Wizualizacja egzocytozy nielitycznej Cryptococcus neoformans z makrofagów przy użyciu cyfrowej mikroskopii świetlnej

Summary

Opisujemy, jak wizualizować interakcje makrofagów-C. neoformansów (Cn) w czasie rzeczywistym, ze szczególnym naciskiem na proces egzocytozy nielitycznej za pomocą cyfrowej mikroskopii świetlnej. Za pomocą tej techniki można badać indywidualnie zakażone makrofagi w celu ustalenia różnych aspektów tego zjawiska.

Abstract

Wiele aspektów infekcji makrofagów przez Cryptococcus neoformans zostało dokładnie zbadanych i dobrze zdefiniowanych. Jednak jedną szczególną interakcją, która nie jest jasno poznana, jest egzocytoza nielityczna. W tym procesie komórki drożdży są uwalniane do przestrzeni zewnątrzkomórkowej przez słabo poznany mechanizm, który pozostawia przy życiu zarówno makrofagi, jak i Cn. Tutaj opisujemy, jak obserwować dużą liczbę indywidualnie zakażonych makrofagów przez 24-godzinny okres infekcji za pomocą mikroskopii poklatkowej. Zakażone makrofagi są umieszczane w komorze grzewczej z atmosferą CO₂ podłączoną do mikroskopu, który zapewnia takie same warunki jak inkubator do hodowli komórkowych. Mikroskopia cyfrowa na żywo może dostarczyć informacji o dynamicznych interakcjach między gospodarzem a patogenem, które nie są dostępne na obrazach statycznych. Możliwość wizualizacji każdej zainfekowanej komórki może dostarczyć wskazówek na temat tego, jak makrofagi radzą sobie z infekcjami grzybiczymi i odwrotnie. Technika ta jest potężnym narzędziem w badaniu dynamiki, która stoi za złożonym zjawiskiem.

Introduction

Etapy infekcji grzybiczej między komórkami kryptokokowymi a makrofagami są dobrze udokumentowane ^1-3. Po spożyciu komórek drożdży przez makrofagi mogą wystąpić różne interakcje: makrofagi mogą lizować, uwalniając ładunek grzybów do przestrzeni zewnątrzkomórkowej lub mogą kontrolować infekcję, utrzymując komórki drożdży w granicach błony komórkowej ⁴. Jednak kilka lat temu nowy wynik został opisany niezależnie przez dwie grupy: egzocytoza nielityczna, proces, w którym makrofag usunął niektóre lub wszystkie komórki kryptokokowe do otaczającego środowiska lub sąsiedniej komórki, a zarówno gospodarz, jak i patogen pozostają żywotne ^5-8. W kilku badaniach próbowano zrozumieć mechanizmy molekularne stojące za tą interakcją, ale nadal nie mamy pełnego zrozumienia, co napędza to zjawisko.

Możliwość przechwytywania obrazów w czasie rzeczywistym, a następnie analizowania wielu zainfekowanych makrofagów, pozwala odpowiedzieć na wiele pytań dotyczących właściwości fizycznych otaczających egzocytozę nielityczną w odniesieniu do czasu, pojemności przestrzennej, zmiany morfologii, a nawet stresu makrofagów podczas infekcji grzybiczej. Pozwalając komórkom przebywać w środowisku porównywalnym do środowiska w inkubatorze, możemy dostrzec dynamiczną naturę interakcji makrofagów z komórkami grzybów. Naukowcy wykorzystali tę technikę do zbadania różnych elementów tego procesu. Rola fagosomu w tym procesie została uwidoczniona przy użyciu barwienia fluorescencyjnego i środków blokujących aktynę ⁹, podczas gdy inna grupa wykorzystała tę metodę, aby pokazać, że egzocytoza nielityczna została zablokowana w komórkach, w których usunięto domeny białkowe zarodkujące WASH ¹⁰. Wpływ sygnalizacji cytokin został również ustalony za pomocą mikroskopii w czasie rzeczywistym ¹¹. Proces ten nie ogranicza się do C. neoformans, ponieważ zaobserwowano go również w przypadku Candida albicans, innego patogenu grzybowego, który ma zdolność infekowania makrofagów ¹². Odkrycia te są przykładami tego, jak ta metoda może dostarczyć bogactwa informacji w obszarze, o którym wiemy tak niewiele.

Protocol

Wszystkie prace na zwierzętach zostały wykonane zgodnie z przepisami i wytycznymi Instytutu Badań nad Zwierzętami w Albert Einstein College of Medicine.

1. Warunki wzrostu C. neoformans H99 (Serotyp A)

1. Hoduj pojedyncze kolonie C. neoformans (Cn) na płytkach agarowych Sabouraud.
2. Dzień przed eksperymentem wybierz jedną rodzinę i zaszczep 10 ml bulionu Sabouraud.
3. Pozostawić kulturę do wzrostu przez noc w temperaturze 37 °C, wytrząsając z prędkością 250 obr./min.

2. Izolacja i przygotowanie pierwotnych makrofagów kostnych od myszy C57/Bl6

1. Poddaj myszy eutanazji, umieszczając zwierzę w komorze CO₂ do momentu, aż przestanie oddychać. Jako drugi środek, zwichnąć szyję szyjki macicy przed rozpoczęciem rozwarstwienia. Wysterylizuj całe ciało 70% alkoholem etylowym.
2. Usuń obie kości udowe i piszczelowe, a następnie umieść kości w sterylnym DMEM.
3. Usuń nadmiar tkanki i mięśni za pomocą delikatnych chusteczek, aż kości będą całkowicie czyste.
4. Umieść tylko nienaruszone kości na szalce Petriego zawierającej 70% alkoholu etylowego i inkubuj przez 3 minuty w celu zabicia powiązanych mikroorganizmów. Usunąć kości i umieścić na szalce Petriego ze sterylnym DMEM.
5. Ostrożnie odetnij końce kości. Trzymać kość nad pustą stożkową probówką o pojemności 50 ml umieszczoną na lodzie i ostrożnie przepłukać 10 ml zimnego DMEM za pomocą igły 25 G przez każdą kość.
   UWAGA: Każda mysz da 4 kości (2 kości udowe, 2 piszczelowe). Dlatego jedna mysz powinna dać około 40 ml zawiesiny komórkowej.
6. Zawiesinę komórek odwirować w temperaturze pokojowej przez 10 minut przy 650 x g.
7. Podczas tego wirowania przygotuj i przefiltruj pożywkę do karmienia makrofagów szpiku kostnego, która składa się z DMEM uzupełnionego 20% L929, 10% płodowej surowicy cielęcej, 10% NCTC-109, 1% Pen-Strep, 1% HEPES, 1% L-glutaminy, 1% aminokwasów endogennych, 0,1% 2-merkaptoetanolu.
8. Zawiesić powstały osad za pomocą 10 ml pożywki. Przepuść zawiesinę komórek przez sitko komórkowe o średnicy 70 μm, aby rozbić grudki komórek i usunąć duże zanieczyszczenia.
9. Płytka 1 ml zawiesiny komórkowej w 10 ml pożywki na szalkach Petriego, które są przeznaczone do hodowli tkankowych (w sumie 10 płytek).
10. Pozostawić komórki do przylegania w temperaturze 37 °C z 10% CO₂ . Dodać 5 ml świeżej pożywki w dniu 3. W 7 dniu całkowicie wymień pożywkę pokarmową, a makrofagi są gotowe do użycia.
11. Dzień przed eksperymentem oderwij makrofagi od płytki, usuwając pożywkę i dodaj 5 ml delikatnego odczynnika do usuwania komórek na płytkę.
12. Inkubować przez 5-10 minut w temperaturze 37 °C i usunąć makrofagi za pomocą delikatnego pipetowania.
13. Komórki osadu przez odwirowanie przy 650 x g przez 10 min.
14. Zawiesić osad w 1 ml pożywki. Stosując rozcieńczenie 1:20, obliczyć stężenie makrofagów, odmierzając 10 μl zawiesiny komórkowej na hemocytometr.
15. Używając 14-milimetrowych szalek Petriego ze szklanym dnem, nanieś stężenie 1 x^10-5 makrofagów bezpośrednio na wewnętrzną studzienkę, która zawiera maksymalnie 200 μl, dlatego należy uważać, aby nie przekroczyć tej objętości, jak pokazano na rysunku 4.
16. Pozostawić komórki do przylegania do szklanej płytki Petriego, umieszczając je w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 1 godzinę.
17. Dodać 1-2 ml pożywki uzupełnionej LPS w stężeniu 1 mg/ml i IFNg w stężeniu 500 u/ml i pozostawić komórki do inkubacji przez noc.

3. Współinkubacja pierwotnych mysich makrofagów i C. neoformans

1. W dniu doświadczenia usunąć 1 ml zaszczepionej przez noc kultury i osadów drożdży przez odwirowanie przez 5 minut przy 420 x g.
2. Umyj komórki 3 razy sterylnym PBS, aby usunąć pożywkę i zewnątrzkomórkowe produkty kryptokokowe, takie jak polisacharyd glukuronoksylomannan (GXM) z prędkością i czasem wymienionym powyżej.
3. Zawiesić osad komórkowy w 1 ml sterylnego PBS i rozcieńczyć w stosunku 1:100. Pobrać pipetę 10 μl rozcieńczenia na hemocytometr i policzyć komórki. Dodaj komórki drożdży w MOI 1:5. Na przykład, jeśli jest 1 x 10⁵ makrofagów/studzienkę, należy wykonać zawiesinę komórkową 5 x 10⁶ / ml Cn i dodać 100 μl tego roztworu, aby uzyskać całkowitą ilość 5 x 10⁵ Cn.
4. Dodać obliczoną objętość zawiesiny komórek kryptokokowych do 1 ml pożywki z przeciwciałem mAb 18B7 o stężeniu 10 μg/ml. Zawiesinę komórek inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min.
5. Usunąć pożywkę ze szklanego dna z szalki Petriego i umyć 1x sterylnym PBS. Dodaj 100 μl opsonizowanego Cn bezpośrednio do studzienki.
6. Pozostawić komórki do inkubacji przez 2 godziny w temperaturze 37 °C przy stężeniu 10% CO₂ .
7. Po koinkubacji sprawdź pod mikroskopem, czy makrofagi zinternalizowały Cn. Aby można je było uznać za zinternalizowane, komórki kryptokokowe powinny być wyraźnie widoczne w granicach makrofagów.
8. Umyj szalkę Petriego 3x sterylnym PBS, aby usunąć wszelkie zewnątrzkomórkowe Cn.
9. Dodać 1-2 ml pożywki bez dodatku mAb 18B7 i ustawić mikroskop.

4. Wizualizacja egzocytozy nielitycznej w czasie rzeczywistym za pomocą cyfrowej mikroskopii świetlnej

UWAGA: Do przeprowadzenia tych eksperymentów wymagany jest mikroskop z dołączoną komorą inkubacyjną, która zawiera dostarczanie CO₂ i urządzenie grzewcze.

1. Przed eksperymentem należy wstępnie ogrzać komorę inkubacyjną przez co najmniej 30 minut do temperatury 37 °C. Upewnij się, że jednostka CO₂ wskazuje 5% na początku eksperymentu.
2. Umieść szalkę Petriego ze szklanym dnem na platformie mikroskopu, przykryj pokrywką CO₂ i zamknij wszystkie drzwiczki, aby upewnić się, że ciepło nie ucieka.
3. Używając obiektywu 10X z mikroskopem w kontraście fazowym, skup się na czystym polu zakażonych makrofagów. Na podstawie eksperymentu określ cel używany przez liczbę makrofagów, które należy zbadać.
4. Skonfiguruj oprogramowanie mikroskopu, aby robić zdjęcie co 4 minuty przez okres 24 godzin.
5. Po 24 godzinach eksperyment zostanie zakończony i w sumie zostanie zebranych 361 obrazów. Wyeksportuj te obrazy jako .jpeg z kompresją 5%. Korzystając z oprogramowania Image J, wyświetlaj obrazy jako stos wizualny z szybkością 5 klatek na sekundę. Jeśli film musi zostać wyświetlony do publikacji lub prezentacji, zapisz go jako plik .avi lub .mov, w zależności od tego, który format jest najlepszy dla widza.

Results

Obrazy, które tworzy ta technika, mogą być analizowane na różne sposoby, aby zebrać informacje o tym, co dzieje się po fagocytozowaniu komórek przez C. neoformans. Jak widać na rycinie 1, istnieje około 100 makrofagów, które są albo zakażone, albo niezainfekowane. Każdy z tych makrofagów daje widzowi możliwość zbadania interakcji gospodarz-patogen na bardzo mikroskopowym poziomie. Jak pokazują rysunki 2 i 3, istnieją różne wyniki, które mogą wystąpić między makr...

Discussion

Tutaj opisaliśmy metodę, za pomocą której interakcje grzyb-makrofag mogą być rejestrowane i analizowane w czasie rzeczywistym przez okres 24 godzin. Nasze laboratorium wykorzystało ten protokół do zbadania wielu czasowych aspektów egzocytozy nielitycznej i będzie nadal używać mikroskopii w czasie rzeczywistym w celu ustalenia składników morfologicznych otaczających ten proces.

Aby ta technika przyniosła idealne wyniki, należy zwrócić szczególną uwagę na niektóre kroki w protokole. Gęstość komó...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sabouraud Dekstroza Agar	BD	DF0109-17-1
Sabouraud Bulion dekstrozowy	BD	DF0382-17-9
Dubelcco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Corning Cellgro	10-013-CV
Płodowa surowica cielęca (FCS)	Atlanta Biologicals	S12450
NCTC 109	Invitrogen	21340-039
Penicylina-Streptomycyna	Gibco	15140-122
Bufor HEPES	Corning Cellgro	25-060-Cl
Glutamax	Invitrogen	35050-061
Aminokwasy endogenne	Corning Cellgro	25-025-Cl
2-merkaptoetanol	Invitrogen	21985-023	Toksyczny
3003 Kultura tkankowa Szalki Petriego	Fisher Naukowy	08772E
CellStripper	Corning Cellgro	25-056-CL
Mat-tek Naczynia do hodowli ze szklanym dnem	MatTek	P35GC-1.5-14-C
LPS	Sigma	L3137
Mysz IFN-g	Roche	NC 9222016
mAb 18B7	Niekomercyjne przeciwciało produkowane w naszym laboratorium
Axiovert 200M Mikroskop z komorą inkubacyjną	Zeiss