Wykrywanie kompleksów białkowo-białkowych in situ w połączeniu nerwowo-mięśniowym larw Drosophila za pomocą testu ligacji zbliżeniowej

Podsumowanie

Ten protokół pokazuje, jak można użyć testu ligacji zbliżeniowej do wykrywania interakcji in situ białko-białko w połączeniu nerwowo-mięśniowym larw Drosophila. Dzięki tej technice wykazano, że duże dyski i Hu-li tai shao tworzą kompleks w regionie postsynaptycznym, związek wcześniej zidentyfikowany poprzez koimmunoprecypitację.

Streszczenie

Discs large (Dlg) jest konserwatywnym członkiem rodziny kinaz guanylanowych związanych z błoną i służy jako główne białko rusztowania w larwalnym złączu nerwowo-mięśniowym (NMJ) u Drosophila. Wcześniejsze badania wykazały, że postsynaptyczny rozkład Dlg w larwalnym NMJ pokrywa się z rozkładem Hu-li tai shao (Hts), homologiem do addudyn ssaków. Ponadto zaobserwowano, że Dlg i Hts tworzą ze sobą kompleks na podstawie eksperymentów z koimmunoprecypitacją z udziałem całych dorosłych lizatów much. Ze względu na charakter tych eksperymentów nie wiadomo było jednak, czy kompleks ten występuje konkretnie w NMJ podczas rozwoju larw.

Test ligacji zbliżeniowej (PLA) to niedawno opracowana technika stosowana głównie w hodowlach komórkowych i tkankowych, która może wykrywać interakcje białko-białko in situ. W tym teście próbki są inkubowane z pierwszorzędowymi przeciwciałami przeciwko dwóm białkom będącym przedmiotem zainteresowania przy użyciu standardowych procedur immunohistochemicznych. Przeciwciała pierwszorzędowe są następnie wykrywane za pomocą specjalnie zaprojektowanej pary przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z oligonukleotydami, zwanych sondami PLA, które mogą być używane do generowania sygnału tylko wtedy, gdy dwie sondy zwiążą się w bliskiej odległości od siebie. W ten sposób można uwidocznić białka znajdujące się w kompleksie. W tym miejscu pokazano, w jaki sposób można wykorzystać PLA do wykrywania interakcji białko-białko in situ w larwalach Drosophila NMJ. Technikę tę przeprowadza się na preparatach mięśni ściany ciała larw, aby pokazać, że kompleks między Dlg i Hts rzeczywiście istnieje w regionie postsynaptycznym NMJ.

Wprowadzenie

Drosophila Discs large (Dlg) jest konserwatywnym członkiem rodziny białek rusztowania kinazy guanylanowej związanych z błoną, które pomagają organizować składanie dużych kompleksów białkowych w określonych miejscach błony plazmatycznej. Pierwotnie zidentyfikowane jako białko supresorowe nowotworu, Dlg służy jako ważny wyznacznik nabłonkowej polaryzacji apikopodstawnej ^1,2,3. Dlg służy również jako główny moduł rusztowania w złączu nerwowo-mięśniowym (NMJ) glutaminergicznym neuronów ruchowych podczas rozwoju larwalnego ⁴. Dlg odgrywa różne role w larwalach NMJ, a jego plejotropizm opiera się na zdolności do łączenia się z wieloma białkami ^5,6. Jednym z takich białek jest Hu-li tai shao (Hts), homolog ssaków adducyny, które zostały opisane głównie w odniesieniu do ich roli w regulacji cytoszkieletu spektryny aktyny ⁷. Wcześniej wykazano, że Dlg i Hts mogą tworzyć ze sobą kompleks na podstawie eksperymentów in vitro z udziałem całych dorosłych lizatów much ⁸. Jedną z wad tych wyników jest jednak to, że nie wskazują one, gdzie ten kompleks się formuje. Za pomocą immunohistochemii obserwuje się, że rozkłady Dlg i Hts nakładają się na siebie w błonie postsynaptycznej larw NMJ, ale czy są one w kompleksie w tym regionie ⁸? Jak ostatnio wykazano i szczegółowo opisano tutaj, test ligacji zbliżeniowej (PLA) służy do poszukiwania związku in situ między Dlg i Hts, w szczególności w larwie NMJ ²⁷.

PLA to stosunkowo nowa technika stosowana głównie w hodowlach komórkowych i tkankowych, która może wykrywać interakcje białko-białko in situ ⁹. W tym teście pierwszorzędowe przeciwciała przeciwko dwóm białkom będącym przedmiotem zainteresowania są wykrywane za pomocą pary specyficznych dla gatunku przeciwciał drugorzędowych, zwanych sondami PLA, które są sprzężone z oligonukleotydami (Figura 1A, B). Jeśli dwa białka znajdują się w bliskiej odległości od siebie (tj. w odległości kilkudziesięciu nanometrów), odległość między dołączonymi sondami PLA można zniwelować poprzez hybrydyzację dwóch dodatkowych oligonukleotydów łącznikowych (ryc. 1C). W tej konformacji wolne końce oligonukleotydów łącznikowych są wystarczająco blisko, aby się ze sobą stykać, a po ligacji in situ można utworzyć zamkniętą kolistą cząsteczkę DNA (ryc. 1D). Okrągła cząsteczka DNA służy jako matryca do amplifikacji in situ w toczeniu koła, która jest zapoczątkowana przez jeden z oligonukleotydów sprzężonych z sondami PLA (ryc. 1E). Sekwencje w powstałym amplifikowanym, konkatenerycznym produkcie DNA można następnie wizualizować za pomocą znakowanych fluorescencyjnie, komplementarnych sond oligonukleotydowych (ryc. 1F). Ponieważ amplifikowane DNA pozostaje przyłączone do jednej z sond PLA, można łatwo ustalić subkomórkową lokalizację interakcji białko-białko w tkance.

Kilka metod jest powszechnie używanych do wykrywania interakcji białko-białko, w tym techniki in vitro, takie jak koimmunoprecypitacja, testy pull-down i badania przesiewowe drożdży dwuhybrydowych, oraz techniki in vivo, takie jak Förster Resonance Energy Transfer (FRET) i Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC). Pułapką technik in vitro jest to, że nie identyfikują one, gdzie interakcja zachodzi endogennie, podczas gdy wyżej wymienione techniki in vivo obejmują sztuczną ekspresję białek fuzyjnych, które mogą nie odzwierciedlać natywnego zachowania ich endogennych odpowiedników. Jedną z głównych zalet PLA jest to, że jest w stanie określić w tkance subkomórkową lokalizację endogennych interaktorów białkowych, które znajdują się blisko siebie i prawdopodobnie tworzą kompleks, przy czym stopień bliskości wymagany do wygenerowania sygnału jest porównywalny z FRET i BiFC. PLA może wykrywać interakcje o wysokiej swoistości i czułości dzięki sprzężeniu rozpoznawania przeciwciał i amplifikacji DNA. W ten sposób test może generować dyskretne, jasne sygnały w postaci puncta, które ujawniają dokładne położenie oddziaływania. Ponadto można wykryć ledwo widoczne antygeny. Wreszcie, PLA jest stosunkowo prostą techniką do wykonania i nie zajmuje więcej czasu niż standardowa procedura immunohistochemiczna. W związku z tym PLA zapewnia techniczną przewagę nad innymi testami interakcji białko-białko, które często są nękane długim czasem przygotowania i obszernym rozwiązywaniem problemów.

Ten protokół pokazuje, jak PLA może być zastosowany do larwy Drosophila NMJ w celu wykrywania endogennych interakcji białko-białko in situ. W tym przypadku PLA wykonuje się na preparatach mięśni ściany ciała larw, w których wykazano, że Dlg i Hts rzeczywiście występują w kompleksie w regionie postsynaptycznym NMJ. PLA nie był wcześniej używany do badania larw NMJ, a obecnie istnieje tylko kilka opublikowanych prac, w których zastosowano ten test w tkance Drosophila. Oczekuje się, że dalsza ekspozycja PLA na społeczność Drosophila spowoduje jego zwiększone wykorzystanie jako dodatkowego narzędzia uzupełniającego inne, częściej stosowane testy interakcji białko-białko.

Protokół

1. Przygotowanie ściany ciała

UWAGA: Przygotowanie ścian ciała larw w trzecim stadium rozwojowym (do badania złączy nerwowo-mięśniowych (NMJs), które unerwiają mięśnie ściany ciała) przeprowadzono zgodnie z wcześniejszym opisem w pracy Brent et al. ¹⁰ lub Ramachandran i Budnik ^11,12, lecz z pewnymi modyfikacjami.

1. Sekcja
   1. Hodować linie muszek i prowadzić krzyżówki w temperaturze 25 °C przez pięć do sześciu dni zgodnie ze standardowymi procedurami ¹³.
   2. Za pomocą precyzyjnej pęsety należy wyłowić pełzające larwy trzeciego stadium z fiolek lub butelek.
   3. Przemyj larwy w małej szalce Petri z solą fosforanowo-buforowaną (PBS), aby usunąć cząsteczki pokarmu.
   4. Umieść jedną larwę na krążku z Sylgardu i zanurz ją w kilku kroplach lodowatego PBS. Zastosowanie lodowatego PBS pomoże ogłuszyć larwę, co ułatwi manipulację. Przez cały czas trwania sekcji należy dbać o to, aby preparat był stale zanurzony w PBS, aby zapobiec jego wysychaniu.
   5. Ułóż larwę grzbietem do góry w taki sposób, aby dwa pęczki tchawiczne były widoczne pod mikroskopem stereoskopowym (Rysunek 2A). Za pomocą pęsety chwyć szpilkę entomologiczną i przyszpil larwę za tylny koniec w pobliżu przetchanic (Rycina 2B). Za pomocą innego szpilki przebij kutykulę na przednim końcu, w pobliżu haczyków gębowych. Delikatnie rozciągnij larwę wzdłuż jej osi, a następnie przymocuj ją szpilką (Rycina 2B).
   6. Za pomocą nożyczek do mikrosekcji uciśnij tylny koniec w pobliżu szpilki, aby utworzyć niewielki otwór. Nacięcie powinno być na tyle powierzchowne, aby przebić jedynie kutykulę.
   7. Wprowadź końcówkę dolnego ostrza nożyczek do nacięcia, a następnie przetnij wzdłuż całej długości linii środkowej grzbietowej pomiędzy dwoma traktami tchawiczymi (Rycina 2C). Podczas cięcia kieruj ostrza nożyczek lekko ku górze, aby uniknąć uszkodzenia mięśni brzusznej ściany ciała.
   8. Wykonaj niewielkie poziome nacięcie nieco przednio w stosunku do umieszczonego z tyłu pinu (Rycina 2C). Wykonać kolejne, podobne nacięcie nieco bardziej posterioralnie względem umieszczonego wcześniej anterioralnie pinu (Rysunek 2C). Nacięcia powinny przejść jedynie przez kutykulę.
      UWAGA: Trzy nacięcia wykonane w krokach 1.1.7 i 1.1.8 powinny łącznie przypominać literę „po zakończeniu, t. j.należy wykonać lewą i prawą klapkę na stronie grzbietowej ciała larwy.
   9. Ostrożnie usuń organy wewnętrzne za pomocą pęsety. Dodanie kilku silnych kropel PBS pomoże wypłukać organy z ciała larwy, co ułatwi ich usunięcie. Należy unikać nakłuwania ciała larwy, ponieważ spowoduje to uszkodzenie mięśni ściany ciała.
   10. Rozprostować ciało larwy i przytwierdzić jego narożniki szpilkami (Rysunek 2D). Podczas przypinania rozciągnąć ścianę ciała zarówno w poziomie, jak i w pionie, aby utworzyć równomiernie napięty prostokąt (patrz Rycina 2G (dla zachowania kształtu), uważając, aby w tym procesie nie przerwać mięśni ściany ciała.
   11. Dokończ usuwanie wszelkich pozostałych narządów wewnętrznych (Rysunek 2E).
2. Fiksacja i permeabilizacja
   1. Zanurzyć przypięte ścianie ciała w kilku kroplach roztworu Bouina. Inkubować przez 15 min w lodzie. Alternatywnie można zastosować 4% paraformaldehyd (PFA) jako zamienny utrwalacz; inkubować przez 30 min.
   2. Przepłukać trzykrotnie roztworem buforu fosforanowo-solnego z dodatkiem Tritonu (PBT).
   3. Za pomocą precyzyjnej pęsety ostrożnie usuń piny i przenieś ścianki ciała, chwytając je za narożniki, do zylikonizowanej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 0,65 ml.
   4. Przechowywać ściany ciała w PBT w temperaturze 4 °C do momentu rozpoczęcia procedury PLA. Aby uzyskać optymalne wyniki, należy rozpocząć immunostaining ścian ciała w ciągu jednego lub dwóch dni od sekcji.
      UWAGA: Aby zaoszczędzić odczynniki i zapewnić równą traktację wszystkich ścianek ciała podczas analizy, różne genotypy można umieścić w jednej probówce. Genotypy można rozróżnić, przycinając narożniki ścianek ciała w różny sposób (patrz Rycina 2F (np. dla przykładów).

2. Immunohistochemia

UWAGA: Immunobarwienie ścian ciała larw trzeciego stadium przeprowadzono zgodnie z opisem w pracach Brent et al. ¹⁴ oraz Ramachandran i Budnik ¹¹, z pewnymi modyfikacjami ^11,14.
UWAGA: Wszystkie etapy należy przeprowadzać w temperaturze pokojowej i przy łagodnym mieszaniu, chyba że wskazano inaczej.

1. Blokowanie
   1. Przemyć ściany ciała roztworem PBT trzy razy po 10 min.
   2. Blokować 1% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) przez 1 h.
2. Immunobarwienie
   1. Inkubować ściany ciała z mysimi i króliczymi przeciwciałami pierwszorzędowymi przeciwko dwóm białkom docelowym (rozcieńczonymi w 1% BSA) przez 2 h w temperaturze pokojowej lub przez noc w 4 °C. W tym przypadku należy zastosować przeciwciało mysie anty-Dlg w rozcieńczeniu 1:10 oraz królicze anty-HtsM w rozcieńczeniu 1:250 ^15,16. Można również dołączyć przeciwciała przeciwko markerom, które nie są produkowane u myszy ani królika — np. zastosować kozie anty-Hrp w rozcieńczeniu 1:200 w celu wyznaczenia błon neuronowych.
   2. Przemyć roztworem PBT trzy razy po 10 min.
   3. Inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z fluoroforem w celu wykrycia markerów (rozcieńczonymi w 1% BSA) przez 2 h w temperaturze pokojowej lub przez noc w 4 °C. Ponieważ sygnał PLA jest później wizualizowany za pomocą czerwonego fluoroforu, do wykrycia markera należy użyć innego fluoroforu — np. zastosować przeciwciało anty-kozie sprzężone z FITC w rozcieńczeniu 1:200 do wykrycia przeciwciała koziego anty-Hrp. Ze względu na zastosowanie reagentów światłoczułych, od tego momentu przechowywać probówki w ciemności.
      UWAGA: Stosowany zestaw umożliwia przeprowadzenie PLA pomiędzy przeciwciałami pierwszorzędowymi wytworzonymi u myszy i królika, przy czym sygnał jest wizualizowany w kanale czerwonym w mikroskopii konfokalnej. W razie potrzeby dostępne są inne zestawy, które pozwalają na wykonanie testu z przeciwciałami pierwszorzędowymi wytworzonymi u innych gatunków i wizualizację sygnału w innych kanałach.

3. Test ligacji bliskości (Proximity Ligation Assay)

UWAGA: Wszystkie etapy należy przeprowadzać w temperaturze pokojowej i przy delikatnym mieszaniu, chyba że wskazano inaczej.

1. Sondy PLA
   1. Przemyć ścianki ciała w roztworze PBT trzykrotnie, po 10 min za każdym razem.
   2. Inkubować z sondami PLA (każda w rozcieńczeniu 1:5 w 1% BSA) przez 2 hr w 37 °C. W tym przypadku użyć 40 µl sondy PLA anti-mouse MINUS, 40 µl sondy PLA anti-rabbit PLUS oraz 120 µl 1% BSA, aby zapewnić właściwe zanurzenie i wymieszanie 5-10 ścianek ciała. Rozcieńczenie sond PLA nawet do 1:25 może nadal zapewniać odpowiedni stosunek sygnału do szumu (tzn. w przypadku tego eksperymentu).
2. Ligacja
   1. Przemyć ścianki ciała w Buforze do Płukania A dwukrotnie, po 5 min za każdym razem.
   2. Inkubować z roztworem do ligacji (rozcieńczenie Ligazy 1:40 w buforze do ligacji) przez 1 hr w 37 °C. W tym przypadku użyć 5 µl Ligazy, 40 µl buforu do ligacji oraz 155 µl wody wysokiej czystości, aby zapewnić właściwe zanurzenie i wymieszanie 5-10 ścianek ciała.
3. Amplifikacja
   1. Przemyć ścianki ciała w Buforze do Płukania A dwukrotnie, po 2 min za każdym razem.
   2. Inkubować z roztworem do amplifikacji (rozcieńczenie Polimerazy 1:80 w buforze do amplifikacji) przez 2 hr w 37 °C. W tym przypadku użyć 2,5 µl Polimerazy, 40 µl buforu do amplifikacji oraz 157,5 µl wody wysokiej czystości, aby zapewnić właściwe zanurzenie i wymieszanie 5-10 ścianek ciała.
4. Przygotowanie do obrazowania
   1. Przemyć ścianki ciała w Buforze do Płukania B dwukrotnie, po 10 min za każdym razem.
   2. Przemyć raz w roztworze 0,01x Buforu do Płukania B przez 1 min.
   3. Równoważyć w kilku kroplach medium montażowego przez co najmniej 30 min przed montażem lub przechowywać przez noc w 4 °C.
   4. Za pomocą precyzyjnej pęsety ostrożnie przenieść ścianki ciała na szkiełko obiektowe, kładąc je kutykulą do dołu. Ułożyć ścianki ciała w rzędach i w tej samej orientacji w jednej lub dwóch kroplach medium montażowego. Przykryć preparat szkiełkiem nakrywkowe 22 mm x 40 mm, dbając o to, aby nie powstały pęcherzyki powietrza, a następnie uszczelnić szkiełko bezbarwnym lakierem do paznokci.
   5. Przechowywać szkiełka w ciemności w -20 °C do czasu obrazowania konfokalnego.

Wyniki

W złączach nerwowo-mięśniowych (NMJ) larw trzeciego stadium rozwoju typu dzikiego, Dlg znajduje się głównie w błonie postsynaptycznej glutaminergicznych pęcherzy typu I, przy czym poziom immunoreaktywności Dlg jest bardziej wyraźny w pęcherzach typu Ib niż w pęcherzach typu Is (Ryc. 3A) ⁴. Hts występuje w całym mięśniu, ale koncentruje się w regionie postsynaptycznym, gdzie poziom immunoreaktywności Hts wydaje się być taki sam w obu typach pęcherzy typu I; białko to występuje również presynapt...

Dyskusja

Raport ten pokazuje, w jaki sposób PLA można zastosować do larwy Drosophila NMJ. Test przeprowadza się na preparatach mięśni ściany ciała larw w celu wykrycia endogennych oddziaływań białko-białko obecnych w NMJ. Dzięki tej technice wykazano, że Dlg i Hts znajdują się blisko siebie, a zatem istnieją w kompleksie, szczególnie w regionie postsynaptycznym ²⁷. Na poparcie tego wyniku, poprzednie badanie dostarczyło dowodów na ich związek z następującymi danymi: 1) immunoreaktywne dystrybucje Dlg i Hts nak...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kleszcze (drobne #5)	Almedic	A10-704
Sylgard Disc	World Precision Instruments	SYLG184	Wymieszaj bazę elastomerową i utwardzacz w proporcji 10:1. Ustawiany na 30 min. Wlać do formy (np. użyć 12-dołkowej płytki do hodowli komórkowej). Pozostaw na utwardzenie przez co najmniej 24 godziny. Podczas preparowania należy przykleić się do pokrywki z płytki Petriego o wymiarach 60 x 15 mm.
Szpilki minutien (0,0125  mm średnica końcówki)	Fine Science Tools	26002-10
Nożyczki do mikrodysekcji (bardzo cienkie)	Narzędzia do nauki	15200-00
Prowadnice			Przyklej dwa szkiełka nakrywkowe 22 x 22 mm2 na szkiełku mikroskopowym za pomocą przezroczystego lakieru do paznokci, pozostawiając < Odstęp 20 mm pomiędzy nimi do montażu próbki.
w1118	Bloomington Drosophila Stock Center	3605
hts01103	Bloomington Drosophila Stock Center	10989	Stado zostało ponownie zbalansowane za pomocą równoważnika GFP, dzięki czemu homozygotyczne mutanty mogą być wybierane na podstawie braku sygnału GFP.
1x PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami): 3  mM NaH2PO4, 7  mM Na2HPO4, 130  mM NaCl, pH 7,0			NaH2PO4 (Caledon Laboratories - 8180-1), Na2HPO4 (Caledon - 8120-1), NaCl (Caledon - 7560-1)
Roztwór Bouina	Sigma-Aldrich	HT10132
4% PFA (Paraformaldehyd): 4% PFA w 1x PBS			PFA (nauka o anachemii - 66194-300). Zobacz doi:10.1101/pdb.rec9959 Cold Spring Harb Protoc 2006 w celu uzyskania instrukcji, jak przygotować rozwiązanie.
[nagłówek]
1x PBT (sól fizjologiczna buforowana fosforanami z trytonem): 1x PBS z 0,01% Triton			Triton X-100 (Sigma-Aldrich - T8787)
1% BSA (albumina surowicy bydlęcej): 1% BSA w 1x PBT			BSA (Bioshop Canada - ALB001). Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
mysz anty-Dlg (duże dyski)	Badania rozwojowe Hybridoma Bank	4F3	Stosować w rozcieńczeniu 1:10 w 1% BSA.
królik anty-HtsM (Hu-li tai shao)			Dostarczone przez dr Lynn Cooley (Uniwersytet Yale). Stosować w rozcieńczeniu 1:250 w 1% BSA.
królik anty-Pak (kinaza aktywowana p21)			Dostarczone przez dr Nicholasa Hardena (Simon Fraser University). Stosować w rozcieńczeniu 1:500 w 1% BSA.
mysz anty-Wg (bezskrzydły)	Badania rozwojowe Hybridoma Bank	4D4	Stosować w rozcieńczeniu 1:5 w 1% BSA.
kozia anty-Hrp (peroksydaza chrzanowa)	Jackson                          ImmunoResearch	123-065-021	Stosować w rozcieńczeniu 1:200 w 1% BSA.
Anty-kozioł z koniugacją FITC	Jackson                        ImmunoResearch	705-095-003	Stosować w rozcieńczeniu 1:200 w 1% masy ciała.
Duolink In Situ PLA Sonda anty-mysia MINUS	Sigma-Aldrich	DUO92004
Duolink In Situ PLA Sonda anty-królicza PLUS	Sigma-Aldrich	DUO92002
Duolink In Situ Odczynniki do wykrywania Red	Sigma-Aldrich	DUO92008
1x Bufor do płukania A: 0,01  M Tris, 0,15  M NaCl, 0,05% Tween 20, pH 7,4	Sigma-Aldrich	DUO82049	Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1), Tween 20 (Fisher Scientific - BP337)
1x Bufor do płukania B: 0,2  M Tris, 0,1  M NaCl, pH 7,5	Sigma-Aldrich	DUO82049	Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1)
0,01x Bufor do płukania B: 2  mM Tris, 1  mM NaCl, pH 7,5	Sigma-Aldrich	DUO82049	Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1)
Duolink In Situ Medium montażowe z DAPI	Sigma-Aldrich	DUO82040

precyzyjnej platformowe