Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wyprowadzanie limfocytów T in vitro z embrionalnych komórek macierzystych myszy

10.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52119

⸱

14 października 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Hunter College and Graduate Center, City University of New York, 2Sunnybrook Research Institute, Department of Immunology, University of Toronto

W tym artykule

Podsumowanie

Mysie embrionalne komórki macierzyste mogą być różnicowane do limfocytów T in vitro za pomocą systemu kohodowli OP9-DL1. Powodzenie tej procedury wymaga zwrócenia szczególnej uwagi na konserwację odczynnika/ogniwa oraz kluczowych kroków wrażliwych na technikę. W tym miejscu omawiamy te krytyczne parametry i przedstawiamy szczegółowy protokół, aby zachęcić do przyjęcia tej technologii.

Streszczenie

System kohodowli OP9/OP9-DL1 stał się dobrze znaną metodą wyprowadzania zróżnicowanych typów komórek krwi od embrionalnych i hematopoetycznych prekursorów zarówno pochodzenia mysiego, jak i ludzkiego. Jest ona obecnie wykorzystywana do rozwiązywania coraz większej liczby złożonych problemów genetycznych, komórkowych i molekularnych związanych z hematopoezą i znajduje się w czołówce wysiłków mających na celu przełożenie tych podstawowych odkryć na zastosowania terapeutyczne. Procedury są proste i rutynowo dają solidne wyniki. Jednak osiągnięcie skutecznego różnicowania układu krwiotwórczego in vitro wymaga zwrócenia szczególnej uwagi na szczegóły utrzymania odczynników i hodowli komórkowych. Co więcej, protokół zawiera kroki wrażliwe na technikę, które, choć nie są trudne, wymagają staranności i praktyki, aby je opanować. W tym miejscu skupimy się na procedurach różnicowania limfocytów T z embrionalnych komórek macierzystych myszy (mESC). Zapewniamy szczegółowy protokół z omówieniem krytycznych etapów i parametrów, które umożliwiają powtarzalne różnicowanie komórkowe in vitro. W interesie tej dziedziny leży rozważenie szerszego zastosowania tej technologii, ponieważ może ona przyczynić się do zmniejszenia wykorzystania zwierząt, obniżenia kosztów i skrócenia czasu przeprowadzania eksperymentów zarówno podstawowych, jak i translacyjnych.

Wprowadzenie

Ustanowiono system hodowli komórek, w którym embrionalne komórki macierzyste myszy (mESC) są różnicowane do limfocytów T in vitro.1 System ten wykorzystuje zdolność sygnalizacji Notch do sterowania różnicowaniem limfocytów T. 2 Linia komórkowa OP9-DL1 została utworzona przez transdukcję komórek OP9 pochodzących ze szpiku kostnego3 za pomocą liganda Notch, podobnego do Delta-like 1 (DL1). 4 Aktywacja kaskady sygnalizacyjnej Notch in vitro ułatwia rozwój limfocytów T z wyłączeniem innych linii komórkowych. Dzięki włączeniu odpowiednich cytokin, system ten zapewnia "mikrośrodowisko" hodowli komórkowej, które wspiera sekwencyjny postęp mESC w kierunku linii komórek krwiotwórczych i ostatecznie limfocytów T. System ten wspomaga identyfikację limfocytów T metodą cytometrii przepływowej na różnych etapach rozwoju obserwowanych podczas prawidłowej ontogenezy limfocytów T w grasicy. W celu zbadania wybranych zagadnień związanych z rozwojem limfocytów T, procedura ta stała się atrakcyjną alternatywą dla metod hodowli całych mysich modeli in vivo 5 i in vitro hodowli płodowych narządów grasicy stosowanych do wywoływania rozwoju limfocytów T z prekursorów hematopoetycznych pochodzących z embrionalnych komórek macierzystych myszy. 6 Główną zaletą systemu kohodowli OP9 jest to, że wykorzystuje on standardowe i proste techniki hodowli komórkowej i nie jest zależny od ciągłego wykorzystywania zwierząt doświadczalnych.

W naszych eksperymentach stosujemy szczegółowy, wcześniej opublikowany protokół, stosując to podejście. 7 Wykorzystaliśmy tę technologię do zbadania produktów różnicowania układu krwiotwórczego niezmanipulowanych klonów mESC, wysokiej jakości klonów mESC ręcznie wybranych do stworzenia chimerycznych zarodków8 oraz stabilnie transfekowanych klonów ESC pochodzących bezpośrednio z selekcji leków. 9 Zauważyliśmy, że kinetyka czasowa początkowego różnicowania in vitro od mESC do kolonii podobnych do mezodermy w tym modelu może być zmienna między poszczególnymi klonami. Współkultury mESC-OP9 można wizualnie ocenić pod kątem progresji do mezodermy. Podczas gdy zwykle zostanie to zakończone do piątego dnia wspólnej hodowli, wśród pojedynczych klonów zakończenie może być opóźnione o jeden lub dwa dni. Ilościowe (~ 80-90%) tworzenie mezodermy musi być osiągnięte przed transferem, aby uzyskać optymalne tworzenie hematopoetycznych komórek progenitorowych (HPC) i solidną limfopoezę. Tak więc, podczas pracy z wieloma klonami mESC, to przejście "dnia 5" najlepiej opóźnić do momentu, gdy wszystkie klony zakończą przejście do kolonii podobnych do mezodermy. Umożliwia to synchronizację późniejszego rozwoju wśród klonów po ich przeniesieniu do warunków różnicowania krwiotwórczego. Trzy dni po przejściu 80-90% formacji mezodermalnych, HPC są zbierane z monowarstw OP9. HPC można wysiewać na nowych komórkach OP9, aby umożliwić różnicowanie linii komórek monocytowych, erytroidalnych i B. Alternatywnie, HPC mogą być wysiewane na komórkach OP9-DL1 i kierowane w kierunku rozwoju limfocytów T. Wszystkie hodowle różnicujące in vitro otrzymują Flt-3L począwszy od 5 dnia, z dalszym dodawaniem IL-7 począwszy od 8 dnia. Analizy cytometrii przepływowej wykonywane w różnych punktach czasowych eksperymentu umożliwiają monitorowanie postępów w poszczególnych etapach i liniach różnicowania układu krwiotwórczego i rozwoju limfocytów T. Podwójnie dodatnie (DP) limfocyty T CD4 / CD8 zaczynają pojawiać się w 16 dniu kohodowli, a zarówno pojedyncze dodatnie (SP) komórki DP, jak i CD8 są obfite w 20 dniu. Ogólny wynik i solidność kokultury zależy w dużym stopniu od zdolności do wizualnego upewnienia się, że nastąpiły znaczące punkty zwrotne w rozwoju, które mają miejsce. Protokół ten ma być przewodnikiem do rozpoznawania tych kamieni milowych, a także innych krytycznych parametrów, które są kluczem do skutecznego różnicowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie pożywek hodowlanych, cytokin i żelowatych płytek

  1. Przygotuj pożywkę komórkową ES przy użyciu modyfikacji pożywki Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco z pirogronianem glukozy i sodu. Dodać 20% kwalifikowanej przez ESC płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1% penicyliny/streptomycyny, 1% L-glutaminy, 1% buforu HEPES, 1% aminokwasów endogennych, 0,1% gentamycyny (50 mg/ml) i 0,1% (55 μM) β-merkaptoetanolu. Sterylizuj media komórkowe ES przez filtrację.
  2. Przygotuj pożywkę OP9, przygotowując 1 l Alpha Minimum Essential Medium (α-MEM) z proszku zgodnie z instrukcjami producenta. Dodać 20% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% penicyliny/streptomycyny. Odwróć, aby wymieszać. Sterylizować przez filtrację do dwóch 500 ml podwielokrotności.
    UWAGA: Stosowanie pożywek wykonanych z proszku jest zalecane i prawdopodobnie przyniesie lepsze wyniki utrzymania komórek OP9 i różnicowania in vitro. Takie podejście stało się naszą standardową procedurą. Zauważamy jednak również, że czasami używaliśmy gotowego płynnego α-MEM z odpowiednim powodzeniem.
  3. Przygotuj pożywkę do zamrażania, dodając 10% sulfotlenku dimetylu (DMSO) do 90% FBS. Delikatnie zamieszaj i sterylizuj przez filtrację. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  4. Przygotować 2 000 x ligand Flt-3 (10 μg/ml) rozpuszczając ludzki rekombinowany ligand Flt-3 (Flt-3L) w kompletnych pożywkach OP9 do 10 μg/ml. Podwielokrotność przelać do 1,5 ml probówek mikrowirówkowych i przechowywać w temperaturze -80 °C. Postępować zgodnie z zaleceniami dostawcy dotyczącymi stabilności i przechowywania.
    UWAGA: Stabilność Flt-3L jest krótka (1 miesiąc w temperaturze 4 °C lub 3 miesiące w temperaturze -80 °C).
  5. Przygotuj 1,000x IL-7 (1 μg/ml) używając kompletnych pożywek OP9. Porcjować do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C. Postępować zgodnie z zaleceniami dostawcy dotyczącymi stabilności i przechowywania (IL-7 jest stabilna do 12 miesięcy w temperaturze -80 °C).
  6. Przygotować 1,000x czynnik hamujący białaczkę (LIF) (10 μg / ml) przez rozcieńczenie 1:10 10 7 jednostek LIF w pożywce komórkowej ES. Przechowywać podwielokrotność porcji w temperaturze 4 °C. Należy zwrócić uwagę na datę ważności podaną przez producenta na fiolkach z podwielokrotnościami.
    UWAGA: Produkt jest stabilny w postaci skoncentrowanej lub rozcieńczonej przez co najmniej 18 miesięcy od daty produkcji.
  7. Przygotować zżelatynizowane płytki 6-dołkowe, dodając 1,5 ml 0,1% roztworu żelatyny do każdego dołka płytki 6-dołkowej. Pozostaw naczynia w sterylnym kapturze w temperaturze pokojowej z założonymi pokrywkami, pozostawiając co najmniej 30 minut na pokrycie. Naczynia można również pozostawić na noc w nawilżonym inkubatorze. Usuń resztki roztworu żelatyny tuż przed wysiewem komórek. Nie pozwól, aby roztwór żelatyny całkowicie wyschł w studzience.

2. Przygotowanie i utrzymanie komórek zasilających i embrionalnych komórek macierzystych myszy (mESC)

UWAGA: Inkubuj wszystkie komórki w nawilżanym inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2.

  1. Rozmrażające fibroblasty embrionalne myszy (MEF)
    1. Szybko rozmrozić zamrożoną fiolkę (~5 x 106 komórek/fiolkę) MEF traktowanych mitomycyną C (lub w inny sposób zatrzymanych mitotetycznie) i przenieść je do probówki o pojemności 15 ml.
    2. Dodać 8 ml pożywki z komórek ES do rozmrożonych komórek, kroplami, aby stopniowo rozcieńczać DMSO od pożywki zamrażającej.
    3. Odwirować komórki w temperaturze 400 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 3 ml pożywki z komórek ES.
    4. Przygotować probówkę wirówkową o pojemności 50 ml z 33 ml wstępnie podgrzanej pożywki z komórek ES. Dodać 3 ml ponownie zawieszonych MEF, aby doprowadzić końcową objętość do 36 ml.
    5. Rozprowadzić 3 ml ponownie zawieszonych MEF do każdej studzienki dwóch żelatynizowanych płytek 6-dołkowych. Umieść płytki w inkubatorze na co najmniej sześć godzin, aby umożliwić komórkom przyczepienie się i rozłożenie przed wysiewem na nie mESC. Te mitotycznie zatrzymane warstwy zasilające mogą być używane przez kilka dni po początkowym wysiewie, jeśli ich podłoża są zmieniane co 2-3 dni.
      UWAGA: Można również użyć świeżo aresztowanych MEF-ów.
  2. Wysiew mESC
    1. Szybko rozmrozić fiolkę z zamrożonym klonem mESC w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i przygotować komórki zgodnie z opisem w 2.1.1-2.1.3.
      UWAGA: Zamrażamy 2 fiolki mESC z konfluentnej studzienki na 6-dołkowej płytce.
    2. Usunąć pożywkę z jednego dołka (na klon mESC) płytki 6-dołkowej z zatrzymanymi monowarstwami MEF (przygotowanymi w kroku 2.1.5) i umieścić 3 ml mESC na wierzchu monowarstwy MEF. Dodać 3 μl 1 000x LIF (10 ng/ml). Włóż naczynia do inkubatora.
  3. Utrzymanie komórek ES i pasaż za pośrednictwem trypsyny
    UWAGA: Zmieniaj nośnik codziennie lub dziel na podstawie zbiegu mESC. Optymalnie zbieraj i dziel/ponownie plateruj komórki co drugi dzień.
    1. Usunąć pożywkę z komórek ES i przemyć mESC 2 ml PBS. Usuń PBS. Dodać 1 ml 0,25% trypsyny i inkubować w temperaturze 37 °C przez 3-5 minut.
    2. Zbierz trypsynizowane komórki i przenieś je do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Energicznie pipetować zawiesinę komórkową, aby rozbić grudki mESC. Dodać 2 ml kompletnej pożywki z komórek ES do zawiesiny komórek, aby zneutralizować trypsynę.
    3. Wirować komórki w temperaturze 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 3 ml pożywki ES
      4. .
    4. Usunąć pożywkę z płytek 6-dołkowych zawierających przygotowane zatrzymane monowarstwy MEF. Dodać odpowiednią ilość zawiesiny komórkowej (w oparciu o pożądany stosunek podziału) w 3 ml pożywki komórkowej ES do każdej studzienki, która ma być wysiana. Dodać 3 μl 1,000x LIF. Zlewający się mESC dobrze podzielony 1:6 będzie gotowy do przejścia w ciągu 2 dni.
  4. Konserwacja ogniw OP9/OP9-DL1
    1. Rozmrozić fiolkę z komórkami OP9 (wykonaj kroki 2.1.1-2.1.3 za pomocą pożywki OP9)
    2. Dodać 7 ml pożywki OP9 do 10 cm naczynia do hodowli tkankowych. Dodać 3 ml zawieszonych komórek kroplami, rozprowadzając komórki po całej płytce. Umieść komórki na noc w inkubatorze.
    3. Następnego dnia sprawdź zbieg komórek OP9. Jeśli naczynie zawiera wiele martwych pływających komórek, usuń pożywkę i dodaj 10 ml świeżej pożywki OP9. Umieść szalkę z powrotem w inkubatorze, jeśli nie obserwuje się prawie pełnej zbieżności. Podziel (przy użyciu trypsyny) 1:4 prawie zlewającą się monowarstwę OP9.
      UWAGA: Płytki powinny ponownie osiągnąć ten sam poziom konfluencji za około 2 dni. Uważaj, aby komórki OP9 nie stały się nadmiernie zlewne.
    4. Zamroź wczesne przejścia komórek OP9 jako zapasy rozprężne.
      UWAGA: Zamrażamy 2 fiolki z komórkami OP9 z jednego naczynia o średnicy 10 cm, które się zlewa. Każda fiolka z materiałem ekspansywnym może być dalej rozmnażana w celu wytworzenia zapasów roboczych, które są później wykorzystywane w eksperymentach z kokulturą mESC. Wszystkie zapasy OP9 należy przechowywać w stanie zamrożonym w ciekłym azocie, a nie w zamrażarce o temperaturze -80 °C, ponieważ wahania temperatur mogą negatywnie wpłynąć na jakość zamrażania.

3. OP9-DL1 Procedura kohodowli

  1. Preparaty do kokultury
    1. Na około tydzień przed rozpoczęciem kohodowli należy rozmrozić MEF, mESC i zapasy robocze komórek OP9. Ponieważ komórki OP9-DL1 nie są potrzebne do 8 dnia wspólnej hodowli, należy rozmrozić komórki OP9-DL1 w ciągu pierwszych trzech dni po rozpoczęciu wspólnej hodowli. W razie potrzeby utrzymuj lub zamrażaj wszystkie komórki.
    2. Określ początkową liczbę 10 cm płytek z monowarstwami komórek OP9 przygotowanych do osiągnięcia 80% zbieżności w dniu wspólnej hodowli 0 w oparciu o skalę eksperymentu (np. liczbę klonów mESC do różnicowania i liczbę punktów czasowych kohodowli do analizy). Aby przygotować się do kohodowli, należy rozszczepić komórki OP9 w pobliżu zlewającej się płytki między 1:4 a 1:6 na dwa dni przed tym, kiedy monowarstwy będą potrzebne.
      UWAGA: Potrzebna będzie co najmniej jedna płytka na klon ESC. Zazwyczaj pojedynczy klon ESC wysiewany na pojedynczej płytce (jak opisano poniżej) w dniu 0 powinien dać wystarczającą liczbę komórek, aby zasiać sześć płytek w dniu 5. Każdego dnia 5 tabliczek umożliwi jeden kolejny punkt czasowy analizy.
    3. Ponieważ monowarstwy OP9 będą stale potrzebne do przejścia kokultury, należy zawsze zadbać o utrzymanie odpowiedniej liczby dodatkowych płytek hodowlanych OP9 równolegle z kokulturą.
  2. Dzień 0: Inicjacja kokultury
    1. Zebrać mESC jak w ppkt 2.3.1-2.3.4. Policz komórki.
    2. Dla każdego klonu mESC należy przygotować 5 x 104 mESC w 10 ml pożywki OP9 na płytkę.
      UWAGA: Chociaż go nie używaliśmy, zauważamy, że alternatywne podłoże składające się z α-MEM, 10% FBS i 5 x 10-5 M β-merkaptoetanolu zostało również zgłoszone do stosowania w kokulturach różnicujących. 10
    3. Usuń stare podłoża z szalek OP9 i dodaj 10 ml zawiesiny mESC do szalek, zwracając uwagę na równomierne rozprowadzenie komórek na całej płytce. Umieścić naczynia w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
  3. Dzień 3: Zmiana mediów
    1. Wyjmij naczynia z inkubatora i obserwuj pod mikroskopem. Kolonie powinny zacząć tracić połysk i wydawać się spłaszczone.
    2. Wyjmij pożywkę z naczyń i delikatnie dodaj 10 ml świeżej pożywki OP9.
    3. Zwróć naczynia z kokultury do inkubatora. Codziennie monitoruj wizualnie tworzenie kolonii podobnych do mezodermy, aby poinformować o czasie przygotowania monowarstwy karmnika OP9 do następnego przejścia (dzień 5), które nie powinno być przeprowadzane, dopóki ~ 80-90% kolonii nie wyświetli wizualnie morfologii podobnej do mezodermy. Maksymalne odroczenie etapu transferu komórek w dniu 5 wynosi 2 dni.
  4. Dzień 5: Pasaż za pośrednictwem trypsyny ze wstępnym posiewem.
    UWAGA: Przygotuj wcześniej odpowiednią liczbę 10 cm naczyń z optymalnie zlewającymi się komórkami OP9. Kontynuuj kolejne kroki tylko wtedy, gdy kokultury wizualnie wykazują cechy opisane w kroku 3.3.3 (patrz również Reprezentatywne wyniki).
    1. Usuń pożywkę z naczyń współkulturowych. Dodać 4 ml PBS do przemycia. Zakręć PBS i usuń. Dodać 4 ml 0,25% trypsyny i umieścić naczynia w inkubatorze na ~5 min.
    2. Rozbić warstwę trypsynizowanych komórek poprzez energiczne pipetowanie, uważając, aby nie wprowadzić nadmiernych pęcherzyków powietrza, aż do uzyskania jednorodnej, przeważnie jednokomórkowej zawiesiny.
    3. Dodać 4 ml kompletnej pożywki OP9 i wymieszać pipetując. Przenieś komórki do nowej, pustej 10-centymetrowej naczynia i umieść w inkubatorze na 30 minut, aby komórki OP9 przylgnęły do naczynia. Ten etap "wstępnego powlekania" zmniejsza liczbę komórek OP9 przenoszonych do następnego etapu kohodowli.
    4. Przygotować probówki wirówkowe o pojemności 50 ml z sitkami o wielkości 40 μm.
    5. Zebrać nieprzylegające komórki z wstępnie poszczepionego naczynia i przepuścić je przez sitko do komórek do probówki. Delikatnie umyj naczynie 6 ml PBS i przepuść je przez to samo sitko, pozostawiając dołączone komórki OP9.
    6. Odwirować komórki w temperaturze 400 x g 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić granulowane komórki w 3 ml kompletnej pożywki OP9. Policz komórki.
    7. Usuń pożywkę z 10-centymetrowych płytek z optymalnie zlewającymi się komórkami OP9.
    8. Dla każdego punktu czasowego analizy zasiać 5 x 105 komórek na monowarstwie OP9 w 10 ml końcowej objętości
      9. .
    9. Dodać 5 ng/ml rekombinowanego ludzkiego Flt-3L i umieścić naczynia w inkubatorze.
  5. Dzień 8: Pobranie krwiotwórczych komórek progenitorowych (HPC)
    UWAGA: Przygotuj wcześniej odpowiednią liczbę płytek 6-dołkowych z monowarstwami komórek OP9 lub OP9-DL1, tak aby były one ~80% zlewające się na czas tego etapu.
    1. Przygotować probówki wirówkowe o pojemności 50 ml z sitkami o średnicy 40 μm.
    2. Wyjąć szalki z inkubatora i obserwować pod mikroskopem. Błyszczące klastry HPC powinny być luźno przymocowane do monowarstwy OP9. Zbierz jak najwięcej tych komórek, myjąc (ale nie rozbijając nadmiernie) monowarstwy OP9 za pomocą pipety i istniejących pożywek na naczyniu. Aby zapobiec pienieniu, należy zawsze pozostawić co najmniej 1 ml pożywki na końcówce pipety podczas tego etapu zbierania/mycia HPC.
    3. Przepuść komórki przez sitko 40 μm do probówki. Dodać 8 ml PBS do tej samej płytki i sprawdzić pod mikroskopem, czy zebrano wszystkie HPC. Powtórz etap mycia/zbierania z PBS i (jeśli to konieczne) z bardziej mocnym praniem. Przecedzić komórki do probówki, w której znajdują się już komórki z tej samej płytki.
    4. Odwirować komórki przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    5. Przygotować mieszankę wzorcową składającą się z 3 ml (na płytkę wysianą w dniu 5) pożywki OP9 z 5 ng/ml Flt-3L i 1 ng/ml IL-7.
    6. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w pożywce OP9 za pomocą mieszanki głównej Flt-3L+IL-7 (3 ml na każde przetworzone 10 cm naczynia). Przenieś zebrane komórki z każdej płytki do jednego dołka 6-dołkowej płytki z komórkami OP9.
      1. Aby skierować komórki w kierunku linii monocytowych, limfocytów B lub erytroidalnych, należy zasiać zebrane komórki na komórkach OP9. Aby uzyskać limfocyty T, zasiaj komórki na monowarstwach komórek OP9-DL1.
    7. Umieścić 6-dołkowe płytki w inkubatorze.
  6. Dzień 10: Zmiana mediów
    1. Przygotować probówkę wirówkową o pojemności 15 ml dla każdej odrębnej kombinacji typu klon mESC i komórka zasilająca we wspólnej hodowli.
    2. Przygotować główną mieszaninę pożywek OP9 z 5 ng/ml Flt-3L i 1 ng/ml IL-7. Przygotuj 3 ml na każdą studzienkę.
    3. Delikatnie zebrać pożywkę z każdej studzienki 6-dołkowej płytki, łącząc pożywki z wielu studzienek zawierających tę samą kombinację typu klon-ogniwo zasilające ESC.
    4. Dodać 2 ml głównej mieszanki pożywki OP9 (patrz 3.6.2) do każdego dołka.
    5. Odwirować zebrane podłoże o sile 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić każdą osadkę (bardzo małą, jeśli jest widoczna) w 1 ml głównej mieszanki pożywki OP9 (patrz 3.6.2) na każde dołek pierwotnie zebrany w kroku 3.6.3.
    6. Rozprowadzić 1 ml komórek z powrotem do każdej studzienki, z której pierwotnie pobrano pożywkę, zwiększając objętość w każdym dołku do 3 ml. Włożyć szalki z powrotem do inkubatora.
  7. Dzień 12: Brak pasażu trypsyny
    UWAGA: Przygotuj wcześniej odpowiednią liczbę 6-dołkowych naczyń z komórkami OP9 lub OP9-DL1, aby optymalnie zlały się na czas tego etapu. Dzień 12 jest idealny do analiz cytometrii przepływowej rozwijających się limfocytów T erytroidalnych, monocytowych i we wczesnym stadium.
    1. Przygotować główną mieszaninę (3 ml na każdą studzienkę, która będzie kontynuowana w kokulturze) pożywki OP9 z 5 ng/ml Flt-3L i 1 ng/ml IL-7.
    2. Przygotować probówki wirówkowe o pojemności 50 ml z sitkami o średnicy 40 μm (po jednym dla każdej kombinacji typu komórki klonologicznej ESC we wspólnej hodowli).
    3. Energicznie odpipetować istniejące pożywki w każdym dołku, aby zdezagregować wszystkie komórki (w tym monowarstwę) w studzience. Kontynuuj intensywne pipetowanie, aż do uzyskania stanu przypominającego zawiesinę jednokomórkową.
    4. Przełóż zebrane komórki przez sitko do probówki. Dodaj 3 ml PBS do każdej studzienki, aby umyć i zebrać wszystkie pozostałe komórki. Przepuść komórki przez to samo sitko. Połącz komórki z wielu studzienek zawierających tę samą kombinację typu komórki klonu i zasilacza ESC.
    5. Wyrzucić zużyte sitko do komórek i usunąć podwielokrotność odpowiadającą jednemu studzienkowi (~6 ml) do wszelkich pożądanych analiz cytometrii przepływowej (lub innych), które mają być przeprowadzone w tym dniu. Przed użyciem należy przechowywać te porcje na lodzie.
    6. Odwirować komórki przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant. Zawiesić osad z probówek wirówkowych o pojemności 50 ml w 3 ml mieszanki wzorcowej na dołek w celu ponownego zasiania. Dodać 3 ml na studzienkę zawiesiny każdej komórki do odpowiedniego typu komórki zasilającej i umieścić szalki w inkubatorze.
  8. Dzień 14: Zmiana mediów
    1. Postępuj zgodnie z instrukcjami opisanymi w sekcji 3.6.
  9. Dzień 16: Brak pasażu trypsyny
    UWAGA: Na tym etapie przygotuj wcześniej 6-dołkowe naczynia z optymalnie zlewających się komórek OP9 lub OP9-DL1.
    UWAGA: Dzień 16 jest idealny do analiz cytometrii przepływowej limfocytów B i limfocytów T w środkowym stadium.
    1. Postępuj zgodnie z instrukcjami opisanymi w sekcji 3.7.
  10. Dzień 18: Zmiana nośników
    1. Postępuj zgodnie z instrukcjami opisanymi w sekcji 3.6.
  11. Dzień 20: Brak pasażu trypsyny
    UWAGA: Dzień 20 jest idealny do analiz cytometrii przepływowej rozwijających się limfocytów T w średnim i późnym stadium.
    1. Postępuj zgodnie z instrukcjami opisanymi w sekcji 3.7. W razie potrzeby przenieś komórki różnicujące po 20 dniach, zmieniając pożywkę i nie pasażując trypsyny co dwa dni, z codziennym monitorowaniem szybkości ekspansji limfocytów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Podczas hodowli na MEF w obecności LIF, mESC mogą być utrzymywane w stanie niezróżnicowanym. W optymalnych warunkach widoczne są jako zwarte kolonie komórek otoczone błyszczącym halo w mikroskopii kontrastowej (Rysunek 1). Kultury te muszą być monitorowane codziennie. W zależności od stopnia konfluencji komórek można wymieniać pożywkę lub pasażować komórki. Sąsiednie kolonie mESC nie powinny stykać się ze sobą. Normalna, zdrowa kultura niezróżnicowanych mESC jest niezbędnym punktem wyjścia dla różnicowan...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

System kohodowli OP9-DL1 został wykorzystany do zbadania roli różnych produktów genowych podczas rozwoju typów komórek krwi z komórek macierzystych. 8,12,13 Okazało się również, że jest to skuteczny model do badania funkcji regulatorowego DNA genów podczas różnicowania komórek. 9,14 Zastosowanie tego podejścia jako alternatywy dla całych modeli mysich może przynieść znaczne oszczędności czasu i kosztów eksperymentów, które odpowiadają na wiele podstawowych pytań dotyczących hematopoezy. Jednak dosto...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Joon Kim za fachową pomoc w cytometrii przepływowej. Badania w laboratoriach autorów są wspierane przez program SCORE National Institutes of Health (grant SC1-GM095402 dla B.D.O) oraz Canadian Institutes of Health Research (dla J.C.Z.P.). J.C.Z.P. jest wspierany przez Kanadyjską Katedrę Badań w Immunologii Rozwojowej. Infrastruktura badań biomedycznych Hunter College jest częściowo wspierana przez program NIH Research Centers in Minority Institutions (RCMI) poprzez MD007599 grantów. Dziękujemy również Programowi Naukowemu Komórek Macierzystych Stanu Nowy Jork (NYSTEM) za wsparcie w rozpoczęciu badań nad komórkami macierzystymi w Hunter College poprzez C023048 grantów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DMEMCorning15-013-CV
Kwalifikowany do komórek macierzystych FBSGemini100-125Inaktywowana termicznie
penicylina/streptomycynaCorning30-002-CI
L-alanylo-glutaminaCorning25-015-CI
Bufor HEPES MilliporeTMS-003-C
Aminokwasy endogenneThermoScientificSH30853.01
Gentamycyna Regent Solution (50 mg/ml)Life Technologies 15750-060
β-merkaptoetanol (55 mM) w DPBSLife Technologies 21985-023
Jednostka filtrującaMilliporeSCGPU05RE0,22 μ m Membrana PES
Klasa hodowli komórkowej WodaCorning25-055-CM
α-MEM Technologie życiowe 12000-022Proszek, rozpuszczony zgodnie z zaleceniami producenta
Wodorowęglan sodu SigmaS5761-500G
FBSThermoScientificSH 30396.03Wymagane testowanie poszczególnych partii 
Siarczotlenek dimetylu SigmaD2650
Rekombinowany ludzki ligand Flt-3R& D Systems308-FK
Rekombinowana mysz IL-7PeproTech217-17
LIF MilliporeESG1107
Utrapure woda z 0,1% żelatynąMilliporeES-006-B
MEFs mitomycyna C traktowanaMilliporePMEF-CFMożna stosować dowolne mitotycznie zatrzymane MEF-y
DPBSCorning21-031-CV
Sitko do komórek (40 μ m)Fisher22363547
Naczynie do hodowli tkankowych 100 x 20 mmBD Falcon353003
Multiwell 6-dołkoweprobówki do353046
1,5 mlUSA Scientific1615-5500
15 ml probówki wirówkoweBD Falcon352096
50 mlBD Falcon352070
5 ml polistyrenowa probówka okrągłodenna z nakrętką z sitkiem do komórekBD Falcon352235Probówki do FACS 
Ogniwa ES R1Ogniwa
OP9Ogniwa można uzyskać z Riken Laboratory Cell Repository (Japonia).
Ogniwa OP9-DL1       Ogniwa można zamówić w Zú ñ iga-Pflü Laboratorium CKER.
Oprogramowanie FlowJo Tree StarFACS
Cytometr przepływowyBDFACScan, FACSCalibur i FACSVantage
mikrowirówek BD Falcon ATCC SCRC-1011 W naszym laboratorium wykorzystano analizy danych

Bibliografia

  1. Schmitt, T. M., et al. Induction of T cell development and establishment of T cell competence from embryonic stem cells differentiated in vitro. Nat Immunol. 5, 410-417 (2004).
  2. Pui, J. C., et al. Notch1 expression in early lymphopoiesis influences B versus T lineage determination. Immunity. 11, 299-308 (1999).
  3. Nakano, T., Kodama, H., Honjo, T. Generation of lymphohematopoietic cells from embryonic stem cells in culture. Science. 265, 1098-1101 (1994).
  4. Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T cell development from hematopoietic progenitor cells by delta-like-1 in vitro. Immunity. 17, 749-756 (2002).
  5. Chen, J., Lansford, R., Stewart, V., Young, F., Alt, F. W. RAG-2-deficient blastocyst complementation: an assay of gene function in lymphocyte development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 4528-4532 (1993).
  6. de Pooter, R. F., Cho, S. K., Carlyle, J. R., Zuniga-Pflucker, J. C. In vitro generation of T lymphocytes from embryonic stem cell-derived prehematopoietic progenitors. Blood. 102, 1649-1653 (2003).
  7. Holmes, R., Zuniga-Pflucker, J. C. The OP9-DL1 system: generation of T-lymphocytes from embryonic or hematopoietic stem cells in vitro. Cold Spring Harb Protoc. 2009, (2009).
  8. Arsov, I., et al. A role for autophagic protein beclin 1 early in lymphocyte development. J Immunol. 186, 2201-2209 (2011).
  9. Lahiji, A., et al. Complete TCR-alpha gene locus control region activity in T cells derived in vitro from embryonic stem cells. J Immunol. 191, 472-479 (2013).
  10. Hirashima, M., Kataoka, H., Nishikawa, S., Matsuyoshi, N., Nishikawa, S. Maturation of embryonic stem cells into endothelial cells in an in vitro model of vasculogenesis. Blood. 93, 1253-1263 (1999).
  11. Nishikawa, S. I., Nishikawa, S., Hirashima, M., Matsuyoshi, N., Kodama, H. Progressive lineage analysis by cell sorting and culture identifies FLK1+VE-cadherin+ cells at a diverging point of endothelial and hemopoietic lineages. Development. 125, 1747-1757 (1998).
  12. de Pooter, R. F., et al. Notch signaling requires GATA-2 to inhibit myelopoiesis from embryonic stem cells and primary hemopoietic progenitors. J Immunol. 176, 5267-5275 (2006).
  13. Watarai, H., et al. Generation of functional NKT cells in vitro from embryonic stem cells bearing rearranged invariant Valpha14-Jalpha18 TCRalpha. 115, 230-237 (2010).
  14. Pipkin, M. E., et al. Chromosome transfer activates and delineates a locus control region for perforin. Immunity. 26, 29-41 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Różnicowanie limfocytów Tsystem kokultury OP9hematopoetyczne komórki progenitoroweanaliza cytometrycznaprowadzenie kultur komórkowychmonowarstwa komórek zrębowychrozwój limfocytów Tmodel in vitropodwójnie pozytywne CD4 CD8
Wyprowadzanie limfocytów T in vitro z embrionalnych komórek macierzystych myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.