Artykuł metodologiczny

Identyfikacja kluczowych czynników regulujących samoodnawianie i różnicowanie w hematopoetycznych komórkach prekursorowych EML za pomocą analizy sekwencjonowania RNA

DOI:

10.3791/52104

⸱

11 listopada 2014

 ,  ,  , 
1The Vivian L. Smith Department of Neurosurgery, Center for Stem Cell and Regenerative Medicine, University of Texas Health Science Center, The University of Texas Graduate School of Biomedical Sciences at Houston

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sekwencjonowanie RNA i analizy bioinformatyczne zostały wykorzystane do identyfikacji znacząco i różnicowo wyrażonych czynników transkrypcyjnych w subpopulacjach Lin-CD34+ i Lin-CD34- mysich komórek EML. Te czynniki transkrypcyjne mogą odgrywać ważną rolę w określaniu przełączania między samoodnawiającymi się komórkami Lin-CD34 + a częściowo zróżnicowanymi komórkami Lin-CD34.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hematopoetyczne komórki macierzyste (HSC) są stosowane klinicznie w leczeniu transplantacyjnym w celu odbudowy układu krwiotwórczego pacjenta w wielu chorobach, takich jak białaczka i chłoniak. Wyjaśnienie mechanizmów kontrolujących samoodnawianie i różnicowanie HSC jest ważne dla zastosowania HSC do zastosowań badawczych i klinicznych. Nie jest jednak możliwe uzyskanie dużej ilości HSC ze względu na ich niezdolność do namnażania się in vitro. Aby pokonać tę przeszkodę, użyliśmy linii komórkowej pochodzącej ze szpiku kostnego myszy, linii komórkowej EML (erytroidalnej, mieloidalnej i limfocytowej), jako systemu modelowego dla tego badania.

Sekwencjonowanie RNA (RNA-Seq) jest coraz częściej używane do zastępowania mikromacierzy w badaniach ekspresji genów. Przedstawiamy tutaj szczegółową metodę wykorzystania technologii RNA-Seq do zbadania potencjalnych kluczowych czynników regulujących samoodnawianie i różnicowanie komórek EML. Protokół przedstawiony w niniejszym dokumencie jest podzielony na trzy części. Pierwsza część wyjaśnia, jak hodować komórki EML i oddzielać komórki Lin-CD34+ i Lin-CD34-. Druga część protokołu oferuje szczegółowe procedury przygotowania całkowitego RNA i późniejszej budowy biblioteki do sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Ostatnia część opisuje metodę analizy danych RNA-Seq i wyjaśnia, jak wykorzystać dane do identyfikacji czynników transkrypcyjnych o zróżnicowanej ekspresji między komórkami Lin-CD34+ i Lin-CD34-. Zidentyfikowano najbardziej znaczące czynniki transkrypcyjne o zróżnicowanej ekspresji, które są potencjalnymi kluczowymi regulatorami kontrolującymi samoodnawianie i różnicowanie komórek EML. W części poświęconej dyskusji w tym artykule zwracamy uwagę na kluczowe kroki prowadzące do pomyślnego przeprowadzenia tego eksperymentu.

Podsumowując, ten artykuł oferuje metodę wykorzystania technologii RNA-Seq do identyfikacji potencjalnych regulatorów samoodnawiania i różnicowania w komórkach EML. Kluczowe zidentyfikowane czynniki są poddawane dalszej analizie funkcjonalnej in vitro i in vivo.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hematopoetyczne komórki macierzyste to rzadkie komórki krwi, które znajdują się głównie w niszy dorosłego szpiku kostnego. Są odpowiedzialne za produkcję komórek niezbędnych do uzupełnienia krwi i układu odpornościowego1. Jako rodzaj komórek macierzystych, HSC są zdolne zarówno do samoodnawiania, jak i różnicowania. Wyjaśnienie mechanizmów, które kontrolują decyzję o losie HSC, w kierunku samoodnawiania się lub różnicowania, dostarczy cennych wskazówek na temat manipulacji HSC w badaniach nad chorobami krwi i zastosowaniach klinicznych2. Jednym z problemów, z którymi borykają się naukowcy, jest to, że HSC mogą być utrzymywane i namnażane in vitro w bardzo ograniczonym zakresie; Zdecydowana większość ich potomstwa jest częściowo zróżnicowana w kulturze2.

Aby zidentyfikować kluczowe regulatory, które kontrolują procesy samoodnawiania się i różnicowania w skali całego genomu, użyliśmy mysiej prymitywnej linii komórek progenitorowych hematopoetycznych EML jako systemu modelowego. Ta linia komórkowa pochodziła z mysiego szpiku kostnego3,4. Karmione różnymi czynnikami wzrostu komórki EML mogą różnicować się w komórki erytroidalne, szpikowe i limfoidalne in vitro5. Co ważne, ta linia komórkowa może być rozmnażana w dużych ilościach w pożywce hodowlanej zawierającej czynnik komórek macierzystych (SCF) i zachowująca przy tym swoją multipotencjalność. Komórki EML można podzielić na subpopulacje samoodnawiających się komórek Lin-SCA+CD34+ i częściowo zróżnicowanych komórek Lin-SCA-CD34- opartych na markerach powierzchniowych CD34 i SCA6. Podobnie jak krótkoterminowe HSC, komórki SCA+CD34+ są zdolne do samoodnawiania. Po leczeniu SCF komórki Lin-SCA+CD34+ mogą szybko zregenerować mieszaną populację komórek Lin-SCA+CD34+ i Lin-SCA-CD34- i kontynuować proliferację6. Obie populacje mają podobną morfologię i podobne poziomy mRNA c-kit i białka6. Komórki Lin-SCA-CD34- są zdolne do namnażania się w pożywkach zawierających IL-3 zamiast SCF3. Ujawnienie kluczowych regulatorów wpływających na decyzję dotyczącą losu komórek EML pozwoli lepiej zrozumieć mechanizmy komórkowe i molekularne we wczesnej fazie rozwoju podczas hematopoezy.

W celu zbadania podstawowych różnic molekularnych między samoodnawiającymi się komórkami Lin-SCA+CD34+ a częściowo zróżnicowanymi komórkami Lin-SCA-CD34, użyliśmy RNA-Seq do identyfikacji genów o zróżnicowanej ekspresji. W szczególności skupiamy się na czynnikach transkrypcyjnych, ponieważ czynniki transkrypcyjne mają kluczowe znaczenie w określaniu losu komórki. RNA-Seq to niedawno opracowane podejście, które wykorzystuje możliwości technologii sekwencjonowania nowej generacji (NGS) do profilowania i ilościowego określania RNA transkrybowanych z genomu7,8. Krótko mówiąc, całkowity RNA jest poli-A wybrany i pofragmentowany jako początkowa matryca. Matryca RNA jest następnie przekształcana w cDNA za pomocą odwrotnej transkryptazy. Aby zmapować transkrypty RNA o pełnej długości, ważne jest użycie nienaruszonego, niezdegradowanego RNA do budowy biblioteki cDNA. W celu sekwencjonowania do obu końców cDNA dodaje się określone sekwencje adapterów. Następnie, w większości przypadków, cząsteczki cDNA są amplifikowane metodą PCR i sekwencjonowane w sposób wysokoprzepustowy.

Po sekwencjonowaniu, wynikowe odczyty mogą być dostosowane do genomu referencyjnego i bazy danych transkryptomu. Zliczana jest liczba odczytów, które są mapowane do genu referencyjnego, a informacje te można wykorzystać do oszacowania poziomu ekspresji genu. Odczyty mogą być również składane de novo bez genomu referencyjnego, co umożliwia badanie transkryptomów w organizmach niemodelowych9. Technologia sekwencjonowania RNA została również wykorzystana do wykrywania izoform splicingu10-12, nowych transkryptów13 i fuzji genów14. Oprócz wykrywania genów kodujących białka, RNA-Seq może być również używany do wykrywania nowych i analizowania poziomu transkrypcji niekodujących RNA, takich jak długie niekodujące RNA15,16, mikroRNA17, siRNA itp.18. Ze względu na dokładność tej metody, została ona wykorzystana do wykrywania zmian pojedynczych nukleotydów19,20.

Przed pojawieniem się technologii sekwencjonowania RNA, mikromacierz była główną metodą używaną do analizy profilu ekspresji genów. Wstępnie zaprojektowane sondy są syntetyzowane, a następnie mocowane do stałej powierzchni, tworząc szkiełko21 mikromacierzy. mRNA jest ekstrahowane i przekształcane w cDNA. Podczas procesu odwrotnej transkrypcji znakowane fluorescencyjnie nukleotydy są włączane do cDNA, a cDNA może być hybrydyzowane na szkiełkach mikromacierzy. Intensywność sygnału zebranego z określonego miejsca zależy od stopnia wiązania cDNA z konkretną sondą w tym miejscu21. W porównaniu z technologią RNA-Seq, mikromacierz ma kilka ograniczeń. Po pierwsze, mikromacierz opiera się na istniejącej już wiedzy na temat adnotacji genów, podczas gdy technologia RNA-Seq jest w stanie wykryć nowe transkrypty na stosunkowo wysokim poziomie tła, co ogranicza jej zastosowanie, gdy poziom ekspresji genów jest niski. Poza tym technologia RNA-Seq ma znacznie większy dynamiczny zakres detekcji (8000 razy)7, podczas gdy ze względu na tło i nasycenie sygnałów, dokładność mikromacierzy jest ograniczona zarówno dla genów o wysokiej, jak i niskiej ekspresji7,22. Wreszcie, sondy mikromacierzowe różnią się wydajnością hybrydyzacji, co sprawia, że wyniki są mniej wiarygodne przy porównywaniu względnych poziomów ekspresji różnych transkryptów w jednej próbce23. Chociaż RNA-Seq ma wiele zalet w porównaniu z mikromacierzami, jego analiza danych jest złożona. Jest to jeden z powodów, dla których wielu badaczy nadal używa mikromacierzy zamiast sekwencji RNA. Do przetwarzania i analizy danych RNA-Seq potrzebne są różne narzędzia bioinformatyczne24.

Wśród kilku platform sekwencjonowania nowej generacji (NGS), 454, Illumina, SOLID i Ion Torrent są najczęściej używane. 454 była pierwszą komercyjną platformą NGS. W przeciwieństwie do innych platform sekwencjonowania, takich jak illumina i SOLID, platforma 454 generuje dłuższą długość odczytu (średnio 700 odczytów podstawowych)25. Dłuższe odczyty są lepsze do wstępnej charakterystyki transkrypcji ze względu na ich wyższą wydajność składania25. Główną wadą platformy 454 jest jej wysoki koszt w przeliczeniu na megabazę sekwencji. Platformy Illumina i SOLID generują odczyty o zwiększonej liczbie i krótkich długościach. Koszt za megabazę sekwencji jest znacznie niższy niż w przypadku platformy 454. Ze względu na dużą liczbę krótkich odczytów dla platform Illumina i SOLID, analiza danych jest znacznie bardziej intensywna obliczeniowo. Cena instrumentu i odczynników do sekwencjonowania dla platformy Ion Torrent jest tańsza, a czas sekwencjonowania krótszy25. Jednak poziom błędów i koszt na megabazę sekwencji są wyższe w porównaniu z platformami Illumina i SOLID. Różne platformy mają swoje zalety i wady i wymagają różnych metod analizy danych. Platformę należy wybrać w oparciu o cel sekwencjonowania i dostępność finansowania.

W tym artykule bierzemy jako przykład platformę Illumina RNA-Seq. Wykorzystaliśmy komórkę EML jako system modelowy do zbadania kluczowych regulatorów samoodnawiania i różnicowania komórek EML oraz zapewniliśmy szczegółowe metody budowy biblioteki RNA-Seq i analizy danych do obliczania poziomu ekspresji i wykrywania nowych transkryptów. Wykazaliśmy w naszej poprzedniej publikacji, że badanie sekwencyjne RNA w systemie modelowymEML 2, w połączeniu z testem funkcjonalnym (np. knockdown shRNA) zapewnia potężne podejście do zrozumienia molekularnego mechanizmu wczesnych stadiów różnicowania układu krwiotwórczego i może służyć jako model do analizy samoodnawiania się i różnicowania komórek w ogóle.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. EML Hodowla komórkowa i separacja komórek Lin-CD34+ i Lin-CD34- za pomocą magnetycznego systemu sortowania komórek i metody sortowania komórek aktywowanych fluorescencją

  1. Przygotowanie pożywki do hodowli komórek nerki chomika (BHK) do pobrania czynnika komórek macierzystych:
    1. Hodowla komórek BHK w pożywce DMEM zawierającej 10% FBS w kolbie o średnicy 25cm2 (tabela 1) w temperaturze 37 °C, 5% CO2 w inkubatorze do hodowli komórkowych.
    2. Gdy komórki osiągną 80-90% konfluencji, umyj komórki raz 10 ml PBS. Dodać 5 ml 0,25% roztworu trypsyny-EDTA do monowarstwy i inkubować komórki przez 1-5 minut w temperaturze pokojowej (RT), aż komórki zostaną odłączone.
    3. Delikatnie pipetuj roztwór w górę i w dół, aby rozbić grudki komórek. Dodać 5 ml kompletnego DMEM do kolby, aby zatrzymać aktywność trypsyny. Zebrać komórki przez odwirowanie przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    4. Usunąć pożywkę i ponownie zawiesić osad komórkowy w 10 ml świeżej pożywki do hodowli komórkowych BHK.
    5. Przenieść 2 ml zawiesiny komórek z etapu 1.1.4 do nowej kolbyo długości 75 cm2 i dodać do kolby 48 ml świeżej pożywki do hodowli komórkowych BHK.
    6. Hoduj komórki BHK przez dwa dni i zbierz pożywkę. Przepuścić medium przez filtr 0,45 μm. Przechowywać pożywkę w temperaturze -20 °C do czasu dalszego użycia.
  2. Hodowla komórek EML:
    1. Hodowla komórek EML (w zawiesinie) w pożywce podstawowej EML zawierającej pożywkę do hodowli komórkowych BHK (tabela 1) w temperaturze 37 °C, 5% CO2 w inkubatorze do hodowli komórkowych.
    2. Utrzymuj komórki EML w niskiej gęstości komórek (0,5-5 x 105 komórek/ml) przy gęstości piku mniejszej niż 6 x 105 komórek/ml. Dziel komórki co 2-3 dni w stosunku 1:5. Delikatnie pasażuj komórki EML i wyrzuć kulturę po pasażowaniu przez 10 pokoleń.
  3. Zubożenie komórek dodatnich linii:
    1. Zebrać komórki EML przez odwirowanie przy 200 x g przez 5 minut i przemyć komórki raz PBS. Zebrać komórki przez odwirowanie przy 200 x g przez 5 minut.
    2. Ponownie zawiesić komórki za pomocą PBS i policzyć komórki za pomocą hemocytometru. Określ stężenie przeciwciał w kolejnym etapie separacji komórek w zależności od liczby komórek (proszę zapoznać się z instrukcjami dostarczonymi przez dostawcę systemu izolacji komórek).
    3. Wyizolować komórki liniowo ujemne (Lin-) za pomocą koktajlu przeciwciał liniowych (koktajl przeciwciał monoklonalnych sprzężonych z biotyną CD5, CD45R (B220), CD11b, anty-Gr-1(Ly-6G/C), 7-4 i Ter-119) oraz systemu sortowania komórek aktywowanych magnetycznie zgodnie z instrukcjami producenta.
  4. Rozdzielenie ogniw Lin-CD34+ i Lin-CD34-:
    1. Obracać komórki Lin- z kroku 1.3.3 przy 200 x g przez 5 minut. Ponownie zawiesić osad komórkowy za pomocą PBS i policzyć komórki za pomocą hemocytometru.
    2. Umyj komórki dwukrotnie buforem FACS i osadzaj komórki w masie 200 x g przez 5 minut.
    3. Oznaczyć pięć probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml odpowiednio numerami 1, 2, 3, 4, 5. Ponownie zawiesić komórki za pomocą 100 μl buforu FACS na 106 komórek (106 komórek na probówkę).
    4. Dodać 1 μg przeciwciała Anti-Mouse CD34 FITC do probówki 1 i probówki 2 i delikatnie wymieszać probówki.
    5. Inkubować wszystkie probówki w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę w ciemności.
    6. Dodać 0,25 μg przeciwciała anty-Sca1 sprzężonego z PE i 20 μl przeciwciał Lineage Cocktail sprzężonych z APC do probówki 1, 0,25 μg przeciwciała anty-Sca1 sprzężonego z PE do probówki 3 i 20 μl przeciwciał Lineage Cocktail sprzężonych z APC do probówki 4.
    7. Delikatnie wymieszać wszystkie probówki i inkubować komórki w temperaturze 4 °C przez dodatkowe 30 minut w ciemności.
    8. Dodać 300 μl buforu FACS do komórek i wirować komórki w temperaturze 200 x g przez 5 minut.
    9. Przemyć komórki trzykrotnie 500 μl buforu FACS.
    10. Zawiesić osad komórkowy w 500 μl buforu FACS.
    11. Użyj komórek w probówkach 2, 3, 4 i 5 do ustawienia kompensacji. Wyizoluj komórki Lin-SCA+CD34+ i Lin-SCA-CD34- w probówce 1 za pomocą FACS Aria.

2. Przygotowanie RNA i budowa biblioteki dla sekwencjonowania o wysokiej przepustowości

  1. Izolacja, analiza jakości i kwantyfikacja RNA:
    1. Ekstrahuj całkowite RNA odpowiednio z komórek Lin-CD34 + i Lin-CD34 - za pomocą TRIzolu zgodnie z protokołem producenta.
    2. Usunąć zanieczyszczone DNA za pomocą dezoksyrybonukleazy I (DNazy I) zgodnie z protokołem producenta. Na tym etapie opcjonalnie należy przechowywać RNA w temperaturze -80 °C do dalszego wykorzystania.
    3. Oceń jakość całkowitego RNA za pomocą Bioanalyzera zgodnie z instrukcjami dostarczonymi przez dostawcę. Użyj próbki RNA o liczbie integralności RNA (RIN) większej niż 9.
  2. Budowa biblioteki i sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości:
    UWAGA: Ten protokół opisuje sekwencję RNA przy użyciu platformy Illumina. W przypadku innych platform sekwencjonowania wymagane są różne metody przygotowania biblioteki.
    1. Do przygotowania biblioteki należy użyć 0,1-4 μg wysokiej jakości całkowitego RNA na próbkę. Zwykle 2 μg całkowitego RNA można wyekstrahować z 105 komórek EML.
    2. Użyj systemu przygotowania próbki do sekwencjonowania RNA do oczyszczania i fragmentacji RNA, syntezy pierwszej i drugiej nici cDNA, naprawy końców, adenylacji końcówek 3', ligacji adaptera i amplifikacji PCR, postępując zgodnie ze szczegółowymi standardowymi procedurami z instrukcji dostawcy.
      1. Pozytywnie wybierz mRNA PolyA za pomocą kulek magnetycznych oligo-dT i fragmentuj mRNA.
      2. Wykonaj odwrotną transkrypcję za pomocą losowych starterów, aby uzyskać cDNA, a następnie zsyntetyzuj drugą nić cDNA, aby wygenerować dwuniciowe cDNA.
      3. Usuń zwisy 3' i wypełnij zwisy 5' polimerazą DNA. Adenylate 3' kończy się, aby zapobiec ligowaniu fragmentów cDNA ze sobą.
      4. Dodaj adaptery indeksowania multipleksu do obu końców dscDNA. Wykonaj PCR w celu wzbogacenia fragmentów DNA.
    3. Zmierz A260/A280, aby uzyskać informacje o stężeniu biblioteki za pomocą spektrofotometru.
    4. Oceń jakość biblioteki i zmierz zakres wielkości fragmentów DNA za pomocą bioanalizatora.

3. Analiza danych

Aby zapoznać się z oprogramowaniem używanym w tej części, zobacz (Tabela 2).

  1. Przetwarzanie plików danych do dalszej analizy:
    1. Konwertuj plik .bcl (podstawowy plik wywołania) na plik .fastq za pomocą oprogramowania CASAVA (Illumina, wersja 1.8.2).
      1. Uruchom "Terminal" w systemie Linux. Przejdź do folderu danych, który zawiera plik danych z maszyny do sekwencjonowania Illumina HiSeq2000. Załóżmy, że folder wyników to "NASboy1/JiaqianLabData/HiSeq_RUN/2013_07_11/130627_SN860_0309_A_2013-166_H0PW9ADXX/", wpisz polecenie na rysunku S1A i wprowadź folder danych.
      2. Zainstaluj CASAVA 1.8.2 w systemie Linux. Załóżmy, że folder wyjściowy jest "Niewyrównany", użyj polecenia na rysunku S1B, aby przygotować plik konfiguracyjny do konwersji. Użyj opcji --fastq-cluster-count 0 , aby upewnić się, że dla każdej próbki jest tworzony tylko jeden plik .fastq. Wygenerowany plik .fastq jest w formacie .gz. Rozpakuj go do dalszej analizy (rysunek S1B).
      3. Po wygenerowaniu folderu "Niewyrównany" przejdź do folderu "Niewyrównany" (Rysunek S1C).
      4. Użyj polecenia na rysunku S1D, aby rozpocząć proces konwersji. Parametr "-j" podaje numer procesora, który będzie używany.
      5. Po zakończeniu procesu konwersji przez system przejdź do folderu wyników w folderze "Niewyrównane" (Rysunek S1E).
      6. Użyj polecenia na rysunku S1F, aby zdekompresować plik .fastq.gz do pliku .fastq w każdym folderze próbki.
  2. Wykrywaj nowe transkrypcje i oceń poziom ekspresji za pomocą Tuxedo Suite26:
    1. Mapuj odczyty RNA-Seq na sparowanym końcu genomu referencyjnego myszy (UCSC wersja mm9, uzyskana z http://cufflinks.cbcb.umd.edu/igenomes.html) za pomocą oprogramowania Tophat (wersja 1.3.3)27, które wykorzystuje mapowanie odczytu Bowtie (wersja 0.12.7)28. Tophat jest dostarczany z opcją "-no-novel-juncs" w celu poprawy dokładności szacowania poziomu wyrażenia.
      1. Umieść pliki .fastq w folderze, w którym zostanie zaimplementowany proces mapowania. Załóżmy, że istnieją 2 pliki .fastq (zmień nazwę na Example1.read1, Example1.read2) dla próbki sekwencjonowania sparowanych końców, użyj polecenia na rysunku S2, aby wykonać mapowanie (dostosuj parametry zgodnie z ustawieniami systemu). Parametr "-p" podaje numer procesora, który będzie używany. Parametry "–r" i "–mate-std-dev" można uzyskać z biblioteki QC lub wywnioskować z podzbioru wyrównanych odczytów (rysunek S2).
    2. Złóż zmapowane odczyty w transkrypty RNA za pomocą oprogramowania Spinki do mankietów (wersja 1.3.0)29. Uruchom spinki do mankietów, używając pliku adnotacji znanych genów (ten sam plik .gtf używany przez Tophat) i pliku .bam utworzonego przez Tophat.
      1. Po zakończeniu działania Tophat w tym samym folderze użyj polecenia na rysunku S3A, aby uruchomić spinki do mankietów w celu skonstruowania transkryptomu i oszacowania poziomu wyrażenia transkrypcji. Pliki "mm9_repeatMasker.gtf" i sekwencji genomu w folderze "GenomeSeqMM9" można pobrać z UCSC Genome Browser.
      2. Wynikowe pliki genes.expr i transcripts.expr zawierają wartość wyrażenia genów i transkryptów (izoform). Skopiuj i wklej zawartość pliku do pliku Excel i manipuluj za pomocą aplikacji arkusza kalkulacyjnego (Rysunek S3B).
      3. Użyj polecenia na rysunku S3C, aby porównać wynikowy plik "transcripts.gtf" z referencyjnym plikiem "mm9_genes.gtf" w celu zidentyfikowania nowych transkrypcji.
      4. Wynikowy plik .tmap zawiera wynik porównania. Skopiuj i wklej zawartość pliku do pliku Excel i manipuluj za pomocą aplikacji do obsługi arkuszy kalkulacyjnych. Transkrypcje z kodem klasy "u" można uznać za "nowatorskie" w porównaniu z dostarczonym referencyjnym plikiem .gtf (rysunek S3D).
        UWAGA: Dla wygody dalszej analizy ustaw wartości FPKM na 0,1, jeśli wartości są poniżej 0,1,
        UWAGA: Krok 3.2.3 - 3.2.6 jest opcjonalny dla tych, którzy chcą poprawić dokładność szacowania ekspresji nowych transkryptów. Zajmie to znacznie więcej czasu, ponieważ mapowanie i budowa transkryptomu muszą być uruchamiane więcej niż raz.
    3. Uruchom Tophat przy użyciu parametrów domyślnych, a następnie uruchom spinki do mankietów do wygenerowanego pliku .gtf za pomocą polecenia na rysunku S3E.
    4. Porównaj wynikowy plik .gtf z referencyjnym plikiem genomu .gtf za pomocą polecenia na rysunku S3F.
    5. Przeanalizuj wynikowy plik .tmap zgodnie z opisem w kroku 3.2.2.4. Skopiuj i wklej zawartość pliku do pliku Excel i manipuluj za pomocą aplikacji do obsługi arkuszy kalkulacyjnych. Transkrypcje z kodem klasy "u" można uznać za "nowatorskie" w porównaniu z dostarczonym plikiem referencyjnym .gtf.
    6. Po kroku 3.2.5 w folderze znajduje się plik .combined.gtf, którego można użyć jako pliku referencyjnego .gtf. Drugi przebieg Tophat i spinki do mankietów można wykonać zgodnie z opisem w krokach 3.2.1 i 3.2.2, aby uzyskać dokładniejsze oszacowanie FPKM nowych transkryptów.
  3. Wykrywanie genów o zróżnicowanej ekspresji za pomocą pakietu DESeq30.
    1. Dane wejściowe DESeq to nieprzetworzona tabela liczby odczytów. Aby uzyskać taką tabelę, należy użyć skryptu htseq-count dystrybuowanego wraz z pakietem HTSeq Python, który można pobrać ze strony HTSeq (http://www-huber.embl.de/users/anders/HTSeq/doc/count.html).
      1. Upewnij się, że w systemie są zainstalowane programy samtools, python i htseq-count. Uzyskaj surowe liczby odczytów z danych wyjściowych tophat za pomocą polecenia na rysunku S4A.
      2. Przygotuj pliki "Raw_Count_Table.txt", "ExperimentDesign.txt" za pomocą programu Excel. Skopiuj i zapisz zawartość w formacie .txt dla pakietu DESeq R (Rysunek S4B).
      3. Zainstaluj program R w systemie. W terminalu wpisz "R" i naciśnij ENTER. Pojawi się komunikat na ekranie, jak pokazano na rysunku S4C.
      4. Przeczytaj "Raw_Count_Table.txt", "ExperimentDesign.txt" do R za pomocą polecenia na rysunku S4D.
      5. Załaduj pakiet DESeq za pomocą polecenia na rysunku S4E.
      6. Rozkład warunków na czynniki pierwsze w R (rysunek S4F).
      7. Użyj polecenia na rysunku S4G, aby uruchomić ujemny test dwunominalny na znormalizowanej tabeli zliczania.
      8. Użyj polecenia na rysunku S4H, aby wyprowadzić geny o znaczącej ekspresji różnicowej w pliku .csv.
  4. Sprawdzanie wartości FPKM czynników transkrypcyjnych (TF) w próbkach przy użyciu programu Excel. Przetnij tabelę genów DE i tabelę TFs. Geny należące do obu tabel są czynnikami transkrypcyjnymi o różnej ekspresji.
    1. Wejdź na stronę http://www.bioguo.org/AnimalTFDB/download.php i pobierz czynniki transkrypcyjne. Następnie wyszukaj czynniki transkrypcyjne DE w programie Excel (rysunek S5).
  5. Generowanie pliku .bigwig do wizualizacji przeglądarki genomu UCSC.
    1. Pobierz pakiet oprogramowania 'bedtools' ze strony internetowej https://github.com/arq5x/bedtools2 i zainstaluj oprogramowanie w systemie31. Pobierz narzędzia UCSC "bedGraphToBigWig" ze strony internetowej http://hgdownload.cse.ucsc.edu/admin/exe/ i zainstaluj oprogramowanie w systemie.
    2. W folderze zawierającym plik .bam użyj polecenia na rysunku S6A, aby przekonwertować plik .bam wygenerowany przez tophat na plik .bed.
    3. Po utworzeniu pliku .bed użyj polecenia na rysunku S6B, aby wygenerować plik .bigwig. Plik "ChromInfo.txt" można pobrać z następującego adresu URL: http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/mm9/database/chromInfo.txt.gz.
    4. Obserwuj niestandardową ścieżkę w przeglądarce UCSC Genome Browser. Zapoznaj się ze stroną internetową http://genome.ucsc.edu/goldenPath/help/customTrack.html aby dowiedzieć się, jak wyświetlić niestandardową ścieżkę za pomocą przeglądarki genomu UCSC.

figure-protocol-1
Rysunek S1: Konwersja pliku .bcl na plik .fastq za pomocą oprogramowania CASAVA.

figure-protocol-2
Rysunek S2: Mapowanie odczytuje genom referencyjny za pomocą Tophat.

figure-protocol-3
Rysunek S3: Wykrywanie nowych transkryptów i szacowanie poziomu ekspresji.

figure-protocol-4
Rysunek S4: Wywoływanie genu o ekspresji różnicowej za pomocą pakietu DESeq.

figure-protocol-5
Rysunek S5: Identyfikacja różnicowo wyrażonych czynników transkrypcyjnych.

figure-protocol-6
Rysunek S6: Konwersja wyniku mapowania na potrzeby wizualizacji danych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby przeanalizować geny o zróżnicowanej ekspresji w komórkach Lin-CD34+ i Lin-CD34- EML, użyliśmy technologii RNA-Seq. Rysunek 1 przedstawia przebieg procedur. Po wyizolowaniu komórek line-ujemnych przez magnetyczne sortowanie komórek, oddzieliliśmy komórki Lin-SCA + CD34 + i Lin-SCA-CD34 - za pomocą FACS Aria. Komórki EML wzbogacone w Lin wybarwiono przeciwciałami anty-CD34, anty-Sca1 i koktajlem linii. Tylko komórki Lin- bramkowano do analizy ekspresji Sca1 i CD34. Dwie populacje (SCA + CD34 + i SCA-CD...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transkryptom ssaków jest bardzo złożony34-38. Technologia RNA-Seq odgrywa coraz ważniejszą rolę w badaniach nad analizą transkryptomu, wykrywaniem nowych transkryptów i odkrywaniem zmienności pojedynczych nukleotydów itp. Ma wiele zalet w porównaniu z innymi metodami analizy ekspresji genów. Jak wspomniano we wprowadzeniu, pokonuje artefakty hybrydyzacji mikromacierzy i może być używany do identyfikacji nowych transkryptów de novo. Jednym z ograniczeń sekwencjonowania RNA jest stosunk...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

JQW, SZ, SD i KC są wspierane przez granty z National Institutes of Health i Staman Ogilvie Fund - Memorial Hermann Foundation.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Antybiotyk-Antybiotyk PrzeciwgrzybiczyInvitrogen15240-062Hodowla komórek BHK
Anty-Myszy CD34 FITCeBioscience11-0341-81Sortowanie FACS
Anty-mysie Ly-6A/E (Sca-1) PEeBioscience12-5981-81Sortowanie FACS
Koktajl przeciwciał APC Mouse Lineage BDBiosciences558074sortowanie FACS
Sortownik komórek BD FACSAriaBD BiosciencesOferta specjalna sysmtemFACS sortowanie
Corning™ Kolby poddane hodowli komórkowych 75 cm2Corning incorporated430641Hodowla komórkowa
Corning™ Kolby poddane działaniu hodowli komórkowych 25 cm2Corning wbudowana430639Hodowla komórkowa
Deoksyrybonukleaza I, stopień amplifikacjiInvitrogen18068-015Przygotowanie biblioteki
DMEMInvitrogen11965-092Hodowla komórkowa BHK
DPBSGibco14190Hodowla komórkowa
HI FBSInvitrogen16140071Hodowla komórkowa BHK
Surowica końskaInvitrogen16050-122Hodowla komórek EML
IMDMHyCloneSH30228.02Hodowla komórek EML
L-glutaminaInvitrogen25030-081Hodowla komórkowa
Zestaw do zmniejszania liczby komórek linii, myszMiltenyi Biotec130-090-858Izolacja komórek ujemnych w linii
Spektrofotometr NanoVue PlusGE Healthcare28-9569-62Kontrola jakości
Thermo Scientific™ Napco i handel; 8000 Inkubatory CO2 z płaszczem wodnymThermo Scientific15-497-002Hodowla komórkowa
Penicylina-StreptomycynaInvitrogen15140-122Hodowla komórkowa EML
TRIzol® OdczynnikInvitrogen15596-018Ekstrakcja RNA
TruSeq™ Zestaw do przygotowania próbek RNA v2 -Zestaw B (48 rxn)IlluminaRS-122-2002Przygotowanie biblioteki
2100 Elektroanalizator Bioanalizator InstrumentAgilentG2939AAKontrola jakości
0,25% Trypsyna-EDTAGibco25200Hodowla komórkowa
0,45 i mikro; m Filtry strzykawkoweNalgene190-2545Hodowla komórkowa

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chambers, S. M., Goodell, M. A. Hematopoietic stem cell aging: wrinkles in stem cell potential. Stem Cell Rev. 3, 201-211 (2007).
  2. Wu, J. Q., et al. Tcf7 is an important regulator of the switch of self-renewal and differentiation in a multipotential hematopoietic cell line. PLoS genetics. 8, (2012).
  3. Ye, Z. J., et al. Complex interactions in EML cell stimulation by stem cell factor and IL-3. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 4882-4887 (2011).
  4. Tsai, S., Bartelmez, S., Sitnicka, E., Collins, S. Lymphohematopoietic progenitors immortalized by a retroviral vector harboring a dominant-negative retinoic acid receptor can recapitulate lymphoid, myeloid, and erythroid development. Genes Dev. 8, 2831-2841 (1994).
  5. Weiler, S. R., et al. D3: a gene induced during myeloid cell differentiation of Linlo c-Kit+ Sca-1(+) progenitor cells. Blood. 93, 527-536 (1999).
  6. Ye, Z. J., Kluger, Y., Lian, Z., Weissman, S. M. Two types of precursor cells in a multipotential hematopoietic cell line. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 18461-18466 (2005).
  7. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature reviews. Genetics. 10, 57-63 (2009).
  8. Chu, Y., Corey, D. R. RNA sequencing: platform selection, experimental design, and data interpretation. Nucleic acid therapeutics. 22, 271-274 (2012).
  9. Hornett, E. A., Wheat, C. W. Quantitative RNA-Seq analysis in non-model species: assessing transcriptome assemblies as a scaffold and the utility of evolutionary divergent genomic reference species. BMC genomics. 13, 361(2012).
  10. Eswaran, J., et al. RNA sequencing of cancer reveals novel splicing alterations. Scientific reports. 3, 1689(2013).
  11. Wang, E. T., et al. Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature. 456, 470-476 (2008).
  12. Wu, J. Q., et al. Dynamic transcriptomes during neural differentiation of human embryonic stem cells revealed by short, long, and paired-end sequencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 5254-5259 (2010).
  13. Loraine, A. E., McCormick, S., Estrada, A., Patel, K., Qin, P. RNA-seq of Arabidopsis pollen uncovers novel transcription and alternative splicing. Plant physiology. 162, 1092-1109 (2013).
  14. Edgren, H., et al. Identification of fusion genes in breast cancer by paired-end RNA-sequencing. Genome biology. 12, 6(2011).
  15. Ilott, N. E., Ponting, C. P. Predicting long non-coding RNAs using RNA sequencing. Methods. 63, 50-59 (2013).
  16. Sun, L., et al. Prediction of novel long non-coding RNAs based on RNA-Seq data of mouse Klf1 knockout study. BMC bioinformatics. 13, 331(2012).
  17. Luo, S. MicroRNA expression analysis using the Illumina microRNA-Seq Platform. Methods in molecular biology. 822, 183-188 (2012).
  18. Bolduc, F., Hoareau, C., St-Pierre, P., Perreault, J. P. In-depth sequencing of the siRNAs associated with peach latent mosaic viroid infection. BMC molecular biology. 11, 16(2010).
  19. Chepelev, I., Wei, G., Tang, Q., Zhao, K. Detection of single nucleotide variations in expressed exons of the human genome using RNA-Seq. Nucleic acids research. 37, 106(2009).
  20. Djari, A., et al. Gene-based single nucleotide polymorphism discovery in bovine muscle using next-generation transcriptomic sequencing. BMC genomics. 14, 307(2013).
  21. Murphy, D. Gene expression studies using microarrays: principles, problems, and prospects. Advances in physiology education. 26, 256-270 (2002).
  22. Chen, K., et al. RNA-seq characterization of spinal cord injury transcriptome in acute/subacute phases: a resource for understanding the pathology at the systems level. PLoS one. 8, 72567(2013).
  23. Marioni, J. C., Mason, C. E., Mane, S. M., Stephens, M., Gilad, Y. RNA-seq: an assessment of technical reproducibility and comparison with gene expression arrays. Genome research. 18, 1509-1517 (2008).
  24. Ramskold, D., Kavak, E., Sandberg, R. How to analyze gene expression using RNA-sequencing data. Methods in molecular biology. 802, 259-274 (2012).
  25. Glenn, T. C. Field guide to next-generation DNA sequencers. Mol Ecol Resour. 11, 759-769 (2011).
  26. Trapnell, C., et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nature protocols. 7, 562-578 (2012).
  27. Trapnell, C., Pachter, L., Salzberg, S. L. TopHat: discovering splice junctions with RNA-Seq. Bioinformatics. 25, 1105-1111 (2009).
  28. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome biology. 10, 25(2009).
  29. Trapnell, C., et al. Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nature. 28, 511-515 (2010).
  30. Anders, S., Huber, W. Differential expression analysis for sequence count data. Genome biology. 11, 106(2010).
  31. Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26, 841-842 (2010).
  32. Cheranova, D., et al. RNA-seq analysis of transcriptomes in thrombin-treated and control human pulmonary microvascular endothelial cells. J Vis Exp. , (2013).
  33. Zhang, H. M., et al. AnimalTFDB: a comprehensive animal transcription factor database. Nucleic acids research. 40, 144-149 (2012).
  34. Wu, J. Q., et al. Systematic analysis of transcribed loci in ENCODE regions using RACE sequencing reveals extensive transcription in the human genome. Genome Biol. 9, 3(2008).
  35. Wu, J. Q., et al. Large-scale RT-PCR recovery of full-length cDNA clones. Biotechniques. 36, 690-696 (2004).
  36. Wu, J. Q., Shteynberg, D., Arumugam, M., Gibbs, R. A., Brent, M. R. Identification of rat genes by TWINSCAN gene prediction, RT-PCR, and direct sequencing. Genome Res. 14, 665-671 (2004).
  37. Dewey, C., et al. Accurate identification of novel human genes through simultaneous gene prediction in human, mouse, and rat. Genome Res. 14, 661-664 (2004).
  38. Wu, J. Characterize Mammalian Transcriptome Complexity. , LAP Lambert Academic Publishing. (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Kom rki EMLCD34 dodatnieCD34 ujemneczynniki transkrypcyjnesortowanie kom rek aktywowane fluorescencjkonstrukcja bibliotekianaliza r nicowej ekspresji

Powiązane artykuły