In vitro Analiza komórkowej odpowiedzi immunologicznej za pośrednictwem Myd88 na zakażenie zmutowanym szczepem wirusa Zachodniego Nilu

Podsumowanie

Dwie metody oparte na cytometrii przepływowej - test in vitro na bazie limfocytów T i wewnątrzkomórkowe barwienie cytokin zostały wykorzystane do zmierzenia zdolności komórek dendrytycznych do prezentacji antygenu i odpowiedzi limfocytów T specyficznych dla antygenu na infekcję mutantem wirusa Zachodniego Nilu u myszy.

Streszczenie

Atenuowany wirus Zachodniego Nilu (WNV), niestrukturalny (NS) mutant 4B-P38G, indukował wyższe wrodzone odpowiedzi cytokin i limfocytów T niż dziki typ WNV u myszy. Niedawno wykazano, że sygnalizacja czynnika różnicowania szpiku 88 (MyD88) jest ważna dla początkowego pobudzania limfocytów T i rozwoju komórek T pamięci podczas infekcji mutantem WNV NS4B-P38G. W tym badaniu wykorzystano dwie metody oparte na cytometrii przepływowej – test pobudzania limfocytów T in vitro i wewnątrzkomórkowe barwienie cytokin (ICS) – do oceny komórek dendrytycznych (DC) i funkcji limfocytów T. W teście primingu limfocytów T proliferację komórek analizowano za pomocą cytometrii przepływowej po wspólnej hodowli DC z obu grup myszy z estrem karboksyfluoresceiny sukcynimidylowej (CFSE) - znakowanymi limfocytami T CD4 ⁺ myszy transgenicznych OTII. Podejście to pozwoliło na dokładne określenie odsetka proliferujących limfocytów T CD4 ⁺ przy znacznie lepszej ogólnej czułości niż tradycyjne testy z odczynnikami promieniotwórczymi. System probówek mikrowirówkowych zastosowano zarówno w procedurach barwienia hodowli komórkowych, jak i cytokin w protokole ICS. W porównaniu z tradycyjnym systemem opartym na płytkach do hodowli tkankowych, ta zmodyfikowana procedura była łatwiejsza do wykonania w obiektach o poziomie bezpieczeństwa biologicznego (BL) 3. Co więcej, komórki zakażone WNV poddano działaniu paraformaldehydu w obu testach, co umożliwiło dalszą analizę poza obiektami BL3. Ogólnie rzecz biorąc, te testy immunologiczne in vitro mogą być wykorzystywane do skutecznej oceny odpowiedzi immunologicznej za pośrednictwem komórek podczas infekcji WNV.

Wprowadzenie

Wirus Zachodniego Nilu (WNV), neurotropowy, flawiwirus z plusem, stanowi nowe zagrożenie dla zdrowia publicznego. Obecnie żadna szczepionka nie została zatwierdzona do stosowania u ludzi¹. Wiadomo, że atenuowany szczep WNV, który ma substytucję P38G w białku niestrukturalnym (NS)4B, nie indukuje śmiertelności u myszy, ale wyższe wrodzone cytokiny i odpowiedzi komórek T u myszy niż szczep^WNV NY99 typu dzikiego 2. Myszy zaszczepione mutantem NS4B-P38G były chronione przed wtórnym wyzwaniem śmiertelnym dzikim WNV. Sugeruje to, że mutant NS4B-P38G ma odpowiednie cechy dla idealnego kandydata na szczepionkę. Mechanizmy, za pomocą których mutant NS4B-P38G indukuje wysoką ochronną odporność adaptacyjną, nie są jeszcze dokładnie poznane. Receptory toll-podobne (TLR), które rozpoznają wzorce molekularne związane z patogenem, odgrywają zasadniczą rolę w inicjacji wrodzonej odporności na infekcję wirusową. Rdzeń szlaku sygnałowego TLR wykorzystuje gen pierwotnej odpowiedzi szpiku 88 (MyD88) jako główny adaptor^3,4. W niedawnym badaniu wykazano, że sygnalizacja MyD88 odgrywa ważną rolę w rozwoju odporności komórkowej podczas infekcji mutantem WNV NS4B-P38G u myszy⁵. Komórki dentrytyczne (DC) są jednymi z najważniejszych komórek prezentujących antygen, wykazującymi unikalną zdolność do inicjowania pierwotnych odpowiedzi limfocytów T podczas infekcji wirusowej^6,7. Limfocyty T CD4 ⁺ i CD8 ⁺ przyczyniają się do długotrwałej odporności ochronnej i są ważne dla przetrwania gospodarza po zakażeniu WNV typu dzikiego^8,9. W tym badaniu zastosowano dwa testy immunologiczne w celu oceny funkcji tych komórek u myszy zakażonych mutacją NS4B-P38G.

Po pierwsze, test in vitro na bazie limfocytów T został wykorzystany do porównania zdolności do prezentacji antygenu przez DC myszy typu dzikiego i MyD88^−/− zakażonych WNV. Aby zwiększyć czułość testu, naiwne limfocyty T CD4 ⁺ wyizolowano od myszy transgenicznych OTII, które wyrażają TCR Vα2 / Vβ5 specyficzny dla peptydu albuminy jaja kurzego (OVA) 323 - 339. DC myszy zakażonych WNV oczyszczono i współhodowano z limfocytami T CD4 ⁺ znakowanymi karboksyfluoresceiną sukcynimidylem wielkanocnym (CFSE) w obecności peptydu OVA. Po 5 dniach kohodowli komórki zebrano i utrwalono za pomocą paraformaldehydu (PFA) i przeanalizowano za pomocą cytometrii przepływowej. Testy proliferacyjne tradycyjnie przeprowadza się poprzez włączenie 5-bromo-2'-deoksyurydyny (BrdU) lub trityowanego deoksyrybozydu tyminy (³HTdr)¹⁰. Niemniej jednak testy te są albo radioaktywne, albo wymagają specjalnego sprzętu w obiektach na poziomie bezpieczeństwa biologicznego (BL) 3, w których prowadzone są badania WNV. Analiza cytometryczna przepływowa proliferacji limfocytów poprzez seryjne zmniejszanie o połowę intensywności fluorescencji ważnego barwnika CFSE stała się częściej stosowana w testach immunologicznych, ponieważ barwnik jest bardziej stabilnie i równomiernie wprowadzany do komórek, łatwo wykrywany przez cytometrię przepływową i jest nieradioaktywny¹¹. Test ma również możliwość oceny liczby podziałów komórkowych. Jedną z głównych zalet stosowania tego testu w badaniach WNV jest to, że utrwalenie zakażonych komórek za pomocą 1-2% PFA może dezaktywować WNV¹², co umożliwi pobranie próbki za pomocą cytometru przepływowego w laboratorium BL2.

Następnie, zmodyfikowana procedura barwienia cytokin wewnątrzkomórkowych (ICS) została użyta do zbadania roli sygnalizacji MyD88 w regulacji odpowiedzi limfocytów T specyficznych dla WNV u myszy zakażonych mutacją NS4B-P38G. W tym teście splenocyty wyizolowane od zakażonych myszy traktowano in vitro peptydami specyficznymi dla WNV. Brefeldyna A została dodana w celu zatrzymania cytokin w komórce. Po 5 godzinach inkubacji komórki zebrano, umyto i wybarwiono pod kątem podzbiorów limfocytów T. Komórki następnie utrwalono w PFA, przeniknięto i wybarwiono pod kątem interferonu (IFN)-γ i przeanalizowano za pomocą cytometrii przepływowej. Podobnie jak w przypadku innych testów opartych na cytometrii przepływowej, po potraktowaniu komórek buforem utrwalającym i przepuszczalnym zawierającym PFA, zakażone próbki można przenieść do laboratorium BL2 w celu dalszego przetwarzania i analizy. W kilku opublikowanych badaniach użyliśmy ICS do pomiaru funkcji efektorów limfocytów T u myszy zakażonych WNV^13,14. Chociaż jest to dobrze znane, jedną z głównych wad tego testu jest to, że procedura jest bardzo długa i może być bardziej czasochłonna, gdy jest wykonywana w obiektach BL3. W tym przypadku wykazano, że metoda ICS oparta na probówkach mikrowirówkowych jest bardziej wykonalna, łatwiejsza do przeprowadzenia i mniej czasochłonna, gdy jest wykonywana w laboratorium BL3.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Wykorzystania na Wydziale Medycznym Uniwersytetu w Teksasie.

1. Izolacja DC od myszy niezainfekowanych i zainfekowanych WNV

1. Zgodność wieku i płci 6-10 tygodniowych, dzikich myszy C57BL/6 (B6) i MyD88^−/−. Zaszczepić dootrzewnowo (i.p.) 500 jednostką tworzącą płytkę nazębną (PFU) mutanta WNV NS4B-P38G. W 3 dniu po zakażeniu poddaj myszy eutanazji B6 i MyD88^−/− za pomocą CO₂. Użyj niezainfekowanych myszy z obu grup jako grupy kontrolnej. Użyj trzech myszy z każdej grupy.
2. Zmocz futro po lewej stronie ofiarowanej myszy za pomocą 70% etanolu i odetnij futro wzdłuż lewej strony myszy, mniej więcej w połowie odległości między przednimi i tylnymi nogami. Rozetnij jamę ciała. Usuń śledzionę za pomocą kleszczy. Umieść śledzionę na szalce Petriego z RPMI.
3. Wyizoluj DC śledziony za pomocą kulek magnetycznych anty-CD11c zgodnie z instrukcjami producenta.

2. Oczyszczanie i znakowanie limfocytów T transgenicznych myszy OTII

1. Zbierz jedną śledzionę od naiwnej myszy OTII, jak opisano w kroku 1.2 powyżej, i zhomogenizuj śledzionę między oszronionymi końcami dwóch szkiełk. Przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml, dodać pożywkę RPMI do 14 ml. Pozostawić zawiesinę na 5 minut i przenieść 13 ml do nowej probówki stożkowej o pojemności 15 ml.
2. Wyizoluj limfocyty T CD4⁺ śledziony za pomocą zestawu do izolacji limfocytów T CD4⁺ zgodnie z instrukcjami producenta.
3. Przenieść komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml, przemyć dwukrotnie PBS. Ponownie zawiesić komórki w PBS z 0,5% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) w stężeniu 1 x 10⁶ komórek na ml i dodać 0,5 μmol/ml CFSE. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 minut, chroniąc przed światłem.
4. Dodać 5 ml zimnej, kompletnej pożywki (RPMI-1640 z 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą, 1/100 obj. antybiotykami/lekami przeciwgrzybiczymi, 1/100 obj. L-glutaminą i 1/1000 obj. 1,000 x 2-merkaptoetanolem).
5. Inkubować na lodzie przez 5 minut. Umyć komórki raz PBS, utrwalić 0,2 x 10⁶ znakowanych limfocytów T CD4 ⁺ w 2% PFA i pobrać na cytometr przepływowy. Użyj tej próbki, aby określić podstawowy poziom CFSE. Ponownie zawieś resztę znakowanych komórek na pełnym podłożu.

3. Wspólna hodowla limfocytów T OTII z DC myszy zakażonych WNV

1. Hodowla 2 x 10⁵ oczyszczonych limfocytów T CD4 ⁺ myszy OTII samodzielnie lub z oczyszczonymi DC myszy typu dzikiego lub MyD88^−/− (2 x 10⁴) na 24-dołkowej płytce z lub bez reszty OVA 323-339 (1 g / ml) w 1 ml kompletnej pożywki na basenik.
2. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 5 dni. Zebrać komórki, przemyć dwukrotnie w buforze FACS (PBS z 1% FBS) i utrwalić w 0,25 ml 2% PFA. Wir natychmiast.

4. Analiza metodą cytometrii przepływowej gruntowania limfocytów T in vitro

1. Aby uzyskać akwizycję, kliknij dwukrotnie ikonę oprogramowania do cytometrii przepływowej. Aby uzyskać wykres gęstości liniowej FSC-A w porównaniu z liniową SSC-A, wybierz kanały od 0 do 200 000 w FSC-A i od 0 do 200 000 w SSC-A. Następnie utwórz bramkę na żywych komórkach (P2; patrz rysunek 1A).
2. Aby przeanalizować intensywność fluorescencji CFSE, otwórz histogram kanału FL1 i uzyskaj 20 000 zdarzeń w populacji bramkowanej. Ustaw marker na próbkach dla komórek OTII hodowanych samodzielnie (Figura 1A).
3. W podobny sposób należy pobrać próbki komórek OTII hodowanych wspólnie z DC typu dzikiego (Figura 1B) lub DCs MyD88^−/− (Figura 1C).

5. Izolacja i stymulacja splenocytów do oznaczania cytokin

1. Zainfekuj myszy B6 i MyD88^−/− mutantem WNV NS4B-P38G, stosując tę samą procedurę, jak opisano w kroku 1.1. W 30 dniu po zakażeniu ponownie prowokuj myszy, które przeżyły, za pomocą 2000 PFU dzikiego szczepu WNV i.p. W 8 i 21 dniu po pierwotnym zakażeniu WNV lub w 4 dniu po wtórnym zakażeniu należy poddać myszy eutanazji za pomocą CO₂ w celu pobrania śledziony.
   UWAGA: Użyliśmy 2-3 myszy na grupę dla każdego punktu czasowego.
2. Wykonaj jednokomórkową zawiesinę splenocytów, jak opisano powyżej w kroku 1.2 i kroku 2.2. Policz komórki za pomocą hemocytometru i ponownie zawiesić je w 10 ml kompletnej pożywki.
3. Rozcieńczyć komórki kompletną pożywką do 2,5 x 10⁶ komórek/ml. Dodać 1 ml splenocytów do 1,5 ml probówki do mikrowirówki.
4. Aby symulować limfocyty T CD8 ⁺, rozcieńczyć peptydy NS4B i E specyficzne dla WNV (SSVWNATTA i IALTFLAV) do 1 mg / ml w DMSO. W celu stymulacji limfocytów T CD4 ⁺ należy rozcieńczyć peptydy NS3 i E specyficzne dla WNV (RRWCFDGPRTNTILE i PVGRLVTVNPFVSVA) do 1 mg / ml w DMSO. Dodać 10 μl peptydów do komórek, a następnie 1 μl roztworu Brefeldin A. Użyj komórek bez leczenia peptydami jako kontroli. Wymieszaj komórki.
5. Przebij dwa otwory igłą 18 G w nasadce tuby. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 5 godzin.

6. Barwienie cytokin wewnątrzkomórkowych

1. Przenieś komórki do nowej probówki mikrowirówkowej. Wiruj komórki przez 5 minut w temperaturze 300-400 x g i odlej supernatant. Dodać 1 ml buforu FACS, wirować przez 5 minut w temperaturze 300-400 x g i ponownie zawiesić komórki, pipetując ze 120 μl buforu FACS.
2. Dodać 2 μl blokera Fc i inkubować komórki w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Do każdej probówki dodać 1 ml buforu FACS. Wirowanie 5 min przy 300 - 400 x g.
3. Ponownie zawieś komórki w buforze FACS o pojemności 300 μl i podziel je na trzy probówki (około 0,8 x 10,⁶ komórek na probówkę). Jak pokazano w Tabeli 1, należy zarezerwować pierwszą probówkę z każdego warunku hodowli do barwienia IgG-PE szczurów. Do drugiej probówki dodać 3 μl anty-CD4 APC do komórek traktowanych peptydami CD4, 3 μl anty-CD8 FITC do komórek traktowanych peptydami CD8 lub oba przeciwciała do komórek bez leczenia peptydami. Użyj trzeciej probówki do barwienia kompensacyjnego. Dla każdego warunku hodowli należy użyć trzech probówek komórek wybarwionych samymi przeciwciałami CD4 sprzężonymi z APC, CD8 sprzężonymi z FITC lub CD3 znakowanymi PE (3 μl na probówkę) jako kontrole kompensacji kanałów FL1, FL2 i FL4.
4. Krótko zawiruj komórki. Pozostaw na lodzie na 20 minut i chroń przed światłem. Dodać 1,4 ml buforu FACS. Odwirować 5 minut w temperaturze 300-400 x g i odlać z supernatantu.
5. Mieszać, aby rozbić osad komórkowy (lub krótko wir). Ponownie zawiesić osad komórkowy w 250 μl roztworu do utrwalania/przepuszczalności przez pipetowanie. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut i chronić przed światłem.
6. Dodać 1,2 ml buforu FACS. Wirować 5 minut przy 300-400 x g i ponownie zawiesić komórki w 300 μl buforze FACS.
   UWAGA: W tym momencie komórki można przenieść do laboratorium BL2 w celu dalszego przetwarzania lub przechowywać w lodówce i chronić przed światłem przez okres do trzech dni.
7. Dodać 500 μl buforu FACS. Wirować przez 5 minut przy 300-400 x g i ponownie zawiesić komórki w 500 μl 1x buforu przepuszczalnego/płuczącego. Wirowanie 5 min przy 300-400 x g.
8. Ponownie zawiesić komórki w 100 μl 1x trwała ondulacja/płukanie, dodać 3,5 μl anty-IFNγ-PE do probówki wcześniej dodanej z przeciwciałami dla markerów limfocytów T CD4 i/lub CD8 w kroku 6.3 i 3,5 μl szczurzej IgG-PE w probówce przeznaczonej do kontroli IgG przez 25 minut na lodzie i chronić przed światłem. Przemyć komórki, dodając 1,4 ml 1x buforu do przepuszczania/przemywania wody. Wirowanie 5 min przy 300-400 x g. Powtórz etap płukania, dodając 1,4 ml 1x bufor do przepuszczania/płukania.
9. Odwirować 5 minut przy 300-400 x g i zdekantować supernatant. Przemyć komórki, dodając 1,4 ml buforu FACS i ponownie zawiesić w 400 μl buforu FACS w celu ostatecznego pobrania.

7. Analiza cytometrii przepływowej wewnątrzkomórkowego barwienia cytokin

1. Użyj tych samych ustawień pobierania, co w kroku 4.1. Utwórz bramkę na aktywnych komórkach (P2; patrz Rysunek 2A). Dostosuj napięcia za pomocą lamp kompensacyjnych dla każdej grupy.
2. Otwórz dwa nowe wykresy kropkowe, jeden do wyświetlania danych zebranych dla FL1 vs. FL2 (CD8 kontra. IFN-γ), a drugi ma na celu wyświetlenie danych zebranych dla FL4 vs. FL2 (CD4 vs. IFN-γ). Uzyskaj 50 000 zdarzeń dla populacji bramkowanej każdej próbki.

Wyniki

W teście primingu limfocytów T, limfocyty T CD4⁺ znakowane CFSE hodowano z oczyszczonymi komórkami DC od myszy typu dzikiego oraz myszy MyD88^−/− zainfekowanych mutantem NS4B-P38G, w obecności lub wobec braku peptydów OVA. Jako kontrole negatywne wykorzystano znakowane limfocyty T hodowane osobno, z OVA lub bez niej, przez 5 dni. Jak pokazano na Rysunku 1A, całkowitą populację limfocytów T wyodrębniono w celu analizy intensywności fluorescencji w kanale FL1. Mar...

Dyskusja

WNV jest patogenem BL3. Ze względu na przepisy bezpieczeństwa, testy immunologiczne z próbkami zakażonymi WNV są często ograniczone dostępnością sprzętu w obiektach BL3 lub bardziej długotrwałe i żmudne do wykonania. W niedawnym badaniu zastosowaliśmy dwie metody oparte na cytometrii przepływowej do zbadania odpowiedzi immunologicznej za pośrednictwem komórek podczas infekcji WNV⁵. W obu testach komórki zakażone WNV traktowano bezpośrednio 1-2% PFA lub roztworem utrwalającym/przepuszczalnym zawierającym 4% PFA...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
RPMI 1640	Invitrogen	11875	rozgrzewka przy 37 stopniach;
Koraliki magnetyczne C anty-CD11c	Miltenyi Biotec	130-052-001	są zgodne z zaleceniami producenta s instrukcje
koraliki magnetyczne anty-CD4	Miltenyi Biotec	130-095-248	postępuj zgodnie z instrukcjami producenta s instrukcje
CFSE	Invitrogen	C34554
Reszta OVA 323-339	Genscript Corporation	RP10610
Peptydy	Proimmune	PC0AD-D Brefeldin
A roztwór	BD Bioscience	555029
Mysi bloker Fc	e-Bioscience	14-0161-85
CD4	sprzężony z APCe-Bioscience	17-0041-81
CD8 sprzężony z FITC	e-Bioscience	11-0081-82
Roztwór do utrwalania/permeabilizacji	BD-Bioscience	554722
Bufor do permeabilizacji/płukania	BD-Bioscience	554723
anty-IFNγ-PE	e-Bioscience	12-7311-82
Cytometr przepływowy Accuri	BD Biologią