Identyfikacja kluczowych czynników regulujących samoodnawianie i różnicowanie w hematopoetycznych komórkach prekursorowych EML za pomocą analizy sekwencjonowania RNA

Shan Zong; Shuyun Deng; Kenian Chen; Jia Qian Wu

doi:10.3791/52104

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Identyfikacja kluczowych czynników regulujących samoodnawianie i różnicowanie w hematopoetycznych komórkach prekursorowych EML za pomocą analizy sekwencjonowania RNA

11.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52104

⸱

11 listopada 2014

Shan Zong^*¹ , Shuyun Deng^*¹ , Kenian Chen¹ , Jia Qian Wu¹

¹The Vivian L. Smith Department of Neurosurgery, Center for Stem Cell and Regenerative Medicine, University of Texas Health Science Center, The University of Texas Graduate School of Biomedical Sciences at Houston

^* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Sekwencjonowanie RNA i analizy bioinformatyczne zostały wykorzystane do identyfikacji znacząco i różnicowo wyrażonych czynników transkrypcyjnych w subpopulacjach Lin-CD34+ i Lin-CD34- mysich komórek EML. Te czynniki transkrypcyjne mogą odgrywać ważną rolę w określaniu przełączania między samoodnawiającymi się komórkami Lin-CD34 + a częściowo zróżnicowanymi komórkami Lin-CD34.

Streszczenie

Hematopoetyczne komórki macierzyste (HSC) są stosowane klinicznie w leczeniu transplantacyjnym w celu odbudowy układu krwiotwórczego pacjenta w wielu chorobach, takich jak białaczka i chłoniak. Wyjaśnienie mechanizmów kontrolujących samoodnawianie i różnicowanie HSC jest ważne dla zastosowania HSC do zastosowań badawczych i klinicznych. Nie jest jednak możliwe uzyskanie dużej ilości HSC ze względu na ich niezdolność do namnażania się in vitro. Aby pokonać tę przeszkodę, użyliśmy linii komórkowej pochodzącej ze szpiku kostnego myszy, linii komórkowej EML (erytroidalnej, mieloidalnej i limfocytowej), jako systemu modelowego dla tego badania.

Sekwencjonowanie RNA (RNA-Seq) jest coraz częściej używane do zastępowania mikromacierzy w badaniach ekspresji genów. Przedstawiamy tutaj szczegółową metodę wykorzystania technologii RNA-Seq do zbadania potencjalnych kluczowych czynników regulujących samoodnawianie i różnicowanie komórek EML. Protokół przedstawiony w niniejszym dokumencie jest podzielony na trzy części. Pierwsza część wyjaśnia, jak hodować komórki EML i oddzielać komórki Lin-CD34+ i Lin-CD34-. Druga część protokołu oferuje szczegółowe procedury przygotowania całkowitego RNA i późniejszej budowy biblioteki do sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Ostatnia część opisuje metodę analizy danych RNA-Seq i wyjaśnia, jak wykorzystać dane do identyfikacji czynników transkrypcyjnych o zróżnicowanej ekspresji między komórkami Lin-CD34+ i Lin-CD34-. Zidentyfikowano najbardziej znaczące czynniki transkrypcyjne o zróżnicowanej ekspresji, które są potencjalnymi kluczowymi regulatorami kontrolującymi samoodnawianie i różnicowanie komórek EML. W części poświęconej dyskusji w tym artykule zwracamy uwagę na kluczowe kroki prowadzące do pomyślnego przeprowadzenia tego eksperymentu.

Podsumowując, ten artykuł oferuje metodę wykorzystania technologii RNA-Seq do identyfikacji potencjalnych regulatorów samoodnawiania i różnicowania w komórkach EML. Kluczowe zidentyfikowane czynniki są poddawane dalszej analizie funkcjonalnej in vitro i in vivo.

Wprowadzenie

Hematopoetyczne komórki macierzyste to rzadkie komórki krwi, które znajdują się głównie w niszy dorosłego szpiku kostnego. Są odpowiedzialne za produkcję komórek niezbędnych do uzupełnienia krwi i układu odpornościowego¹. Jako rodzaj komórek macierzystych, HSC są zdolne zarówno do samoodnawiania, jak i różnicowania. Wyjaśnienie mechanizmów, które kontrolują decyzję o losie HSC, w kierunku samoodnawiania się lub różnicowania, dostarczy cennych wskazówek na temat manipulacji HSC w badaniach nad chorobami krwi i zastosowaniach klinicznych². Jednym z problemów, z którymi borykają się naukowcy, jest to, że HSC mogą być utrzymywane i namnażane in v....