Obrazowanie na żywo interakcji między komórkami immunologicznymi i przednowotworowymi przy użyciu indukowalnego systemu ekspresji Gal4/UAS w skórze larw danio pręgowanego

Podsumowanie

Badanie najwcześniejszych zdarzeń progresji komórek przednowotworowych i interakcji wrodzonych komórek odpornościowych jest kluczowe dla zrozumienia i leczenia raka. W tym miejscu opisujemy metodę warunkowego wywoływania przemian komórek nabłonkowych i późniejszego obrazowania na żywo interakcji wrodzonych komórek odpornościowych z komórkami skóry wyrażającymi HRAS^G12V u larw danio pręgowanego.

Streszczenie

Tutaj opisujemy metodę warunkowego wywoływania transformacji komórek nabłonkowych za pomocą indukowanego^przez 4-hydroksytamoksyfen (4-OHT) systemu ekspresji KalTA4-ER^T2/UAS 1 u larw danio pręgowanego, a następnie obrazowanie na żywo interakcji wrodzonych komórek odpornościowych z komórkami skóry wyrażającymi^{HRAS G12V}. System KalTA4-ER^T2/UAS jest zarówno indukowalny, jak i odwracalny, co pozwala nam indukować transformację komórek z precyzyjną rozdzielczością czasowo-przestrzenną in vivo. Daje nam to wyjątkową okazję do zobrazowania na żywo, w jaki sposób poszczególne komórki przednowotworowe oddziałują z tkankami gospodarza zaraz po ich pojawieniu się, a następnie śledzenia ich progresji i regresji. Ostatnie badania na larwach danio pręgowanego wykazały troficzną funkcję odporności wrodzonej w najwcześniejszych stadiach nowotworzenia^2,3. Nasz indukowalny system pozwoliłby nam na obraz na żywo początku transformacji komórkowej i następującej po niej odpowiedzi gospodarza, co może prowadzić do ważnych informacji na temat mechanizmów leżących u podstaw regulacji onkogennych troficznych odpowiedzi zapalnych. Omawiamy również, w jaki sposób można dostosować nasz protokół, aby osiągnąć czasową i przestrzenną kontrolę ektopowej ekspresji genów w dowolnej tkance będącej przedmiotem zainteresowania.

Wprowadzenie

Przerost potomstwa komórek prenowotworowych w normalnym arkuszu nabłonka silnie zależy od interakcji z jego mikrośrodowiskiem. Interakcja z tkanką gospodarza będzie prawdopodobnie głównym wyznacznikiem tego, czy komórka przednowotworowa jest w stanie stworzyć niszę klonalną, aby dalej rozwijać się w pełnoobjawowego raka. Pomimo swojego znaczenia w rozwoju, ta początkowa faza progresji raka jest niedostępna w większości powszechnie stosowanych systemów modelowych, in vivo.

Danio rerio, danio pręgowany, jest dobrze znanym organizmem modelowym do badań obrazowych na żywo ze względu na jego przejrzystość w trakcie rozwoju, możliwość manipulacji genetycznych i dostępność leków rozpuszczalnych w wodzie. Ostatnie badania z wykorzystaniem modelu larwalnego danio pręgowanego, powodującego nadekspresję ludzkiego onkogenu HRAS^G12V w celu transformacji komórek nabłonkowych, wykazały, że sygnały pochodzące z komórek gospodarza, w szczególności_H2O2, prowadzą do rekrutacji wrodzonych komórek odpornościowych. Co ciekawe, wykazano, że zrekrutowane komórki odpornościowe, neutrofile i makrofagi, odgrywają troficzną rolę we wspieraniu proliferacji komórek przednowotworowych^2,3.

Aby zrozumieć wczesne zdarzenia inicjacji i progresji nowotworu, jak również wkład reakcji zapalnej, trzeba być w stanie zobrazować te zdarzenia od najwcześniejszego punktu czasowego. Dlatego konieczne jest kontrolowanie przemian komórkowych w sposób czasowy i specyficzny dla tkanki. Wykorzystujemy system Gal4 / UAS, który został z powodzeniem zaadaptowany z Drosophila⁴ do warunkowej ekspresji ludzkiego onkogenu HRAS^G12V pod kontrolą specyficznego dla skóry promotora keratyny 4 (krt4)⁵. Zmodyfikowana wersja aktywatora transkrypcyjnego Gal4, a mianowicie KalTA4⁶, umożliwia ekspresję HRAS^G12V pod kontrolą sekwencji aktywującej przed prądem (UAS). Aby warunkowo indukować ekspresję aktywatora transkrypcji, KalTA4 został połączony ze zmutowaną domeną wiążącą ligand ludzkiego receptora estrogenowego α (ER^T2)⁷, który wiąże specyficznie 4-hydroksytamoksyfen (4-OHT)¹. W przypadku braku 4-OHT ER^T2 jest wiązany w cytoplazmie przez białka szoku cieplnego. Po związaniu 4-OHT białka szoku cieplnego dysocjują, umożliwiając translokację jądrową KalTA4-ER^T2, a następnie aktywację interesującego genu kontrolowanego przez UAS⁸ (Figura 1C, b). Ponieważ ten system ekspresji zależy od obecności 4-OHT, kontrolowana przez KalTA4 ekspresja genu będącego przedmiotem zainteresowania jest odwracalna. W przeciwieństwie do układu Cre-ER^T2/Lox, który prowadzi do nieodwracalnego zdarzenia rekombinacji, indukcja aktywacji transkrypcyjnej przez KalTA4-ER^T2 jest odwracalna przez dodanie lub usunięcie 4-OHT.

Następujący protokół pozwala na warunkową transformację komórek skóry u larw danio pręgowanego i późniejsze monitorowanie interakcji z wrodzonymi komórkami odpornościowymi poprzez fluorescencyjną ekspresję białka. Podstawowe metodologie zastosowane w tym protokole są podobne do niektórych powszechnie stosowanych technik w społeczności danio pręgowanego^9–13.

Generowanie i kombinacyjne wykorzystanie linii transgenicznych wraz z mikroiniekcją konstruktów transgenicznych umożliwia przejściowe podejście do przekształcania tylko pojedynczych komórek w sposób mozaikowy. Przepuszczalność tlenu przez zarodkową i larwalną skórę danio pręgowanego zwiększa możliwość prowadzenia poklatkowych badań obrazowych na żywo za pomocą mikroskopii o wysokiej rozdzielczości z godzin do dni. Co więcej, jego dostępność dla leków rozpuszczalnych w wodzie umożliwi przyszłe badania mechanistyczne i monitorowanie zdarzeń biologicznych w komórkach in vivo, co może prowadzić do lepszego zrozumienia najwcześniejszych etapów rozwoju raka.

Ten protokół może być dostosowany do przeprowadzania warunkowej ekspresji genów w dowolnej tkance u larw danio pręgowanego, w sposób mozaikowy. Można również zoptymalizować ustawienie mikroskopu, aby na żywo obrazować głębsze tkanki inne niż skóra.

Protokół

Następujące procedury eksperymentalne zostały przeprowadzone w ścisłej zgodności z Ustawą o Zwierzętach (Procedurach Naukowych) z 1986 roku.

1. Przygotowanie plazmidowego DNA do mikroiniekcji

1. Oczyść plazmid pTol2-krt4:KalTA4-ER^T2; cmlc2: eGFP z komercyjnym zestawem do oczyszczania plazmidowego DNA zgodnie z instrukcjami producenta i rozcieńczyć DNA plazmidu do końcowego stężenia roztworu podstawowego 100 ng / μl.
2. Linearyzować transpozazę zawierającą plazmid pT3TS/Tol2¹⁴ przez trawienie restrykcyjne BamHI, zgodnie z protokołem producenta. Ten krok może zostać przedłużony z dnia na dzień. Wytrącić zlinearyzowane DNA przez ekstrakcję fenolem/chloroformem, zgodnie ze standardowym protokołem.
3. In vitro transkrybować mRNA transpozazy ze zlinearyzowanego plazmidu za pomocą komercyjnego zestawu do transkrypcji dla dużych ilości ograniczonego RNA zgodnie z instrukcjami producenta, rozcieńczyć i podwielokrotnić do końcowego stężenia roztworu podstawowego 100 ng / μl w wodzie wolnej od nukleaz. Zapewnić jakość oczyszczonego RNA za pomocą natywnej elektroforezy w żelu agarozowym 1-2% TAE (40 mM Tris, 20 mM kwasu octowego, 1 mM EDTA) w żelu agarozowym (80-120 V). Przechowywać RNA w temperaturze -80 °C.

2. Mikroiniekcja plazmidowego DNA w celu przejściowej ekspresji genów

1. Przygotować płytkę do wstrzykiwań z agarozą, aby przytrzymać zapłodnione komórki jajowe podczas wstrzykiwania. Wlej płyn 3% agarozy do szalki Petriego o średnicy 90 mm. Pozostaw agarozę do ostygnięcia do temperatury 40-50 °C i dodaj klinowatą formę do mikroiniekcji TU-1 na płynną agarozę. Po stwardnieniu w temperaturze pokojowej odstaw agarozę w temperaturze 4 °C na 30 minut przed wyjęciem formy. Formy do mikroiniekcji należy przechowywać w temperaturze 4 °C i użyć ponownie.
2. Przygotować porcję roztworu do wstrzykiwań. Wykonaj następujące czynności na lodzie. Odpipetować 1 μl plazmidowego DNA (końcowe stężenie 10 ng/μl), 2 μl mRNA transpozazy (końcowe stężenie 20 ng/μl), 2 μl 10 mg/μl izotiocyjanianu rodaminy-dekstranu, 2 μl 5x roztwór Danieau (290 mM NaCl, 3,5 mM KCl, 2 mM MgSO₄, 3 mM Ca(NO₃)₂, 25 mM HEPES, pH 7,6) do końcowej objętości 10 μl w wodzie wolnej od nukleaz.
3. Przygotować igły z kapilar ze szkła borokrzemianowego o średnicy 1 mm zawierających włókno wewnętrzne, pociągając kapilarnę w przeciwnych kierunkach za pomocą ściągacza do mikropipet. Użyj następującego programu: ciepło 530, ciągnięcie 200, prędkość 80 i czas 150.
4. Napełnić jedną igłę 2 μl roztworu do wstrzykiwań (przechowywanego na lodzie). Unikaj pęcherzyków, ostrożnie wyjmując końcówkę mikroładowarki, jednocześnie uwalniając roztwór do kapilary. Ostrożnie przełam końcówkę igły kleszczami.
5. Reguluj wielkość kropli za pomocą pneumatycznej pompy pico. Zmierzyć średnicę/objętość kropli (V = 4/3πr³) i dostosować wielkość kropli za pomocą mikrometru okularowego pod stereoskopem w dimetylopolisiloksan. Zalecamy 100 μm, co odpowiada 0,5 nl. Zapewnia to jednolite i powtarzalne stężenia na każdy wstrzyknięty zarodek. Miareczkować wstrzykiwane stężenie i dostosowywać do każdego konstruktu i preparatu plazmidowego.
6. Umieścić zygoty (Rysunek 1A) otrzymane ze skrzyżowania Tg(UAS:eGFP-HRAS^G12V)io006 ¹⁵ z Tg(lysC:dsRed2)nz50Tg ¹⁶ w formach płytki wtryskowej za pomocą pastety o pojemności 3 ml. W międzyczasie należy trzymać końcówkę wcześniej przygotowanej igły do wstrzykiwań w dimetylopolisiloksan, aby uniknąć wysychania i krzepnięcia roztworu.
7. Wstrzyknąć wcześniej zmierzoną kroplę (100 μm odpowiadającą 0,5 nl) pod stereoskopem przez kosmówkę do blastodysku¹⁷, przed pierwszym rozszczepieniem (ryc. 1A). Iniekcja do stadium jednokomórkowego zwiększa potencjał równomiernego rozmieszczenia plazmidowego DNA i RNA w rozwijającej się masie komórkowej oraz możliwość transmisji w linii zarodkowej. Warto zauważyć, że ekspresja konstruktów częściej ma tendencję do mozaiki.

3. Warunkowa transformacja komórek skóry przez 4-hydroksytamoksyfen (4-OHT)

1. Przenieść wstrzyknięte zarodki do 0,3 x roztworu Danieau i utrzymywać je w temperaturze 28,5 °C w inkubatorze. Usuń niezapłodnione jaja z naczynia na etapie^{kuli 17}. Jednocześnie wstrzykiwany izotiocyjanian rodaminy B może być stosowany jako kontrola iniekcji pod fluorescencyjnym stereoskopem.
2. Badania przesiewowe zarodków w temperaturze 24 hpf (godz. po zapłodnieniu) pod kątem ekspresji eGFP w sercu. Kontynuuj hodowlę zarodków danio pręgowanego z dodatnim wynikiem cpl do 72 hpf. Uważnie monitoruj jakość wody (0,3x Danieau).
3. Usuń kosmówkę tych zarodków, które się nie wykluły, za pomocą kleszczy w temperaturze 72 hpf. Ostrożnie szturchnij kosmówkę 1 kleszczem i rozsuń ją za pomocą drugiego. Wybierz zarodki do ekspresji lysC:dsRed2 za pomocą fluorescencyjnego stereoskopu.
4. Dodać 10 μl 10 mM zapasu (Z)-4-hydroksytamoksyfenu do 20 ml 0,3 x roztworu Danieau (końcowe stężenie 5 μM). Roztwór indukcyjny 4-OHT należy stosować do jednej standardowej szalki Petriego (90 mm) na partię 40-60 zarodków.
5. Przenieść zarodki na nową szalkę Petriego zawierającą 20 ml świeżo przygotowanego roztworu indukcyjnego. 4-OHT musi być przechowywany i przetwarzany w ciemności. Pierwsze oznaki odciągania pokarmu można wykryć 2 godziny po rozpoczęciu indukcji. Etap indukcji można przedłużyć z dnia na dzień, pamiętając, że początkowe interakcje między komórką gospodarza a komórką przednowotworową mogą wystąpić już kilka godzin po leczeniu.

4. Montowanie i obrazowanie na żywo larw danio pręgowanego

1. Przygotuj szalkę Petriego o średnicy 60 mm, wprowadzając otwór o średnicy 18-20 mm. Użyj smaru silikonowego o wysokiej próżni, aby przykryć i uszczelnić otwór na zewnętrznym dnie szalki Petriego szkłem nakrywkowym o średnicy 25 mm (Rysunek 1B).
2. Przygotować 1% agarozę o niskiej temperaturze topnienia (LMP). Przechowywać jedną probówkę 1,5 ml agarozy LMP w temperaturze 37 °C w bloku grzewczym.
3. Wstępny wybór Tg(krt4:KalTA4-ER^T2; Bezzałogowy statek powietrzny:eGFP-HRAS^G12V; larwy lisC: dsRed2) dla zielonych fluorescencyjnych komórek skóry i ekspresji wrodzonych komórek odpornościowych dsRed2 dodatnich, pod fluorescencyjnym stereoskopem. Znieczulić larwy przez dodanie 1 ml 0,4% tricainy¹⁸ do 20 ml roztworu indukcyjnego.
4. Przenieś wstępnie wybrane larwy z pastetą do płynnej agarozy LMP. Pozwól larwom zanurzyć się w agarozie LMP i przenieś je na szkło nakrywkowe (ryc. 1B). Zorientuj zarodki pod stereoskopem. Larwy należy umieścić bezpośrednio na szkle, aby zmniejszyć odległość roboczą (do 6 larw).
5. Przykryj agarozę LMP roztworem indukcji zawierającym trikainę po jej stwardnieniu (strzałka Rysunek 1B).
6. Zobrazuj osadzone larwy za pomocą mikroskopu konfokalnego z odwróconym fluorescencyjnym, skaningowym lub wirującym dyskiem. Użyj obiektywu 40X lub 63X, ponieważ obiektywy o dużej odległości roboczej umożliwiają ustawienie ostrości przez całe larwy.

Wyniki

Zygoty z krzyżówki Tg(UAS:eGFP-HRAS^G12V)io006 i Tg(lysC:dsRed2)nz50Tg zostały zebrane 10-15 minut po zapłodnieniu (Rysunek 1A) w celu uzyskania 1 zarodka w stadium komórkowym. Po wstrzyknięciu zarodki hodowano do 3 dpf, przed indukcją 4-OHT i montażem do obrazowania na żywo (ryc. 1B). 2-6 godzin po indukcji zamontowane zarodki umieszczono pod odwróconym mikroskopem fluorescencyjnym (ryc. 2A) lub odwróconym mikroskopem konfokalnym (ryc. 2B-C) i obrazowano przez 2-3 godziny w odstępach 1,5 minuty. Przednowotworowe powierzchowne komórki skóry można zidentyfikować na podstawie ich bardziej zaokrąglonej morfologii w porównaniu z normalnymi keratynocytami, a także zielonej emisji fluorescencyjnej zlokalizowanej w błonie eGFP-HRAS^G12V. Obszary obrazowania wybrano do kolokalizacji przednowotworowych komórek skóry i wrodzonych komórek odpornościowych (ryc. 2A). Ze względu na szybki proces migracji neutrofili, interwały poklatkowe zostały wybrane tak, aby wynosiły od 1 do 1,5 minuty z rozmiarami kroku stosu Z wynoszącymi 0,7-1,7 μm, aby uzyskać projekcje o maksymalnej intensywności (Rysunek 2, Wideo 1). Istnieje szeroki zakres zachowań, które można zaobserwować podczas obrazowania na żywo: neutrofile migrują obok i pod komórkami przednowotworowymi (Figura 2C, Wideo 1), tworzą bezpośrednie kontakty z komórkami (Figura 2B i C), usuwają resztki komórek przednowotworowych, które ulegają apoptozie (Wideo 1) lub aktywnie pochłaniają części komórek przednowotworowych (nie pokazano). Aby uchwycić pełne spektrum interakcji, wskazane jest śledzenie ich zachowań za pomocą poklatkowego obrazowania na żywo.

Rysunek 1: Schemat warunkowej transformacji komórek skóry u larw danio pręgowanego. (A) Obraz zygoty Tg(UAS:eGFP-HRAS^G12V; lysC:dsRed2) danio pręgowany po 10 minutach od zapłodnienia (mpf). Zapłodnione jajo otoczone jest kosmówką (grotem strzały). Miejscem wstrzyknięcia jest blastodysk (gwiazdka), utworzony przez strumienie cytoplazmatyczne z żółtka (strzałki), który określa zwierzęcy biegun zarodka. (B) Mocowanie larw danio pręgowanego. Szalka Petriego o średnicy 60 mm z otworem (grotem strzałki) o średnicy 18-20 mm, który jest uszczelniony szkłem nakrywkowym o średnicy 25 mm. Larwy danio pręgowanego są unieruchamiane i mocowane na szkle nakrywkowym za pomocą 1% agarozy LMP. 0,3x Roztwór Danieau (strzałka) zawierający 5 μM 4-OHT służy do pokrycia agarozy LMP. (C) Indukowane przez 4-OHT przemiany powierzchownych komórek skóry. (a) Schematyczny profil przekroju poprzecznego skóry larwalnej. Skóra embrionalna i larwalna składa się z dwóch warstw komórek nabłonka, powierzchownej warstwy komórkowej i warstwy podstawnej komórek keratynocytów, które są połączone z leżącą poniżej błoną podstawną (BM). (b) Przejściowy system ekspresji w celu wywołania klonu komórek przednowotworowych wśród powierzchownych komórek skóry. KalTA4-ER^T2 ulega ekspresji wyłącznie w najbardziej zewnętrznej warstwie skóry napędzanej przez promotor krt4 (żółty). Mozaikowa ekspresja KalTA4-ER^T2 aktywuje kontrolowaną przez UAS (niebieską) ekspresję eGFP-HRAS^G12V w komórkach powierzchownych, prowadząc do klonu komórek przednowotworowych (zielony). (D) Schemat systemu wyrażeń w stanach nieustalonych. a) kaseta Tol2 pTol2-krt4:KalTA4-ER^T2; cmlc2: wektor wyrażenia eGFP używany przejściowo. (b) Warunkowa indukcja ekspresji aktywatora transkrypcji. KalTA4 jest połączony ze zmutowaną domeną wiążącą ligand ludzkiego receptora estrogenowego α (ER^T2), który wiąże się specyficznie z 4-hydroksytamoksyfenem (4-OHT). W przypadku braku 4-OHT ER^T2 jest wiązany w cytoplazmie przez białka szoku cieplnego (Hsp90). Po związaniu 4-OHT Hsp90 dysocjuje, umożliwiając translokację jądrową KalTA4-ER^T2, a następnie aktywację kontrolowanej przez UAS ekspresji eGFP-HRAS^G12V. Podziałka skali A = 500 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję rysunku.

Rycina 2: Obrazowanie na żywo interakcji przednowotworowej i wrodzonej odporności. (A-C) Zdjęcia 4 dpf Tg(UAS:eGFP-HRAS^G12V; lysC:dsRed2) zarodek, któremu wstrzyknięto pTol2-krt4:KalTA4-ER^T2; cmlc2: eGFP i transpozaza mRNA na jednym etapie komórki. Zdjęcia wykonano po 6 godzinach indukcji 4-OHT. (A) Widok boczny obszaru płetwy ogonowej po 6 godzinach od zabiegu, pokazujący plamy komórek skóry wyrażających eGFP-HRAS^G12V (strzałka) i neutrofile lysC:dsRed2+ (grot strzałki). (B-C) Reprezentatywne zdjęcia wykonane z konfokalnego filmu poklatkowego, pokazujące interakcje neutrofili (czerwony) z komórkami skóry wykazującymi ekspresję eGFP-HRAS^G12V (zielony). (B) Komórka przednowotworowa tworzy krótkie przedłużenie filopodialne z kontaktującym się neutrofilem (grotem strzały). (C) Neutrofile (kolor czerwony) jest w bliskim kontakcie z klonem komórek skóry w stanie przednowotworowym (kolor zielony). Podziałka w A = 100 μm; B/C = 50 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję rysunku.

Wideo 1: Poklatkowe obrazowanie na żywo interakcji między prenowotworami a wrodzonymi komórkami odpornościowymi. Film poklatkowy 4 dpf Tg(UAS:eGFP-HRAS^G12V; lysC:dsRed2) zarodek, któremu wstrzyknięto pTol2-krt4:KalTA4-ER^T2; cmlc2: eGFP i transpozaza mRNA na jednym etapie komórki. Konfokalny film poklatkowy z 6-9 godzin po indukcji 4-OHT pokazujący interakcje neutrofili lysC:dsRed2+ (czerwony) z komórkami skóry eksprymującymi eGFP-HRAS^G12V (zielony). Neutrofile migrują obok i pod komórkami przednowotworowymi i usuwają resztki komórki przednowotworowej, która ulega apoptozie. Interwały poklatkowe wynoszące 1,5 minuty w ciągu 3 godzin z krokami stosu Z wynoszącymi 1,3 μm.

Dyskusja

Podczas embriogenezy i rozwoju larwalnego zarodkowa skóra danio pręgowanego składa się z dwóch warstw nabłonkowych, warstwy powierzchownej zwanej perydermą i warstwy keratynocytów podstawnych, które są przyczepione do leżącej poniżej błony podstawnej¹⁹ (ryc. 1C, a). Przedstawiony tutaj protokół opisuje prostą metodę warunkowego wywoływania transformacji komórek przednowotworowych w powierzchownej warstwie skóry larw danio pręgowanego i pozwala na późniejszą analizę interakcji z wrodzonymi komórkami odpornościowymi za pomocą obrazowania na żywo. Podstawowe metodologie w naszym protokole są zgodne z dobrze znanymi technikami danio pręgowanego ^9-13, a nasz protokół można łatwo dostosować i zmodyfikować.

Zastosowany tutaj promotor krt4 ⁵ napędza ekspresję KalTA4-ER^T2 specyficznie w najbardziej zewnętrznej warstwie skóry (Figura 1C, b). Jednak modułowa strategia klonowania MultiSite Gateway, używana do generowania konstrukcji krt4:KalTA4-ER^T2 (Rysunek 1D, a), zapewnia możliwość sklonowania dowolnego interesującego promotora przed KalTA4-ER^T2 w jednym kroku klonowania. Adaptacja przedstawionej tu metody jest zatem możliwa dla większości tkanek w okresie embriogenezy i stadiów larwalnych. Dostępność sekwencji promotorowych jest tym czynnikiem ograniczającym. Co więcej, prawie każdy gen będący przedmiotem zainteresowania sklonowany za UAS może ulegać warunkowej nadekspresji na różnych etapach rozwoju przy użyciu kontrolowanej przestrzennie i czasowo ekspresji KalTA4-ER^T2 . W związku z tym nasz protokół może być dostosowany do przeprowadzania warunkowej ekspresji genów w dowolnej tkance będącej przedmiotem zainteresowania larw danio pręgowanego, w sposób mozaikowy. Można również zoptymalizować ustawienie mikroskopu, aby na żywo obrazować głębsze tkanki, takie jak wątroba czy trzustka.

Opisaliśmy tutaj jedną aplikację wykorzystującą protokół, podobnie można nadekspresję innych modulatorów stanu zapalnego za pomocą tego protokołu do badania regulacji odpowiedzi zapalnych, ponieważ można łatwo obrazować na żywo zmiany behawioralne neutrofili i makrofagów po indukcji i zatrzymaniu ekspresji kandydującego modulatora stanu zapalnego. Co więcej, dostosowany protokół byłby również korzystny dla tych, którzy chcą śledzić ruchy komórek i zmiany zachowania podczas różnych etapów morfogenezy tkanek i tworzenia narządów, a wreszcie na żywo obrazować interakcję interakcji wrodzonych komórek odpornościowych z innymi specyficznymi liniami komórkowymi, które mogą być celem indukowalnego systemu ekspresji KalTA4-ER^T2 / UAS.

Użyliśmy wektora pDestTol2CG z danio pręgowanego Tol2kit^20–23 , który zawiera kasetę cmlc2: eGFP-pA (ryc. 1D, a), która umożliwia późniejszą selekcję zarodków przez zielone fluorescencyjne serca dodatnie jako marker selekcyjny²⁰ , który upraszcza proces badań przesiewowych F0. Stabilna insercja genu otoczonego transpozonem do genomu jest ułatwiona przez jednoczesne wstrzyknięcie plazmidowego DNA wraz z mRNA transpozy. Przygotowanie plazmidowego DNA i mRNA transpozazy do mikroiniekcji przebiega zgodnie ze standardowymi protokołami. Jednak udana integracja konstruktu z genomem zależy od transpozycji opartej na Tol2¹⁴. Podkreśla to szczególną uwagę, jaką należy zwrócić na pracę na lodzie w sterylnych warunkach, aby uniknąć zanieczyszczeń i degradacji przez RNazy i DNazy. Mikroiniekcja do zarodków w stadium jednokomórkowym jest solidną i dobrze ugruntowaną techniką badań nad zyskiem i utratą funkcji u danio pręgowanego^9,10. Chociaż dobrze wyszkolona osoba może z łatwością wstrzyknąć do żółtka ponad 1000 zarodków w ciągu 1 godziny, wstrzyknięcie do blastodysku (ryc. 1A, gwiazdka) wymaga większego doświadczenia i treningu. Kluczowe znaczenie podczas tej procedury ma obchodzenie się z igłą. Igła musi być bardzo cienka, aby wniknąć w komórkę bez uszkodzeń, a zatem musi być złamana tylko na samym końcu. Ważne jest, aby regularnie kontrolować i mierzyć wielkość kropli podczas wstrzyknięcia, aby zagwarantować równomierne wstrzyknięcie do każdego zarodka. Ostrożnie obchodzona igła może być używana do obracania zarodka. Jest to często potrzebne, aby znaleźć blastodysk i optymalny kąt penetracji.

Stężenie DNA i mRNA transpozazy używane do wstrzykiwań prawie na pewno wpływa na wydajność ekspresji. Wyższe dawki mogą prowadzić do zwiększenia odsetka komórek wykazujących ekspresję transgenu, ale przy wyższych stężeniach DNA (>50 ng/μl) i mRNA transpozazy (>100 ng/μl) pojawia się również potencjalne skutki toksyczne wśród wstrzykniętych zarodków. Opowiadamy się za użyciem mRNA transpozazy 10 ng/μl DNA i transpozazy 20 ng/μl do iniekcji, co odpowiada 50 pg plazmidowego DNA i 100 pg RNA na wstrzyknięty zarodek. 100% zarodków, którym wstrzyknięto te stężenia, rozwija się normalnie, a od 40 do 70% wykazuje ekspresję eGFP-HRAS^G12V po indukcji 4-OHT, w zależności od skuteczności wstrzyknięcia do pojedynczej komórki. Wśród zarodków dodatnich zwykle znajdujemy około 30%, które mają 1-10 klonów, 40% ma 10-50 klonów, a 30% ma więcej niż 50 klonów. Ze względu na nasze cele badawcze opowiadamy się za wykorzystaniem zarodków z mniejszą liczbą klonów wykazujących ekspresję eGFP-HRAS^G12V. Do naszych przejściowych eksperymentów wybieramy zarodki z 10-50 klonami. Do produkcji transgenicznych ryb założycielskich zalecamy wybieranie tylko zarodków z zarówno eGFP dodatnim markerem sercowym, jak i dużą liczbą dodatnich klonów eGFP-HRAS^G12V w ich naskórku.

(Z)-4-hydroksytamoksyfen ulega interkonwersji cis-trans (E-Z) pod wpływem światła²⁴. Stwierdzono, że izomer cis (E) jest 100 razy mniej antyestrogenny niż jego trans odpowiednik^25,26. Dlatego należy unikać ekspozycji na światło. Roztwór podstawowy 4-OHT rozpuszczony w etanolu może być przechowywany w temperaturze -20 °C w ciemności przez długi okres czasu. Zalecamy użycie pudełka do ochrony szalek Petriego przed światłem podczas indukcji docelowego genu w inkubatorze i transportu. Chociaż obszar obrazowania jest bardzo mały, a ekspozycja 4-OHT na światło UV jest zredukowana do minimum, zaleca się stałą wymianę roztworu indukcyjnego co 2 godziny podczas obrazowania przez dłuższy czas, aby utrzymać maksymalny poziom ekspresji. 4-OHT skutecznie przenika przez kosmówkę i najbardziej zewnętrzne warstwy skóry podczas embriogenezy danio pręgowanego, dzięki czemu może bardzo szybko indukować ekspresję genów. Emisję eGFP możemy łatwo zaobserwować po 2 godzinach od indukcji i doniesiono, że pierwsze oznaki ekspresji genu docelowego można zaobserwować po 1 godzinie, a plateau po 3 godzinach leczenia⁸. Różnice mogą wynikać z innego promotora zastosowanego w naszym badaniu. Ponieważ wcześniej informowano, że leczenie 4-OHT jest zależne od dawki^8,27, zdecydowaliśmy się użyć najwyższego zgłoszonego stężenia 5 μM, aby osiągnąć solidne i powtarzalne poziomy ekspresji w naszym przejściowym podejściu. Powinno to zagwarantować, że wszystkie komórki przenoszące transgen będą indukować ekspresję genu docelowego.

Należy wziąć pod uwagę, że przedstawione tutaj podejście przejściowe może prowadzić do różnych poziomów ekspresji ze względu na możliwość wielokrotnych i losowych zdarzeń insercji genomu. Co więcej, zastosowanie mRNA transpozazy w transgenicznym tle Tol2 Tg(UAS:eGFP-HRAS^G12V)io006 może prowadzić do potencjalnych transpozycji transgenu UAS, co może skutkować wyciszeniem lub zakłóceniem genu. Ponieważ jednak przedstawiona tutaj metoda jest podejściem przejściowym, wstępna selekcja zarodków po wstrzyknięciu jest obowiązkowa. Wiele laboratoriów odkryło, że sekwencje UAS mają tendencję do wyciszania u transgenicznego potomstwa, stąd wstrzykiwanie pTol2-krt4:KalTA4-ER^T2; cmlc2: konstrukt eGFP do zarodków Tg(UAS:eGFP-HRAS^G12V)io006 może nie być tak wydajny, jak wstrzyknięcie konstruktu UAS do Tg(krt4:KalTA4-ER^T2; cmlc2:GFP) zarodków. Zastosowanie stabilnej linii transgenicznej Tg(krt4:KalTA4-ER^T2) skrzyżowanej z Tg(UAS:eGFP-HRAS^G12V)io006 pozwoli na precyzyjne monitorowanie kinetyki włączania/wyłączania aktywacji genu 4-OHT zależnej od dawki w czasie.

Krytycznym etapem podczas montowania larw jest przeniesienie do agarozy LMP i na szkło nakrywkowe (ryc. 1B). Istnieje tylko krótki czas na temperaturę agarozy cieczy LMP, który pozwala na bezpieczne przenoszenie i orientację wstępnie wybranych larw bez szkody dla ryb przez szok cieplny lub stwardnienie żelu. Larwy należy ustawić bezpośrednio na szkle nakrywkowym, aby zmniejszyć odległość roboczą do późniejszej analizy mikroskopowej. Ponieważ może to być czynnikiem ograniczającym podczas mikroskopii, wybór odpowiednich obiektywów jest obowiązkowy. Po zamontowaniu larwa może być utrzymywana od kilku godzin do dni.

Przedstawiona w niniejszym artykule warunkowość systemu modelowego pozwala na wielokrotną transformację poprzez aktywację transgenu przez 4-OHT. System ekspresji zależy od obecności 4-OHT, a zatem kontrolowana przez KalTA4 ekspresja genu będącego przedmiotem zainteresowania jest odwracalna (Figura 1D, b). W przeciwieństwie do systemu Cre-ER^T2/Lox, który ułatwia nieodwracalną rekombinację genomową²⁸, KalTA4-ER^T2/UAS może być aktywowany i dezaktywowany po dodaniu lub usunięciu 4-OHT, a ten potencjał wielokrotnej indukcji stanowi przewagę tej techniki nad systemem Cre-ER^T2/Lox. Jednak wymóg stałego poziomu 4-OHT jest ograniczeniem, jeśli eksperyment musi zostać przedłużony z dni do tygodni.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
(Z)-4-Hydroxytamoxifen	Sigma Aldrich	H7904	rozcieńczyć w etanolu i przechowywać w ciemności w temperaturze -20  ° C
20X Obiektyw	Zeiss		20X/0.5 Ph2 ∞/0.17
40X Obiektyw	Zeiss		40X/1.2W Korr ∞/0.14-0.18
63X Obiektyw	Zeiss		63X/1.4 Oil Ph3 ∞/0.17
BamHI	New England Biolabs	R0136S
Mikroskop konfokalny	Zeiss		LSM 510 META
Cover szkło	VWR	631-0171	Średnica 25 mm
Dimetylopolisiloksan	Sigma Aldrich	DMPSV
Dow Corning wysokopróżniowy smar silikonowy	Sigma Aldrich	MKBL4135V
Flaming/Brown P-97 Ściągacz do mikropipet	Sutter Instruments Co.	P-97	: ciepło 530, ciąg 200, prędkość 80 i czas 150
Stereoskop fluorescencyjny	Kapilary ze		M205 FA
Kwik-Fill	World Precision Instruments	1B100F-4
Forma do mikroiniekcji TU-1	Adaptacyjne narzędzia naukowe	Końcówka do
	Eppendorf	930001007
Mikroskop	Zeiss		Axiovert 200
mMESSAGE Zestaw mMACHINE	Ambion	AM1348
Woda bez nukleaz	Invitrogen	AM9937
Pneumatyczna pompa piko	World Precision Instruments	PV820
Pompa pneumatyczna	pico Warner Instruments	PLI-90A
pTol2-krt4:KalTA4-ERT2; cmlc2: eGFP			Dr. Thomas Ramezani / Yi Feng Lab / Uniwersytet w Edynburgu
QIAprep Spin Miniprep Kit	Quiagen	27106
Izotiocyjanian rodaminy B-Dekstran	Sigma Aldrich	R8881	10 mg / μ l w wodzie
Stereoskop	Leica		M80
Tg(lysC:dsRed2)nz50Tg			BMC Developmental Biology 7, 42, doi:10.1186/1471-213X-7-42 (2007)
Tg(UAS:eGFP-HRASG12V)io006			PloS One 5 (12), e15170, doi:10.1371/journal.pone.0015170 (2010)
Trikaina/MS-222	Sigma Aldrich	A5040
UltraPure Agaroza	Invitrogen	16500-100
UltraPure Agaroza o niskiej temperaturze topnienia	Invitrogen	16520-050
UltraPure Phenol : Chloroform : Alkohol izoamylowy	Invitrogen	15593-031	25:24:1, v/v