Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Identyfikacja kluczowych czynników regulujących samoodnawianie i różnicowanie w hematopoetycznych komórkach prekursorowych EML za pomocą analizy sekwencjonowania RNA

11.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52104

⸱

11 listopada 2014

 ,  ,  , 
1The Vivian L. Smith Department of Neurosurgery, Center for Stem Cell and Regenerative Medicine, University of Texas Health Science Center, The University of Texas Graduate School of Biomedical Sciences at Houston

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Sekwencjonowanie RNA i analizy bioinformatyczne zostały wykorzystane do identyfikacji znacząco i różnicowo wyrażonych czynników transkrypcyjnych w subpopulacjach Lin-CD34+ i Lin-CD34- mysich komórek EML. Te czynniki transkrypcyjne mogą odgrywać ważną rolę w określaniu przełączania między samoodnawiającymi się komórkami Lin-CD34 + a częściowo zróżnicowanymi komórkami Lin-CD34.

Streszczenie

Hematopoetyczne komórki macierzyste (HSC) są stosowane klinicznie w leczeniu transplantacyjnym w celu odbudowy układu krwiotwórczego pacjenta w wielu chorobach, takich jak białaczka i chłoniak. Wyjaśnienie mechanizmów kontrolujących samoodnawianie i różnicowanie HSC jest ważne dla zastosowania HSC do zastosowań badawczych i klinicznych. Nie jest jednak możliwe uzyskanie dużej ilości HSC ze względu na ich niezdolność do namnażania się in vitro. Aby pokonać tę przeszkodę, użyliśmy linii komórkowej pochodzącej ze szpiku kostnego myszy, linii komórkowej EML (erytroidalnej, mieloidalnej i limfocytowej), jako systemu modelowego dla tego badania.

Sekwencjonowanie RNA (RNA-Seq) jest coraz częściej używane do zastępowania mikromacierzy w badaniach ekspresji genów. Przedstawiamy tutaj szczegółową metodę wykorzystania technologii RNA-Seq do zbadania potencjalnych kluczowych czynników regulujących samoodnawianie i różnicowanie komórek EML. Protokół przedstawiony w niniejszym dokumencie jest podzielony na trzy części. Pierwsza część wyjaśnia, jak hodować komórki EML i oddzielać komórki Lin-CD34+ i Lin-CD34-. Druga część protokołu oferuje szczegółowe procedury przygotowania całkowitego RNA i późniejszej budowy biblioteki do sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Ostatnia część opisuje metodę analizy danych RNA-Seq i wyjaśnia, jak wykorzystać dane do identyfikacji czynników transkrypcyjnych o zróżnicowanej ekspresji między komórkami Lin-CD34+ i Lin-CD34-. Zidentyfikowano najbardziej znaczące czynniki transkrypcyjne o zróżnicowanej ekspresji, które są potencjalnymi kluczowymi regulatorami kontrolującymi samoodnawianie i różnicowanie komórek EML. W części poświęconej dyskusji w tym artykule zwracamy uwagę na kluczowe kroki prowadzące do pomyślnego przeprowadzenia tego eksperymentu.

Podsumowując, ten artykuł oferuje metodę wykorzystania technologii RNA-Seq do identyfikacji potencjalnych regulatorów samoodnawiania i różnicowania w komórkach EML. Kluczowe zidentyfikowane czynniki są poddawane dalszej analizie funkcjonalnej in vitro i in vivo.

Wprowadzenie

Hematopoetyczne komórki macierzyste to rzadkie komórki krwi, które znajdują się głównie w niszy dorosłego szpiku kostnego. Są odpowiedzialne za produkcję komórek niezbędnych do uzupełnienia krwi i układu odpornościowego1. Jako rodzaj komórek macierzystych, HSC są zdolne zarówno do samoodnawiania, jak i różnicowania. Wyjaśnienie mechanizmów, które kontrolują decyzję o losie HSC, w kierunku samoodnawiania się lub różnicowania, dostarczy cennych wskazówek na temat manipulacji HSC w badaniach nad chorobami krwi i zastosowaniach klinicznych2. Jednym z problemów, z którymi borykają się naukowcy, jest to, że HSC mogą być utrzymywane i namnażane in vitro w bardzo ograniczonym zakresie; Zdecydowana większość ich potomstwa jest częściowo zróżnicowana w kulturze2.

Aby zidentyfikować kluczowe regulatory, które kontrolują procesy samoodnawiania się i różnicowania w skali całego genomu, użyliśmy mysiej prymitywnej linii komórek progenitorowych hematopoetycznych EML jako systemu modelowego. Ta linia komórkowa pochodziła z mysiego szpiku kostnego3,4. Karmione różnymi czynnikami wzrostu komórki EML mogą różnicować się w komórki erytroidalne, szpikowe i limfoidalne in vitro5. Co ważne, ta linia komórkowa może być rozmnażana w dużych ilościach w pożywce hodowlanej zawierającej czynnik komórek macierzystych (SCF) i zachowująca przy tym swoją multipotencjalność. Komórki EML można podzielić na subpopulacje samoodnawiających się komórek Lin-SCA+CD34+ i częściowo zróżnicowanych komórek Lin-SCA-CD34- opartych na markerach powierzchniowych CD34 i SCA6. Podobnie jak krótkoterminowe HSC, komórki SCA+CD34+ są zdolne do samoodnawiania. Po leczeniu SCF komórki Lin-SCA+CD34+ mogą szybko zregenerować mieszaną populację komórek Lin-SCA+CD34+ i Lin-SCA-CD34- i kontynuować proliferację6. Obie populacje mają podobną morfologię i podobne poziomy mRNA c-kit i białka6. Komórki Lin-SCA-CD34- są zdolne do namnażania się w pożywkach zawierających IL-3 zamiast SCF3. Ujawnienie kluczowych regulatorów wpływających na decyzję dotyczącą losu komórek EML pozwoli lepiej zrozumieć mechanizmy komórkowe i molekularne we wczesnej fazie rozwoju podczas hematopoezy.

W celu zbadania podstawowych różnic molekularnych między samoodnawiającymi się komórkami Lin-SCA+CD34+ a częściowo zróżnicowanymi komórkami Lin-SCA-CD34, użyliśmy RNA-Seq do identyfikacji genów o zróżnicowanej ekspresji. W szczególności skupiamy się na czynnikach transkrypcyjnych, ponieważ czynniki transkrypcyjne mają kluczowe znaczenie w określaniu losu komórki. RNA-Seq to niedawno opracowane podejście, które wykorzystuje możliwości technologii sekwencjonowania nowej generacji (NGS) do profilowania i ilościowego określania RNA transkrybowanych z genomu7,8. Krótko mówiąc, całkowity RNA jest poli-A wybrany i pofragmentowany jako początkowa matryca. Matryca RNA jest następnie przekształcana w cDNA za pomocą odwrotnej transkryptazy. Aby zmapować transkrypty RNA o pełnej długości, ważne jest użycie nienaruszonego, niezdegradowanego RNA do budowy biblioteki cDNA. W celu sekwencjonowania do obu końców cDNA dodaje się określone sekwencje adapterów. Następnie, w większości przypadków, cząsteczki cDNA są amplifikowane metodą PCR i sekwencjonowane w sposób wysokoprzepustowy.

Po sekwencjonowaniu, wynikowe odczyty mogą być dostosowane do genomu referencyjnego i bazy danych transkryptomu. Zliczana jest liczba odczytów, które są mapowane do genu referencyjnego, a informacje te można wykorzystać do oszacowania poziomu ekspresji genu. Odczyty mogą być również składane de novo bez genomu referencyjnego, co umożliwia badanie transkryptomów w organizmach niemodelowych9. Technologia sekwencjonowania RNA została również wykorzystana do wykrywania izoform splicingu10-12, nowych transkryptów13 i fuzji genów14. Oprócz wykrywania genów kodujących białka, RNA-Seq może być również używany do wykrywania nowych i analizowania poziomu transkrypcji niekodujących RNA, takich jak długie niekodujące RNA15,16, mikroRNA17, siRNA itp.18. Ze względu na dokładność tej metody, została ona wykorzystana do wykrywania zmian pojedynczych nukleotydów19,20.

Przed pojawieniem się technologii sekwencjonowania RNA, mikromacierz była główną metodą używaną do analizy profilu ekspresji genów. Wstępnie zaprojektowane sondy są syntetyzowane, a następnie mocowane do stałej powierzchni, tworząc szkiełko21 mikromacierzy. mRNA jest ekstrahowane i przekształcane w cDNA. Podczas procesu odwrotnej transkrypcji znakowane fluorescencyjnie nukleotydy są włączane do cDNA, a cDNA może być hybrydyzowane na szkiełkach mikromacierzy. Intensywność sygnału zebranego z określonego miejsca zależy od stopnia wiązania cDNA z konkretną sondą w tym miejscu21. W porównaniu z technologią RNA-Seq, mikromacierz ma kilka ograniczeń. Po pierwsze, mikromacierz opiera się na istniejącej już wiedzy na temat adnotacji genów, podczas gdy technologia RNA-Seq jest w stanie wykryć nowe transkrypty na stosunkowo wysokim poziomie tła, co ogranicza jej zastosowanie, gdy poziom ekspresji genów jest niski. Poza tym technologia RNA-Seq ma znacznie większy dynamiczny zakres detekcji (8000 razy)7, podczas gdy ze względu na tło i nasycenie sygnałów, dokładność mikromacierzy jest ograniczona zarówno dla genów o wysokiej, jak i niskiej ekspresji7,22. Wreszcie, sondy mikromacierzowe różnią się wydajnością hybrydyzacji, co sprawia, że wyniki są mniej wiarygodne przy porównywaniu względnych poziomów ekspresji różnych transkryptów w jednej próbce23. Chociaż RNA-Seq ma wiele zalet w porównaniu z mikromacierzami, jego analiza danych jest złożona. Jest to jeden z powodów, dla których wielu badaczy nadal używa mikromacierzy zamiast sekwencji RNA. Do przetwarzania i analizy danych RNA-Seq potrzebne są różne narzędzia bioinformatyczne24.

Wśród kilku platform sekwencjonowania nowej generacji (NGS), 454, Illumina, SOLID i Ion Torrent są najczęściej używane. 454 była pierwszą komercyjną platformą NGS. W przeciwieństwie do innych platform sekwencjonowania, takich jak illumina i SOLID, platforma 454 generuje dłuższą długość odczytu (średnio 700 odczytów podstawowych)25. Dłuższe odczyty są lepsze do wstępnej charakterystyki transkrypcji ze względu na ich wyższą wydajność składania25. Główną wadą platformy 454 jest jej wysoki koszt w przeliczeniu na megabazę sekwencji. Platformy Illumina i SOLID generują odczyty o zwiększonej liczbie i krótkich długościach. Koszt za megabazę sekwencji jest znacznie niższy niż w przypadku platformy 454. Ze względu na dużą liczbę krótkich odczytów dla platform Illumina i SOLID, analiza danych jest znacznie bardziej intensywna obliczeniowo. Cena instrumentu i odczynników do sekwencjonowania dla platformy Ion Torrent jest tańsza, a czas sekwencjonowania krótszy25. Jednak poziom błędów i koszt na megabazę sekwencji są wyższe w porównaniu z platformami Illumina i SOLID. Różne platformy mają swoje zalety i wady i wymagają różnych metod analizy danych. Platformę należy wybrać w oparciu o cel sekwencjonowania i dostępność finansowania.

W tym artykule bierzemy jako przykład platformę Illumina RNA-Seq. Wykorzystaliśmy komórkę EML jako system modelowy do zbadania kluczowych regulatorów samoodnawiania i różnicowania komórek EML oraz zapewniliśmy szczegółowe metody budowy biblioteki RNA-Seq i analizy danych do obliczania poziomu ekspresji i wykrywania nowych transkryptów. Wykazaliśmy w naszej poprzedniej publikacji, że badanie sekwencyjne RNA w systemie modelowymEML 2, w połączeniu z testem funkcjonalnym (np. knockdown shRNA) zapewnia potężne podejście do zrozumienia molekularnego mechanizmu wczesnych stadiów różnicowania układu krwiotwórczego i może służyć jako model do analizy samoodnawiania się i różnicowania komórek w ogóle.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Hodowla komórek EML i separacja komórek Lin-CD34+ oraz Lin-CD34- przy użyciu systemu magnetycznego sortowania komórek oraz metody sortowania komórek aktywowanego fluorescencją

  1. Przygotowanie pożywki do hodowli komórek nerek młodej chomika (BHK) w celu pozyskania czynnika wzrostu komórek macierzystych:
    1. Hodować komórki BHK w pożywce DMEM zawierającej 10% FBS w kolbie 25 cm2 (Tabela 1) w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w inkubatorze do hodowli komórek.
    2. Gdy komórki osiągną 80-90% konfluencji, przemyć je raz 10 ml PBS. Do monowarstwy dodać 5 ml 0,25% roztworu trypsyny-EDTA i inkubować komórki przez 1-5 min w temperaturze pokojowej (RT), aż do ich odklejenia.
    3. Delikatnie pipetować roztwór w górę i w dół, aby rozbić agregaty komórek. Do kolby dodać 5 ml kompletnej pożywki DMEM, aby zatrzymać działanie trypsyny. Zebrać komórki poprzez wirowanie przy 200 x g przez 5 min w RT.
    4. Usunąć pożywkę i resuspendować osad komórkowy w 10 ml świeżej pożywki do hodowli komórek BHK.
    5. Przenieść 2 ml zawiesiny komórkowej z kroku 1.1.4 do nowej kolby 75 cm2 i dodać do niej 48 ml świeżej pożywki do hodowli komórek BHK.
    6. Hodować komórki BHK przez dwa dni i zebrać pożywkę hodowlaną. Przefiltrować pożywkę przez filtr 0,45 μm. Przechowywać pożywkę w temperaturze -20 °C do dalszego użycia.
  2. Hodowla komórek EML:
    1. Hodować komórki EML (w zawiesinie) w podstawowej pożywce EML zawierającej pożywkę do hodowli komórek BHK (Tabela 1) w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w inkubatorze do hodowli komórek.
    2. Utrzymywać niską gęstość komórek EML (0,5-5 x 105 komórek/ml), tak aby gęstość szczytowa nie przekraczała 6 x 105 komórek/ml. Przesiewać komórki co 2-3 dni w stosunku 1:5. Przesiewać komórki EML delikatnie i utylizować hodowlę po 10 pasażach.
  3. Usuwanie komórek z dodatnimi markerami linii (lineage positive):
    1. Zebrać komórki EML poprzez wirowanie przy 200 x g przez 5 min i przemyć je raz PBS. Zebrać komórki poprzez wirowanie przy 200 x g przez 5 min.
    2. Resuspendować komórki w PBS i policzyć je za pomocą hemocytometru. Ustalić stężenie przeciwciał w kolejnym etapie separacji komórek w zależności od liczby komórek (należy odnieść się do instrukcji dostarczonych przez producenta systemu izolacji komórek).
    3. Wyizolować komórki ujemne pod kątem markerów linii (Lin-) przy użyciu koktajlu przeciwciał lineage (koktajl przeciwciał monoklonalnych sprzężonych z biotyną: CD5, CD45R (B220), CD11b, Anti-Gr-1(Ly-6G/C), 7-4 i Ter-119) oraz magnetycznego systemu sortowania komórek (MACS) zgodnie z instrukcjami producenta.
  4. Separacja komórek Lin-CD34+ i Lin-CD34-:
    1. Odwirować komórki Lin- z kroku 1.3.3 przy 200 x g przez 5 min. Resuspendować osad komórkowy w PBS i policzyć komórki za pomocą hemocytometru.
    2. Przemyć komórki dwukrotnie buforem FACS i odwirować przy 200 x g przez 5 min.
    3. Oznaczyć pięć probótek do mikrowirowania o pojemności 1,5 ml numerami od 1 do 5. Resuspendować komórki w 100 µl buforu FACS na 106 komórek (106 komórek na probówkę).
    4. Do probótek 1 i 2 dodać 1 µg przeciwciała Anti-Mouse CD34 FITC i delikatnie wymieszać zawartość probótek.
    5. Inkubować wszystkie probówki w temperaturze 4 °C przez 1 h w ciemności.
    6. Do probówki 1 dodać 0,25 µg przeciwciała Anti-Sca1 sprzężonego z PE oraz 20 µl przeciwciał z koktajlu Lineage sprzężonych z APC; do probówki 3 dodać 0,25 µg przeciwciała Anti-Sca1 sprzężonego z PE, a do probówki 4 dodać 20 µl przeciwciał z koktajlu Lineage sprzężonych z APC.
    7. Delikatnie wymieszać wszystkie probówki i inkubować komórki w temperaturze 4 °C przez dodatkowe 30 min w ciemności.
    8. Dodać do komórek 300 µl buforu FACS i odwirować przy 200 x g przez 5 min.
    9. Przemyć komórki trzykrotnie 500 µl buforu FACS.
    10. Resuspendować osad komórkowy w 500 µl buforu FACS.
    11. Wykorzystać komórki z probówek 2, 3, 4 i 5 do ustawienia kompensacji. Wyizolować komórki Lin-SCA+CD34+ oraz Lin-SCA-CD34- z probówki 1 za pomocą FACS Aria.

2. Przygotowanie RNA i konstrukcja biblioteki do sekwencjonowania wysokoprzepustowego

  1. Izolacja, analiza jakości i kwantyfikacja RNA:
    1. Wyodrębnić całkowite RNA z komórek Lin-CD34+ oraz Lin-CD34- odpowiednio przy użyciu TRIzol, zgodnie z protokołem producenta.
    2. Usunąć zanieczyszczone DNA przy użyciu doksyrybonukleazy I (DNase I), postępując zgodnie z protokołem producenta. Opcjonalnie, na tym etapie RNA można przechowywać w temperaturze -80 °C do dalszego wykorzystania.
    3. Ocenić jakość całkowitego RNA za pomocą Bioanalizatora zgodnie z instrukcjami dostawcy. Należy użyć próbek RNA z numerem integralności RNA (RIN) większym niż 9.
  2. Konstrukcja biblioteki i sekwencjonowanie wysokoprzepustowe:
    UWAGA: Niniejszy protokół opisuje RNA-Seq z wykorzystaniem platformy Illumina. W przypadku innych platform sekwencjonowania wymagane są inne metody przygotowania bibliotek.
    1. Do przygotowania biblioteki użyć od 0,1 do 4 µg wysokiej jakości całkowitego RNA na próbkę. Zazwyczaj z 105 komórek EML można wyodrębnić 2 µg całkowitego RNA.
    2. Użyć systemu przygotowania próbek do sekwencjonowania RNA w celu oczyszczania i fragmentacji RNA, syntezy pierwszej i drugiej nici cDNA, naprawy końców, adenylacji końców 3’, ligacji adapterów i amplifikacji PCR, postępując zgodnie ze szczegółowymi standardowymi procedurami z instrukcji dostawcy.
      1. Przeprowadzić pozytywną selekcję mRNA PolyA za pomocą magnetycznych kulek oligo-dT i sfragmentować mRNA.
      2. Przeprowadzić odwrotną transkrypcję z użyciem randomowych starterów w celu otrzymania cDNA, a następnie zsyntezować drugą nić cDNA, aby uzyskać dwuniciowe cDNA.
      3. Usunąć nawisy 3' i uzupełnić nawisy 5' za pomocą polimerazy DNA. Zaadenylować końce 3', aby zapobiec ligacji fragmentów cDNA między sobą.
      4. Dodać multipleksowe adaptery indeksujące do obu końców dscDNA. Przeprowadzić PCR w celu wzbogacenia fragmentów DNA.
    3. Zmierzyć stosunek A260/A280 za pomocą spektrofotometru w celu uzyskania informacji o stężeniu biblioteki.
    4. Ocenić jakość biblioteki i zmierzyć zakres wielkości fragmentów DNA za pomocą Bioanalizatora.

3. Analiza danych

W celu uzyskania informacji na temat oprogramowania wykorzystanego w tej części, prosimy zapoznać się z (Tabelą 2).

  1. Przetwarzanie plików danych do dalszej analizy:
    1. Konwersja pliku .bcl (base call file) na plik .fastq przy użyciu oprogramowania CASAVA (Illumina, wersja 1.8.2).
      1. Uruchom „Terminal” w systemie Linux. Przejdź do folderu danych zawierającego plik z maszyny do sekwencjonowania Illumina HiSeq2000. Zakładając, że folder z wynikami to „NASboy1/JiaqianLabData/HiSeq_RUN/2013_07_11/130627_SN860_0309_A_2013-166_H0PW9ADXX/”, wpisz polecenie przedstawione na Rysunku S1A i wejdź do folderu danych.
      2. Zainstaluj CASAVA 1.8.2 w systemie Linux. Zakładając, że folder wyjściowy to „Unaligned”, użyj polecenia z Rysunku S1B, aby przygotować plik konfiguracyjny do konwersji. Użyj opcji --fastq-cluster-count 0, aby zapewnić utworzenie tylko jednego pliku .fastq dla każdej próbki. Wygenerowany plik .fastq jest w formacie .gz. Rozpakuj go do dalszej analizy (Rysunek S1B).
      3. Po wygenerowaniu folderu „Unaligned”, przejdź do folderu „Unaligned” (Rysunek S1C).
      4. Użyj polecenia z Rysunku S1D, aby rozpocząć proces konwersji. Parametr „-j” określa liczbę rdzeni CPU, które zostaną wykorzystane.
      5. Po zakończeniu procesu konwersji przez system, przejdź do folderu z wynikami wewnątrz folderu „Unaligned” (Rysunek S1E).
      6. Użyj polecenia z Rysunku S1F, aby rozpakować plik .fastq.gz do pliku .fastq w folderze każdej próbki.
  2. Wykrywanie nowych transkryptów i ocena poziomu ekspresji przy użyciu Tuxedo Suite26:
    1. Mapowanie odczytów RNA-Seq typu paired-end do referencyjnego genomu myszy (UCSC wersja mm9, pobrana ze strony http://cufflinks.cbcb.umd.edu/igenomes.html) przy użyciu oprogramowania Tophat (wersja 1.3.3)27, które wykorzystuje maper odczytów Bowtie (wersja 0.12.7)28. Tophat jest uruchamiany z opcją „-no-novel-juncs” w celu poprawy dokładności szacowania poziomu ekspresji.
      1. Umieść pliki .fastq w folderze, w którym zostanie przeprowadzony proces mapowania. Zakładając, że dla próbki sekwencjonowania paired-end istnieją 2 pliki .fastq (zmianione nazwy na Example1.read1, Example1.read2), użyj polecenia z Rysunku S2, aby wykonać mapowanie (dostosuj parametry do ustawień systemu). Parametr „-p” określa liczbę rdzeni CPU, które zostaną wykorzystane. Parametry „–r” oraz „–mate-std-dev” można uzyskać z kontroli jakości (QC) biblioteki lub wywnioskować z podzbioru zmapowanych odczytów (Rysunek S2).
    2. Asemblacja zmapowanych odczytów w transkrypty RNA przy użyciu oprogramowania Cufflinks (wersja 1.3.0)29. Uruchom Cufflinks, korzystając z pliku adnotacji znanych genów (ten sam plik .gtf, którego użyto w Tophat) oraz pliku .bam wygenerowanego przez Tophat.
      1. Po zakończeniu pracy programu Tophat, w tym samym folderze użyj polecenia z Rysunku S3A, aby uruchomić cufflinks w celu konstrukcji transkryptomu i oszacowania poziomu ekspresji transkryptów. Plik „mm9_repeatMasker.gtf” oraz pliki sekwencji genomu w folderze „GenomeSeqMM9” można pobrać z przeglądarki UCSC Genome Browser.
      2. Wynikowe pliki genes.expr i transcripts.expr zawierają wartości ekspresji genów i transkryptów (izofom). Skopiuj i wklej zawartość plików do pliku Excel i przetwórz je za pomocą aplikacji arkusza kalkulacyjnego (Rysunek S3B).
      3. Użyj polecenia z Rysunku S3C, aby porównać wynikowy plik „transcripts.gtf” z referencyjnym plikiem „mm9_genes.gtf” w celu zidentyfikowania nowych transkryptów.
      4. Wynikowy plik .tmap zawiera wynik porównania. Skopiuj i wklej zawartość pliku do pliku Excel i przetwórz go za pomocą aplikacji arkusza kalkulacyjnego. Transkrypty z kodem klasy „u” mogą być uznane za „nowe” w porównaniu z dostarczonym referencyjnym plikiem .gtf (Rysunek S3D).
        UWAGA: Dla ułatwienia dalszej analizy ustaw wartości FPKM na 0,1, jeśli wartości te są niższe niż 0,1.
        UWAGA: Kroki 3.2.3 - 3.2.6 są opcjonalne dla osób chcących poprawić dokładność szacowania ekspresji nowych transkryptów. Zajmie to znacznie więcej czasu, ponieważ mapowanie i konstrukcja transkryptomu muszą być uruchomione więcej niż raz.
    3. Uruchom Tophat z domyślnymi parametrami, a następnie uruchom cufflinks, aby wygenerować plik .gtf, używając polecenia z Rysunku S3E.
    4. Porównaj wynikowy plik .gtf z referencyjnym plikiem genomu .gtf, używając polecenia z Rysunku S3F.
    5. Przeanalizuj wynikowy plik .tmap zgodnie z opisem w kroku 3.2.2.4. Skopiuj i wklej zawartość pliku do pliku Excel i przetwórz go za pomocą aplikacji arkusza kalkulacyjnego. Transkrypty z kodem klasy „u” mogą być uznane za „nowe” w porównaniu z dostarczonym referencyjnym plikiem .gtf.
    6. Po wykonaniu kroku 3.2.5 w folderze znajduje się plik .combined.gtf, który może służyć jako referencyjny plik .gtf. Można przeprowadzić drugie uruchomienie Tophat i cufflinks zgodnie z opisem w kroku 3.2.1 i 3.2.2, aby uzyskać dokładniejsze oszacowanie FPKM dla nowych transkryptów.
  3. Wykrywanie genów różnicowo wyrażonych przy użyciu pakietu DESeq30.
    1. Wejściem dla DESeq jest tabela surowych zliczeń odczytów (raw read counts). Aby uzyskać taką tabelę, użyj skryptu htseq-count dołączonego do pakietu Python HTSeq, który można pobrać ze strony internetowej HTSeq (http://www-huber.embl.de/users/anders/HTSeq/doc/count.html).
      1. Upewnij się, że programy samtools, python i htseq-count są zainstalowane w systemie. Uzyskaj surowe liczby zliczeń odczytów z wyników tophat, używając polecenia z Rysunku S4A.
      2. Przygotuj pliki „Raw_Count_Table.txt” i „ExperimentDesign.txt” w programie Excel. Skopiuj i zapisz zawartość w formacie .txt dla pakietu R DESeq (Rysunek S4B).
      3. Zainstaluj program R w systemie. W terminalu wpisz „R” i naciśnij ENTER. Pojawi się komunikat na ekranie, jak pokazano na Rysunku S4C.
      4. Wczytaj pliki „Raw_Count_Table.txt” i „ExperimentDesign.txt” do programu R, używając polecenia z Rysunku S4D.
      5. Załaduj pakiet DESeq, używając polecenia z Rysunku S4E.
      6. Zdefiniuj warunki jako czynniki (factors) w programie R (Rysunek S4F).
      7. Użyj polecenia z Rysunku S4G, aby przeprowadzić test dwumianowy ujemny na znormalizowanej tabeli zliczeń.
      8. Użyj polecenia z Rysunku S4H, aby wyeksportować istotne geny różnicowo wyrażone do pliku .csv.
  4. Wyszukiwanie wartości FPKM czynników transkrypcyjnych (TFs) w próbkach za pomocą programu Excel. Wykonaj część wspólną tabeli genów DE i tabeli TFs. Geny należące do obu tabel są różnicowo wyrażonymi czynnikami transkrypcyjnymi.
    1. Wejdź na stronę http://www.bioguo.org/AnimalTFDB/download.php i pobierz dane o czynnikach transkrypcyjnych. Następnie wyszukaj różnicowo wyrażone czynniki transkrypcyjne w programie Excel (Rysunek S5).
  5. Generowanie pliku .bigwig do wizualizacji w przeglądarce genomu UCSC.
    1. Pobierz pakiet oprogramowania „bedtools” ze strony https://github.com/arq5x/bedtools2 i zainstaluj oprogramowanie w systemie31. Pobierz narzędzie UCSC „bedGraphToBigWig” ze strony http://hgdownload.cse.ucsc.edu/admin/exe/ i zainstaluj oprogramowanie w systemie.
    2. W folderze zawierającym plik .bam użyj polecenia z Rysunku S6A, aby przekonwertować plik .bam wygenerowany przez tophat na plik .bed.
    3. Po utworzeniu pliku .bed użyj polecenia z Rysunku S6B, aby wygenerować plik .bigwig. Plik „ChromInfo.txt” można pobrać z następnego adresu URL: http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/mm9/database/chromInfo.txt.gz.
    4. Przeglądaj niestandardową ścieżkę (custom track) w przeglądarce UCSC Genome Browser. Odwiedź stronę http://genome.ucsc.edu/goldenPath/help/customTrack.html, aby dowiedzieć się, jak wyświetlić niestandardową ścieżkę w przeglądarce genomu UCSC.

Przebieg analizy danych sekwencjonowania DNA; kroki w wierszu poleceń dla generowania plików fastq, konfiguracja HiSeq.
Rycina S1: Konwersja pliku .bcl do pliku .fastq przy użyciu oprogramowania CASAVA.

Wiersz poleceń Tophat dla wyrównania danych RNA-Seq w eksperymencie bioinformatycznym.
Rysunek S2: Mapowanie odczytów do genomu referencyjnego przy użyciu Tophat.

Analiza ekspresji genów; polecenia Cufflinks i Cuffcompare oraz TopHat, wyniki w arkuszu kalkulacyjnym.
Rycina S3: Detekcja nowych transkryptów i szacowanie poziomu ekspresji.

Proces analizy różnicowej ekspresji genów z wykorzystaniem R i DESeq; konfiguracja wiersza poleceń i tabeli.
Rycina S4: Wyznaczanie genów o różnicowej ekspresji przy użyciu pakietu DESeq.

Tabela bazy danych czynników transkrypcyjnych zwierząt; symbole genów, próbki, analiza zmian krotności.
Rycina S5: Identyfikacja różnicowo wyrażonych czynników transkrypcyjnych.

Polecenia konwersji BAM do BED i BED do BigWig; schemat procesu transformacji danych.
Rycina S6: Konwersja wyników mapowania do wizualizacji danych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W celu analizy genów o różnej ekspresji w komórkach EML Lin-CD34+ oraz Lin-CD34- wykorzystaliśmy technologię RNA-Seq. Rysunek 1 przedstawia schemat blokowy przeprowadzonych procedur. Po izolacji komórek z negatywnym markerem linii za pomocą magnetycznego sortowania komórek, oddzieliliśmy komórki Lin-SCA+CD34+ oraz Lin-SCA-CD34- przy użyciu urządzenia FACS Aria. Komórki EML wzbogacone w frakcję Lin- znakowano przeciwciałami anty-CD34, anty-Sca1 oraz koktajlem przeciwciał przeciwko markerom linii. Do anali...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Transkryptom ssaków jest bardzo złożony34-38. Technologia RNA-Seq odgrywa coraz ważniejszą rolę w badaniach nad analizą transkryptomu, wykrywaniem nowych transkryptów i odkrywaniem zmienności pojedynczych nukleotydów itp. Ma wiele zalet w porównaniu z innymi metodami analizy ekspresji genów. Jak wspomniano we wprowadzeniu, pokonuje artefakty hybrydyzacji mikromacierzy i może być używany do identyfikacji nowych transkryptów de novo. Jednym z ograniczeń sekwencjonowania RNA jest stosunk...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

JQW, SZ, SD i KC są wspierane przez granty z National Institutes of Health i Staman Ogilvie Fund - Memorial Hermann Foundation.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Antybiotyk-Antybiotyk PrzeciwgrzybiczyInvitrogen15240-062Hodowla komórek BHK
Anty-Myszy CD34 FITCeBioscience11-0341-81Sortowanie FACS
Anty-mysie Ly-6A/E (Sca-1) PEeBioscience12-5981-81Sortowanie FACS
Koktajl przeciwciał APC Mouse Lineage BDBiosciences558074sortowanie FACS
Sortownik komórek BD FACSAriaBD BiosciencesOferta specjalna sysmtemFACS sortowanie
Corning™ Kolby poddane hodowli komórkowych 75 cm2Corning incorporated430641Hodowla komórkowa
Corning™ Kolby poddane działaniu hodowli komórkowych 25 cm2Corning wbudowana430639Hodowla komórkowa
Deoksyrybonukleaza I, stopień amplifikacjiInvitrogen18068-015Przygotowanie biblioteki
DMEMInvitrogen11965-092Hodowla komórkowa BHK
DPBSGibco14190Hodowla komórkowa
HI FBSInvitrogen16140071Hodowla komórkowa BHK
Surowica końskaInvitrogen16050-122Hodowla komórek EML
IMDMHyCloneSH30228.02Hodowla komórek EML
L-glutaminaInvitrogen25030-081Hodowla komórkowa
Zestaw do zmniejszania liczby komórek linii, myszMiltenyi Biotec130-090-858Izolacja komórek ujemnych w linii
Spektrofotometr NanoVue PlusGE Healthcare28-9569-62Kontrola jakości
Thermo Scientific™ Napco i handel; 8000 Inkubatory CO2 z płaszczem wodnymThermo Scientific15-497-002Hodowla komórkowa
Penicylina-StreptomycynaInvitrogen15140-122Hodowla komórkowa EML
TRIzol® OdczynnikInvitrogen15596-018Ekstrakcja RNA
TruSeq™ Zestaw do przygotowania próbek RNA v2 -Zestaw B (48 rxn)IlluminaRS-122-2002Przygotowanie biblioteki
2100 Elektroanalizator Bioanalizator InstrumentAgilentG2939AAKontrola jakości
0,25% Trypsyna-EDTAGibco25200Hodowla komórkowa
0,45 i mikro; m Filtry strzykawkoweNalgene190-2545Hodowla komórkowa

Bibliografia

  1. Chambers, S. M., Goodell, M. A. Hematopoietic stem cell aging: wrinkles in stem cell potential. Stem Cell Rev. 3, 201-211 (2007).
  2. Wu, J. Q., et al. Tcf7 is an important regulator of the switch of self-renewal and differentiation in a multipotential hematopoietic cell line. PLoS genetics. 8, (2012).
  3. Ye, Z. J., et al. Complex interactions in EML cell stimulation by stem cell factor and IL-3. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 4882-4887 (2011).
  4. Tsai, S., Bartelmez, S., Sitnicka, E., Collins, S. Lymphohematopoietic progenitors immortalized by a retroviral vector harboring a dominant-negative retinoic acid receptor can recapitulate lymphoid, myeloid, and erythroid development. Genes Dev. 8, 2831-2841 (1994).
  5. Weiler, S. R., et al. D3: a gene induced during myeloid cell differentiation of Linlo c-Kit+ Sca-1(+) progenitor cells. Blood. 93, 527-536 (1999).
  6. Ye, Z. J., Kluger, Y., Lian, Z., Weissman, S. M. Two types of precursor cells in a multipotential hematopoietic cell line. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 18461-18466 (2005).
  7. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature reviews. Genetics. 10, 57-63 (2009).
  8. Chu, Y., Corey, D. R. RNA sequencing: platform selection, experimental design, and data interpretation. Nucleic acid therapeutics. 22, 271-274 (2012).
  9. Hornett, E. A., Wheat, C. W. Quantitative RNA-Seq analysis in non-model species: assessing transcriptome assemblies as a scaffold and the utility of evolutionary divergent genomic reference species. BMC genomics. 13, 361(2012).
  10. Eswaran, J., et al. RNA sequencing of cancer reveals novel splicing alterations. Scientific reports. 3, 1689(2013).
  11. Wang, E. T., et al. Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature. 456, 470-476 (2008).
  12. Wu, J. Q., et al. Dynamic transcriptomes during neural differentiation of human embryonic stem cells revealed by short, long, and paired-end sequencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 5254-5259 (2010).
  13. Loraine, A. E., McCormick, S., Estrada, A., Patel, K., Qin, P. RNA-seq of Arabidopsis pollen uncovers novel transcription and alternative splicing. Plant physiology. 162, 1092-1109 (2013).
  14. Edgren, H., et al. Identification of fusion genes in breast cancer by paired-end RNA-sequencing. Genome biology. 12, 6(2011).
  15. Ilott, N. E., Ponting, C. P. Predicting long non-coding RNAs using RNA sequencing. Methods. 63, 50-59 (2013).
  16. Sun, L., et al. Prediction of novel long non-coding RNAs based on RNA-Seq data of mouse Klf1 knockout study. BMC bioinformatics. 13, 331(2012).
  17. Luo, S. MicroRNA expression analysis using the Illumina microRNA-Seq Platform. Methods in molecular biology. 822, 183-188 (2012).
  18. Bolduc, F., Hoareau, C., St-Pierre, P., Perreault, J. P. In-depth sequencing of the siRNAs associated with peach latent mosaic viroid infection. BMC molecular biology. 11, 16(2010).
  19. Chepelev, I., Wei, G., Tang, Q., Zhao, K. Detection of single nucleotide variations in expressed exons of the human genome using RNA-Seq. Nucleic acids research. 37, 106(2009).
  20. Djari, A., et al. Gene-based single nucleotide polymorphism discovery in bovine muscle using next-generation transcriptomic sequencing. BMC genomics. 14, 307(2013).
  21. Murphy, D. Gene expression studies using microarrays: principles, problems, and prospects. Advances in physiology education. 26, 256-270 (2002).
  22. Chen, K., et al. RNA-seq characterization of spinal cord injury transcriptome in acute/subacute phases: a resource for understanding the pathology at the systems level. PLoS one. 8, 72567(2013).
  23. Marioni, J. C., Mason, C. E., Mane, S. M., Stephens, M., Gilad, Y. RNA-seq: an assessment of technical reproducibility and comparison with gene expression arrays. Genome research. 18, 1509-1517 (2008).
  24. Ramskold, D., Kavak, E., Sandberg, R. How to analyze gene expression using RNA-sequencing data. Methods in molecular biology. 802, 259-274 (2012).
  25. Glenn, T. C. Field guide to next-generation DNA sequencers. Mol Ecol Resour. 11, 759-769 (2011).
  26. Trapnell, C., et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nature protocols. 7, 562-578 (2012).
  27. Trapnell, C., Pachter, L., Salzberg, S. L. TopHat: discovering splice junctions with RNA-Seq. Bioinformatics. 25, 1105-1111 (2009).
  28. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome biology. 10, 25(2009).
  29. Trapnell, C., et al. Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nature. 28, 511-515 (2010).
  30. Anders, S., Huber, W. Differential expression analysis for sequence count data. Genome biology. 11, 106(2010).
  31. Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26, 841-842 (2010).
  32. Cheranova, D., et al. RNA-seq analysis of transcriptomes in thrombin-treated and control human pulmonary microvascular endothelial cells. J Vis Exp. , (2013).
  33. Zhang, H. M., et al. AnimalTFDB: a comprehensive animal transcription factor database. Nucleic acids research. 40, 144-149 (2012).
  34. Wu, J. Q., et al. Systematic analysis of transcribed loci in ENCODE regions using RACE sequencing reveals extensive transcription in the human genome. Genome Biol. 9, 3(2008).
  35. Wu, J. Q., et al. Large-scale RT-PCR recovery of full-length cDNA clones. Biotechniques. 36, 690-696 (2004).
  36. Wu, J. Q., Shteynberg, D., Arumugam, M., Gibbs, R. A., Brent, M. R. Identification of rat genes by TWINSCAN gene prediction, RT-PCR, and direct sequencing. Genome Res. 14, 665-671 (2004).
  37. Dewey, C., et al. Accurate identification of novel human genes through simultaneous gene prediction in human, mouse, and rat. Genome Res. 14, 661-664 (2004).
  38. Wu, J. Characterize Mammalian Transcriptome Complexity. , LAP Lambert Academic Publishing. (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Kom rki EMLCD34 dodatnieCD34 ujemneczynniki transkrypcyjnesortowanie kom rek aktywowane fluorescencjkonstrukcja bibliotekianaliza r nicowej ekspresji
Identyfikacja kluczowych czynników regulujących samoodnawianie i różnicowanie w hematopoetycznych komórkach prekursorowych EML za pomocą analizy sekwencjonowania RNA
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.