Synergiczne zastosowanie neuronalnych komórek prekursorowych i samoorganizujących się peptydów w eksperymentalnym uszkodzeniu rdzenia kręgowego w odcinku szyjnym

Summary

Leczenie uszkodzeń rdzenia kręgowego odcinka szyjnego zarówno za pomocą peptydów samoorganizujących się (SAP), jak i nerwowych komórek prekursorowych (NPC), wraz z czynnikami wzrostu, jest obiecującym podejściem do promowania regeneracji i regeneracji. Ustalono szczurzy model klisa do stłuczenia/ucisku tętniaka szyjki macicy i leczenia skojarzonego obejmującego wstrzyknięcie SAP i przeszczep NPC.

Abstract

Urazy rdzenia kręgowego (SCI) powodują poważne upośledzenie neurologiczne oraz psychologiczne, ekonomiczne i społeczne konsekwencje dla pacjentów i ich rodzin. Klinicznie ponad 50% SCI dotyczy odcinka szyjnego^{kręgosłupa 1}. W wyniku pierwotnego urazu dochodzi do kaskady mechanizmów wtórnych, w tym zapalenia, apoptozy i demielinizacji, co ostatecznie prowadzi do bliznowacenia tkanek i rozwoju jam śródszpikowych^2,3. Oba stanowią fizyczne i chemiczne bariery dla przeszczepu, integracji i regeneracji komórek. W związku z tym kształtowanie środowiska hamującego i wypełnianie jam w celu stworzenia środowiska wspierającego dla przeszczepu i regeneracji komórek jest obiecującym celem terapeutycznym⁴. W tym miejscu opisano model stłuczenia/ucisku SCI szyjki macicy za pomocą klipsa tętniaka. Model ten jest bardziej istotny klinicznie niż inne modele eksperymentalne, ponieważ całkowite przecięcie lub pęknięcie rdzenia jest rzadkie. Również w porównaniu z modelem spadku masy ciała, który w szczególności uszkadza kolumny grzbietowe, kompresję obwodową rdzenia kręgowego wydaje się korzystna. Siłę zamykania klipsa i czas trwania można dostosować, aby uzyskać różną ciężkość obrażeń. Sprężyna pierścieniowa ułatwia precyzyjną kalibrację i stałość siły zacisku. W warunkach fizjologicznych syntetyczne peptydy samoorganizujące się (SAP) samoorganizują się w nanowłókna, a tym samym są atrakcyjne do zastosowania w SCI⁵. Można je wstrzykiwać bezpośrednio do zmiany, minimalizując uszkodzenia rdzenia. SAP to biokompatybilne struktury wznoszące rusztowania w celu wypełnienia jam śródszpikowych, a tym samym wyposażenia uszkodzonego rdzenia do zabiegów regeneracyjnych. K2(QL)6K2 (QL6) to nowy SAP wprowadzony przez Dong et a ^l.6 W porównaniu z innymi peptydami, QL6 samoorganizuje się w β-arkusze przy neutralnym pH^6,14 dnia po SCI, po ostrym etapie SAP są wstrzykiwane do środka zmiany, a neuronalne komórki prekursorowe (NPC) są wstrzykiwane do sąsiednich kolumn grzbietowych. W celu wsparcia przeżycia komórek przeszczep łączy się z ciągłym podtwardówkowym podawaniem czynników wzrostu za pomocą mikropomp osmotycznych przez 7 dni.

Introduction

Ponad 50% urazów rdzenia kręgowego jest związanych z odcinkiem szyjnym kręgosłupa. W warunkach klinicznych opisano dwa główne mechanizmy patofizjologiczne: początkowe stłuczenie rdzenia kręgowego, a następnie ciągły ucisk spowodowany złamaniami kości, krwotokami lub obrzękiem tkanek.

Model ucisku tętniaka/ucisku naśladuje oba patofizjologiczne mechanizmy: zatrzaśnięcie klipsa powoduje stłuczenie, a czas trwania przycinania reprezentuje składnik kompresji, przyznając, że ucisk w warunkach klinicznych spowodowany złamaniami kości, krwotokami lub obrzękiem tkanek trwa znacznie dłużej. Zastosowany klips do tętniaka jest modyfikowany przez sprężynę pierścieniową, która gwarantuje dokładną i powtarzalną siłę zacisku. Zwłaszcza w porównaniu z modelem transsekcji połowiczej lub kontuzją, ten model klipsa tętniaka naśladuje najlepsze warunki kliniczne. Podczas gdy pacjenci z urazami klatki piersiowej cierpią na paraplegię, większość pacjentów z urazami szyjki macicy jest tetraplegiczna i całkowicie zależna. Budowa anatomiczna rdzenia szyjnego wykazuje jednak znaczne różnice w porównaniu z odcinkiem piersiowym lub lędźwiowym kręgosłupa, a zatem jest w szczególności uwzględniona w niniejszym protokole.

Rozwój jam śródszpikowych i bliznowacenie tkanek są przeszkodami w powrocie do zdrowia i regeneracji. Aby pokonać te bariery, obiecującym podejściem jest zastosowanie materiału rusztowaniowego. Peptydy samoorganizujące się mogą być wstrzykiwane bezpośrednio do epicentrum zmiany. Tam łączą się w rusztowania z nanowłókien wypełniające jamę i poprawiają środowisko hamujące, zmniejszając stan zapalny i bliznowacenie tkanek. Podczas gdy sztywne materiały powodują znaczne uszkodzenia rdzenia kręgowego podczas implantacji, peptydy płynu mogą być wstrzykiwane bezpiecznie i bez poważnych dodatkowych uszkodzeń.

Poprawa środowiska hamującego za pomocą peptydów samoorganizujących się przed przeszczepem komórek macierzystych, a tym samym wspomaganie integracji komórek, różnicowanie i w końcu, odzyskiwanie funkcji po urazie rdzenia kręgowego w odcinku szyjnym.

Protocol

UWAGA: Poniższy protokół eksperymentalny został zatwierdzony przez komitet opieki nad zwierzętami University Health Network (Toronto, Kanada) i jest zgodny z zasadami ustalonymi w przewodniku do opieki i użytkowania zwierząt doświadczalnych przygotowanym przez Kanadyjską Radę Opieki nad Zwierzętami.

1. Model stłuczenia/ucisku tętniaka szyjki macicy

1. Przed zabiegiem należy autoklawować narzędzia i utrzymywać sterylne warunki podczas całego zabiegu chirurgicznego poprzez umieszczanie narzędzi w kąpieli alkoholowej o stężeniu 70%.
2. Znieczulenie szczurów Wistar (250-270 g) kombinacją tlenu (_O2), podtlenku azotu (N₂O) (1:1) i 1,8-2,2% izofluranu i wspomaganie spontanicznego oddychania za pomocą maski do znieczulenia gazowego. W celu indukcji znieczulenia należy rozpocząć od 5% izofluranu przez 1 minutę, a następnie zmniejszyć. Przed przystąpieniem do zabiegu należy kontrolować głębokość znieczulenia poprzez podanie bolesnego bodźca (np. w łapy). Stosuj tłuste maści do oczu, aby uniknąć wysuszenia i zapobiec późniejszym infekcjom.
3. Połóż szczury na poduszce grzewczej (37 °C) i przymocuj głowę do ramy stereotaktycznej.
4. Ogolić obszar chirurgiczny wokół odcinka szyjnego kręgosłupa i zdezynfekować jodonem powidonu i 70% alkoholem.
5. Wykonaj nacięcie w linii środkowej powyżej kręgosłupa od kręgu szyjnego (C2) sięgające do wydatnego wyrostka trzonu kręgu piersiowego 2 (T2).
6. Przetnij zewnętrzną warstwę mięśni kręgowych bezpośrednio na linii środkowej (aby uniknąć krwawienia) w kierunku czaszkowo-ogonowym i dalej tępo rozetnij głębsze warstwy mięśni, aż dotrzesz do wyrostka kolczastego i blaszek. Wkładać zwijacze.
7. Zorientuj wydatny processus spinosus trzonu kręgu T2, aby obserwować docelowe poziomy dla laminektomii. Po identyfikacji i mikrochirurgicznym przygotowaniu wybranych blaszek należy przeciąć więzadła kłamkowe w celu rozluźnienia blaszek i wyrostka kolczastego. Na koniec przetnij blaszki obcinaczem do kości bocznym do rdzenia kręgowego i usuń je delikatnie, unikając ucisku samego rdzenia kręgowego.
   UWAGA: Najpopularniejsze poziomy to C5/6, C6/7 lub C7/T1. Śmiertelność okołooperacyjna wzrasta wraz z poziomem urazu. Krwawienie z zatoki żylnej przykręgosłupowej jest powszechne i można mu zaradzić poprzez ostrożne uciskanie gąbką.
8. Przed włożeniem klipsa w celu uszkodzenia pępowiny, zidentyfikuj wyłaniające się korzenie nerwowe, aby oszczędzić im przycinania (szczególnie na poziomie C5/6).
9. W celu zapewnienia płynnej indukcji klipsa należy poluzować oponę twardą brzuszną od grzbietowej strony trzonów kręgów za pomocą haczyka i przygotować korytarz dla klipsa.
10. Na koniec włóż otwarty klips i pozwól mu się zatrzasnąć (szybkie zamknięcie), aby uzyskać uraz spowodowany kontuzją. Siła zamykania klipsa i czas trwania zamknięcia klipsa określają intensywność urazu i stopień kompresji. Powszechnie stosowane są siły klipsa wynoszące od 15 do 35 g i czas przycinania wynoszący np. 1 minutę (rysunek 1).
11. Po zdjęciu klipsa należy ułożyć mięśnie w 2 warstwach i zamknąć ranę.
12. Przerwij znieczulenie i pozwól zwierzęciu obudzić się pod ciągłą obserwacją, aż odzyska wystarczającą świadomość do leżenia mostka. Na koniec umieść szczura w pojedynczej klatce i postępuj zgodnie z wytycznymi dotyczącymi leczenia pooperacyjnego.
13. Ponieważ zwierzęta zmagają się z ciężkością tego typu urazów, należy zwrócić szczególną uwagę na leczenie pooperacyjne:
    1. Podawać leki przeciwbólowe (buprenorfinę i meloksykam odpowiednio przez 3 dni i 5 dni oraz w zależności od objawów klinicznych).
    2. Podawać dodatkowy roztwór soli fizjologicznej podskórnie przez 3 dni (2 razy dziennie po 5-10 mililitrów (ml)).
    3. Antybiotyki należy dodawać do wody pitnej 2 dni przed zabiegiem i do 7 dni po zabiegu (np. moksyfloksacyna)
    4. Ściskaj pęcherz moczowy 2-3 razy dziennie, aż powrót do funkcji pęcherza będzie stale widoczny.
    5. Deficyty neurologiczne i stan fizjologiczny operowanych zwierząt należy obserwować co najmniej raz dziennie.

2. Wstrzykiwanie SAP i NPC (14 dni po kontuzji)

1. Wywołać znieczulenie zgodnie z opisem w ppkt 1.1 do 1.3, zamocować głowę szczura w ramie stereotaktycznej, usunąć szwy lub klipsy do ran i zdezynfekować ranę i obszar operacyjny jodonem powidonu i 70% alkoholem.
2. Ostrożnie wypreparuj mięśnie przykręgosłupowe, włóż retraktory, usuń mikroskopijnie tkankę bliznowatą z opony twardej i ponownie odsłonij miejsce zmiany.
3. Przygotuj SAPs w stężeniu 1% (w/v) do wykonania żelu macierzy zewnątrzkomórkowej. QL6 SAP mają fizjologicznie zgodne pH i nie muszą być buforowane przed wstrzyknięciem. Do wizualizacji SAP w rdzeniu kręgowym należy użyć fluorescencyjnej pochodnej QL6 (QL6-FITC).
4. Wstrzyknąć SAP (5 mikrolitrów (μl) do środka zmiany, rozprowadzane w 2 porcjach, każda 2,5 μl obustronna od linii środkowej. Użyj strzykawki Hamilton połączonej z ramką stereotaktyczną za pomocą kapilary z mikroszkła (średnica zewnętrzna (OD) 100 mikrometrów (μm)). Ostrożnie otwórz oponę twardą końcówką ostrej igły i włóż szklaną kapilarnę stereotaktycznie na 2 milimetry (mm) do uszkodzonego rdzenia kręgowego.
5. Po wstrzyknięciu 1/3 objętości należy usunąć igłę na głębokość 1,5 mm, a po upływie kolejnych 1/3 do 1 mm. Po wstrzyknięciu całej objętości, a przed wyjęciem strzykawki, należy odczekać 5 minut, aby ustabilizować tworzenie się żelu.
6. Aby wygenerować NPC, użyj dorosłych myszy DsRed (lub myszy YFP dodatnich, zielonych) i wyizoluj je i hoduj ze strefy przybrzusznej^4,18,21.
7. Oceń żywotność NPC za pomocą barwienia błękitem trypanowym wskazującym na obecność ~90% żywych komórek w zawiesinie komórki. Rozcieńczyć komórki w pożywce wzrostowej (50 x 103 żywe komórki/μl), a następnie użyć ich do przeszczepu komórek.
8. Wykonać cztery wstrzyknięcia dordzeniowe o objętości 2 μl (8 μl objętości całkowitej, zawierające 4 x 10⁵ NPC) obustronnie w odległości 2 mm od miejsca urazu. Po otwarciu opony twardej należy wprowadzić kapilarnę Hamilton micro glass 1,5 mm poniżej grzbietowej powierzchni rdzenia kręgowego i wstrzyknąć 2 μl zawiesiny komórkowej. Wybrać szybkość wstrzykiwania na poziomie około 0,5 μl /min (min).
9. Pod koniec każdego wstrzyknięcia, a przed usunięciem naczynia włosowatego ze włókniny włóknistej, należy odczekać co najmniej 1 minutę, pozwalając na rozciągnięcie tkanki w celu dostosowania się do nowej objętości komórki. (Rysunek 2)

3. Implantacja pomp podtwardówkowych do aplikacji czynnika wzrostu

1. W celu wzbogacenia płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) w czynniki wzrostu wspomagające przeżycie komórek, należy stosować pompy mikroosmotyczne rozcieńczające czynniki wzrostu podstożkowo przez 7-14 dni, o szybkości rozcieńczania 0,5 μl/h, średnicy cewnika 0,04 cm OD i objętości zbiornika 100 μl.
2. Wybierz preferowane czynniki wzrostu (np. czynnik wzrostu pochodzenia mózgowego (BDGF), naskórkowy czynnik wzrostu (EGF), czynnik wzrostu fibroblastów (FGF)), napełnij pompy 6-10 godzin przed implantacją i wyrównaj pompy w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C.
3. Bezpośrednio po wstrzyknięciu NPC należy przygotować wgłębienie podskórne w celu umieszczenia pompy. Preferowane lokalizacje to boczne boki okolicy piersiowo-brzusznej, co pozwala uniknąć dużego miejscowego dyskomfortu spowodowanego przez samą pompę.
4. Aby uzyskać najwyższe stężenie czynników wzrostu, upewnij się, że otwarta końcówka cewnika kończy się blisko miejsca zmiany. Dlatego należy wykonać skip-laminektomię sąsiedniego górnego lub dolnego poziomu. Na przykład, jeśli SCI znajduje się na C7/T1, wykonaj małą laminektomię C5.
5. Umieścić pompę w wgłębieniu podskórnym, skrócić cewnik do niezbędnej długości i zabezpieczyć go kilkoma szwami (6,0) na mięśniach przykręgosłupowych, unikając zwichnięć związanych z ruchem.
6. Po otwarciu opony twardej (np. w C5) ostrą końcówką igły, należy wprowadzić cewnik do przestrzeni podtwardówkowej i pozwolić mu przesuwać się w kierunku doogonowym bez żadnego oporu i bez uszkadzania pasma włóknistego. Pominięta blaszka np. C6 służy jako dodatkowy punkt mocowania i stabilizacji cewnika.
7. Upewnij się, że cewnik działa płynnie i nie składa się.
8. Zamknij mięśnie warstwami i skórę za pomocą szwów lub klipsów. (Rysunek 3)
9. Przerwij znieczulenie i pozwól zwierzęciu obudzić się pod ciągłą obserwacją, aż odzyska wystarczającą świadomość do leżenia mostka. Na koniec umieść je z powrotem w jednej klatce i postępuj zgodnie z wytycznymi dotyczącymi leczenia pooperacyjnego.
10. Zapewnij specjalne leczenie pooperacyjne, nawet jeśli zwierzęta mogły częściowo wyzdrowieć w tym momencie:
    1. Podawać leki przeciwbólowe (Buprenorthine i Meloksykam odpowiednio przez 3 dni i 5 dni, w zależności od objawów klinicznych).
    2. Antybiotyki należy podawać w butelkach z wodą na 2 dni przed zabiegiem do 7 dni po zabiegu (np. moksyfloksacyna).
    3. Kontynuuj ściskanie pęcherza moczowego, jeśli nadal jest to konieczne.
    4. Podaj dodatkowe płyny podskórne, jeśli szczury wydają się odwodnione.
    5. Obserwuj funkcje neurologiczne i stan fizjologiczny operowanych zwierząt co najmniej raz dziennie.
    6. Leczenie immunosupresyjne należy podawać odpowiednio 2 dni przed wstrzyknięciem NPC i do 7 dni po transplanacji (minocyklina) i do uśmiercenia (sandimmunologia).

4. Ocena tkanek

1. Uśmiercać zwierzęta pod koniec czasu obserwacji (np. 4 tygodnie po SCI) w głębokim znieczuleniu (5% izofluranu przez 2-3 minuty) i perfuzjować je przezsercowo za pomocą 50 ml zimnego (4 °C) soli fizjologicznej, a następnie 150 ml zimnego 4% paraformaldehydu w 0,1 M soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS).
2. Usuń rdzeń kręgowy i umieść go w 4% paraformaldehydzie w 0,1 M soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) na 24 godziny.
3. Umieść rdzeń kręgowy w 25% roztworze sacharozy w celu krioprotekcji przez 48 godzin.
4. Wykonaj kriosekcje wzdłużne o grubości <30 μm.
5. Do barwienia immunohistochemicznego wszystkich jąder komórkowych stanowiących tło należy użyć DAPI (1:1,000). DsRed dodatnie NPC są czerwone, QL-6 FITC pojawiają się na zielono, a zatem oba nie muszą być specjalnie barwione. (Rysunek 4).
6. W przypadku skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) pozwól próbkom zanurzyć się w aldehydzie glutarowym w temperaturze 4 °C przez 2 godziny, odwadniaj je powoli w krokach co 10% etanolu przez 5 minut i umieść je w syfonie CO₂ pod ciśnieniem na 1 godzinę. Pokryj rusztowania złotem za pomocą powlekarki do napylania. Rób zdjęcia za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego Hitachi S-3400N. (Rysunek 5)

Results

Podczas wykonywania wyżej opisanej procedury, otrzymasz rusztowanie SAP wypełniające jamę i oferujące poprawę środowiska hamującego, mniejsze straszenie tkanek i wzrost przeżywalności NPC. Rycina 4 przedstawia przekrój podłużny rdzenia kręgowego szczura uzyskany w miejscu urazu 6 tygodni po SCI i 4 tygodnie po wstrzyknięciu QL6 SAP i przeszczepie NPC. Peptydy QL6 udało się wstrzyknąć do pępowiny, zagregować w epicentrum i rozdyfundować rostro-doogonowo w półcieniu. Obrazowanie mikroskopem elektronowym po...

Discussion

Protokół ten został opracowany, aby umożliwić czytelnikowi wykonanie modelu urazu szyjki macicy u szczurów i zastosowanie skojarzonego podejścia do leczenia z SAP i NPC, co sprzyja lepszej rekonwalescencji po SCI szyjki macicy.

Szczególnie w porównaniu z innymi modelami urazów szyjki macicy, takimi jak model przecięcia (półkrwi) lub modele spadku masy ciała i wstrząsu mózgu, model stłuczenia/kompresji klipsa reprezentuje oba główne patofizjologiczne mechanizmy urazów – stłuczenie i ucisk – a z...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Klips tętniakowy	SharpTech
	Leica
	World Precision Instruments, Inc.
Przyrząd stereotaktyczny dla małych zwierząt	David Kopf Instruments
Hamilton	firma Hamilton Pompy
	podtwardówkowe
Instrument chirurgiczny	Narzędzia
do nauk ścisłychIsoflurane USP	Pharmaceutical Partners of Canada Inc.
0,9% Chlorek sodu do wstrzykiwań USP	Baxter
7,5% jodu powidonu	Purdue Pharma 70
% Alkohol izopropylowy USP	GreenField Ethanol Inc.
QL6 SAP	Covidien
0,4% Błękit trypanowy	Gibco
(PDGF)	Sigma
Naskórkowy czynnik wzrostu (EGF)	Sigma
(FGF)	Sigma