Artykuł metodologiczny

Ocena interakcji leukocytów-śródbłonka w warunkach przepływu w autoperfuzyjnym teście komorowym ex vivo z mikroprzepływem

9.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52130

⸱

30 grudnia 2014

 ,  , 
1Angiogenesis Laboratory, Department of Ophthalmology, Harvard Medical School, Massachusetts Eye & Ear Infirmary, 2St. Elizabeth's Medical Center

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół, który pozwala badaczowi ocenić dynamikę rekrutacji leukocytów ex vivo poprzez podłączenie komory pokrytej cząsteczkami adhezyjnymi pochodzącymi ze śródbłonka do układu krążenia myszy. Metoda ta ma istotne zalety, ponieważ pozwala na ocenę leukocytów we względnych warunkach biologicznych.

Streszczenie

Interakcje leukocyty-śródbłonek są wczesnymi i krytycznymi zdarzeniami w ostrym i przewlekłym zapaleniu i mogą, gdy są rozregulowane, pośredniczyć w uszkodzeniu tkanki, prowadząc do trwałego uszkodzenia patologicznego. Istniejące konwencjonalne testy pozwalają na analizę cząsteczek adhezyjnych leukocytów dopiero po ekstrakcji leukocytów z krwi. Wymaga to, aby krew przeszła kilka etapów, zanim leukocyty krwi obwodowej (PBL) będą gotowe do analizy, co z kolei może stymulować PBL, wpływając na wyniki badań. Test z autoperfuzją w komorze mikroprzepływowej pozwala jednak naukowcom badać dysregulację funkcjonalną wczesnych leukocytów przy użyciu przepływu ogólnoustrojowego żywej myszy, mając jednocześnie swobodę manipulowania powlekaną komorą. Za pomocą modelu choroby funkcjonalną ekspresję cząsteczek adhezyjnych leukocytów można ocenić i określić ilościowo w komorze z mikroszkła pokrytej unieruchomionymi cząsteczkami adhezyjnymi śródbłonka ex vivo. W tym modelu krew przepływa między prawą tętnicą szyjną wspólną a lewą żyłą szyjną zewnętrzną żywej myszy w znieczuleniu, co umożliwia interakcję natywnych PBL w komorze. Analiza eksperymentalna w czasie rzeczywistym jest przeprowadzana za pomocą mikroskopu przyżyciowego, a także urządzenia ciśnieniowego Harvard Apparatus. Zastosowanie regulatora przepływu w punkcie wejściowym szklanej komory pozwala na uzyskanie porównywalnych fizjologicznych warunków przepływu między eksperymentami. Głównym wynikiem jest prędkość toczenia leukocytów, która jest mierzona za pomocą ogólnodostępnego oprogramowania ImageJ National Institutes of Health. Podsumowując, autoperperfuzyjny test w komorze mikroprzepływowej zapewnia optymalne środowisko fizjologiczne do badania interakcji śródbłonka leukocytów i pozwala naukowcom wyciągać dokładne wnioski podczas badania stanu zapalnego.

Wprowadzenie

Stan zapalny jest uniwersalną reakcją organizmu na uraz i jest kluczowym krokiem zarówno w funkcjonowaniu wrodzonego, jak i adaptacyjnego układu odpornościowego. W odpowiedzi na uraz i/lub bodźce zapalne komórki śródbłonka regulują w górę określone cząsteczki adhezyjne; Prowadzi to do wynaczynienia leukocytów przez śródbłonek mikronaczyniowy, głównie w żyłkach zawłosionych naczyń włosowatych. Proces ten rozpoczyna się od uwiązania swobodnie płynących leukocytów w krwiobiegu na śródbłonku. Stabilne zwijanie i mocne przyleganie leukocytów, co z kolei prowadzi do transmigracji i wydzielania czynników cytotoksycznych, następuje po tym wiązaniu1,2. Wiadomo, że selektyny pośredniczą we wczesnych etapach kaskady3-5; Integryny są odpowiedzialne za późniejsze etapy mocnej adhezji i transmigracji1,6-8.

Coraz więcej dowodów sugeruje, że leukocyty i cząsteczki adhezyjne śródbłonka odgrywają istotną rolę w zwierzęcych modelach niedokrwienia, uszkodzenia reperfuzyjnego, astmy, łuszczycy, stwardnienia rozsianego i zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem9-12. W tych warunkach reakcja zapalna jest niewłaściwie kierowana, aby zaatakować własne ciało, co powoduje rozpad zdrowej tkanki. Istniejące środki przeciwzapalne (takie jak niesteroidowe leki przeciwzapalne, kortykosteroidy lub inne środki chemioterapeutyczne) niosą ze sobą ryzyko poważnych skutków ubocznych przy długotrwałym stosowaniu13. Dlatego bardzo interesujące jest posiadanie odpowiednich narzędzi zdolnych do identyfikacji cząsteczek specyficznych dla choroby, które ostatecznie mogą być ukierunkowane tak, aby uzyskać pożądane działanie przeciwzapalne, pozostając jednocześnie nietoksycznymi14.

Istniejące metody in vitro, takie jak statyczny test adhezji leukocytów, były stosowane już w 1976 roku15. Komora z przepływem równoległym została po raz pierwszy użyta in vitro w 1987 roku do badania interakcji leukocytów-śródbłonka w warunkach przepływu. W tych eksperymentach stymulowane ludzkie leukocyty wielojądrzaste (PMN) z krwi żylnej były perfundowane przez monowarstwę pierwotnych ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC). Do kontroli hemodynamicznych warunków przepływu zastosowano pompę strzykawkową Harvard Apparatus16. Alternatywnie, aby uniknąć izolacji sztucznych leukocytów, użyto krwi pełnej w połączeniu ze szklaną komorą pokrytą unieruchomionymi cząsteczkami adhezyjnymi17.

Aby uniknąć stymulacji leukocytów i mechanistycznie badać ich interakcję z cząsteczkami adhezyjnymi w przybliżonych warunkach fizjologicznych, opracowano ex vivo autoperfundowany, pozaustrojowy, tętniczo-żylny obwód16. W tym obwodzie krew przepływa między prawą tętnicą szyjną wspólną a lewą żyłą szyjną zewnętrzną żywej myszy w znieczuleniu, umożliwiając interakcję natywnych PBL w szklanej komorze mikroprzepływowej pokrytej pojedynczymi lub współunieruchomionymi cząsteczkami adhezyjnymi. Główną zaletą tego systemu jest możliwość wykorzystania genetycznie modyfikowanych myszy, u których szlaki zapalne są bezpośrednio lub pośrednio manipulowane. Dodatkowo istnieje możliwość określenia wyizolowanego udziału cząsteczek adhezyjnych leukocytów w zapaleniu, bez aktywacji zewnętrznej, w warunkach przepływu. Zastosowanie regulatora przepływu w punkcie wejściowym komory przepływowej zapewnia szeroki zakres eksperymentalnych zmian sił ścinających, które naśladują systemy tętnicze lub żylne18-22. W tym miejscu bardzo szczegółowo opisujemy protokół dotyczący przygotowania i przeprowadzenia testu komorowego ex vivo z autoperfuzją mikroprzepływową.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach były przeprowadzane zgodnie z oświadczeniem Stowarzyszenia Badań nad Wzrokiem i Okulistyką dotyczącą wykorzystania zwierząt w badaniach nad okulistyką i wzrokiem oraz wytycznymi i przepisami określonymi przez Komitet Opieki nad Zwierzętami w Massachusetts Eye and Ear Infirmary.

Dzień przed eksperymentem:

1. Przygotowanie rurki do komory przepływowej

  1. Aby przygotować stronę szyjną, podłącz rurkę polietylenową PE10 o średnicy 1 cm do rurki silikonowej o średnicy 6 cm, a następnie rurki polietylenowej o średnicy 5 cm. Po stronie szyjnej przygotuj się podobnie jak po stronie szyjnej, dodając rurkę T w silikonowej rurce o długości 6 cm w odległości około 1,5 cm od rurki polietylenowej o długości 1 cm (Rysunek 1A, B). Aby wprowadzić rurkę T, w razie potrzeby poszerz rurkę silikonową za pomocą drobnych kleszczyków.
  2. Podłącz jeden koniec 10 cm silikonowej rurki do przetwornika ciśnienia, a następnie włóż koniec T rurki T po stronie tętnicy szyjnej do drugiego końca. Upewnij się, że miejsca połączeń są szczelne i wolne od wycieków. W razie potrzeby nałóż mały prostokątny kawałek parafilmu na miejsce, w którym rurki pasują do siebie, aby zapobiec wyciekom (Rysunek 1C).

2. Powlekanie komory

  1. Przygotować białko powlekające powierzchnię śródbłonka (np. Selektyna P, cząsteczka adhezji międzykomórkowej-1 (ICAM-1), białko adhezji komórek naczyniowych-1 (VCAM-1)) w 0,1% BSA. Orientacyjnie 1 μg białka w 200 μl BSA wystarcza do pokrycia 4-5 komór. Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml podłączonej do igły o masie 25 G napełnić każdą komorę (0,04 x 0,4 x 50 mm) białkiem pokrywającym powierzchnię śródbłonka. Przechowywać powlekane komory w probówce o pojemności 15 ml w temperaturze 4 °C przez noc.

Dzień eksperymentu:

3. Przygotowanie komory

  1. Usunąć powlekane komory z 4 °C i połączyć rurki szyjne i szyjne z każdej strony. Uszczelnij połączenia, ostrożnie rozciągając mały prostokątny kawałek parafilmu nad miejscem, w którym rurka styka się z komorą. Za pomocą strzykawki napełnij komorę i rurkę 0,1% BSA (sprawdź, czy nie ma wycieków). Inkubować przez 45 minut.
  2. Przygotuj szalkę Petriego o średnicy 35 mm do przytrzymania komory, wycinając nacięcia z każdej strony naczynia. Ustabilizuj komorę w nacięciach; Następnie użyj małej kropli silikonu, aby przymocować komorę do naczynia w miejscu z nacięciem. Upewnij się, że komora jest wypoziomowana, patrząc pod mikroskop. Pozostaw silikon do wyschnięcia na co najmniej 15 minut.
  3. Napełnić strzykawkę blokującą o pojemności 60 ml heparyną i podłączyć do przetwornika ciśnienia. Podłącz przetwornik ciśnienia do rurki szyjnej w następującej kolejności: przetwornik, rurka silikonowa i rurka T.
    1. Użyj 1 cm PE50 między silikonową rurką podłączoną do przetwornika a rurką T, aby zabezpieczyć połączenie. Przełóż silikonową rurkę tętnicy szyjnej przez zacisk ciśnieniowy (Rysunek 1D). Przepuść heparynę 100USP przez rurkę i komorę, aż nie będzie pęcherzyków powietrza.

4. Konfiguracja oprogramowania

  1. Aby przygotować oprogramowanie, włącz komputer, mikroskop i otwarte urządzenie laboratoryjne. Kliknij dwukrotnie pakiet aplikacji Leica (LAS) (lub jego odpowiednik) i przygotuj folder do zapisania wideo: przeglądaj → pobierz → film → zdefiniuj sekwencję klipów (klipy = 15, czas nagrywania = 30 sekund i interwały = 15 sekund), a następnie kliknij znak "+", aby potwierdzić.
  2. Aby zarejestrować ciśnienie przepływu, otwórz plik LabChart (lub jego odpowiednik) i skoordynuj nazwę pliku z folderem nagrywania w kroku 4.1 powyżej.

5. Zabieg chirurgiczny

  1. Znieczulenie 8-10-tygodniowej myszy za pomocą kombinacji ketaminy (60 mg / kg) i ksylazyny (6 mg / kg) wstrzykiwanej dootrzewnowo (IP). Upewnij się, że głęboką sedację osiąga się w ciągu 5-10 minut poprzez utratę odruchu wycofania pedału. W razie potrzeby izofluran podawany w postaci maski na twarz może być podawany w razie potrzeby.
  2. W znieczuleniu umieść podkładkę rozgrzewającą pod klatką i ustaw na 37 °C, aby utrzymać temperaturę ciała. Po potwierdzeniu prawidłowego znieczulenia umieść mysz w pozycji brzusznej i pokryj oczy maścią z bacytracyny, aby zapobiec suchości oka.
  3. Następnie ogol włosy w miejscu nacięcia za pomocą żyletki i dokładnie oczyść to miejsce alkoholem.
  4. Po całkowitym znieczuleniu zabezpiecz zwierzę taśmą, utrzymując mysz w pozycji brzusznej. Odsłoń obszar szyi nożyczkami i usuń tarczycę, aby odsłonić tchawicę i naczynia (ryc. 2A).
  5. Oczyść tętnicę szyjną do całkowitego odsłonięcia, uważając, aby nie uszkodzić nerwu błędnego (ryc. 2B). Złóż kawałek szwu i przełóż zgięcie pod tętnicą szyjną, a następnie przetnij w zgięciu, tak aby pod tętnicą szyjną znajdowały się teraz 2 kawałki szwu. Owiń każdy szew w węzły (nie zaciskaj węzłów).
  6. Powtórz tę samą procedurę, aby odsłonić lewą żyłę szyjną (ryc. 2C), przygotowując szwy w ten sam sposób (ryc. 2D).
  7. Podłącz rurkę do układu krwionośnego myszy.
    1. Heparynizacja myszy polega na wstrzyknięciu 1 ml heparyny IP.
    2. Zaciśnij górny szew na tętnicy szyjnej. Umieść naczynie clamp tak nisko, jak to możliwe na tętnicy szyjnej (Rysunek 3A). Użyj kleszczy, aby przytrzymać tętnicę za górny szew i wykonaj małe nacięcie, około 1/8 obwodu tętnicy, używając mikronożyczek (ryc. 3B).
    3. Przełóż rurkę tętnicy szyjnej przez drugi węzeł w górnym szwie i do nacięcia wykonanego w tętnicy. Zawiąż dolny szew tak, aby tętnica była uszczelniona wokół rurki (należy wykonać kilka węzłów, aby zapewnić szczelne uszczelnienie; Rysunek 3C).
    4. Powtórz tę samą procedurę wprowadzania rurki żyły szyjnej (zacisk naczynia nie jest potrzebny po stronie szyjnej; Rysunek 3D).
    5. Przetestuj przepływ, zwalniając naczynie clamp. Jeśli nie ma wycieków, przesuń mysz do mikroskopu i podłącz rurkę szyjną i żyłę szyjną do rurki komory (patrz załączony film, aby zobaczyć demonstrację procedury chirurgicznej).

6. Rejestrowanie prędkości toczenia

  1. Otwórz zacisk tętnicy szyjnej, aby napełnić komorę, tworząc obwód z układem krążenia myszy. Pozwól krwi krążyć przez 3-5 minut, aby warunki przepływu się ustabilizowały. W okresie oczekiwania 3-5 minut należy wyregulować stolik mikroskopu tak, aby komora znajdowała się na poziomie z jednego końca na drugi z obiektywem mikroskopu, a jej krawędź była równoległa do okna nagrywania wideo na ekranie.
  2. Napełnij zmodyfikowaną szalkę Petriego zawierającą szklaną komorę wodą, a następnie opuść obiektyw 10-krotnego zanurzenia w wodzie do naczynia tak, aby widoczne były komórki przepływające przez komorę. Może być konieczne dostosowanie natężenia światła w celu odpowiedniego oglądania komórek. Ogólnie rzecz biorąc, im mniejsza intensywność, tym lepiej.
  3. Wyreguluj zacisk na wężyku tak, aby przetwornik wskazywał stałe 30 mm Hg, odpowiadające średniemu fizjologicznemu ciśnieniu przepływu lub zgodnie z życzeniem.
  4. Naciśnij "start", aby rozpocząć nagrywanie zarówno wideo, jak i ciśnienia, z pierwszym upływem czasu blisko końca szyjnego i przesuwaniem się pod prąd w kierunku końca szyjnego, aż do zakończenia.
    UWAGA: Na tej samej myszy można badać kilka warunków powlekania przy użyciu różnych cząsteczek adhezyjnych przy użyciu wielu komór. W danym momencie nagrywana jest tylko jedna komora.
    1. Po zakończeniu nagrywania zamknij zawór w miejscu wejściowym, zatrzymując przepływ krwi. Wyjmij komorę i dopasuj nową komorę (pokrytą inną cząsteczką adhezyjną) do obwodu, używając cienkich kleszczyków w jednej ręce i rowkowanych kleszczyków w drugiej ręce. Wznów nagrywanie dla nowej komory zgodnie z opisem w krokach 6.1-6.4.
  5. Poddaj eutanazji wszystkie myszy przez uduszenie CO2 , a następnie zwichnięcie rdzenia kręgowego pod koniec eksperymentu. Procedura jest nieuleczalna, dlatego myszy są poddawane eutanazji przez zwichnięcie rdzenia kręgowego pod koniec eksperymentu.

7. Interpretacja wyników

  1. Do analizy zarejestrowanych danych służy wtyczka "M TrackJ" do oprogramowania ImageJ23.
  2. Przekonwertuj plik na skalę szarości, wybierając plik → zaimportuj → AVI → przekonwertuj na skalę szarości.
  3. Ustandaryzuj klatki za pomocą właściwości Wybierz → obrazu → → wprowadź odstępy między klatkami (i) → globalne. Oblicz odstępy między klatkami, dzieląc całkowity czas trwania filmu (zwykle 30 sekund) przez liczbę klatek w jednym filmie (pokazaną w górnym rogu okna wideo Obraz J).
  4. Zmierz przepływ każdego leukocytu za pomocą wtyczki Select → M TrackJ → Dodaj ścieżki → wybierz leukocyt → Śledź go z każdą klatką przez 15 - 20 sekund → Merge.
  5. Powtórz krok 7.4 dla wszystkich widocznych leukocytów.
  6. Określ średnią prędkość toczenia leukocytów za pomocą Wybierz miarę, → pojawią się dwie kolumny → Skopiuj wszystkie M TrakJ:Tracks do arkusza kalkulacyjnego. Kolumna oznaczona jako "średnia V" to toczenie leukocytów mierzone w pikselach na sekundę. Przelicz na μm/s, dzieląc przez 2/3.
  7. Aby przeanalizować dane dotyczące ciśnienia, zaznacz i wyeksportuj je do arkusza kalkulacyjnego, a następnie wykonaj następujące obliczenia: ΔP (mm Hg) i t (dyna/cm2) dla porównania między każdą grupą eksperymentalną. Po obliczeniach skopiuj dane do oprogramowania prism w celu sporządzenia wykresów.

Wyniki

Podczas każdego nagrania w komorze widoczne są jedynie leukocyty wchodzące w interakcje. Wyniki z reprezentatywnego eksperymentu przedstawiono na Rysunku 4. Białe strzałki wskazują poszczególne leukocyty, które zostały wychwycone przez badaną cząsteczkę adhezyjną i toczą się wzdłuż komory pomiędzy innymi, swobodnie przepływającymi komórkami w strumieniu krwi. Częsty artefakt poza komorą, widoczny we wszystkich obrazach, stanowią duże ciemne sfery. Ciemne sfery pomagają odbiorcy ocenić ruch leukocytów w odniesieniu do punktu stałego. Przesunięcie leukocytów w czasie 22 sec można zaobserwować w relacji do tych sfer. Wykres na tym samym rysunku przedstawia końcowy rozkład danych, z którego wynika, że Tx1 zmniejsza prędkość toczenia (przesunięcie w lewo), a Tx2 zwiększa prędkość (przesunięcie w prawo) w porównaniu z kontrolą.

Narzędzia do montażu komory, schemat konfiguracji komory, przetwornik z zaciskiem przepływowym, regulacja ciśnienia.
Rycina 1: Przygotowanie rurek do komory przepływowej. (A) Narzędzia wymagane do montażu rurek i komory (mikrokomora szklana 0,4 x 0,04 x 50 mm, rurka polietylenowa PE10, rurka polietylenowa PE60, rurka silikonowa 002, rurka Y, rurka T, szalka Petriego 35 mm, pęseta precyzyjna, nożyczki precyzyjne, uchwyt do rurek, zacisk naczyniowy, jedwabna nić chirurgiczna 7-0. (B) Przygotowanie rurek do tętnicy szyjnej i żyły szyjnej w celu przekierowania przepływu krwi mysiej przez powleczoną komorę. (C) Podłączenie rurki z tętnicy szyjnej do przetwornika ciśnienia. (D) Przeciągnięcie rurki z przetwornika przez zacisk w celu regulacji szybkości przepływu krwi. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Schemat procedury chirurgicznej przedstawiający odsłonięcie tchawicy, tętnicy szyjnej i żyły szyjnej u gryzonia.
Rycina 2: Odsłanianie tętnicy szyjnej i żyły szyjnej. (A) Ostrożnie naciąć obszar szyi, aby odsłonić tchawicę. (B) Oczyścić prawą tętnicę szyjną tak, aby pod naczynie można było przełożyć nitkę szwy (żółta przerywana linia obrysowuje tętnicę szyjną). (C) Oczyścić lewą żyłę szyjną tak, aby pod naczynie można było przełożyć nitkę szwy (żółta przerywana linia obrysowuje żyłę szyjną). (D) Umieścić luźno zawiązane szwy w górnym i dolnym odcinku tętnicy szyjnej oraz żyły szyjnej (strzałki wskazują górne i dolne odcinki naczyń). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat procedury chirurgicznej przedstawiający etapy wprowadzania cewników do tętnicy szyjnej i żyły szyjnej.
Rycina 3: Podłączenie cewników do tętnicy szyjnej i żyły szyjnej. (A) Zaciśnij górny węzeł na tętnicy szyjnej i umieść zacisk poniżej dolnego węzła. (B) Za pomocą mikronożyczek wykonaj niewielkie nacięcie w tętnicy szyjnej, obejmujące około 1/8 jej obwodu (żółte przerywane koło wskazuje miejsce nacięcia). (C) Wprowadź cewnik do tętnicy szyjnej i zabezpiecz go co najmniej dwoma szwami (zielona przerywana linia przedstawia cewnik, a żółta przerywana linia tętnicę szyjną). (D) W podobny sposób wprowadź cewnik do żyły szyjnej (zielona przerywana linia przedstawia cewnik, a żółta przerywana linia żyłę szyjną). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rolowanie leukocytów w mikrokanale, obrazy mikroskopowe i analiza wykresu rozkładu prędkości.
Rycina 4: Reprezentatywny przebieg czasowy rolowania leukocytów przez komorę przepływową (Pasek skali = 100 μm) (białe groty strzałek wskazują rolowane leukocyty). Wykres przedstawia reprezentatywne wyniki po eksporcie do programu graficznego (Tx1 i Tx2 to grupy badawcze, a CTR to grupa kontrolna). Tx1 reprezentuje terapię, w której leukocyty zwalniają, co prowadzi do zmniejszenia prędkości rolowania leukocytów i przesunięcia wykresu w lewo w porównaniu z grupą nieleczoną (CTR), podczas gdy Tx2 prowadzi do przesunięcia w prawo, co odzwierciedla wzrost prędkości rolowania leukocytów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Dyskusja

Proces rekrutacji leukocytów jest kluczowym krokiem w odpowiedzi zapalnej; Polega ona na migracji leukocytów z układu krwionośnego w kierunku tkanek docelowych, gdzie są one w stanie pełnić swoją funkcję efektorową. Rekrutacja leukocytów jest integralną częścią różnych stanów zapalnych, takich jak blaszki miażdżycowe, zawał mięśnia sercowego, niedokrwienie/reperfuzja i chirurgia przeszczepu1, a także wiele stanów neurozapalnych związanych z OUN10-12,20,24,25. Biorąc pod uwagę różnorodność stanów chorobowych, które obejmuje rekrutacja leukocytów, autoperfuzyjna komora mikroprzepływowa stanowi niezbędne narzędzie umożliwiające badaczowi badanie dynamiki migracji leukocytów.

W ciągu ostatnich kilku dekad opracowano szereg testów in vitro w celu zbadania dynamiki adhezji komórek leukocytów26. Niestety, wszystkie te testy wymagają ekstrakcji leukocytów z krwi, wprowadzając aktywację mechaniczną. Aby zbliżyć się do środowiska in vivo , dokonano adaptacji w celu pobrania próbek krwi pełnej i kontrolowania hemodynamicznych warunków przepływu16,17. Tutaj rozszerzamy wcześniejsze postępy w tej dziedzinie, łącząc powlekaną komorę z układem krążenia myszy. Jesteśmy w stanie regulować przepływ krwi do fizjologicznego zakresu i badać dynamikę toczenia się leukocytów. Powlekana komora daje nam możliwość badania oddziaływań leukocytów z określonymi cząsteczkami adhezyjnymi. Ponieważ system funkcjonuje jako jednostka obsługiwana przez żywą mysz, bardziej naśladuje środowisko naturalne, co pozwala nam badać interakcje leukocyty-śródbłonek w różnych immunologicznych modelach myszy. Dodatkowo system ten pozwala nam korzystać z wielu dostępnych genetycznych modeli myszy. Chociaż system nie odwzorowuje w pełni środowiska in vivo , stanowi platformę do badania określonych elementów leukocytów w warunkach fizjologicznych, co wcześniej nie było możliwe. Mimo że przybliża nas to o krok do bardziej fizjologicznego środowiska, istnieją ograniczenia systemu. Nie odwzorowuje w pełni złożonej matrycy 3D układu krwionośnego, więc jesteśmy w stanie ocenić tylko niektóre elementy interakcji leukocytów, które są ograniczone do powłoki komory. Ponadto należy dołożyć wszelkich starań, aby zapewnić zamknięty system krążenia myszy, postępując zgodnie ze wszystkimi krokami wymienionymi w protokole. Wprowadzenie pęcherzyków powietrza znacznie wpłynie na dokładność i powtarzalność eksperymentów.

Chociaż opisujemy zastosowanie komory Autoperfuzyjnego Mikroprzepływu do oceny dynamiki toczenia leukocytów, procedura może zostać spersonalizowana przez badaczy w celu zbadania różnych chorób. Na przykład komórki rakowe dają przerzuty poprzez ekspresję wielu wspólnych integryn wspólnych dla leukocytów. Badanie ich dynamiki toczenia się w otoczeniu, które bardziej naśladuje środowisko in vivo , może pomóc w naszej wiedzy, a być może także w przewidywaniu inwazyjnej natury niektórych komórek nowotworowych. Jednym z możliwych podejść może być połączenie techniki znakowania komórek nowotworowych, takiej jak GFP27, wraz z testem w komorze przepływowej w celu śledzenia dynamiki toczenia komórek rakowych wykazujących ekspresję GFP. Biorąc pod uwagę elastyczność powlekania komory różnymi substancjami i łączenia wielu komór z tą samą myszą, interesujące będzie zobaczenie, jak ta procedura jest modyfikowana do użytku w innych laboratoriach w połączeniu z genetycznie zmodyfikowanymi myszami i modelami chorób. Technika, którą tu opisujemy, dotyka jedynie znacznie szerszego potencjału aplikacyjnego, który jest ograniczony jedynie kreatywnością badacza.

Oświadczenia

Autorzy (L.M., H.S. i K.M.C.) nie mają żadnych konkurencyjnych interesów finansowych do ujawnienia.

Podziękowania

Badania opisane w tej publikacji były wspierane przez National Eye Institute of the National Institutes of Health pod numerami nagród: R01EY022084/S1 (KMC), T32EY007145 (HS) i P30EY014104. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health. Dodatkowe wsparcie zostało zapewnione przez Massachusetts Lions Eye Research Fund (K.M.C.) oraz Special Scholar Award od Research to Prevent Blindness (dla K.M.C.).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Komora z mikroszkła 0,4 x 0,04 x 50 mmVitroCom2540-050
Rurka polietylenowa PE 10Fisher Scientific427400
Rurka polietylenowa PE 60Fisher Scientific427416
Rurka silikonowa 002Fisher Scientific11-189-15A Rurka
YWartość Tworzywa sztuczneY210-6
T wartość rurytworzywa sztuczneT410-6
Żel silikonowySklep z narzędziami - Strona główna Depo
35 mm szalka PetriegoCorning430165
ParafilmPechiney Plastikowe opakowaniePM996
Kleszczyki precyzyjneFST11253-25
Cienkie nożyczkiFST15000-08
Uchwyt na rurkęFST00608-11
Aplikator zaciskowyFST18057-14
Zacisk naczyniowyFST18055-04
6-0 nici jedwabneGeorge Tiemann & Co160-1215-6/0
25 x 1 G igłyBD305125
30 x 1/2 Gigły BD305106
Heparyna 100 jednostek USP/mlApteka szpitalna

Bibliografia

  1. Barreiro, O., Sanchez-Madrid, F. Molecular basis of leukocyte-endothelium interactions during the inflammatory response. Revista Espanola de Cardiologia. 62, 552-562 (2009).
  2. Muller, W. A. Leukocyte-endothelial-cell interactions in leukocyte transmigration and the inflammatory response. Trends in Immunology. 24, 327-334 (2003).
  3. Alon, R., Ley, K. Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells. Current Opinion in Cell Biology. 20, 525-532 (2008).
  4. Mehta, P., Cummings, R. D., McEver, R. P. Affinity and kinetic analysis of P-selectin binding to P-selectin glycoprotein ligand-1. The Journal of Biological Chemistry. 273, 32506-32513 (1998).
  5. Nicholson, M. W., Barclay, A. N., Singer, M. S., Rosen, S. D., vander Merwe, P. A. Affinity and kinetic analysis of L-selectin (CD62L) binding to glycosylation-dependent cell-adhesion molecule-1. The Journal of Biological Chemistry. 273, 763-770 (1998).
  6. Sandig, M., Negrou, E., Rogers, K. A. Changes in the distribution of LFA-1, catenins, and F-actin during transendothelial migration of monocytes in culture. Journal of Cell Science. 110 (22), 2807-2818 (1997).
  7. Shaw, S. K., et al. Coordinated redistribution of leukocyte LFA-1 and endothelial cell ICAM-1 accompany neutrophil transmigration. The Journal of Experimental Medicine. 200, 1571-1580 (2004).
  8. Woodfin, A., et al. JAM-A mediates neutrophil transmigration in a stimulus-specific manner in vivo: evidence for sequential roles for JAM-A and PECAM-1 in neutrophil transmigration. Blood. 110, 1848-1856 (2007).
  9. Blankenberg, S., Barbaux, S., Tiret, L. Adhesion molecules and atherosclerosis. Atherosclerosis. 170, 191-203 (2003).
  10. Parmeggiani, F., et al. Mechanism of inflammation in age-related macular degeneration. Mediators of Inflammation. 2012, 546786(2012).
  11. Ding, X., Patel, M., Chan, C. C. Molecular pathology of age-related macular degeneration. Progress in Retinal and Eye Research. 28, 1-18 (2009).
  12. Xu, H., Chen, M., Forrester, J. V. Para-inflammation in the aging retina. Progress in Retinal and Eye Research. 28, 348-368 (2009).
  13. Peterson, K., et al. Drug Class Review: Nonsteroidal Antiinflammatory Drugs (NSAIDs): Final Update 4 Report. Drug Class Reviews. , Oregon Health & Science University. Portland, OR. (2010).
  14. Ulbrich, H., Eriksson, E. E., Lindbom, L. Leukocyte and endothelial cell adhesion molecules as targets for therapeutic interventions in inflammatory disease. Trends in Pharmacological Sciences. 24, 640-647 (2003).
  15. Stamper, H. B., Woodruff, J. J. Lymphocyte homing into lymph nodes: in vitro demonstration of the selective affinity of recirculating lymphocytes for high-endothelial venules. The Journal of Experimental Medicine. 144, 828-833 (1976).
  16. Lawrence, M. B., McIntire, L. V., Eskin, S. G. Effect of flow on polymorphonuclear leukocyte/endothelial cell adhesion. Blood. 70, 1284-1290 (1987).
  17. Abbitt, K. B., Nash, G. B. Characteristics of leucocyte adhesion directly observed in flowing whole blood in vitro. British Journal of Haematology. 112, 55-63 (2001).
  18. Smith, M. L., Sperandio, M., Galkina, E. V., Ley, K. Autoperfused mouse flow chamber reveals synergistic neutrophil accumulation through P-selectin and E-selectin. Journal of Leukocyte Biology. 76, 985-993 (2004).
  19. Yuan, J., Melder, R. J., Jain, R. K., Munn, L. L. Lateral view flow system for studies of cell adhesion and deformation under flow conditions. BioTechniques. 30, 388-394 (2001).
  20. Moalem, G., et al. Autoimmune T cells protect neurons from secondary degeneration after central nervous system axotomy. Nature Medicine. 5, 49-55 (1999).
  21. Hafezi-Moghadam, A., Thomas, K. L., Cornelssen, C. A novel mouse-driven ex vivo flow chamber for the study of leukocyte and platelet function. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 286, 876-892 (2004).
  22. Almulki, L., et al. Surprising up-regulation of P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1) in endotoxin-induced uveitis. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 23, 929-939 (2009).
  23. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
  24. Rapalino, O., et al. Implantation of stimulated homologous macrophages results in partial recovery of paraplegic rats. Nature Medicine. 4, 814-821 (1998).
  25. Yoles, E., et al. Protective autoimmunity is a physiological response to CNS trauma. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 21, 3740-3748 (2001).
  26. Buchanan, M. R., Vazquez, M. J., Gimbrone, M. A. Arachidonic acid metabolism and the adhesion of human polymorphonuclear leukocytes to cultured vascular endothelial cells. Blood. 62, 889-895 (1983).
  27. Connor, K. M., et al. Manganese superoxide dismutase enhances the invasive and migratory activity of tumor cells. Cancer Res. 67, 10260-10267 (2007).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Komora mikroprzep ywowa ex vivofizjologiczne warunki przep ywupr dko toczenia si leukocyt wmikroskopia wewn trz yciowaprzetwornik ci nieniaanaliza w programie ImageJcz steczki adhezyjne r db onkaleukocyty krwi obwodowejt tniczo ylny obieg zamkni ty

Powiązane artykuły