Dwie metody oparte na cytometrii przepływowej - test in vitro na bazie limfocytów T i wewnątrzkomórkowe barwienie cytokin zostały wykorzystane do zmierzenia zdolności komórek dendrytycznych do prezentacji antygenu i odpowiedzi limfocytów T specyficznych dla antygenu na infekcję mutantem wirusa Zachodniego Nilu u myszy.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
In vitro Analiza komórkowej odpowiedzi immunologicznej za pośrednictwem Myd88 na zakażenie zmutowanym szczepem wirusa Zachodniego Nilu
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Atenuowany wirus Zachodniego Nilu (WNV), niestrukturalny (NS) mutant 4B-P38G, indukował wyższe wrodzone odpowiedzi cytokin i limfocytów T niż dziki typ WNV u myszy. Niedawno wykazano, że sygnalizacja czynnika różnicowania szpiku 88 (MyD88) jest ważna dla początkowego pobudzania limfocytów T i rozwoju komórek T pamięci podczas infekcji mutantem WNV NS4B-P38G. W tym badaniu wykorzystano dwie metody oparte na cytometrii przepływowej – test pobudzania limfocytów T in vitro i wewnątrzkomórkowe barwienie cytokin (ICS) – do oceny komórek dendrytycznych (DC) i funkcji limfocytów T. W teście primingu limfocytów T proliferację komórek analizowano za pomocą cytometrii przepływowej po wspólnej hodowli DC z obu grup myszy z estrem karboksyfluoresceiny sukcynimidylowej (CFSE) - znakowanymi limfocytami T CD4 + myszy transgenicznych OTII. Podejście to pozwoliło na dokładne określenie odsetka proliferujących limfocytów T CD4 + przy znacznie lepszej ogólnej czułości niż tradycyjne testy z odczynnikami promieniotwórczymi. System probówek mikrowirówkowych zastosowano zarówno w procedurach barwienia hodowli komórkowych, jak i cytokin w protokole ICS. W porównaniu z tradycyjnym systemem opartym na płytkach do hodowli tkankowych, ta zmodyfikowana procedura była łatwiejsza do wykonania w obiektach o poziomie bezpieczeństwa biologicznego (BL) 3. Co więcej, komórki zakażone WNV poddano działaniu paraformaldehydu w obu testach, co umożliwiło dalszą analizę poza obiektami BL3. Ogólnie rzecz biorąc, te testy immunologiczne in vitro mogą być wykorzystywane do skutecznej oceny odpowiedzi immunologicznej za pośrednictwem komórek podczas infekcji WNV.
Wprowadzenie
Wirus Zachodniego Nilu (WNV), neurotropowy, flawiwirus z plusem, stanowi nowe zagrożenie dla zdrowia publicznego. Obecnie żadna szczepionka nie została zatwierdzona do stosowania u ludzi1. Wiadomo, że atenuowany szczep WNV, który ma substytucję P38G w białku niestrukturalnym (NS)4B, nie indukuje śmiertelności u myszy, ale wyższe wrodzone cytokiny i odpowiedzi komórek T u myszy niż szczepWNV NY99 typu dzikiego 2. Myszy zaszczepione mutantem NS4B-P38G były chronione przed wtórnym wyzwaniem śmiertelnym dzikim WNV. Sugeruje to, że mutant NS4B-P38G ma odpowiednie cechy dla idealnego kandydata na szczepionkę. Mechanizmy, za pomocą których mutant NS4B-P....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Wykorzystania na Wydziale Medycznym Uniwersytetu w Teksasie.
1. Izolacja DC od myszy niezainfekowanych i zainfekowanych WNV
- Zgodność wieku i płci 6-10 tygodniowych, dzikich myszy C57BL/6 (B6) i MyD88−/−. Zaszczepić dootrzewnowo (i.p.) 500 jednostką tworzącą płytkę nazębną (PFU) mutanta WNV NS4B-P38G. W 3 dniu po zakażeniu poddaj myszy eutanazji B6 i MyD88−/− za pomocą CO2. Użyj niezainfekowanych myszy z obu grup jako grupy kontrolnej. Użyj trzech myszy z każdej grupy.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W teście primingu limfocytów T, limfocyty T CD4+ znakowane CFSE hodowano z oczyszczonymi komórkami DC od myszy typu dzikiego oraz myszy MyD88−/− zainfekowanych mutantem NS4B-P38G, w obecności lub wobec braku peptydów OVA. Jako kontrole negatywne wykorzystano znakowane limfocyty T hodowane osobno, z OVA lub bez niej, przez 5 dni. Jak pokazano na Rysunku 1A, całkowitą populację limfocytów T wyodrębniono w celu analizy intensywności fluorescencji w kanale FL1. Mar.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
WNV jest patogenem BL3. Ze względu na przepisy bezpieczeństwa, testy immunologiczne z próbkami zakażonymi WNV są często ograniczone dostępnością sprzętu w obiektach BL3 lub bardziej długotrwałe i żmudne do wykonania. W niedawnym badaniu zastosowaliśmy dwie metody oparte na cytometrii przepływowej do zbadania odpowiedzi immunologicznej za pośrednictwem komórek podczas infekcji WNV5. W obu testach komórki zakażone WNV traktowano bezpośrednio 1-2% PFA lub roztworem utrwalającym/przepuszczalnym zawierającym 4% PFA.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez granty NIH dla T.W. (R01AI072060 i R01AI099123). G. Xie był wspierany przez Sealy Center for Vaccine Development Predoctoral Fellowship. Dziękujemy dr Richardowi Flavellowi (Howard Hughes Medical Institute, Yale University School of Medicine, New Haven) i dr Shizuo Akirze (Uniwersytet w Osace, Japonia) za dostarczenie MyD88–/– myszy oraz dr Y Cong (UTMB, Galveston) za dostarczenie transgenicznych myszy OTII.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875 | rozgrzewka przy 37 stopniach; |
| Koraliki magnetyczne C anty-CD11c | Miltenyi Biotec | 130-052-001 | są zgodne z zaleceniami producenta s instrukcje |
| koraliki magnetyczne anty-CD4 | Miltenyi Biotec | 130-095-248 | postępuj zgodnie z instrukcjami producenta s instrukcje |
| CFSE | Invitrogen | C34554 | |
| Reszta OVA 323-339 | Genscript Corporation | RP10610 | |
| Peptydy | Proimmune | PC0AD-D Brefeldin | |
| A roztwór | BD Bioscience | 555029 | |
| Mysi bloker Fc | e-Bioscience | 14-0161-85 | |
| CD4 | sprzężony z APCe-Bioscience | 17-0041-81 | |
| CD8 sprzężony z FITC | e-Bioscience | 11-0081-82 | |
| Roztwór do utrwalania/permeabilizacji | BD-Bioscience | 554722 | |
| Bufor do permeabilizacji/płukania | BD-Bioscience | 554723 | |
| anty-IFNγ-PE | e-Bioscience | 12-7311-82 | |
| Cytometr przepływowy Accuri | BD Biologią |
Bibliografia
- Campbell, G. L., Marfin, A. A., Lanciotti, R. S., Gubler, D. J. West Nile virus. Lancet Infect. Dis. 2, 519-529 (2002).
- Welte, T., et al. Immune responses to an attenuated West Nile virus NS4B-P38G mutant strain. Vaccine. 29, 4853-4861 (2011).
- Iwasaki, A., Medzhitov, R.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
