Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Monitorowanie aktywności PAD4 w oparciu o fluorescencję za pomocą analogu substratu profluorescencyjnego

9.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52114

⸱

5 listopada 2014

 ,  , 
1Department of Chemistry, Lehigh University

W tym artykule

Podsumowanie

PAD4 to enzym odpowiedzialny za konwersję peptydylo-argininy do peptydylo-cytruliny. Rozregulowanie PAD4 jest związane z wieloma chorobami u ludzi. Opisano łatwy i wysokoprzepustowy, kompatybilny test PAD4 oparty na fluorescencji.

Streszczenie

Modyfikacje potranslacyjne mogą prowadzić do zmiany stanów funkcjonalnych białek poprzez zwiększenie kowalencyjnych zmian w łańcuchach bocznych wielu substratów białkowych. Ogony histonowe reprezentują jeden z najsilniej zmodyfikowanych odcinków we wszystkich ludzkich białkach. Wykazano, że deiminaza peptydylo-argininowa 4 (PAD4) przekształca reszty argininy w niekodowaną genetycznie resztę cytruliny. Niewiele opisanych do tej pory testów było operacyjnie łatwych z zadowalającą czułością. Tak więc brak odpowiednich testów prawdopodobnie przyczynił się do braku silnych niekowalencyjnych inhibitorów PAD4. W artykule opisano nowatorski test oparty na fluorescencji, który pozwala na monitorowanie aktywności PAD4. Zaprojektowano analog substratu profluorescencyjnego, aby powiązać aktywność enzymatyczną PAD4 z uwalnianiem fluorescencji po dodaniu proteazy trypsyny. Wykazano, że test jest kompatybilny z wysokoprzepustowymi warunkami przesiewowymi i ma silny stosunek sygnału do szumu. Ponadto test można również wykonać z surowymi lizatami komórkowymi zawierającymi nadmierną ekspresję PAD4.

Wprowadzenie

Duża liczba białek ssaków jest silnie modyfikowana przez działanie enzymów po biosyntezie białek przez rybosom. Te modyfikacje potranslacyjne (PTM) mogą znacznie zwiększyć funkcjonalną różnorodność proteomu poprzez zmianę rozmiaru, ładunku, struktury i stanu oligomeryzacji (między innymi) białek1-3. W rezultacie zmiana struktury białka może prowadzić do konsekwencji fizjologicznych, takich jak degradacja białka, różnicowanie komórkowe, sygnalizacja, modulacja ekspresji genów i interakcje białko-białko. Podczas gdy modyfikacje te są powszechne w dużym odsetku wszystkich ludzkich białek, końcowe końce białek histonowych podlegają niezwykle dużej liczbie modyfikacji kowalencyjnych4. Białka histonowe to rodzina białek strukturalnych, które ułatwiają kondensację genomowego DNA. Kowalencyjne modyfikacje nieustrukturyzowanych ogonów histonowych są przeprowadzane i regulowane przez szereg enzymów, które mogą katalizować kowalencyjną modyfikację reszt (pisarzy), odwracać te same modyfikacje (gumki) i rozróżniać zmiany drukowane na ogonach histonów (czytniki)5-7. W rzeczywistości większość znanych PTM można zaobserwować w tym krótkim segmencie histonu, w tym metylację, fosforylację, acetylację, sumoilację, ubikwitynację i cytrulinację8.

Cytrulinacja polega na przemianie peptydylo-argininy w peptydylo-cytrulinę kodowaną przez RNA(Rysunek 1A). Białka odpowiedzialne za neutralizację łańcucha bocznego należą do rodziny białek PAD (p eptide arginine deiminase), z których wszystkie są enzymami zależnymi od wapnia. 9,10. Do tej pory opisano pięciu członków rodziny PAD (PAD1, PAD2, PAD3, PAD4 i PAD6). Wydaje się, że każdy członek tej rodziny celuje w odrębne białka komórkowe, a także wykazuje unikalne profile dystrybucji tkanek. PAD4 jest jedynym członkiem tej rodziny białek, o którym wiadomo, że jest zlokalizowany w jądrze za pomocą sekwencji lokalizacji jądrowej11. W związku z tym wykazano, że iminuje szereg celów jądrowych, w tym łańcuchy boczne argininy na N-końcowych ogonach histonów H2A reszty argininy 3 (H2R3), H3 (H3R2, H3R17 i H3R26) i H4 (H4R3)12,13. Podczas gdy każdy z izoenzymów PAD ma specyficzne i krytyczne funkcje fizjologiczne, PAD4 zyskał znacznie więcej uwagi ze względu na jego rolę w wielu procesach zachodzących u ludzi zarówno w chorych, jak i zdrowych komórkach. Niedawno wykazano, że PAD4 jest członkiem sieci transkrypcyjnej pluripotencji14. Wykazano, że zarówno poziomy ekspresji, jak i aktywność PAD4 są podwyższone podczas przeprogramowania i stanów pluripotencjalnych w stanie podstawowym u myszy. Kontrolując regulację genów komórek macierzystych, PAD4 może zachować kluczową rolę w wydajności przeprogramowania komórkowego. PAD4 bierze również udział w tworzeniu zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili, które po związaniu patogenów umożliwiają ich usunięcie z systemu. Hipercytrulinacja białek histonowych przez PAD4 indukuje dekondensację chromatyny, która służy jako materiał bazowy do enkapsulacji bakterii chorobotwórczych przez pułapkę zewnątrzkomórkową, zapobiegając w ten sposób infekcjom bakteryjnym15,16.

Dodatkowo, stwierdzono, że PAD4 odgrywa aktywną rolę w wielu chorobach człowieka. Wcześniej wykazano, że nieprawidłowa ekspresja PAD4 jest związana z wystąpieniem i nasileniem reumatoidalnego zapalenia stawów, choroby Alzheimera, choroby Parkinsona i stwardnienia rozsianego17. W rzeczywistości obecność przeciwciał przeciwko cytrulinowanym białkom jest jednym z najbardziej wiarygodnych i ostatecznych biomarkerów diagnostycznych i prognostycznych. Podobnie, rozregulowaną aktywność PAD4 zaobserwowano ostatnio w wielu nowotworach u ludzi, w tym w raku jajnika, piersi, płuc i przełyku19-22. Wykazano, że związek między PAD4 a rakiem jest pośredniczony przez onkogen ELK1 lub przez białko supresorowe guza p5322,23, a wcześniejsze prace sugerowały, że PAD4 może być nowym przeciwnowotworowym celem terapeutycznym17,24,25. Jako badanie potwierdzające zasadę, wykazano, że wyczerpanie PAD4 poprzez shRNA w linii komórkowej raka jelita grubego HCT116 jest wystarczające do wywołania apoptozy i zatrzymania cyklu komórkowego26. Niedawno opracowany nieodwracalny inhibitor PAD4 doprowadził do siedemdziesięcioprocentowego zmniejszenia masy guza u myszy27. Co ciekawe, hamowanie PAD4 wydawało się działać jak terapia celowana, która skutkowała selektywnym zabijaniem komórek rakowych przy jednoczesnym oszczędzaniu komórek nieprzekształconych.

Użycie małych cząsteczek do wyłączenia funkcji PAD4 może okazać się potężną nową strategią do celowania w komórki rakowe lub do wzmocnienia istniejących chemioterapeutyków przeciwnowotworowych28. Niestety, silny odwracalny inhibitor PAD4 nie został jeszcze odkryty. Wiele inhibitorów kowalencyjnych zostało opracowanych przy użyciu uchwytu chloro/fluoroimidynowego, który naśladuje substrat argininy27,29,30 i okazał się praktycznym narzędziem w zrozumieniu roli PAD4 zarówno w zdrowych, jak i chorych komórkach. Jednak cząsteczki te hamują wszystkie aktywne PAD o podobnej sile. Dlatego kluczowe znaczenie ma łatwy test, który informuje o aktywności PAD4. Do tej pory opisano testy PAD4, które łączą uwalnianie amoniaku z reakcji z odczytem kolorymetrycznym31, wykorzystują fluorescencyjnie znakowany analog substratu chloroamidyny do testu polaryzacji fluorescencji32, opierają się na reakcji wspomaganej kwasem między glioksalem a cytruliną33 i łączą aktywność PAD4 z etapem wygaszania fluorescencji34. Spośród nich tylko strategia haloacetamidyny z modyfikatorem kowalencyjnym okazała się kompatybilna z wysokoprzepustowymi platformami przesiewowymi32,35,36. Opisujemy łatwy test oparty na fluorescencji, który wiarygodnie mierzy aktywność PAD4. Test, który wykazuje silny stosunek sygnału do szumu, szybkość analizy i solidność pomiaru, ma potencjał do odkrycia naprawdę silnego i selektywnego inhibitora PAD4.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Transformacja, ekspresja i oczyszczanie PAD4

  1. W przypadku transformacji PAD4 przekształć plazmid pGEX zawierający fuzję PAD4 GST w chemicznie kompetentne komórki E. Coli (BL21(DE3)) do ekspresji białka, stosując następującą procedurę. Przygotuj chemicznie kompetentne (chlorek wapnia) komórki E. Coli (BL21(DE3)) zgodnie ze standardowymi protokołami.
    1. Rozmrozić 50 μl wcześniej przygotowanych chemicznie kompetentnych komórek BL21(DE3) na lodzie i wymieszać z 1 μl plazmidu pGEX zawierającego gen PAD4 w probówce hodowlanej o pojemności 5 ml. Inkubuj mieszaninę na lodzie przez 10 minut, delikatnie wstrząsając co 2 minuty.
    2. Poddaj komórki szokowi termicznemu, umieszczając mieszaninę w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C na 40 sekund. Natychmiast umieść mieszaninę komórka-plazmid z powrotem na lodzie na 2 minuty, aby umożliwić komórkom regenerację. Dodaj 1 ml sterylnego bulionu LB do mieszaniny i umieść na lodzie na 1 min.
    3. Inkubować komórki poddane szokowi cieplnemu w temperaturze 37 °C, wytrząsając z prędkością 250 obr./min przez 1 godzinę. Pobrać pipetą 75 μl przekształconych komórek na płytkę agarową odporną na ampicylinę i inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 godzin. Przechowywać płytkę w temperaturze 4 °C.
  2. Wyrażenie PAD4.
    1. Pobrać 1 kolonię komórek BL21(DE3) z płytki agarowej ampicyliny i umieścić w 5 ml LB zawierającego 1x ampicylinę. Umieścić w inkubatorze i wstrząsnąć O/N w temperaturze 37 °C.
    2. Przenieść 5 ml LB (startera) do 1 l sterylnego LB zawierającego 1x trójwodzian ampicyliny (MW 403,45 g/mol). Umieść wzrost w inkubatorze z wytrząsaniem o temperaturze 37 °C. Monitoruj OD600 wzrostu. Gdy wzrost osiągnie OD600 równe 0,3, przenieś wzrost do inkubatora z wytrząsaniem o temperaturze 16 °C.
    3. Po osiągnięciu OD600 0,6 indukuj komórki 0,3 mM izopropylotioagalaktozydu (IPTG, MW 238,30 g/mol). Pozostawić komórki do wstrząsania przez 15 godzin w temperaturze 16 °C.
    4. Zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 4 000 x g przez 20 minut w temperaturze 0 °C. Odlać supernatant i przechowywać granulki w temperaturze -80 °C.
  3. Oczyszczanie PAD4
    1. Zawiesić osad zawierający wyrażony PAD4 w komórkach BL21(DE3) w buforze 50 mM NaCl (MW 58,44 g/mol), 300 mM NaH2PO4 (MW 119,98 g/mol), 10 mM Imidazol (MW 68,077 g/mol), 0,1 mM fluorku fenylometylosulfonylu (PMSF, MW 174,94 g/mol) i 1 mM ditiotreitolu (DTT, 154,25 g/mol), pH = 8,0.
    2. Lizować komórki za pomocą sonikacji przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Po sonikacji odwirować lizat komórkowy przy 20 000 x g przez 20 minut w temperaturze 0 °C. Odlać i zachować supernatant. Dozować supernatant z kulkami agarozy glutationu (GSH) przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Spuścić supernatant z kulek/kolumny GST za pomocą grawitacji. Przepłukać kulki 4 x 25 ml 1x PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami, pH = 8,0) w temperaturze pokojowej.
    4. Elute PAD4 z 2 x 10 ml buforem elucyjnym, 50 mM tris (hydroksymetylo)aminometan (zasada Tris, MW 121,14 g/mol), 10 mM glutation (GSH, MW 307,32 g/mol), pH = 8,0.
    5. Zagęścić PAD4 za pomocą odciętych probówek wirówkowych o mocy 100 tys. MW i odwirować przy 4 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Podwielokrotność białka rozprowadzić na 200 μl objętości w probówkach mikrowirówek o pojemności 1,0 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C.

2. Przygotowanie roztworów podstawowych dla

  1. Odważyć chlorek sodu (NaCl, MW 58,44 g/mol) i przygotować 2 M roztwór. Wymieszaj roztwór, aż będzie klarowny.
  2. Odważyć tris(hydroksymetylo)aminometan (zasada Tris, MW 121,14 g/mol) i przygotować 2 M roztwór o pH = 8,0. Wymieszaj roztwór, aż będzie klarowny.
  3. Odważyć dwuwodny chlorek wapnia (CaCl2 2H2O, MW 147,01 g/mol) i przygotować 500 mM roztwór. Wymieszaj roztwór, aż będzie klarowny.
  4. Odważyć tris(2-karboksyetylo)fosfinę (TCEP, MW 250,19 g/mol) i przygotować roztwór o stężeniu 200 mM. Wymieszać roztwór do uzyskania klarowności i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  5. Odważyć ditiotreitol (DTT, MW 154,25 g/mol) i przygotować 1 M roztwór. Wymieszać roztwór do uzyskania klarowności i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  6. Przygotować 0,5% roztwór Triton X-100.
  7. Odważyć kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA, MW 292,24 g/mol) i przygotować 100 mM roztwór. Wymieszaj roztwór, aż będzie klarowny.
  8. Odważyć chlorowodorek Z-Arg-Arg-7-amido-4-metylokoumaryny (ZRcoum, MW 621,69 g/mol) i przygotować 10 mM roztwór w dimetylosulfotlenku (DMSO).

3. Test PAD4 w temperaturze 37 °C

  1. Z 10 mM wywaru ZRcoum przygotuj 125 μM roztwór ZRcoum w wodzie. Ten roztwór 125 μM ZRcoum będzie roztworem A.
  2. Przygotuj bufor 62,5 mM NaCl, 62,5 mM Tris, 12,5 mM CaCl2, 6,25 mM DTT i 5 μM PAD4 (pH = 8,0). Będzie to rozwiązanie B.
  3. Przygotuj bufor 62,5 mM NaCl, 62,5 mM Tris, 12,5 mM CaCl2 i 6,25 mM DTT (pH = 8,0). Będzie to rozwiązanie C.
  4. Odważyć krystaliczną trypsynę (z trzustki bydlęcej) i przygotować 10 mg/ml w 100 mM EDTA. Wymieszać roztwór do uzyskania klarowności i przechowywać w temperaturze -20 °C. Będzie to rozwiązanie D.
  5. Zaopatrzyć się w płytkę 96-dołkową i wyznaczyć liczbę studzienek kontrolnych (bez PAD4) i studzienek testowych (+ PAD4).
  6. Odpipetować 160 μl roztworu B do studzienek testowych i pipetować 160 μl roztworu C do studzienek kontrolnych. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C.
  7. Pobrać pipetą 40 μl roztworu A do wszystkich studzienek i inkubować w temperaturze 37 °C przez 45 minut.
  8. Odpipetować 10 μl dH2O do połowy studzienek kontrolnych i połowy studzienek testowych. Do drugiej połowy studzienek kontrolnych i prób kontrolnych odpipetować 10 μl roztworu D. Inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C.
  9. Uzyskaj odczyt fluorescencji na czytniku multimodalnym o długości fali wzbudzenia 345 nm i długości fali emisji 465 nm.

4. Test PAD4 w RT

  1. Z 10 mM wywaru ZRcoum przygotować 50 μM roztwór ZRcoum w wodzie. Ten roztwór 50 μM ZRcoum będzie roztworem A.
  2. Przygotuj bufor 100 mM NaCl, 100 mM Tris, 20 mM CaCl2, 2 mM TCEP, 0,02% Triton X-100 i 8 μM PAD4 (pH = 8,0). Będzie to rozwiązanie B.
  3. Przygotuj bufor składający się ze 100 mM NaCl, 100 mM Tris, 20 mM CaCl2, 2 mM TCEP i 0,02% Triton X-100 (pH = 8,0). Będzie to rozwiązanie C.
  4. Odważyć krystaliczną trypsynę (z trzustki bydlęcej) i przygotować 10 mg/ml w 100 mM EDTA. Wymieszać roztwór do uzyskania klarowności i przechowywać w temperaturze -20 °C. Będzie to rozwiązanie D.
  5. Zaopatrzyć się w płytkę 384-dołkową i wyznaczyć studzienki kontrolne (bez PAD4) i studzienki testowe (+ PAD4).
  6. Odpipetować 25 μl roztworu B do studzienek testowych i pipetą 25 μl roztworu C do studzienek kontrolnych. Pozostawić bufor z/bez PAD4 do inkubacji w studzienkach przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
  7. Pobrać pipetą 25 μl roztworu C do wszystkich studzienek i inkubować przez 45 minut w temperaturze pokojowej.
  8. Odpipetować 10 μl dH2O do połowy studzienek kontrolnych i połowy studzienek testowych. Do drugiej połowy studzienek kontrolnych i prób kontrolnych odpipetować pipetą 10 μl roztworu D. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
  9. Uzyskaj odczyt fluorescencji na czytniku multimodalnym o długości fali wzbudzenia 345 nm i długości fali emisji 465 nm.

5. Testy kursu czasowego PAD4 w temperaturze 37 °C i RT

  1. Z 10 mM wywaru ZRcoum przygotuj 125 μM roztwór ZRcoum w wodzie. Ten roztwór 125 μM ZRcoum będzie roztworem A.
  2. Przygotuj bufor 62,5 mM NaCl, 62,5 mM Tris, 12,5 mM CaCl2, 6,25 mM DTT i 5 μM PAD4 (pH = 8,0). Będzie to rozwiązanie B.
  3. Odważyć krystaliczną trypsynę (z trzustki bydlęcej) i przygotować 10 mg/ml w 100 mM EDTA. Wymieszać roztwór do uzyskania klarowności i przechowywać w temperaturze -20 °C. Będzie to rozwiązanie C.
  4. Uzyskać 2 płytki 96-dołkowe i odpipetować 160 μl roztworu B do # liczby dołków (# dołków zależy od liczby punktów czasowych).
  5. Inkubować jedną 96-dołkową płytkę w temperaturze 37 °C. Drugą 96-dołkową płytkę inkubować w temperaturze pokojowej.
  6. Odpipetować 40 μl roztworu A do wszystkich studzienek na obu płytkach 96-dołkowych i natychmiast odpipetować 10 μl roztworu C do studzienek t = 0 min. Kontynuuj dodawanie 10 μl roztworu C w określonych punktach czasowych, aż wszystkie studzienki zostaną ugaszone.
  7. Uzyskaj odczyt fluorescencji na czytniku multimodalnym o długości fali wzbudzenia 345 nm i długości fali emisji 465 nm.

6. Test hamowania PAD4 w RT

  1. Z 10 mM wywaru ZRcoum przygotować 83 μM roztwór ZRcoum w wodzie. Ten roztwór 83 μM ZRcoum będzie roztworem A.
  2. Odważyć Cl-amidynę (MW 424,8 g/mol) i przygotować roztwór podstawowy o stężeniu 100 μM. Będzie to rozwiązanie B.
  3. Przygotuj bufor 100 mM NaCl, 100 mM Tris, 20 mM CaCl2, 2 mM TCEP, 0,02% Triton X-100 i 8 μM PAD4 (pH = 8,0). Będzie to rozwiązanie C.
  4. Przygotuj bufor składający się ze 100 mM NaCl, 100 mM Tris, 20 mM CaCl2, 2 mM TCEP i 0,02% Triton X-100 (pH = 8,0). Będzie to rozwiązanie D.
  5. Odważyć krystaliczną trypsynę (z trzustki bydlęcej) i przygotować 10 mg/ml w 100 mM EDTA. Wymieszać roztwór do uzyskania klarowności i przechowywać w temperaturze -20 °C. Będzie to Rozwiązanie E.
  6. Zaopatrzyć się w płytkę 384-dołkową i wyznaczyć studzienki kontrolne (bez PAD4), studzienki testowe (+ PAD4) i studzienki inhibicyjne (PAD4 + Cl-amidyna).
  7. Odpipetować 25 μl roztworu C do studzienek testowych i pipetą 25 μl roztworu D do studzienek kontrolnych. Pozostawić bufor z/bez PAD4 do inkubacji w studzienkach przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
  8. Pobrać pipetą 10 μl roztworu B do studzienek inhibicyjnych i inkubować przez 20 minut w temperaturze RTe.
  9. Odpipetować 15 μl roztworu A do wszystkich studzienek i inkubować przez 45 minut w temperaturze pokojowej.
  10. Odpipetować 10 μl roztworu E do wszystkich studzienek. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
  11. Uzyskaj odczyt fluorescencji na czytniku multimodalnym o długości fali wzbudzenia 345 nm i długości fali emisji 465 nm.

7. Surowy test lizatu komórkowego w RT

  1. Po pobraniu komórek z PAD4 1 L wzrostu, ponownie zawieś komórki w 10 ml 50 mM Tris, 50 mM NaCl, 0,1 mM fluorku fenylometylosulfonylu (PMSF, MW 174,94 g/mol) i 1 mM ditiotreitolu (DTT, 154,25 g/mol), pH = 8,0.
  2. Lizować komórki poprzez sonikację przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Odwirować lizat komórkowy przy 20 000 x g przez 20 minut w temperaturze 0 °C. Zagęścić klarowny supernatant do połowy objętości przez odwirowanie przy 4 000 obr./min w temperaturze 4 °C przy użyciu probówek wirówkowych o mocy 100 tys. MW.
  3. Z 10 mM wywaru ZRcoum przygotować 250 μM roztwór ZRcoum w wodzie. Ten roztwór 250 μM ZRcoum będzie roztworem A.
  4. Przygotować bufor 100 mM NaCl, 100 mM Tris, 20 mM CaCl2 i 2 mM TCEP (pH = 8,0). Będzie to rozwiązanie B.
  5. Odważyć krystaliczną trypsynę (z trzustki bydlęcej) i przygotować 10 mg/ml w 100 mM EDTA. Wymieszać roztwór do uzyskania klarowności i przechowywać w temperaturze -20 °C. Będzie to rozwiązanie C.
  6. Uzyskać czarną płytkę 384-dołkową i wyznaczyć studzienki kontrolne (bez lizatu komórkowego) i studzienki testowe (+ lizat komórkowy).
  7. Odpipetować 100 μl roztworu B do wszystkich studzienek i odpipetować 60 μl lizatu komórkowego do studzienek testowych. Inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
  8. Pobrać pipetą 40 μl roztworu A do wszystkich studzienek i inkubować przez 45 minut w temperaturze pokojowej.
  9. Odpipetować pipetą 10 μl roztworu C do wszystkich studzienek. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
  10. Uzyskaj odczyt fluorescencji na czytniku multimodalnym o długości fali wzbudzenia 345 nm i długości fali emisji 465 nm.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wstępnie wykazano, że ZRcoum może służyć do raportowania aktywności PAD4 w formacie płytek 96-dołkowych. Do dołków dodano substrat ZRcoum w obecności lub przy braku PAD4. Po 45-minutowej inkubacji w temperaturze 37 °C zmierzono fluorescencję przy użyciu filtra 340/40 – 475/15 nm (Rysunek 2A). Zgodnie z oczekiwaniami, poziomy fluorescencji pozostały niskie, ponieważ fluorofor w obrębie ZRcoum (lub cytrulinowanego ZRcoum) pozostał w stanie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym celu z powodzeniem opracowano test oparty na fluorescencji, który monitoruje aktywność PAD4. Test okazał się niezwykle wytrzymały w wielu warunkach wysokiej przepustowości i jest również kompatybilny z lizatami całokomórkowymi37.

Powinowactwo między białkami histonowymi a otaczającymi je niciami DNA rozluźnia się w wyniku neutralizacji ładunku dodatniego w łańcuchu bocznym argininy podczas cytrulinacji. Przewidywano, że neutralizacja łańcucha bocznego argininy może być podobni...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Lehigh University Start-up Package. Dziękujemy dr Walterowi Fastowi za dostarczenie plazmidu GST-PAD4 do ekspresji białek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
LB Broth, Miller (LURIA-BERTANI)AmrescoJ106-2KGa href="http://www.amresco-inc.com/">http://www.amresco-inc.com
Ampicylina trójwodzian (białawy proszek), Fisher BioReagentsFisher ScientificBP902-25 http://www.fishersci.com
Izopropylotioagalakton (IPTG)Life Technogolies15529-019http://www.lifetechnologies.com
Wszystkie sole buforowe Fisher ScientificMożna kupić od Fisher Scieintifc; Firma VWR; Akros; Sigma-Aldrich; itd.
Protino Glutation (GSH) agaroza Machery-Nagel745500.10Sklep pod adresem 4 ° C; http://www.mn-net.com/
Chloroamidyna Chemikalia na Kajmanach 10599Przechowywać przy -20 ° C; https://www.caymanchem.com/app/template/Home.vm
Triton X-100Sigma AldrichX100-100MLa href="http://www.sigmaaldrich.com/">www.sigmaaldrich.com
Płytki MicroWell Corning/Nunclon (96 i 384)Zakup od Corning; Oprogramowanie
czytnika mikropłytek Sigma-Aldrich Tecan Infinite 200 / Tecan i-controlwww.tecan.com
Europium Ex. 340/40 Em. 475/15 filterhttp://www.perkinelmer.com
<<

Bibliografia

  1. Jensen, O. N. Interpreting the protein language using proteomics. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 391-403 (2006).
  2. Sims, R. J. 3rd, Reinberg, D. Is there a code embedded in proteins that is based on post-translational modifications. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 815-820 (2008).
  3. Pandey, A., Mann, M. Proteomics to study genes and genomes. Nature. 405, 837-846 (2000).
  4. Berger, S. L. The complex language of chromatin regulation during transcription. Nature. 447, 407-412 (2007).
  5. Fischle, W., Wang, Y., Allis, C. D. Binary switches and modification cassettes in histone biology and beyond. Nature. 425, 475-479 (2003).
  6. Taverna, S. D., Li, H., Ruthenburg, A. J., Allis, C. D., Patel, D. J. How chromatin-binding modules interpret histone modifications: lessons from professional pocket pickers. Nat. Struct. Mol. Biol. 14, 1025-1040 (2007).
  7. Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M., Pawson, T. Reading protein modifications with interaction domains. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 473-483 (2006).
  8. Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403, 41-45 (2000).
  9. Vossenaar, E. R., Zendman, A. J., van Venrooij, W. J., Pruijn, G. J. PAD, a growing family of citrullinating enzymes: genes, features and involvement in disease. Bioessays. 25, 1106-1118 (2003).
  10. Gyorgy, B., Toth, E., Tarcsa, E., Falus, A., Buzas, E. I. Citrullination: a posttranslational modification in health and disease. Int. J. Biochem. Cell Biol. 38, 1662-1677 (2006).
  11. Nakashima, K., Hagiwara, T., Yamada, M. Nuclear localization of peptidylarginine deiminase V and histone deimination in granulocytes. J. Biol. Chem. 277, 49562-49568 (2002).
  12. Hagiwara, T., Hidaka, Y., Yamada, M. Deimination of histone H2A and H4 at arginine 3 in HL-60 granulocytes. Biochemistry. 44, 5827-5834 (2005).
  13. Kearney, P. L., et al. Kinetic characterization of protein arginine deiminase 4: a transcriptional corepressor implicated in the onset and progression of rheumatoid arthritis. Biochemistry. 44, 10570-10582 (2005).
  14. Christophorou, M. A., et al. Citrullination regulates pluripotency and histone H1 binding to chromatin. Nature. 507 (7490), 104-108 (2014).
  15. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 (2004).
  16. Li, P., et al. PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps. J. Exp. Med. 207, 1853-1862 (2010).
  17. Wang, Y., et al. Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation. J. Cell. Biol. 184, 205-213 (2009).
  18. Wang, S., Wang, Y. Peptidylarginine deiminases in citrullination, gene regulation, health and pathogenesis. Biochim. Biophys. Acta. 1829, 1126-1135 (2013).
  19. Trouw, L. A., Mahler, M. Closing the serological gap: promising novel biomarkers for the early diagnosis of rheumatoid arthritis. Autoimmun. Rev. 12, 318-322 (2012).
  20. Chang, X., Fang, K. PADI4 and tumourigenesis. Cancer Cell Int. 10, 7(2010).
  21. Wang, L., Chang, X., Yuan, G., Zhao, Y., Wang, P. Expression of peptidylarginine deiminase type 4 in ovarian tumors. Int. J. Biol. Sci. 6, 454-464 (2010).
  22. Chang, X., et al. Investigating the pathogenic role of PADI4 in oesophageal cancer. Int. J. Biol. Sci. 7, 769-781 (2011).
  23. Zhang, X., et al. Genome-wide analysis reveals PADI4 cooperates with Elk-1 to activate c-Fos expression in breast cancer cells. PLoS Genet. 7, (2011).
  24. Tanikawa, C., et al. Regulation of histone modification and chromatin structure by the p53-PADI4 pathway. Nat. Commun. 3, 676(2012).
  25. Cui, X., et al. The induction of microRNA-16 in colon cancer cells by protein arginine deiminase inhibition causes a p53-dependent cell cycle arrest. PLos One. 8, (2013).
  26. Jones, J. E., Causey, C. P., Knuckley, B., Slack-Noyes, J. L., Thompson, P. R. Protein arginine deiminase 4 (PAD4): Current understanding and future therapeutic potential. Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 12, 616-627 (2009).
  27. Li, P., et al. Regulation of p53 target gene expression by peptidylarginine deiminase 4. Mol. Cell Biol. 28, 4745-4758 (2008).
  28. Wang, Y., et al. Anticancer peptidylarginine deiminase (PAD) inhibitors regulate the autophagy flux and the mammalian target of rapamycin complex 1 activity. J. Biol. Chem. 287, 25941-25953 (2012).
  29. Slack, J. L., Causey, C. P., Thompson, P. R. Protein arginine deiminase 4: a target for an epigenetic cancer therapy. Cell. Mol. Life Sci. 68, 709-720 (2011).
  30. Luo, Y., Knuckley, B., Lee, Y. H., Stallcup, M. R., Thompson, P. R. A fluoroacetamidine-based inactivator of protein arginine deiminase 4: design, synthesis, and in vitro and in vivo evaluation. J. Am. Chem. Soc. 128, 1092-1093 (2006).
  31. Knuckley, B., et al. Substrate specificity and kinetic studies of PADs. Biochemistry. 1, 4852-4863 (2010).
  32. Knipp, M., Vasak, M. A colorimetric 96-well microtiter plate assay for the determination of enzymatically formed citrulline. Anal. Biochem. 286, 257-264 (2000).
  33. Knuckley, B., et al. A fluopol-ABPP HTS assay to identify PAD inhibitors. Chem. Commun. 46, 7175-7177 (2010).
  34. Bicker, K. L., Subramanian, V., Chumanevich, A. A., Hofseth, L. J., Thompson, P. R. Seeing citrulline: development of a phenylglyoxal-based probe to visualize protein citrullination. J. Am. Chem. Soc. 134, 17015-17018 (2012).
  35. Wang, Q., Priestman, M. A., Lawrence, D. S. Monitoring of protein arginine deiminase activity by using fluorescence quenching: multicolor visualization of citrullination. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 52, 2323-2325 (2013).
  36. Jones, J. E., et al. Synthesis and screening of a haloacetamidine containing library to identify PAD4 selective inhibitors. ACS Chem. Biol. 7, 160-165 (2012).
  37. Dreyton, C. J., et al. Optimization and characterization of a pan protein arginine deiminase (PAD) inhibitor. , (2010).
  38. Shimoyama, S., et al. Deimination stabilizes histone H2A/H2B dimers as revealed by electrospray ionization mass spectrometry. J. Mass Spectrom. 45, 900-908 (2010).
  39. Luo, Y., et al. Inhibitors and inactivators of protein arginine deiminase 4: functional and structural characterization. Biochemistry. 45, 11727-11736 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

test oparty na fluorescencjisubstrat profluorescencyjnyaktywacja trypsynąekspresja białekoczyszczanie GSTprzesiewanie wysokoprzepustowepomiar fluorescencjiinhibicja enzymatycznasurowy lizat
Monitorowanie aktywności PAD4 w oparciu o fluorescencję za pomocą analogu substratu profluorescencyjnego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.