Mechanizmy prowadzące do rozwoju przerostu błony wewnętrznej (IH) i niewydolności przeszczepów żył są nadal słabo poznane. Badanie to opisuje system ex vivo do perfuzji ludzkich żył pod kontrolowanym przepływem i ciśnieniem. Ponadto oceniono skuteczność zbrojenia siatką zewnętrzną w celu ograniczenia rozwoju IH.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Procedura perfuzji żył odpiszczelowych człowieka ex vivo i wzmocnienia zewnętrznego
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Podstawą współczesnych terapii rozległej choroby tętnic okluzyjnych jest pomostowanie żylne. Jednak jego trwałość jest zagrożona przez przerost błony wewnętrznej (IH), który ostatecznie prowadzi do niedrożności naczyń i niewydolności przeszczepu. Uważa się, że siły mechaniczne, szczególnie niskie naprężenia ścinające i wysokie napięcie ścian, inicjują i podtrzymują te zmiany komórkowe i molekularne, ale ich dokładny udział pozostaje do rozwikłania. Aby selektywnie ocenić rolę ciśnienia i naprężeń ścinających na biologię IH, stworzono system perfuzji ex vivo (EVPS) do perfuzji odcinków ludzkich żył odpiszczelowych w schemacie tętniczym (wysokie naprężenie ścinające i wysokie ciśnienie). Kolejne innowacje techniczne pozwoliły na jednoczesną perfuzję dwóch segmentów z tej samej żyły, z których jeden został wzmocniony zewnętrzną siatką. Żyły pobrano przy użyciu techniki bezdotykowej i natychmiast przeniesiono do laboratorium w celu złożenia w EVPS. Jeden odcinek świeżo izolowanej żyły nie uległ perfuzji (kontrola, dzień 0). Dwa pozostałe segmenty były perfundowane przez okres do 7 dni, przy czym jeden z nich był całkowicie osłonięty zewnętrzną siatką o średnicy 4 mm. Ciśnienie, prędkość przepływu i częstość tętna były stale monitorowane i dostosowywane tak, aby naśladować warunki hemodynamiczne panujące w tętnicy udowej. Po zakończeniu perfuzji żyły zostały zdemontowane i wykorzystane do analizy histologicznej i molekularnej. W warunkach ex vivo perfuzja wysokociśnieniowa (tętnicza, średnia = 100 mm Hg) jest wystarczająca do wytworzenia IH i przebudowy żył człowieka. Zmiany te są zmniejszone w obecności zewnętrznej siatki poliestrowej.
Wprowadzenie
Choroby układu krążenia są główną przyczyną zachorowalności i śmiertelności w krajach zachodnich1. Pomimo postępów w leczeniu wewnątrznaczyniowym, chirurgia pomostowania pozostaje podstawą współczesnych terapii, dlatego w Stanach Zjednoczonych wykonuje się ponad pół miliona przeszczepów żył rocznie. Jednak pomimo dziesięcioleci badań, 30-60% przeszczepów żył kończyn dolnych kończy się niepowodzeniem w ciągu pierwszych lat z powodu przerostu błony wewnętrznej (IH)2. Siły mechaniczne, szczególnie niskie naprężenie ścinające (SS) i wysokie naprężenie ścianki, mają kluczowe znaczenie w inicjacji i rozwoju tej reakcji hiperplastycznej3,4. Aby rozwiązać ten problem, stworzono system perfuzji żył ex vivo (EVPS) w celu zbadania, w ściśle kontrolowanych warunkach hemodynamicznych (ciśnienie i naprężenie ścinające), zachowania ludzkich żył odpiszczelowych. W tym badaniu, po wprowadzeniu do krążenia tętniczego, wysokie ciśnienie (średnio = 100 mm Hg) było wystarczające do stymulowania proliferacji i migracji komórek mięśni gładkich do warstwy wewnętrznej (IH)5.
Badania na ssakach sugerują użycie zewnętrznego wzmocnienia jako skutecznej metody wspierania "żyły tętniczej" i przeciwdziałania ostrym zmianom hemodynamicznym, z którymi ma do czynienia żyła po wszczepieniu do środowiska tętniczego. Siatka zapobiegała nadmiernemu rozciągnięciu, zwiększonemu naprężeniu ścinającemu i zmniejszeniu naprężeń ścianek, a w konsekwencji IH6-10. Jednak mechanizmy leżące u podstaw i jego zastosowanie do żył ludzkich w poprawie drożności bypassów nie zostały w pełni scharakteryzowane. Nasz EVPS został wykorzystany do porównania, w warunkach naśladujących zmiany, z jakimi boryka się żyła po wprowadzeniu do schematu tętniczego (naprężenie ścinające i ciśnienie), zachowania ludzkich żył odpiszczelowych przy braku i obecności zewnętrznej makroporowatej poliestrowej siatki rurkowej. Zapobiegając patologicznej przebudowie i IH, siatka dostarczyła dowodów na jej potencjalną skuteczność kliniczną11.
To badanie 1) przedstawia model perfuzji ex vivo ludzkich żył odpiszczelowych pod kontrolowanym ciśnieniem i naprężeniem ścinającym 2) pokazuje, że zewnętrzna makroporowata siatka poliestrowa zmniejsza IH i dostarcza kluczowych informacji dla jej potencjalnego zastosowania klinicznego.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Komitet Etyczny Uniwersytetu w Lozannie zatwierdził eksperymenty, które są zgodne z zasadami określonymi w Deklaracji Helsińskiej z 1975 roku, zmienionej w 1983 roku dotyczącej wykorzystania tkanek ludzkich.
1. Żniwa z żyły odpiszczelowej człowieka
- Pozyskanie nadwyżek nieżylakowych żył odpiszczelowych ludzkich od pacjentów poddawanych operacji pomostowania kończyn dolnych z powodu niedokrwienia. Na sali operacyjnej należy zdezynfekować całą nogę roztworem jodu i ułożyć pacjenta tak, aby odsłonić nogę od pachwiny do stopy.
- Wykonaj środkowe nacięcie od pachwiny do kolana (pozostawiając przerwaną część skóry).
- Zbierz żyłę odpiszczelową z szypułką otaczającej tkanki (technika bezdotykowa). Zabezpiecz boczne gałęzie żył jedwabnymi opaskami 4-0. Nadmiar segmentu żyły odpiszczelowej większej o długości co najmniej 9 cm należy natychmiast przechowywać w pożywce RPMI-1640 Glutamax uzupełnionej 12,5% płodową surowicą cielęcą i przynieść do laboratorium.
2. Projektowanie EVPS
- Zmontuj wyposażenie ogólne pokazane na rysunku 1. Cały sprzęt należy sterylizować w autoklawie i przechowywać wszystkie elementy w sterylnych warunkach. Ponadto upewnij się, że system jest wodoodporny i nie przedostaje chemikaliów do medium. Na okładkę należy użyć polimetakrylanu metylu (PMMA-GS). Stal (X5, Cr, Ni, 18, 10) i tworzywo polioksymetylenowe (POM) jako podpora żyły.
- Zaprojektuj komorę perfuzyjną zgodnie z pożądaną geometrią, aby umożliwić umieszczenie żyły i jej połączenie. Upewnij się, że głębokość (lub promień w przypadku konstrukcji cylindrycznej) wynosi co najmniej 2,5 cm, aby umożliwić minimalne zgięcie i rozszerzenie naczynia wraz ze stałym pokryciem pożywką hodowlaną (ryc. 1). Uszczelnienie jest poważnym problemem i jest powodem, dla którego stosuje się prostokątną konstrukcję z PMMA-GS.
- Zaprojektuj podporę żyły zgodnie z żądaną geometrią. Aby uniknąć załamania żyły lub nadmiernego rozciągnięcia, należy umożliwić regulację długości poprzez pchanie lub ciągnięcie (śruba nie może być używana do tego celu, ponieważ żyła byłaby skręcona wraz ze śrubą).
UWAGA: Zastosowano tutaj pełny stalowy pręt połączony 2 przesuwanymi elementami w kształcie litery L, które podtrzymują 2 cylindry żył (średnica 5 mm pasująca do naczynia) i żyłę (Rysunek 1B i Rysunek 2). - Zaprojektuj kolumnę ciśnieniową w taki sposób, aby "ciśnienie spoczynkowe" przyłożone do układu wynosiło: p = 0-10 = h x ρ x g, gdzie p = ciśnienie (N/m2, Pa) h = wysokość słupa płynu (m) ρ = gęstość cieczy (kg/m3) i g = stała grawitacyjna (9,81 m/s2). Zaprojektuj cztery kanały łączące, od góry do dołu: do wywierania ciśnienia, do odpływu (z żyły), dopływu (do żyły) i do umożliwienia zmiany medium.
- Przygotuj podłoże. Na podstawie wcześniejszych badań5,11-14 wybierz RPMI-1640, uzupełniony o Glutamax, 12,5% płodową surowicę cielęcą i 1% roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczy (10 000 j./ml penicyliny G, plus 10 mg/ml siarczanu streptomycyny, plus 25 mg/ml amfoterycyny B, plus 0,5 μg/ml: gentamycyna). Naprężenie ścinające (SS) jest określone przez SS= 4 μQ/π*r3Q to natężenie przepływu (ml / s), to promień (cm) odcinka żyły, a μ to lepkość ośrodka perfuzyjnego.
- Moduluj SS, dostosowując lepkość poprzez dodanie dekstranu 70 kDa. Zmierz lepkość za pomocą lepkościomierza. Tutaj dodaj 8% dekstranu 70 kDa, aby ustawić SS na 9-15 dyn/cm2.
- Ustawić pompę zębatą tak, aby indukowała pulsacyjny sygnał kardioidalny o prędkości 60 impulsów/min i stałej amplitudzie generujący jednokierunkowy przepływ 150 ± 15 ml/min, niezależny od ciśnienia przyłożonego w układzie i sterowany przez komputer. Upewnij się, że oprogramowanie do jazdy integruje stałe pobieranie i monitorowanie ciśnienia, prędkości przepływu, częstości tętna i sygnału. W razie potrzeby użyj drugiej pompy (niezsynchronizowanej), aby wytworzyć nielaminarny, turbulentny przepływ.
3. Zespół EVPS (Rysunek 1)
- Przed rozpoczęciem upewnij się, że cały sprzęt jest sterylny. Wykonaj wszystkie poniższe czynności pod aseptyką w okapie z przepływem laminarnym.
- Umieść żyłę na szalce Petriego wypełnionej podłożem. Użyj ostrza chirurgicznego i podziel żyłę na 3 równe segmenty.
- Natychmiast wypłukać jeden segment w PBS. Podziel segment na 3 części, umocuj jedną w formalinie do morfometrii. Zamroź pozostałe dwa do ilościowej analizy transkryptu (RT-PCR) i białka (western blot). Rozważ te segmenty jako kontrolną, nieperfundowaną żyłę.
- Użyj 2 pozostałych segmentów do perfuzji.
- Bardzo delikatnie wstrzyknąć pożywkę do żyły i określić normalny kierunek przepływu; w obecności zastawek żyła jest odwrócona.
- Uszczelnienie żył ma ogromne znaczenie dla powodzenia eksperymentu. Sprawdź, czy nie ma wycieków przez zabezpieczenia. Zabezpiecz wszelkie przecieki za pomocą jedwabnych szwów 6-0.
- Połącz odcinek żyły między dwoma metalowymi cylindrami, jeden koniec na raz (2.3, Rysunek 1). Zabezpiecz cylindry za pomocą Ethibon 3-0 wokół wgłębień (Rysunek 1A i B).
- Umieść cały segment żylny w komorze perfuzyjnej uprzednio wypełnionej pożywką. Powtórz tę samą procedurę dla drugiego segmentu.
UWAGA: Niewłaściwe uszczelnienie żyły do cylindra będzie źródłem wycieku, będzie wymagało ponownej interwencji i znacznie zwiększy ryzyko infekcji i niepowodzenia eksperymentu.
- Umieść cały segment żylny w komorze perfuzyjnej uprzednio wypełnionej pożywką. Powtórz tę samą procedurę dla drugiego segmentu.
- Aby wzmocnić (zasiać) drugi segment, zwolnij dwa cylindry (z dołączoną żyłą) z kawałków w kształcie litery L (2.3 i rysunek 1).
- Bądź delikatny i nie dotykaj żyły żadnymi instrumentami. Wsuń siatkę najpierw na cylinder, a następnie na żyłę. Przepychanie się / ciągnięcie sprawi, że siatka znajdzie się na żyle.
- Gdy siatka pokryje całą powierzchnię żyły, przymocuj żyłę z płaszczem do cylindrów za pomocą Ethibon 3-0.
- Ponownie zmontuj związek żyły/cylindra do wspornika w kształcie litery L i przenieś go do komory perfuzyjnej, uprzednio wypełnionej medium.
- Podłącz każdą metalową butlę (wlotową i odpływową) do rozdzielacza Y za pomocą silikonowej rurki nasączonej nadtlenkiem o średnicy wewnętrznej 3.2 mm.
- Podłącz rozdzielacz odpływowy do drugiego rozdzielacza Y za pomocą tego samego typu rurki. Z tego rozdzielacza Y użyj jednej rurki do pomiaru ciśnienia perfuzji w obu naczyniach. Podłącz drugi z powrotem do kolumny, aby utworzyć system zamkniętej pętli (rysunek 2).
- Wewnątrz inkubatora użyj długiej (o długości jednego metra) rurki, aby podłączyć kolumnę ciśnieniową do głowicy pompy.
- Zakończ konfigurację, podłączając głowicę pompy do rozdzielacza Y dopływu za pomocą innej długiej rurki (Rysunek 1).
4. Perfuzja żył
- Po zakończeniu montażu EVPS napełnij kolumnę medium (pozostań poniżej kanału odpływowego żył, aby umożliwić ponowne napełnienie). Dodaj więcej pożywki do kolumny, aż system będzie pełny. Przenieść cały system do inkubatora utrzymywanego w temperaturze 37 ± 0,1 °C przy pH utrzymywanym na stałym poziomie 7,40 ± 0,01 (przy użyciu algorytmu CO2/pH opartego na równaniu Hendersona-Hasselbacha).
- Wyciągnij głowicę pompy zębatej na zewnątrz inkubatora i podłącz ją do napędu pompy zębatej. Przykręć pręty, aby zabezpieczyć zespół.
- Włącz moc pompy, upewnij się, że jest aktywowana w oprogramowaniu napędowym i odczekaj 5 minut, aby medium zostało równomiernie rozprowadzone w każdej komorze.
- Aby monitorować ciśnienie, użyj monitorowania linii tętniczej. Podłącz wyjście ciśnienia EVPS (odpowiada cewnikowi tętniczemu) do przetwornika ciśnienia połączonego z komputerem.
- Upewnij się, że probówka jest całkowicie wypełniona podłożem i nie zawiera żadnych pęcherzyków. Usunąć pęcherzyki z systemu hodowlanego przez rurkę "linii tętniczej" (ryc. 2). Zwróć uwagę na wyświetlacz i poszukaj pulsacyjnego sygnału kardioidalnego o prędkości 60 impulsów/min o stałej amplitudzie. W tym momencie średnie ciśnienie wynosi od 0 do 10 mm Hg. Jeśli ciśnienie wynosi < 0, a kolumna stopniowo się opróżnia, należy poszukać wycieku (zabezpieczenie żyły lub nieodpowiednie uszczelnienie między żyłą a rurką).
- Ustaw minimalne ciśnienie na 6 mm Hg w przypadku próby żylnej lub na 90 mm Hg w przypadku próby tętniczej. W tych warunkach wtryskiwacz powietrza wywiera wymagane ciśnienie na kolumnę i układ .
- Zmieniaj pożywkę co 2 dni za pomocą rurki podłączonej do kolumny ciśnieniowej. Aby zapobiec uszkodzeniom spowodowanym zmianą ciśnienia, najpierw otwórz korek kolumny.
5. Zakończenie perfuzji
- Po 3 lub 7 dniach perfuzji: wyjąć EVPS z inkubatora i zdemontować żyły. Wyrzuć 5 mm bliższe i dystalne końce żyły przymocowane do sprzętu. Z pozostałego segmentu wyciąć środkowe pierścienie o grubości 5 mm i zamocować w formalinie (morfometria). Zamroź pozostałe fragmenty i rozdrobnij na proszek do dalszych analiz molekularnych.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
System EVPS stanowi cenne narzędzie do niezależnej oceny sił hemodynamicznych wpływających na przebudowę przeszczepów z ludzkiej żyły odpiszowej oraz na IH.
Rysunek 1 przedstawia komorę perfuzyjną oraz uchwyt do żyły. Na Rysunkach 1A i B przedstawiono odpowiednio uchwyt do żyły przed (Rysunek 1A) i po (Rysunek 1B) montażu. Składa się on (od góry do dołu) z gładkiej rurki ze stali nierdzewnej o długości 9 cm, k...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Badanie to odkrywa system perfuzji żył ex vivo (EVPS) do przeprowadzania szeroko zakrojonych badań hemodynamicznych w żyłach ludzkich. System ten umożliwia perfuzję żył odpiszczelowych przy określonych parametrach hemodynamicznych przy braku nasilających czynników zapalnych i wzrostowych uwalnianych przez krążące komórki in vivo. W ten sposób zapewnia lepsze zrozumienie podstawowych szlaków zaangażowanych w kontrolę IH w ludzkich przeszczepachżylnych 5,11,12,15.
Po...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez granty z SNF [31003A-138528], Octav i Marcella Botnar Foundation, Novartis Foundation i Emma Muschamp Foundation. Dziękujemy Martine Lambelet i Jean-Christophe'owi Stehle za ich doskonałą pomoc techniczną.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| RPMI 1640 - Glutamax | Life Technologies | 61870-010 | |
| Penicylina/Streptomycyna/Fungizone | Bioconcept | 4-02F00-H | |
| Dekstran z Leuconostoc spp. 500 g | Sigma-Aldrich | 31390 | |
| Tampon PBS CHUV pH 7,1-7,3 1 L | Laboratorium und Grosse Apotheke Dr. G. Bichsel AG | 100 0 324 00 | |
| Podłoże do zatapiania do kriosekcji - Tissue-Tek OCT Compound | Fisher Scientific | 14-373-65 | |
| Rurka silikonowa (nadtlenkowa) L/S 16 (96400-16 ) - 7,5 m | Idex Health & Science GMBH | MF0037ST | |
| rozdzielacz Y | Idex Zdrowie & Science GMBH | Łącznik | |
| 35 mm Naczynie hodowlane | Sigma-Aldrich | CLS430165-100EA | |
| 15 ml Probówka Falcon | BD Bioscence | 352096 | |
| Pompa zębata - Reglo-Z | Idex Health & Nauka GMBH | SM 895 | App-Nr 03736-00194 |
| Głowica pompy | Idex Health & Nauka GMBH | MI0008 | |
| Zestaw monitorujący TRANSPAC IV | icumedical | 011-0J736-01 | |
| Strzykawki 20 ml | B. Braun Medical SA | 4612041-02 | |
| Etibon 3-0 FS-2 | Ethicon- Johnson& Johnson | EH7346H | |
| Mesh ProVena 6-8mm | B. Braun Medical SA | 1105012-14 | |
| NaCl: Perfuzja roztworu chlorku sodu 0,9% (100 ml) | B. Braun Medical SA | 534534 | |
| Masterflex L/S Standard Drive | Cole-Parmer Instrument Co | 7521-10 | |
| Karta akwizycyjna | National Instruments | PCI-6024 E | |
| moduł | Transonic Systems Inc. | Kran TS410 i T402 | |
| z 3-drogowym | filtrem BD Connexta Luerlock | 394600 | |
| Millex | Milian | SE2M229I04 |
Bibliografia
- Sal Go, A., et al. Executive summary: heart disease and stroke statistics--2014 update: a report from the american heart association. Circulation. 129, 399-410 (2014).
- Sal Conte, M., et al. Results of PREVENT III: a multicenter, randomized trial of edifoligide for the prevention of vein graft failure in lower extremity bypass surgery. Journal of Vascular Surgery. 43, 742-751 (2006).
- Yu, P., Nguyen, B. T., Tao, M., Bai, Y., Ozaki, C. K. Mouse vein graft hemodynamic manipulations to enhance experimental utility. The American Journal of Pathology. 178, 2910-2919 (2011).
- Davies, M. G., Hagen, P. O. Reprinted article "Pathophysiology of vein graft failure: a review". European journal of vascular and endovascular surgery : the official journal of the European Society for Vascular Surgery. 42, Suppl 1. S19-S29 (2011).
- Berard, X., et al. Role of hemodynamic forces in the ex vivo arterialization of human saphenous veins. Journal of Vascular Surgery. 57, 1371-1382 (2013).
- Vijayan, V., et al. Long-term reduction of medial and intimal thickening in porcine saphenous vein grafts with a polyglactin biodegradable external sheath. Journal of Vascular Surgery. 40, 1011-1019 (2004).
- Jeremy, J. Y., et al. On the biology of saphenous vein grafts fitted with external synthetic sheaths and stents. Biomaterials. 28, 895-908 (2007).
- Zilla, P., et al. Constrictive external nitinol meshes inhibit vein graft intimal hyperplasia in nonhuman primates. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 136, 717-725 (2008).
- Zilla, P., et al. Utilization of shape memory in external vein-graft meshes allows extreme diameter constriction for suppressing intimal hyperplasia: a non-human primate study. Journal of Vascular Surgery. 49, 1532-1542 (2009).
- Yeoman, M. S., et al. A constitutive model for the warp-weft coupled non-linear behavior of knitted biomedical textiles. Biomaterials. 31, 8484-8493 (2010).
- Longchamp, A., et al. The use of external mesh reinforcement to reduce intimal hyperplasia and preserve the structure of human saphenous veins. Biomaterials. 35, 2588-2599 (2014).
- Saucy, F., et al. Ex vivo pulsatile perfusion of human saphenous veins induces intimal hyperplasia and increased levels of the plasminogen activator inhibitor 1. European Surgical Research. Europaische Chirurgische Forschung. Recherches Chirurgicales Europeennes. 45, 50-59 (2010).
- Dubuis, C., et al. Atorvastatin-loaded hydrogel affects the smooth muscle cells of human veins. The Journal of pharmacology and experimental. 347, 574-581 (2013).
- Deglise, S., et al. Increased connexin43 expression in human saphenous veins in culture is associated with intimal hyperplasia. Journal of Vascular Surgery. 41, 1043-1052 (2005).
- Muto, A., Model, L., Ziegler, K., Eghbalieh, S. D., Dardik, A. Mechanisms of vein graft adaptation to the arterial circulation: insights into the neointimal algorithm and management strategies. Circulation Journal : Official Journal of the Japanese Circulation Society. 74, 1501-1512 (2010).
- Tao, M., et al. A simplified murine intimal hyperplasia model founded on a focal carotid stenosis. The American Journal of Pathology. 182, 277-287 (2013).
- Berard, X., et al. Salvage treatment for venous aneurysm complicating vascular access arteriovenous fistula: use of an exoprosthesis to reinforce the vein after aneurysmorrhaphy. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery : the Official Journal of the European Society for Vascular Surgery. 40, 100-106 (2010).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
