Opisujemy protokół izolacji i hodowli ludzkich komórek nabłonka owodni (hAEC) przy użyciu odczynników wolnych od produktów zwierzęcych, zgodnie z aktualnymi wytycznymi dobrej praktyki produkcyjnej (cGMP).
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Izolacja, kriokonserwacja i hodowla ludzkich komórek nabłonka owodni do zastosowań klinicznych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Ludzkie komórki nabłonkowe owodni (hAEC) pochodzące z błon owodniowych przyciągnęły uwagę badaczy i klinicystów jako potencjalne źródło komórek dla medycyny regeneracyjnej. Powodem tego zainteresowania są dowody na to, że komórki te mają wysoce multipotencjalną zdolność różnicowania, niską immunogenność i funkcje przeciwzapalne. Właściwości te skłoniły naukowców do zbadania potencjału hAEC do stosowania w leczeniu różnych chorób i zaburzeń w przedklinicznych badaniach na zwierzętach z dużym sukcesem.
hAEC znalazły szerokie zastosowanie w leczeniu wielu chorób i zaburzeń. Potencjalne zastosowania kliniczne hAEC obejmują leczenie udaru mózgu, stwardnienia rozsianego, chorób wątroby, cukrzycy oraz przewlekłych i ostrych chorób płuc. Przejście od przedklinicznych badań na zwierzętach do badań klinicznych wymaga wyższego standardu kontroli jakości i bezpieczeństwa produktów terapii komórkowej. Ze względów bezpieczeństwa i kontroli jakości zaleca się, aby protokoły izolacji komórek wykorzystywały odczynniki niezawierające produktów pochodzenia zwierzęcego.
Opracowaliśmy protokoły, które pozwalają badaczom izolować, kriokonserwować i hodować hAEC przy użyciu odczynników wolnych od produktów zwierzęcych. Zaletą tej metody jest to, że komórki te mogą być izolowane, charakteryzowane, kriokonserwowane i hodowane bez ryzyka dostarczenia potencjalnie szkodliwych patogenów zwierzęcych ludziom, przy jednoczesnym zachowaniu odpowiedniej wydajności komórek, żywotności i potencjału wzrostu. Dla badaczy przechodzących od badań przedklinicznych na zwierzętach do badań klinicznych metodologie te znacznie przyspieszą zatwierdzanie przez organy regulacyjne, zmniejszą ryzyko i poprawią jakość populacji komórek terapeutycznych.
Wprowadzenie
Komórki pochodzące ze źródeł okołoporodowych, takich jak łożysko, błony łożyskowe, pępowina i płyn owodniowy, przyciągnęły uwagę badaczy i klinicystów jako potencjalne źródło komórek dla medycyny regeneracyjnej1,2. Powodem tego zainteresowania jest fakt, że wszystkie te typy komórek posiadają pewien stopień plastyczności i zdolności immunomodulacyjnych3, które są fundamentalne dla ich potencjalnych zastosowań terapeutycznych.
hAEC to niejednorodna populacja nabłonkowa, która może pochodzić z błony owodniowej4 lub przedwczesnej, stanowiąc obfite potencjalne źródło regeneracyjnego materiału komórkowego. Właściwości, które sprawiają, że hAEC są atrakcyjne jako terapia komórkowa, obejmują ich multipotencję, niską immunogenność i właściwości przeciwzapalne. Stwierdzono, że hAEC są wysoce multipotencjalne zarówno in vitro, jak i in vivo, zdolne do różnicowania się w linie mezodermalne (kardiomiocyty, miocyty, osteocyty, adipocyty), linie endodermalne (komórki trzustki, komórki wątroby, komórki płuc) i linie ektodermalne (włosy, skóra, komórki nerwowe i astrocyty)5-10.
Pocieszająco, pomimo swojej wielomocności, hAEC nie wydają się tworzyć guzów ani sprzyjać rozwojowi guza in vivo. Co więcej, hAEC są również uprzywilejowane immunologicznie, wykazując niską ekspresję ludzkich antygenów leukocytarnych (HLA) klasy II)8. Ta właściwość prawdopodobnie leży u podstaw ich zdolności do unikania odrzucenia immunologicznego po przeszczepie allogenicznym i ksenogennym, jak wykazano w badaniach z udziałem kompetentnych immunologicznie małp, królików, świnek morskich, szczurów i świń11-13. hAEC wykazują silne właściwości immunomodulujące i immunosupresyjne, a tym samym oferują znaczące korzyści praktyczne dla potencjalnych zastosowań klinicznych w terapii chorób autoimmunologicznych. Uważa się, że hAEC pełnią funkcje immunomodulujące zarówno w wrodzonym, jak i nabytym układzie odpornościowym. Jednym z sugerowanych mechanizmów jest wydzielanie czynników immunomodulujących14.
Obecne zastosowania hAEC w przedklinicznych modelach chorób zwierzęcych obejmują leczenie udaru mózgu, stwardnienia rozsianego, chorób wątroby, cukrzycy oraz przewlekłych i ostrych chorób płuc. Naukowcy wykazali zainteresowanie wykorzystaniem hAEC w leczeniu zapalenia mózgu po udarze ze względu na ich unikalne właściwości. Istnieją dowody na to, że hAEC mogą przekraczać barierę krew-mózg, gdzie mogą się wszczepiać, przeżywać do 60 dni, różnicować się w neurony, zmniejszać stan zapalny i promować regenerację uszkodzonej tkanki ośrodkowego układu nerwowego w zwierzęcych modelach chorób neurologicznych15.
hAEC oferują możliwość namierzania i odwracania wielu ścieżek patologicznych, które przyczyniają się do rozwoju i progresji stwardnienia rozsianego. Na przykład wyniki przedklinicznych badań na zwierzętach sugerują, że hAEC są silnie immunosupresyjne i mogą potencjalnie indukować obwodową tolerancję immunologiczną i odwracać trwające reakcje zapalne. Wykazano również, że hAEC mają zdolność różnicowania się w komórki nerwowe in vivo i wzmacniania endogennej neuroregeneracji poprzez wydzielanie szerokiej gamy czynników neurotroficznych16.
hAEC mogą być stymulowane do wyrażania czynników trzustkowych, w tym transporterów insuliny i glukozy. W kilku badaniach analizowano potencjał hAEC do przywracania poziomu glukozy we krwi u myszy z cukrzycą18. U myszy otrzymujących hAEC zarówno masa ciała zwierzęcia, jak i poziom glukozy we krwi spadły do normalnego poziomu po wstrzyknięciu komórek. Badania te stanowią mocne argumenty przemawiające za stosowaniem hAEC w leczeniu cukrzycy
.hAEC mają udowodnioną rolę w zapobieganiu i leczeniu eksperymentalnych ostrych i przewlekłych uszkodzeń płuc zarówno u dorosłych, jak i u noworodków19. Badania te wykazały, że hAEC różnicują się in vitro w funkcjonalne komórki nabłonka płuc wykazujące ekspresję wielu białek związanych z płucami, w tym transbłonowego regulatora przewodnictwa mukowiscydozy (CFTR), kanału jonowego, który jest zmutowany u pacjentów z mukowiscydozą20. Dodatkowo, gdy hAEC są dostarczane do uszkodzonego płuca dorosłego i noworodka, wywierają swoje działanie naprawcze poprzez modulację komórek odpornościowych gospodarza, zmniejszając rekrutację leukocytów płucnych, w tym neutrofili, makrofagów i limfocytów21-23.
Biorąc pod uwagę ich obfitość, bezpieczeństwo i sprawdzone zastosowania kliniczne dla wielu chorób, badania kliniczne z użyciem hAEC są nieuniknione. Mając na celu przyspieszenie przełożenia terapii hAEC na badania kliniczne, opracowaliśmy metody izolacji, kriokonserwacji i hodowli hAEC w sposób odpowiedni dla badań klinicznych, przy użyciu odczynników niepochodzących z produktów pochodzenia zwierzęcego zgodnie z aktualnymi wytycznymi dobrej praktyki wytwarzania (cGMP).
Oparliśmy ten protokół na wcześniej opublikowanym protokole, którego z powodzeniem używaliśmy do izolowania hAEC za pomocą odczynników pochodzenia zwierzęcego6. Zmieniliśmy pierwotny protokół, aby zastąpić produkty pochodzenia zwierzęcego odczynnikami niezawierającymi produktów pochodzenia zwierzęcego, a następnie przeprowadziliśmy optymalizację w celu optymalizacji wydajności, żywotności i czystości komórek. Naszym celem było opracowanie protokołu, który byłby zgodny ze standardami regulacyjnymi dotyczącymi produkcji komórek do badań klinicznych na ludziach.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
UWAGA: Łożyska powinny być pobierane z pojedynczych zdrowych ciąż, z preferencją dla planowych cięć cesarskich. Należy wyrazić pisemną, świadomą zgodę na pobranie łożyska. Właściwa komisja etyczna ds. badań klinicznych z udziałem ludzi powinna zatwierdzać pobieranie i wykorzystywanie tkanek ludzkich.
1. Izolacja komórek nabłonka owodni
- Umieścić łożysko na sterylnej powierzchni w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II.
- Używając sterylnego roztworu soli zbilansowanej motków (HBSS), wypłucz jak najwięcej krwi z powierzchni łożyska i błon .
- Z łożyskiem umieszczonym pępowiną skierowaną do góry, mechanicznie oddziel zewnętrzną krawędź błony owodniowej i kosmówkowej.
- Po oddzieleniu ręcznie zdejmij błonę owodniową z błony kosmówkowej łożyska, pracując wokół krawędzi błony, w kierunku pępowiny.
UWAGA: Należy uważać, aby usunąć wszelkie kawałki zanieczyszczającej błony kosmówkowej z owodni. - Za pomocą sterylnych nożyczek odciąć błonę owodniową w odległości około 2 cm od podstawy pępowiny i umieścić w szczelnie zamkniętym pojemniku o pojemności 500 ml zawierającym 250 ml HBSS.
- Dokładnie umyć, potrząsając szczelnie zamkniętą butelką zawierającą błonę owodniową.
- Za pomocą sterylnych kleszczy usunąć błonę owodniową z pojemnika zbiorczego i umieścić na szalce Petriego o średnicy 15 cm.
- Pokrój błonę owodniową na kawałki o długości około 5 cm (gdy trzymasz pionowo kleszcze), odrzucając zakrwawione lub podarte kawałki.
- Umieścić w szczelnie zamkniętym pojemniku o pojemności 500 ml i przemyć 250 ml HBSS około 3-5 razy lub do momentu, gdy błona owodniowa stanie się przezroczysta bez zanieczyszczającej krwi.
UWAGA: Obecność krwi może zmniejszać wydajność enzymatycznego roztworu trawiącego. - Przenieść wszystkie kawałki błony owodniowej do pojemnika zawierającego 50 ml enzymatycznego roztworu trawiącego, zwracając uwagę na zminimalizowanie przenoszenia HBSS.
- Inkubować kawałki owodni w enzymatycznym roztworze trawiącym w łaźni wodnej lub ciepłym pomieszczeniu w temperaturze 37 °C przez 15 minut, delikatnie mieszając w celu usunięcia pozostałej krwi.
- Usunąć kawałki błony owodniowej z enzymatycznego roztworu trawiącego i umieścić w nowym sterylnym pojemniku.
- Dodać 100 ml świeżego roztworu enzymatycznego do trawienia błony owodniowej i inkubować w temperaturze 37 °C przez 60 minut w łaźni wodnej lub ciepłym pomieszczeniu, delikatnie wstrząsając (pierwsze trawienie).
- Usuń kawałki błony owodniowej i umieść je w nowym pojemniku, uważając, aby enzymatyczny roztwór trawiący spłynął z każdego kawałka błony.
UWAGA: Można to osiągnąć, przeciągając kawałki owodni wzdłuż wewnętrznej krawędzi pojemnika. - Dodać 100 ml świeżego roztworu enzymatycznego do kawałków błony owodniowej i inkubować przez 60 minut w łaźni wodnej lub ciepłym pomieszczeniu w temperaturze 37 °C, delikatnie wstrząsając (drugie trawienie).
- Przepuścić zawiesinę komórek z kroku 1.14 przez filtr 70 μm i odwirować przy 1 000 x g przez 10 minut.
- Usunąć i odrzucić supernatant oraz ponownie zawiesić osad komórkowy w 4 ml HBSS zawierającym 1 mg/ml inhibitora enzymów na bazie soi. Delikatnie odpipetować kilkakrotnie pipetą o pojemności 1 ml, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki.
UWAGA: Na tym etapie komórki można pozostawić na lodzie, dopóki komórki z drugiego trawienia nie znajdą się na tym samym etapie przetwarzania. - Usuń kawałki błony owodniowej i umieść je w nowym pojemniku, uważając, aby enzymatyczny roztwór trawiący spłynął z każdego kawałka błony.
UWAGA: Można to osiągnąć, przeciągając kawałki owodni wzdłuż wewnętrznej krawędzi pojemnika. - Przepuścić zawiesinę komórek z kroku 1.18 przez filtr 70 μm i odwirować przy 1 000 x g przez 10 minut.
- Usunąć i odrzucić supernatant oraz ponownie zawiesić osad komórkowy w 4 ml HBSS zawierającym 1 mg/ml inhibitora enzymów na bazie soi. Delikatnie odpipetować kilkakrotnie pipetą o pojemności 1 ml, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki.
- Połącz komórki z dwóch wytrawionych lub alternatywnie utrzymuj trawy komórek oddzielnie, dopóki komórki nie zostaną zliczone.
UWAGA: Zapobiega to mieszaniu się komórek o potencjalnie niskiej żywotności z komórkami o wysokiej żywotności. - Dodać HBSS do końcowej objętości 10-20 ml i przeprowadzić liczenie komórek za pomocą błękitu trypanowego w celu zmierzenia żywotności.
- Potwierdź fenotyp komórek nabłonka za pomocą cytometrii przepływowej. Przygotować odpowiednie koktajle przeciwciał za pomocą anty-EpCAM-PE (rozcieńczenie 1:2), anty-CD90-PeCy5 (1:250) i anty-CD105-APC (1:100) w HBSS.
- Zawiesić podzbiór komórek z jednego lub obu procesów trawienia w koktajlu przeciwciał o stężeniu 25 x 106 komórek/ml.
- W przypadku cytometrii przepływowej wybarwić 1 x 106 komórek koktajlami przeciwciał zawierającymi kontrole izotypów (np. Kontrola izotypu IgG1-PE + anty-CD90-PeCy5 + anty-CD105-APC). Utrzymuj ~ 1 x 106 komórek niezabarwionych w celu ustawienia cytometru przepływowego.
- Inkubować komórki w koktajlach przeciwciał w temperaturze 4 °C przez 60 minut.
- Umyj komórki 3x w HBSS i ponownie zawieś w ilości od 5 do 10 milionów komórek na ml do cytometrii przepływowej.
- Wykonaj cytometrię przepływową i zanotuj wyniki. Oczekuje się, że czystość izolatu komórkowego (odsetek komórek EpCAM dodatnich i CD90/CD105 ujemnych) wyniesie odpowiednio 90-95% i <1%.
- Odłożyć odpowiednią liczbę komórek do badania pod kątem właściwych kryteriów kontroli jakości lub uwalniania, określonych w końcowym zastosowaniu.
UWAGA: Może to obejmować badania przesiewowe w kierunku choroby/wirusa lub inne kryteria bezpieczeństwa lub kryteria biologiczne. - W przypadku pozostałych komórek należy postępować zgodnie z protokołem kriokonserwacji lub alternatywnie umieścić bezpośrednio w hodowli (krok 3.6 bezpośrednio do hodowli).
2. Kriokonserwacja hAEC
- Określ liczbę komórek i żywotność za pomocą danych z cytometrii przepływowej lub ręcznego liczenia z wykluczeniem błękitu trypanowego.
- Wirować przy 700 x g przez 5 min.
- Zawieś komórki w zakresie od 1 do 10 milionów komórek na ml w pożywkach do kriokonserwacji bez produktów zwierzęcych.
- Odpipetować odpowiednią objętość komórek do fiolek do kriokonserwacji z pierścieniem O-ringowym i umieścić w aparacie do zamrażania z kontrolowaną szybkością, w którym chłodzenie następuje w temperaturze około 1°C/min, aż do osiągnięcia -80°C.
- Przenieść fiolki do ciekłego azotu w celu długotrwałego przechowywania.
3. Rozmrażanie i kultura cyrokonserwowanych hAEC
- Wyjąć fiolki do krioprezerwacji z ciekłego azotu i umieścić na lodzie.
UWAGA: Tylko do przelewu - przejdź szybko do następnego kroku. - Szybko rozmrozić fiolki do krioprezerwacji w temperaturze 37 °C, aż pozostanie tylko mały kawałek (~5 mm x 5 mm) lodu.
UWAGA: Ważne jest, aby roztwór komórkowy nie nagrzewał się, aby zmniejszyć toksyczne działanie DMSO w pożywkach krioprezerwacyjnych. - Rozcieńczyć pożywkę do kriokonserwacji 10-krotnie zimną (~4 °C) pożywką bez surowicy, dodawaną kroplami do probówki lub pojemnika o odpowiedniej wielkości.
- Wirować przy 700 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
- Zawiesić ponownie w podłożu bez surowicy do przybliżonego stężenia 1 miliona komórek na ml. Określić liczbę komórek i żywotność za pomocą automatycznego lub ręcznego liczenia z wykluczeniem błękitu trypanowego. Oczekiwana żywotność po rozmrożeniu będzie o 5-10% mniejsza niż żywotność przed krioprezerwacją.
- Umieść komórki na standardowych wyrobach z tworzywa sztucznego poddanych hodowli komórkowej lub alternatywnie użyj kolagenu typu I do pokrycia powierzchni hodowli.
- W przypadku powłoki kolagenowej typu I postępuj zgodnie z poniższym protokołem
- Przygotuj rozpuszczalny w kwasach kolagen typu I z ludzkiego łożyska (15 mg kolagenu z 25 ml wody dejonizowanej i 50 μl lodowatego kwasu octowego).
- Przykryj zlewkę Parafilm i mieszaj umiarkowanie w temperaturze 37 °C, aż do rozpuszczenia pasm kolagenu.
- Sterylny roztwór kolagenu z filtrem filtrującym 0,22 μm.
- Przefiltrowany kolagen rozcieńczyć w stosunku 1:10 wodą dejonizowaną. Ten rozcieńczony materiał jest roztworem o stężeniu roboczym do powlekania powierzchni tworzyw sztucznych i membran .
- Kolagen pokrywa powierzchnie plastikowe, szklane i membranowe przez 2 godziny w temperaturze pokojowej w temperaturze 37°C lub O/N w temperaturze 2-8 °C.
- Usuń nadmiar płynu z powlekanej powierzchni i pozostaw do wyschnięcia O/N.
- Spłucz sterylną wodą do hodowli tkanek lub HBSS przed wprowadzeniem komórek i pożywki.
- Umieść hAEC w gęstości 25 000 komórek/cm2 w podłożu bez surowicy i pozwól na przyłączenie przez 72-96 godzin.
- Po przymocowaniu należy zmieniać pożywkę, ostrożnie odsysając i zastępując odpowiednią objętością pożywki bez surowicy co 2-3 dni.
- Komórki pasażowe korzystające z poniższego protokołu
- Odessać pożywkę do hodowli komórkowych i przemyć 1 x objętością sterylnego HBSS
- Dodać 1x objętość enzymatycznego roztworu trawiącego i inkubować przez 5-15 minut lub do momentu, gdy zaobserwuje się, że komórki odrywają się od powierzchni hodowli komórkowej.
- Zebrać enzymatyczny roztwór trawiący zawierający komórki, upewniając się, że komórki są oderwane od powierzchni hodowli komórkowej poprzez wielokrotne pipetowanie enzymatycznego roztworu trawiącego do powierzchni hodowli komórkowej
- Wirować przy 700 x g przez 5 min.
- Zawiesić osad komórkowy w odpowiedniej objętości HBSS zawierającego 1 mg/ml inhibitora enzymów na bazie soi. Delikatnie odpipetować kilkakrotnie pipetą o pojemności 1 ml, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki.
- Dodać pożywkę bez surowicy do przybliżonego stężenia 1 miliona komórek/ml. Określić liczbę komórek i żywotność za pomocą automatycznego lub ręcznego liczenia z wykluczeniem błękitu trypanowego.
- Płytkować hAEC o gęstości 25 000 komórek/cm2 w podłożu bez surowicy i kontynuować standardowe metody hodowli.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Przy prawidłowym przeprowadzeniu tej procedury należy spodziewać się średniej wydajności na poziomie 120 milionów hAECs, przy typowym zakresie od 80 do 160 milionów komórek. Przy takiej wydajności można oczekiwać średniej żywotności na poziomie 83 ± 4%. Zwiększona średnia wydajność i nieco niższa żywotność w metodzie klinicznej mogą wynikać z wyższej aktywności trypsyny w porównaniu z produktem pochodzenia zwierzęcego, a być może również z braku białek surowiczych. Izolowane hAECs charakteryzują się średnim profilem powi...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Istnieje kilka krytycznych parametrów, które mogą mieć znaczący wpływ na powodzenie tej metodologii. Przechowywanie łożyska lub owodni przez okres do 3 godzin przed izolacją hAEC może być pożądane do celów logistycznych lub planowania, jednak zaleca się, aby tkanka została przetworzona tak szybko, jak to możliwe. Jeżeli tkanka ma być przechowywana, zaleca się, aby przechowywanie odbywało się po rozebraniu i umyciu błony owodniowej. Owodnia może być przechowywana w sterylnym HBSS zawierającym antybiotyki w temperaturze 4 ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy dziękują za wsparcie finansowe z Programu Wsparcia Infrastruktury Operacyjnej Rządu Wiktorii.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Zestaw | |||
| ubrań Tacka do zdejmowania izolacji | Fisher Scientific | 13-361B | |
| Kleszcze opatrunkowe Liberty, spiczaste 13 cm | Fisher Scientific | S17329 | |
| Nożyczki - Ostre/Proste | Fisher Scientific | NC0562592 | |
| Sterylne rękawiczki lateksowe | Fisher Scientific | 19-014-643 | |
| Odzież | |||
| Odzież ochronna (fartuch) | U-line | S-15374-M | |
| Fartuchy izolacyjne | U-line | S-15374-M | |
| Sterylne rękawice lateksowe | Fisher Scientific | 19-014-643 | |
| Maska na twarz ogólnego przeznaczenia | Cardinal Health | AT7511 | |
| Maski | Medline | CRI1001 | |
| Ochraniacze na buty | U-line | S-7873W | |
| Media i odczynniki | |||
| Hanks' Zrównoważony roztwór soli (HBSS) | Life Technologies | 14175095 | bez wapnia i magnezu |
| TrypZean (produkt pochodzenia zwierzęcego– wolna rekombinowana trypsyna) | Sigma Aldrich | T3449 | |
| Inhibitor trypsyny sojowej 1g/50mL | Sigma Aldrich | T6522 | |
| Cryostor CS5 | BioLife Solutions | 205102 | |
| odczynnik do błękitu trypanowego | Life Technologies | 15250-061 | |
| Anti-EpCam-PE | Miltenyi Biotec | 130 - 091-253 | |
| Izotyp PE kontrola | Miltenyi Biotec | 130-098-845 | |
| Anty-CD90-PeCy5 | BD Pharmingen | 555597 | |
| Kontrola izotypu PeCy5 | BD Pharmingen | 557224 | |
| Anty-CD105-APC | BD Pharmingen | 562408 | |
| Kontrola izotypu APC | Pharmingen | 340754 | |
| Kolagen Typ VI | Sigma Aldrich | C7521 | |
| Materiały eksploatacyjne | |||
| Pipeta miarowa 50 ml | BD/Falcon | 356550 | |
| Pipeta miarowa 10 ml | BD/Falcon | 356551 | |
| Pipeta miarowa 5 ml | BD/Falcon | 356543 | |
| 50 ml probówki Falcon | BD/Falcon | 352070 | |
| 15 ml probówki Falcon | BD/Falcon | 352096 | |
| 15 cm szalki Petriego | Corning | 351058 | |
| 70 μ m filtry | BD/Falcon | 352350 | |
| 0.22 μ m filtry | Millipore | SLGV033RS | |
| 1 ml Końcówki do pipet | Fisherbrand | 02-707-401 | |
| 200 μ l Końcówki do pipet | Fisherbrand | 02-707-409 | |
| 20 ml Strzykawka | BD/Medical | 309661 | |
| Plastikowa szpatułka | Fisher Scientific | 14-245-97 | |
| Plastikowa łódka wagowa | Fisher Scientific | 02-202-102 | |
| Fiolki kriogeniczne | Nunc | 377267 | |
| Equipment | |||
| Mr Frosty | Fisher Scientific | A451-4 | |
| Szafka na |
Bibliografia
- Murphy, S. V., Wallace, E. M., Jenkin, G. Stem Cells and Regenerative Medicine. Appasani, K. 1, Springer Science and Business Media. 243-264 (2011).
- Murphy, S. V., Atala, A. Amniotic fluid and placental membranes: unexpected sources of highly multipotent cells. Semin. Reprod. Med. 31 (1), 62-68 (2013).
- Parolini, O., et al. Concise review: isolation and characterization of cells from human term placenta: outcome of the first international Workshop on Placenta Derived Stem Cells. Stem Cells. 26 (2), 300-311 (2008).
- Lim, R., et al. Preterm human amnion epithelial cells have limited reparative potential. Placenta. 34 (6), 486-492 (2013).
- Tamagawa, T., Ishiwata, I., Saito, S. Establishment and characterization of a pluripotent stem cell line derived from human amniotic membranes and initiation of germ layers in vitro. Hum Cell. 17 (3), 125-130 (2004).
- Miki, T., Marongiu, F., Ellis, E., Strom, C. S. Isolation of amniotic epithelial stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 1, Unit 1E.3(2007).
- Murphy, S., et al. Amnion epithelial cell isolation and characterization for clinical use. Curr Protoc Stem Cell Biol. 1, Unit 1E.6(2010).
- Ilancheran, S., et al. Stem cells derived from human fetal membranes display multilineage differentiation potential. Biol Reprod. 77 (3), 577-588 (2007).
- Fliniaux, I., Viallet, J. P., Dhouailly, D., Jahoda, C. A. Transformation of amnion epithelium into skin and hair follicles. Differentiation. 72 (9-10), 558-565 (2004).
- Miki, T., Lehmann, T., Cai, H., Stolz, D. B., Strom, S. C. Stem cell characteristics of amniotic epithelial cells. Stem Cells. 23 (10), 1549-1559 (2005).
- Avila, M., Espana, M., Moreno, C., Pena, C. Reconstruction of ocular surface with heterologous limbal epithelium and amniotic membrane in a rabbit model. Cornea. 20 (4), 414-420 (2001).
- Sankar, V., Muthusamy, R. Role of human amniotic epithelial cell transplantation in spinal cord injury repair research. Neuroscience. 118 (1), 11-17 (2003).
- Yuge, I., et al. Transplanted human amniotic epithelial cells express connexin 26 and Na-K-adenosine triphosphatase in the inner ear. Transplantation. 77 (9), 1452-1454 (2004).
- Li, H., et al. Immunosuppressive factors secreted by human amniotic epithelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (3), 900-907 (2005).
- Liu, T., et al. Human amniotic epithelial cells ameliorate behavioral dysfunction and reduce infarct size in the rat middle cerebral artery occlusion model. Shock. 29 (5), 603-611 (2008).
- Venkatachalam, S., et al. Novel neurotrophic factor secreted by amniotic epithelial cells. Biocell. 33 (2), 81-89 (2009).
- Manuelpillai, U., et al. Human amniotic epithelial cell transplantation induces markers of alternative macrophage activation and reduces established hepatic fibrosis. PLoS One. 7 (6), e38631(2012).
- Wei, J. P., et al. Human amnion-isolated cells normalize blood glucose in streptozotocin-induced diabetic mice. Cell Transplant. 12 (5), 545-552 (2003).
- Murphy, S., et al. Human amnion epithelial cells prevent bleomycin-induced lung injury and preserve lung function. Cell Transplant. 20 (6), 909-923 (2011).
- Murphy, S. V., et al. Human amnion epithelial cells induced to express functional cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. PLoS One. 7 (9), e46533(2012).
- Murphy, S. V., et al. Human amnion epithelial cells do not abrogate pulmonary fibrosis in mice with impaired macrophage function. Cell Transplant. 21 (7), 1477-1492 (2012).
- Hodges, R. J., Lim, R., Jenkin, G., Wallace, E. M. Amnion epithelial cells as a candidate therapy for acute and chronic lung injury. Stem cells Int. 2012, 709763(2012).
- Tan, J. L., Chan, S. T., Wallace, E. M., Lim, R. Human amnion epithelial cells mediate lung repair by directly modulating macrophage recruitment and polarization. , (2013).
- Litvinov, S. V., et al. Epithelial cell adhesion molecule (Ep-CAM) modulates cell-cell interactions mediated by classic cadherins. J Cell Biol. 139 (5), 1337-1348 (1997).
- Winter, M. J., Nagtegaal, I. D., van Krieken, J. H., Litvinov, S. V. The epithelial cell adhesion molecule (Ep-CAM) as a morphoregulatory molecule is a tool in surgical pathology. The American journal of pathology. 163 (6), 2139-2148 (2003).
- Musina, R. A., Bekchanova, E. S., Sukhikh, G. T. Comparison of mesenchymal stem cells obtained from different human tissues. Bull Exp Biol Med. 139 (4), 504-509 (2005).
- Park, A., et al. Newborn Stem Cells: Identity, Function, and Clinical Potential. , John Wiley & Sons, Inc. 119-137 (2013).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
