgiego oraz Panu Witalijowi Lernerowi za dane eksperymentalne kory mózgowej. Prace te były wspierane przez PITN-GA-2009-238686 (CEREBNET), FP7-ICT (REALNET), ELSC i ISF.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Pentobarbital | CTS | 170066 | Stężenie: 60 mg/ml w soli fizjologicznej. |
| Duże nożyczki | FST | 14001-16 | Do dekapitacji można użyć dowolnych dużych nożyczek lub gilotyny o wystarczająco ostrych krawędziach |
| Nożyczki do przysłony | Prestige medical | 48,148 | Można używać dowolnych nożyczek z cienką końcówką, pod warunkiem, że ostrza nożyczek nie są dłuższe niż 1.5– 2 cm |
| Kleszczyki z cienką końcówką | FST | 11254-20 | |
| Skalpel | FST | 91003-12 | |
| Ostrze skalpela #11 | FST | 10011-00 | |
| Mała szpatułka | Rybacy | 2350 | |
| Bibuła | Można użyć dowolnej marki laboratoryjnej. | ||
| Szalki | Petriego Duroplan | Z231509-1 | |
| Szklane zlewki | SCHOT | 10022846 | |
| Pipeta Pasteura | Marka liścia klonu | 14672-029 | |
| Super klej | LOCTITE | 4091361/1 | |
| Krajalnica | Campden | 7000-smz | |
| Ceramiczne ostrze do krojenia | Campden | 7550-1-C | |
| Grzałka/mieszadło | Do podgrzewania SPS do zabiegu | ||
| Czajnik | Do podgrzewania wody w celu kontroli temperatury | ||
| Komora odzysku plastrów + jednostka grzewcza | Warner Instrumenty | BSC-HT + Można również stosować modele BSC-BUW | zbudowane w domu. |
| Termometr | do monitorowania temperatury SPS podczas rozcinania i krojenia |
Bibliografia
- Skrede, K., Westgaard, R. The transverse hippocampal slice: a well-defined cortical structure maintained in vitro. Brain Research. 35, 589-593 (1971).
- Aghajanian, G., Rasmussen, K. Intracellular studies in the facial nucleus illustrating a simple new method for obtaining viable motoneurons in adult rat brain slices. Synapse. 3, 331-338 (1989).
- Gueritaud, J. Electrical activity of rat ocular motoneurons recorded in vitro. Neuroscience. 24, 837-852 (1988).
- Lipton, P., et al. Making the best of brain slices: comparing preparative methods. Journal of Neuroscience Methods. 59, 151-156 (1995).
- Richerson, G., Messer, C. Effect of composition of experimental solutions on neuronal survival during rat brain slicing. Experimental Neurology. 131, 133-143 (1995).
- Brahma, B., Forman, R., Stewart, E., Nicholson, C., Rice, M. Ascorbate inhibits edema in brain slices. Journal of Neurochemistry. 74, 1263-1270 (2000).
- Moyer, J. R., Brown, T. H. Patch-clamp techniques applied to brain slices. In: Patch-clamp analysis: advanced techniques. Springer. , 135-193 (2002).
- Ye, J. H., Zhang, J., Xiao, C., Kong, J. Q. Patch-clamp studies in the CNS illustrate a simple new method for obtaining viable neurons in rat brain slices: glycerol replacement of NaCl protects CNS neurons. J. Neuroscience Methods. 156, 251-259 (2006).
- Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J., Jonas, P. Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices. Nature Protocols. 1, 2075-2081 (2006).
- Zhao, S., et al. Cell type–specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nature Methods. 8, 745-752 (2011).
- Huang, S., Uusisaari, M. Y. Physiological temperature during brain slicing enhances the quality of acute slice preparations. Front. Cell. Neurosci. 7, (2013).
- Ohe, G. C., Darian-Smith, C., Garner, C. C., Heller, H. C. The Journal of Neuroscience. 26 (41), 10590-10598 (2006).
- Voets, T., et al. The principle of temperature-dependent gating in cold- and heat-sensitive TRP channels. Nature. 430, 748-754 (2004).
- Coulter, D. A., Huguenard, J. R., Prince, D. A. Calcium currents in rat thalamocortical relay neurones: kinetic properties of the transient, low-threshold current. The Journal of Physiology. 414, 587-604 (1998).
- Gibb, A. J., Edward, F. A. Patch clamp recording from cells in slice tissues. Microelectrode Techniques: the Plymouth workshop handbook. , 2nd edition, Company of Biologists. Cambridge, UK. (1994).
- Lefler, Y., Yarom, Y., Uusisaari, M. Y. Cerebellar Inhibitory Input to the Inferior Olive Decreases Electrical Coupling and Blocks Subthreshold Oscillations. Neuron. 81 (6), 1389-1400 (2014).
- Bourne, J. N., Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. Warmer preparation of hippocampal slices prevents synapse proliferation that might obscure LTP-related structural plasticity. Neuropharmacology. 52, 55-59 (2007).
- Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. Slices have more synapses than perfusion-fixed hippocampus from both young and mature rats. J. Neurosci. 19, 2876-2886 (1999).
- Kirov, S. A., Petrak, L. J., Fiala, J. C., Harris, K. M. Dendritic spines disappear with chilling but proliferate excessively upon rewarming of mature hippocampus. Neuroscience. 127, 69-80 (2004).
- Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice. J. Neurosci. Methods. 171, 181-125 (2008).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
