Opisujemy, jak wizualizować interakcje makrofagów-C. neoformansów (Cn) w czasie rzeczywistym, ze szczególnym naciskiem na proces egzocytozy nielitycznej za pomocą cyfrowej mikroskopii świetlnej. Za pomocą tej techniki można badać indywidualnie zakażone makrofagi w celu ustalenia różnych aspektów tego zjawiska.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wizualizacja egzocytozy nielitycznej Cryptococcus neoformans z makrofagów przy użyciu cyfrowej mikroskopii świetlnej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wiele aspektów infekcji makrofagów przez Cryptococcus neoformans zostało dokładnie zbadanych i dobrze zdefiniowanych. Jednak jedną szczególną interakcją, która nie jest jasno poznana, jest egzocytoza nielityczna. W tym procesie komórki drożdży są uwalniane do przestrzeni zewnątrzkomórkowej przez słabo poznany mechanizm, który pozostawia przy życiu zarówno makrofagi, jak i Cn. Tutaj opisujemy, jak obserwować dużą liczbę indywidualnie zakażonych makrofagów przez 24-godzinny okres infekcji za pomocą mikroskopii poklatkowej. Zakażone makrofagi są umieszczane w komorze grzewczej z atmosferą CO2 podłączoną do mikroskopu, który zapewnia takie same warunki jak inkubator do hodowli komórkowych. Mikroskopia cyfrowa na żywo może dostarczyć informacji o dynamicznych interakcjach między gospodarzem a patogenem, które nie są dostępne na obrazach statycznych. Możliwość wizualizacji każdej zainfekowanej komórki może dostarczyć wskazówek na temat tego, jak makrofagi radzą sobie z infekcjami grzybiczymi i odwrotnie. Technika ta jest potężnym narzędziem w badaniu dynamiki, która stoi za złożonym zjawiskiem.
Wprowadzenie
Etapy infekcji grzybiczej między komórkami kryptokokowymi a makrofagami są dobrze udokumentowane 1-3. Po spożyciu komórek drożdży przez makrofagi mogą wystąpić różne interakcje: makrofagi mogą lizować, uwalniając ładunek grzybów do przestrzeni zewnątrzkomórkowej lub mogą kontrolować infekcję, utrzymując komórki drożdży w granicach błony komórkowej 4. Jednak kilka lat temu nowy wynik został opisany niezależnie przez dwie grupy: egzocytoza nielityczna, proces, w którym makrofag usunął niektóre lub wszystkie komórki kryptokokowe do otaczającego środowiska lub sąsiedniej komórki, a zarówno gospodarz, jak i patogen pozostają żywotne 5-8. W ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie prace na zwierzętach zostały wykonane zgodnie z przepisami i wytycznymi Instytutu Badań nad Zwierzętami w Albert Einstein College of Medicine.
1. Warunki wzrostu C. neoformans H99 (Serotyp A)
- Hoduj pojedyncze kolonie C. neoformans (Cn) na płytkach agarowych Sabouraud.
- Dzień przed eksperymentem wybierz jedną rodzinę i zaszczep 10 ml bulionu Sabouraud.
- Pozostawić kulturę do wzrostu przez noc w temperaturze 37 °C, wytrząsając z prędkością 250 obr./min.
2. Izolacja i przygotowanie pierwotnych makrofagów kostnych od myszy C57/Bl6
- Poddaj mys....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Obrazy generowane za pomocą tej techniki można analizować na różne sposoby, aby zebrać informacje o tym, co dzieje się po fagocytozie C. neoformans przez komórki. Jak widać na Rysunku 1, znajduje się tam około 100 makrofagów, zakażonych lub niezakażonych. Każdy z tych makrofagów daje obserwatorowi możliwość badania interakcji gospodarz-patogen na poziomie mikroskopowym. Jak pokazują Rysunki 2 i 3, między makrofagiem a komórką drożdżaka, a nawet między makrofagam.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Tutaj opisaliśmy metodę, za pomocą której interakcje grzyb-makrofag mogą być rejestrowane i analizowane w czasie rzeczywistym przez okres 24 godzin. Nasze laboratorium wykorzystało ten protokół do zbadania wielu czasowych aspektów egzocytozy nielitycznej i będzie nadal używać mikroskopii w czasie rzeczywistym w celu ustalenia składników morfologicznych otaczających ten proces.
Aby ta technika przyniosła idealne wyniki, należy zwrócić szczególną uwagę na niektóre kroki w protokole. Gęstość komó.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mamy konkurencyjnych interesów finansowych ani innych konfliktów interesów.
Podziękowania
To badanie było częściowo wspierane przez nagrody NIH 5T32AI07506, 5R01AI033774, 5R37AI033142, 5R01AI052733.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Sabouraud Dekstroza Agar | BD | DF0109-17-1 | |
| Sabouraud Bulion dekstrozowy | BD | DF0382-17-9 | |
| Dubelcco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Corning Cellgro | 10-013-CV | |
| Płodowa surowica cielęca (FCS) | Atlanta Biologicals | S12450 | |
| NCTC 109 | Invitrogen | 21340-039 | |
| Penicylina-Streptomycyna | Gibco | 15140-122 | |
| Bufor HEPES | Corning Cellgro | 25-060-Cl | |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-061 | |
| Aminokwasy endogenne | Corning Cellgro | 25-025-Cl | |
| 2-merkaptoetanol | Invitrogen | 21985-023 | Toksyczny |
| 3003 Kultura tkankowa Szalki Petriego | Fisher Naukowy | 08772E | |
| CellStripper | Corning Cellgro | 25-056-CL | |
| Mat-tek Naczynia do hodowli ze szklanym dnem | MatTek | P35GC-1.5-14-C | |
| LPS | Sigma | L3137 | |
| Mysz IFN-g | Roche | NC 9222016 | |
| mAb 18B7 | Niekomercyjne przeciwciało produkowane w naszym laboratorium | ||
| Axiovert 200M Mikroskop z komorą inkubacyjną | Zeiss |
Bibliografia
- Voelz, K., May, R. C. Cryptococcal Interactions With the Host Immune System. Eukaryotic cell. 9 (6), 835-846 (2010).
- Johnston, S. A., May, R. C. Cryptococcus interactions with macrophages: evasion and manipulation of the phagosome by a fungal p....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
