Wysoce wydajna ligacja małych cząsteczek RNA do kwantyfikacji mikroRNA za pomocą sekwencjonowania o wysokiej przepustowości

Podsumowanie

MikroRNA (miRNA) to szeroko konserwatywna klasa cząsteczek regulatorowych. Tutaj opisujemy metodę klonowania miRNA, która opiera się na dwóch silnych etapach ligacji, po których następuje sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości. Nasza metoda pozwala na dokładną ocenę ilościową miRNA w całym genomie.

Streszczenie

Klonowanie MiRNA i sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości, określane jako miR-Seq, stanowi samodzielne podejście obejmujące cały transkryptom do ilościowego oznaczania miRNA z rozdzielczością pojedynczego nukleotydu. Technika ta wychwytuje miRNA poprzez przyłączanie adapterów oligonukleotydowych 3' i 5' do cząsteczek miRNA i umożliwia odkrycie miRNA de novo. W połączeniu z potężnymi platformami sekwencjonowania nowej generacji, miR-Seq odegrał kluczową rolę w badaniach nad biologią miRNA. Jednak znaczne odchylenia wprowadzone przez etapy ligacji oligonukleotydów uniemożliwiły zastosowanie miR-Seq jako dokładnego narzędzia do oznaczania ilościowego. Wcześniejsze badania pokazują, że błędy systematyczne w obecnych metodach miR-Seq często prowadzą do niedokładnej kwantyfikacji miRNA z błędami do 1000 razy w przypadku niektórych miRNA^1,2. Aby rozwiązać te odchylenia wynikające z ligacji RNA, opracowaliśmy metodę ligacji małego RNA, która zapewnia skuteczność ligacji ponad 95% zarówno dla etapów ligacji 3', jak i 5′. Analiza porównawcza tej ulepszonej metody budowy biblioteki przy użyciu równomolowych lub różnicowo mieszanych syntetycznych miRNA konsekwentnie daje odczyty liczb z mniej niż dwukrotnym odchyleniem od oczekiwanej wartości. Co więcej, ta wysokowydajna metoda miR-Seq umożliwia dokładne profilowanie miRNA w całym genomie z próbek całkowitego RNA in vivo ².

Wprowadzenie

Metodologie oparte na sekwencjonowaniu o wysokiej przepustowości zostały szeroko stosowane do wielu próbek biologicznych w ostatnich latach, znacznie poszerzając nasze zrozumienie molekularnej złożoności systemów biologicznych^3,4. Jednak przygotowanie próbek RNA do sekwencjonowania o wysokiej przepustowości często powoduje specyficzne uprzedzenia nieodłącznie związane z zastosowaną metodologią, ograniczając potencjalną użyteczność tych potężnych technik. Te specyficzne dla metody odchylenia zostały dobrze udokumentowane dla opartych na ligacji, preparatów bibliotecznych małych RNA^1,2,5,6. Te odchylenia skutkują 1000-krotną zmiennością liczb odczytów dla równomolowych syntetycznych miRNA, co sprawia, że wnioskowanie o obfitości miRNA na podstawie danych sekwencjonowania jest szalenie zmienne i podatne na błędy.

Badania skupiające się na właściwościach ligaz T4 RNA pochodzących z fagów udokumentowały, że enzymy wykazują preferencje oparte na nukleotydach⁷, które manifestują się jako stronnicze biblioteki w eksperymentach sekwencjonowania o wysokiej przepustowości^1,2,8. W celu zminimalizowania uprzedzeń przenoszonych przez ligazy RNA zastosowano wiele strategii; stłoczenie makromolekularne⁹, randomizacja sekwencji nukleotydów na adapterze, który jest proksymalny do miejsca ligacji⁶, i zastosowanie wysokich stężeń adaptera ligacji². Dzięki połączeniu tych trzech podejść opracowaliśmy przepływ pracy do bezstronnego przygotowania małych bibliotek RNA kompatybilnych z sekwencjonowaniem wysokoprzepustowym (Rysunek 1). Aby uzyskać bezpośrednie porównania między obecnymi protokołami a naszą zoptymalizowaną metodą, zapoznaj się z naszym ostatnim raportem². Ta zoptymalizowana metoda zapewnia skuteczność ligacji większą niż 95% zarówno w krokach 3', jak i 5' i pozwala na bezstronną ligację małych cząsteczek RNA z próbek syntetycznych i biologicznych².

Protokół

UWAGA: Bardzo ważne jest utrzymanie warunków wolnych od RNaz podczas całej procedury.

1. Adenilacja łącznika 3'

1. Rozcieńczony oligonukleotyd DNA przeznaczony do reakcji ligacji 3' do 100 μM w wolnym od nukleaz_H2O.
   UWAGA: Oligonukleotyd powinien mieć grupę fosforanową 5', randomizowany dinukleotyd na końcu 5' i dideoksycytozynę 3'. Grupa fosforanowa 5' jest wymaganiem enzymu Mth do efektywnej adenylacji 5'¹⁰. Fosforan może być dodany przez wstępną obróbkę oligonukleotydu kinazą polinukleotydową lub zamówiony bezpośrednio z modyfikacją. Randomizowany dinukleotyd na końcu 5' jest ważny dla zminimalizowania preferencji sekwencji, jaką wykazują ligazy RNA dla niektórych reakcji łączenia końca końcowego w stosunku do innych⁶. 3' dideoksycytozyna umieszcza element blokujący na końcu 3' oligonukleotydu, aby zahamować tworzenie się konkatamerów łącznik-łącznik podczas kolejnych etapów ligacji, a także służy do blokowania końca 3' cząsteczki miRNA-Linker utworzonej na końcu reakcji ligacji 3'¹¹. Sekwencja łącznika oligonukleotydowego wybrana do bezstronnej metody miR-Seq jest następująca: 5'PO₄NNTGGAATTCTCGGGTGCCAAGG-dideoxyC3'.
2. Złożyć następującą reakcję adenylacji: 200 pmol 3' oligonukleotyd łącznikowy, 4 μl 10x 5' bufor adenylacyjny DNA, 4 μl 1 mM ATP, 4 μl Ligazy Mth RNA, wolne od nukleaz_H2Odo końcowej objętości 40 μl.
3. Inkubować reakcję w temperaturze 65 °C przez 1 godzinę. Zakończyć reakcję ogrzewając do temperatury 85 °C przez 5 minut.
4. Wytrącić adenylowany łącznik przez dodanie 2,5 objętości 100% etanolu i 1/3 objętości 10 M octanu amonu w celu usunięcia pozostałości ATP i zapobieżenia nieprzewidzianym ligacjom w przyszłych reakcjach.
   1. Krótko wymieszaj alkohol, sól i roztwór oligo do jednorodności, wirując z pełną prędkością w mikrowirówce (~15 000 x g) w temperaturze 4 °C przez 20 minut. Umyj osad w 70% etanolu, wysusz na powietrzu i ponownie zawieś w odpowiedniej objętości H₂O bez nukleaz, aby uzyskać 50-100 μM adenylowanego oligo.
5. Potwierdź adenylację, uruchamiając 18% żel poliakrylamidowy.
   1. Przygotuj żel, mieszając ze sobą: 6,3 g mocznika, 6,75 ml 40% akrylamidu i 1,5 ml 10x TBE. Dodać_H2Odo 15 ml.
   2. Mieszać aż do całkowitego rozpuszczenia mocznika i dodać 150 μl 10% (m/v) nadsiarczanu amonu (APS) i 15 μl tetramethlyethylenodiamine (TEMED).
   3. Po stwardnieniu żelu należy go uruchomić przez 30 minut przy szerokości żelu 24 V/cm z 1x buforem TBE w temperaturze pokojowej. Po 30 minutach przepłucz studnie z uruchomionym buforem.
   4. Wymieszać 5 pmol adenylowanych oligonukleotydów z 2x denaturującym buforem ładującym RNA i równą objętość (95% (v/v) formamidu, 0,02% (w/v) SDS, 0,02% błękitu bromofenolowego (w/v), 0,01% (w/v) cyjanolu ksylenowego, 1,0 mM EDTA), krótko podgrzać do 75 °C i schłodzić na lodzie. Dozować całą próbkę do dołka żelu. Uwzględnij również identyczną ilość nieadenylowanej kontroli i wzorce wielkości o niskiej masie cząsteczkowej.
   5. Uruchom żel przy napięciu 24 V/cm, aż błękit bromofenolowy znajdzie się w 3/4 na dnie żelu. Zdemontuj aparaturę, żel po barwieniu z 1x roztworem sybr-gold w 1x TBE i wizualizuj na pudełku z transiluminatorem UV (Rysunek 2).
      UWAGA: Żel oczyszcza adenylowany oligo w sposób podobny do opisanego powyżej, jeśli kontrole "bez wejściowego RNA" skutkują dużą ilością produktu PCR w porównaniu z próbkami z wejściowym RNA.

2. Ligacja łącznika do końca miRNA 3'

1. Podwiązanie 3'
   1. Złóż następujące elementy na lodzie w podanej kolejności: 1,0 μl 50% (w/v) PEG 8000, 0,5 μl 10x bufor ligazy RNA (500 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM MgCl₂, 10 mM DTT), 1,0 μl adenylowany 3' Linker (100 μM), 0,5 μl inhibitor RNazy, 0,5-8,0 μg całkowitego RNA, 0,5 μl ligazy T4 RNA 2, wolnej od nukleaz_H2Odo końcowej objętości 5 μl.
   2. Wymieszać reakcję przez pipetowanie, ponieważ roztwór jest zbyt lepki, aby wirować ze względu na wysokie stężenie PEG 8000. Po dokładnym wymieszaniu umieść reakcję w termocyklerze z podgrzewaną pokrywką. Ustawić blok na 16 °C i inkubować przez 4 godziny
      UWAGA: Reakcję można zwiększyć do końcowej objętości 20 μl bez utraty skuteczności ligacji. Reaguj przez 4 godziny w temperaturze otoczenia lub przez noc w temperaturze 4 °C, aby uzyskać zasadniczo identyczną wydajność ligacji.
2. Oczyszczanie żelu
   1. Po ligacji 3' wymieszać reakcję z równą objętością bufora ładującego 2x RNA. Podgrzej do 70 °C przez 5 minut i ostudź na lodzie.
   2. Uruchom próbkę na 15% żelu poliakrylamidowym w celu oczyszczenia PAGE.
      1. Przygotować 15% żel poliakryloamidowy zawierający 7 M mocznika, w sposób podobny do opisanego wcześniej w kroku 1.5.
      2. Uruchom żel pod napięciem 24 V/cm szerokości żelu przez co najmniej 30 minut. Wyłącz zasilanie, przepłucz studzienki, załaduj próbkę i uruchom żel przy tym samym napięciu, co przed uruchomieniem.
      3. Załaduj próbkę i uruchom STRONĘ, aż błękit bromofenolowy opuści żel. Pożądany produkt będzie migrował w pobliżu cyjanolu ksylenowego.
3. Barwienie, wizualizacja i wycinanie
   1. Zdemontuj aparat żelowy i umieść żel na czystej tacy z 1x buforem do pracy (TBE), 1x sybr-gold i kamieniem na 15 minut.
   2. Usuń żel z naczynia barwiącego i wizualizuj na pudełku z transiluminatorem UV pokrytym czystą folią. Produkt ligacji powinien mieć około 45 nukleotydów długości.
   3. Obszar zawierający produkt do podwiązywania należy wyciąć czystą żyletką i umieścić w probówce do mikrowirówek o pojemności 0,5 ml.
4. Izolacja produktu i wytrącanie
   1. Przekłuć dno probówki do mikrowirówek o pojemności 0,5 ml igłą o pojemności 30 g i umieścić przebitą probówkę w drugiej czystej, nisko retencyjnej probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Wirować przez 5 minut przy ~15 000 x g.
   2. Potwierdź wzrokowo, że cały plasterek żelu przeszedł przez otwór w dętce. W razie potrzeby użyj czystej końcówki pipety, aby wepchnąć niektóre fragmenty żelu bliżej otworu.
   3. Wyrzucić pustą probówkę o pojemności 0,5 ml i dodać 400 μl buforu kolumnowego o wysokiej zawartości soli (HSCB 400 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,1% SDS) do zawiesiny akrylamidu. Rurka(i) skalna w temperaturze 4 °C przez noc.
   4. Przenieś zawiesinę do kolumny wirującej z octanu celulozy o grubości 0,22 mikrona za pomocą końcówki do pipety o szerokim otworze. Wirować przez 3 minuty w temperaturze pokojowej przy ~15 000 x g, aby zebrać cały płyn z matrycy żelu akrylamidowego.
   5. Przenieść płyn do czystej probówki o niskiej retencji 1,5 ml zawierającej 1 μl 20 mg/ml glikogenu. Dodać równą objętość izopropanolu i 1/10^objętości octanu sodu. Wymieszać roztwór, kilkakrotnie odwracając probówkę i wytrącić w zamrażarce o temperaturze -80 °C przez 20 minut.
   6. Wirować z pełną prędkością w temperaturze 4 °C przez 20 minut w celu osadzenia kwasu nukleinowego. Usunąć supernatant i przemyć w 70% etanolu. Suszyć na powietrzu przez 10 minut w temperaturze pokojowej i przejść bezpośrednio do etapu podwiązania 5'.

3. Ligacja łącznika do końca 5' hybrydy łącznika miRNA-3'

1. Do granulowanego kwasu nukleinowego dodaj następujące składniki: 2 μl PEG 8000 (50% w/v), 0,5 μl 10x RNA Ligas Buffer, 0,5 μl ATP (10 mM), 0,5 μl NN-RNA oligo (100 μM) i H₂O do końcowej objętości 4 μl.
   UWAGA: Skład "oligonugolaktykotydy NN-RNA" jest następujący: 5′ odwrócony dideoksy-TCUACAGUCCGACGAUCNN3′ i został oczyszczony przez producenta za pomocą HPLC.
2. Wymieszać tę próbkę, wielokrotnie pipetując w górę i w dół. Rób to przez jakiś czas (do 5 minut), aby upewnić się, że osad został całkowicie ponownie rozpuszczony. Jeśli ponowna solubilizacja jest problematyczna, należy krótko (3-5 minut) podgrzać próbkę do temperatury 37 °C i wznowić pipetowanie w celu wymieszania.
3. Gdy osad znajdzie się z powrotem w roztworze, przenieś zawartość do czystej probówki PCR zawierającej 1 μl mieszaniny 1:1 inhibitora RNazy i ligazy T4 RNA 1 (5 jednostek). Ponownie wymieszać, pipetując w górę i w dół.
4. Inkubować reakcję w termocyklerze w temperaturze 37 °C przez 4 godziny. Natychmiast przejść do syntezy cDNA.

4. Odwrotna transkrypcja/synteza cDNA

1. Do reakcji ligacji 5' dodać następujące składniki: 2 μl buforu 5x RT, 0,75 μl 100 mM naziemnej telewizji cyfrowej, 1 μl Illumina RT Primer 5'-GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3' (1 μM) i 0,5 μl dNTP (10 mM).
2. Mieszać pipetując i podgrzewać do temperatury 65 °C przez 5 minut. Następnie powoli schładzaj na blacie ławki.
3. Gdy reakcja ostygnie do temperatury pokojowej, umieść probówkę na lodzie i dodaj po 0,5 μl enzymu odwrotnej transkryptazy i inhibitora RNazy. Wymieszać przez pipetowanie i umieścić w termocyklerze na etapie przedłużenia wskazanym w instrukcjach producenta.
4. Po zakończeniu dodaj 5 μl H₂O wolnego od nukleaz, aby uzyskać ostateczną objętość biblioteki cDNA do 15 μl.

5. Przygotowanie biblioteki

1. W przypadku indeksowania PCR należy przeprowadzić następującą reakcję na lodzie: 6 μl 5x bufor Phusion, 1 μl dNTPs (10 mM), 0,9 μl DMSO, 0,75 μl 5' Primer (25 μM), 0,75 μl 3' Primer (25 μM), 3 μl biblioteki cDNA (zmienne stężenie w zależności od ilości wejścia), 0,5 μl polimerazy fuzjonowej (1 jednostka), wolna od nukleaz_H2Odo końcowej objętości 30 μl. Wybierz sekwencje starterów, aby zapewnić kompatybilność z wybranym szablonem i platformą sekwencjonowania.
   1. Uruchom reakcję PCR z następującymi ustawieniami: wstępna denaturacja w temperaturze 98 °C przez 3 minuty, przez pierwsze 4 cykle, denaturacja 98 °C przez 15 sekund, wyżarzanie w temperaturze 50 °C przez 15 sekund, przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 15 sekund.
      UWAGA: W zależności od ilości materiału wejściowego należy zmieniać łączną liczbę cykli PCR. Zazwyczaj dla wejścia 1-2 μg całkowitego RNA wystarczy 13 całkowitych cykli PCR do wygenerowania biblioteki miR-Seq.
   2. Kolejne cykle, np. cykle 5-12, należy przeprowadzać w dwóch etapach, w których cykle wyżarzania i przedłużania są łączone i przeprowadzane w temperaturze 70 °C przez 30 sekund, a denaturacja wynosi ponownie 98 °C przez 15 sek.
      UWAGA: Objętość reakcji wynosi 30 μl, aby umożliwić wstrzymanie programu PCR i usunięcie podwielokrotności 10 μl przy wcześniej ustalonych numerach cykli w celu monitorowania pojawienia się pożądanego produktu. Zazwyczaj cykle 10, 13 i 16 są wybierane do testowania z całkowitej próbki RNA.
2. Przygotuj 8% niedenaturujący żel akrylamidowy, mieszając 2 ml 40% akrylamidu, 1 ml 10x TBE i_H2Oz 10 ml. Następnie dodać 100 μl 10% APS i 10 μl TEMED. Wlej żel i pozostaw do zastygnięcia.
   1. Żel należy wstępnie rozprowadzić przy szerokości żelu 12 V/cm przez 30 minut. Przepłukać studzienki. Dodać 1 μl 10x bufora ładującego (15% Ficoll-400, 66 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,1% (w/v) SDS, 0,01% (w/v) błękitu bromofenolowego), dodać 10 μl próbki do każdej studzienki o wymiarach 5 mm x 1 mm x 15 mm. Zazwyczaj do każdej studzienki można załadować do 30 μl próbek. Uruchom próbkę żelu przy 10 V/cm szerokości żelu w 1x buforze TBE, aż niebieski barwnik bromofenolowy po prostu wyczerpie się z dna żelu.
   2. Odbarwić i zwizualizować żel zgodnie z opisem w kroku 2.3.
   3. Wyciąć pasmo 146 par zasad i wymywać przez noc w 0,25 ml HSCB w sposób podobny do opisanego w sekcji 2.4. Wytrącić DNA w równej objętości izopropanolu i 1/10^objętości octanu sodu. Przemyć granulat w 70% etanolu i ponownie zawiesić w buforze TE.
   4. Określ ilościowo bibliotekę za pomocą picogreen zgodnie z zaleceniami producenta.

Wyniki

Przewidywane wyniki dla poprzedniej metody powinny początkowo polegać na obserwacji pojedynczego przesunięcia (zwiększenia) rozmiaru oligonukleotydu DNA, który został poddany adenylacji przez ligazę Mth RNA (Rysunek 2). Po ligacji 3' wizualizacja żelu akryloamidu wskazuje (patrz rysunek 3) na ostre pasma o dużej masie cząsteczkowej widoczne w obszarze 100-300 nukleotydów żelu. Oznacza to, że cała próbka RNA, która jest używana, jest wysokiej jakości (nie ulega degradacji). Po dr...

Dyskusja

Opisana w niniejszym dokumencie metodologia wykorzystuje kilka kluczowych zmiennych w celu maksymalizacji efektywności ligacji, a mianowicie wysokie stężenia PEG, użycie randomizowanych łączników i wysokie stężenie łączników^2,6,9. Takie podejście pozwala na wiarygodne ilościowe biblioteki sekwencjonowania z całkowitych próbek RNA². Przeprowadziliśmy wiele miareczkowania wejściowego RNA i doszliśmy do wniosku, że poprzednia metodologia najlepiej nadaje się do całkowitych ilości RNA w zakresie 1-8 μg ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
3' Linker (5' fosforylowany, 3' zablokowany)	Zintegrowane technologie DNA niestandardowe
5'	Scalone technologie DNA Niestandardowe		5' blokowane, oczyszczone HPLC
T4RNL2 (1-249 K227Q)	New England Biolabs	M0351S	Specjalizuje się w ligacji wstępnie adenylowanych adapterów DNA
10x bufor ligacyjny (bez ATP)	Nowa Anglia Biolabs	W zestawie z M0351S
10-krotny bufor ligacyjny (z ATP)	New England Biolabs	W zestawie z M0204L
RNaseOUT	Invitrogen	10777-019
Glikol polietylenowy (mol. Wt. 8,000)	New England Biolabs	W zestawie z M0204L
Woda bez nukleaz	Ambion	AM9937	Stwierdziliśmy, że woda pobrana z aparatu destylacyjnego jest tej samej jakości.
T4RNL1	New England Biolabs	M0204L
Indeks górny III RT	zestaw Invitrogen	18080-051
Zestaw Phusion PCR	New England Biolabs	M0530S
Starter Illumina RP1	Zintegrowane technologie DNA		informacje o sekwencji dostępne z startera
Illumina Illumina RT	Niestandardowe		informacje o sekwencji dostępne z
Illumina Illumina indeks starter (y)	Zintegrowane technologie DNA niestandardowe		Informacje o sekwencji dostępne w Illumina
40% Akrylamid	Fisher Scientific	BP14081
Mocznik	Sigma Aldrich	U6504
Nadsiarczan amonu	Sigma	Aldrich A3678
Tetramethyethylenodiamina (TEMED)	Sigma Aldrich	T9281
2x Bufor ładujący RNA denaturujący	New England Biolabs	w zestawie z M0351S
Żyletki	VWR	55411-050
SpinX Rurki centrikonowe	Costar	CLS8161
Rurki do mikrofug o niskiej retencji	Fisher Scientific	02-681-320
Sybr Gold	Invitrogen	S-11494
Zestaw do adenylacji	New England Biolabs	E2610L