Szybka i solidna analiza polaryzacji komórkowej i molekularnej indukowanej przez sygnalizację chemokinową

Podsumowanie

Sygnalizacja chemokiny wywołuje wyraźne zmiany w morfologii komórek i niektóre ważne redystrybucje białek wewnątrzkomórkowych. W tym przypadku dostarczany jest szybki i szczegółowy protokół do badania tych zdarzeń.

Streszczenie

Komórki reagują na stymulację chemokiną utratą swojego okrągłego kształtu w procesie zwanym polaryzacją oraz zmianą lokalizacji subkomórkowej wielu białek. Do badania tych zjawisk wykorzystano klasyczne techniki obrazowania. Wymagały one jednak ręcznego pozyskania wielu komórek, a następnie czasochłonnej kwantyfikacji morfologii i kolokalizacji barwienia dziesiątek komórek. W tym miejscu opisano szybką i potężną metodę badania tych zjawisk na próbkach składających się z kilku tysięcy komórek przy użyciu technologii obrazowania cytometrii przepływowej, która łączy zalety mikroskopu z zaletami cytometru. Wykorzystując limfocyty T stymulowane CCL19 i barwienie cząsteczek MHC klasy I i nitkowatej aktyny, przedstawiono strategię bramkowania w celu jednoczesnego pomiaru stopnia zmian kształtu i zakresu kolokalizacji markerów, na które wpływa sygnalizacja CCL19. Co więcej, ta strategia bramkowania pozwoliła nam zaobserwować segregację nitkowatych białek aktyny (z przodu) i fosforylowanych białek Ezrin-Radixin-Moesin (fosfo-ERM) (z tyłu) w spolaryzowanych limfocytach T po stymulacji CXCL12. Technika ta była również przydatna do obserwacji wpływu blokowania na polaryzację dwóch różnych elementów: hamowania polimeryzacji aktyny przez inhibitor farmakologiczny i ekspresji mutantów szlaku sygnałowego Par6/atypowy PKC. W ten sposób wykazano, że technika ta jest przydatna do analizy zarówno zmian morfologicznych, jak i redystrybucji białek.

Wprowadzenie

Chemokiny to małe rozpuszczalne białka, które przyciągają komórki do wyspecjalizowanych miejsc¹. Dlatego uczestniczą w prawidłowym pozycjonowaniu komórek w tkankach, co jest kluczową funkcją w rozwoju i fizjologii. Układ odpornościowy nie jest wyjątkiem od tej reguły, ponieważ opiera się na działaniu wielu różnych typów komórek, które działają wspólnie, aby wytworzyć skuteczną odpowiedź immunologiczną. Kontrolując specyficzną lokalizację jednego typu komórek odpornościowych w danym stanie, chemokiny są wstępnie wymagane, zanim obce antygeny będą mogły zostać wykryte i zneutralizowane.

W szczególności w limfocytach T, chemokiny wiążą się ze specyficznymi receptorami powierzchniowymi, które po zaangażowaniu wywołują wiele sygnałów wewnątrzkomórkowych (wzrost wapnia, fosforylacja ERK, aktywacja GTPaz Rho, wzrost powinowactwa integryn i zmiany cytoszkieletu), które sprzyjają ruchliwości komórek T^2,3. Na poziomie komórkowym można zaobserwować zmiany morfologiczne wywołane stymulacją chemokiną. Te zmiany w kształtach komórek są szczególnie dramatyczne w limfocytach T: odpoczywające limfocyty T mają okrągłą morfologię przypominającą koraliki, gdy podróżują w krwiobiegu. Jednak wykrycie obecności chemokin w miejscach zapalnych lub w pobliżu narządów limfatycznych zmieni kształt limfocytów T, które teraz przyjmują typową morfologię "lustrzanego odbicia dłoni" składającą się z formy dwubiegunowej: krawędź natarcia z przodu i krawędź spływu, czyli uropod,^{z tyłu.} Ponadto składniki wewnątrzkomórkowe mogą segregować się w te dwa przeciwległe regiony spolaryzowanej komórki T, aby podtrzymać migrację. Na przykład polimeryzacja włókien aktynowych wzrasta po stymulacji chemokiną⁵, a spolimeryzowana aktyna gromadzi się z przodu spolaryzowanej limfocytu T². Z drugiej strony, kilka białek, takich jak fosforylowane białka z rodziny Ezrin-Radixin-Moesin (ERM), które łączą błonę plazmatyczną z korowym cytoszkieletem F-aktyny, ponownie lokalizują się w uropodach spolaryzowanych limfocytów T⁶. Co ciekawe, my i inni wykazaliśmy, że ten proces polaryzacji jest wymagany do migracji limfocytów T. Rzeczywiście, każde leczenie, które zakłóca polaryzację, hamuje ruchliwość komórek. Na przykład hamowanie aktywności członków rodziny atypowych kinaz białkowych C (PKC), PKCζ i PKCι blokuje polaryzację limfocytów T i ich migracyjny proces skanowania komórek dendrytycznych⁷. Polaryzacja limfocytów T jest również regulowana przez GTPazy Rho. Wykazaliśmy, że modulacja aktywności RhoA przez niedawno opisane białko Fam65b zakłóca zmiany morfologii limfocytów T i ich zdolność do migracji w teście Transwell⁶. Ponieważ polaryzacja jest niezbędnym etapem dla ruchliwości komórek, ważne jest, aby móc określić ją ilościowo jako główny odczyt odpowiedzi chemokin. Zmiany kształtu komórki były wcześniej mierzone ręcznie⁸. Tego rodzaju kwantyfikacja jest jednak bardzo czasochłonna, przez co zwykle bierze się pod uwagę tylko kilkadziesiąt komórek.

Tutaj prezentowana jest nowa metoda szybkiego ilościowego określania stopnia zmian kształtu limfocytów T narażonych na stymulację chemokinami. Stosowana jest technologia obrazowania cytometrii przepływowej (patrz Tabela specyficznych odczynników/sprzętu), która łączy zalety cytometru przepływowego i mikroskopu⁹ w celu skutecznego ilościowego określenia ilości spolaryzowanych komórek w różnych warunkach stymulacji chemokinami. Oprócz kwantyfikacji zmian morfologicznych, które można solidnie zmierzyć za pomocą tej technologii, możliwa jest również ocena zmian w subkomórkowej lokalizacji niektórych białek po sygnalizacji chemokinowej.

Protokół

1. Przygotowanie limfocytów T

1. Przygotować pierwotne mysie lub ludzkie limfocyty T zgodnie z opisem^10,11.
2. Hodować ludzkie limfocyty T w kompletnym pożywce RPMI z 10% ludzką surowicą AB o gęstości 2 - 3 x 10⁶ komórek/ml.
   UWAGA: Użycie płodowej surowicy cielęcej (FCS) zamiast ludzkiej surowicy może wywołać spontaniczną polaryzację dużej części ludzkich limfocytów T w hodowli. Trzymaj te komórki w hodowli przez 4-5 dni i kontynuuj je w dowolnym momencie w tym okresie.
3. Utrzymuj mysie limfocyty T w kompletnym pożywce RPMI uzupełnionej 10% FCS o podobnej gęstości komórek. Stosować natychmiast lub następnego dnia, po posiewie O/N w temperaturze 37 °C w obecności 10 ng/ml IL7.
4. Hoduj ludzką linię komórek T CEM w kompletnym RPMI uzupełnionym 10% FCS.

2. Stymulacja chemokiny

1. Przemyć 5 x 10⁵ komórek na warunki eksperymentalne w ciepłym pożywce HBSS uzupełnionej 10 mM Hepes. W przypadku niektórych eksperymentów kotransfekcja pierwotnych ludzkich limfocytów T dzień wcześniej z 2 μg pmaxGFP i 8 μg pcDNA3.1 ⁺ (pusty wektor, kontrola), martwa kinaza PKCζ lub N-końcowe plazmidy Par6.
2. Zawiesić osad komórkowy w ciepłym podłożu HBSS-Hepes (użyć 0,3 ml x liczba warunków doświadczalnych).
3. Rozprowadzić komórki w probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
   UWAGA: Dlatego jedna probówka odpowiadająca pojedynczemu warunkowi eksperymentalnemu będzie zawierała 5 x 10⁵ komórek w 0,3 ml pożywki HBSS-Hepes. W przypadku niektórych eksperymentów dodaj 500 nM latrunkuliny A lub nośnika (DMSO) i inkubuj komórki przez 30 minut przed stymulacją chemokiną.
4. Dodać od 10 do 500 ng/ml chemokiny CCL19 lub CXCL12 do każdej probówki.
   UWAGA: Zwykle używamy 10 - 200 ng / ml chemokiny dla ludzkich limfocytów T. Komórki CEM nie wykazują ekspresji receptora CCR7, który wiąże CCL19. Dlatego komórki CEM będą w stanie zareagować tylko na stymulację CXCL12. Ponadto należy stosować wyższe stężenia chemokiny (300 - 500 ng / ml) do polaryzacji mysich limfocytów T.
5. Odwróć probówki kilka razy i inkubuj je w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 8 lub 10 minut odpowiednio dla pierwotnych limfocytów T lub CEM.
6. Zatrzymaj proces polaryzacji, dodając do każdej probówki 0,3 ml ciepłego roztworu zawierającego 2% paraformaldehydu (PFA) i 10 mM Hepes w PBS. Odwrócić probówki i inkubować je w temperaturze 37 °C przez 5 minut.

3. Plamy

1. Przenieś komórki z probówek do mikrowirówek do probówek cytometrii przepływowej.
2. Całkowicie napełnić probówki roztworem RT zawierającym 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 0,5 mM EDTA i 10 mM Hepes w PBS.
3. Odwirować probówki o masie 460 x g przez 4 minuty.
4. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 100 μl roztworu RT zawierającego 5% FCS w PBS.
5. Dodaj 5 μl FITC-anty-HLA-ABC do każdej probówki, wiruj je i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej, z dala od światła.
6. Umyć komórki raz PBS zawierającym 5% FCS i raz tylko PBS.
7. W temperaturze pokojowej: dodać 500 μl 1% PFA, inkubować przez 10 minut, następnie przemyć komórki roztworem zawierającym 1% BSA, 0,5 mM EDTA i 10 mM HEPES w PBS.
8. Odrzucić supernatant, całkowicie napełnić probówki roztworem PBS zawierającym 0,2% BSA, 0,1% saponiny, 0,5 mM EDTA i 10 mM Hepes (bufor permeabilizacyjny).
9. Umyj komórki dwukrotnie w tym medium.
10. Odwróć probówki, aby usunąć pożywkę i odwróć je, aby oddzielić osad komórkowy.
11. Dodać 0,25 μg/ml TRITC-falloidyny i/lub rozcieńczyć przeciwciało anty-P-ERM w stosunku 1:100 do każdej probówki, zawirować je i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
12. Przemyć komórki buforem permeabilizacyjnym. W razie potrzeby inkubować z fluorescencyjnym przeciwciałem drugorzędowym.
13. Ponownie zawiesić komórki w 200 μl PBS i przenieść je do probówek do mikrowirówek.
    UWAGA: Komórki są gotowe do akwizycji. Alternatywnie, zachowując maksymalną całkowitą objętość 200 μl na probówkę, dodać skoncentrowany PFA do końcowego stężenia 1% w celu zachowania barwień, jeśli komórki nie mają być użyte tego samego dnia do dalszego przetwarzania.

4. Akwizycja i analiza obrazów

1. Włącz aparaturę (patrz Tabela Specyficznych Odczynników/Sprzętu) i pozwól mu się skalibrować zgodnie z instrukcjami producenta.
   UWAGA: Oprogramowanie INSPIRE było używane z obiektywem 40X (0,75 NA). Do wszystkich raportowanych kwantyfikacji wykorzystano oprogramowanie IDEAS 3.0.
2. Przygotuj serię okien akwizycji, które można zapisać w szablonie do przyszłych eksperymentów. Narysuj histogramy, które określają ilościowo wartości gradientu RMS. Z populacji "W centrum uwagi", wybranej na histogramie gradientu RMS, wyznacz populację "Pojedyncza komórka" na histogramie obszaru. Po włożeniu probówki mikrowirówki do maszyny, wyreguluj moc lasera, włącz poszczególne komórki i uzyskaj 5,000 limfocytów T.
3. W oprogramowaniu Ideas otwórz plik akwizycji i utwórz histogram, który pokaże wartość RMS gradientu dla obrazów w jasnym polu (Kanał 1) uzyskanych dla każdej pojedynczej komórki. Narysuj bramkę na histogramie gradientu RMS, która uwzględnia komórki wykazujące wartość gradientu RMS powyżej 57,
   UWAGA: Gradient RMS pozwala na uwzględnienie w analizie tylko tych limfocytów T, które znajdują się w płaszczyźnie ogniskowej. Ustaliliśmy empirycznie, że pojedyncze komórki wykazujące wartość gradientu RMS większą niż 57 znajdują się w płaszczyźnie ogniskowej i można je dokładnie uwzględnić.
4. W menu Analiza/Maski utwórz nową maskę o nazwie Erode(M01,2) z maski morfologicznej na obrazach w jasnym polu M01, zerodowanej o 2 piksele. Następnie w menu Analiza/Obiekty utwórz nową cechę Obszaru, obliczoną na masce Ero(M01,2). Z komórek wybranych w poprzedniej bramie otwórz histogram pokazujący obszar komórek przy użyciu tej nowo utworzonej maski.
   UWAGA: Maski morfologii, które są dostępne domyślnie, są znacznie większe niż rzeczywisty rozmiar komórki. W ten sposób bardziej precyzyjne jest erodowanie go do 2 pikseli.
5. Narysuj bramkę na poszczególnych limfocytach T, z wyłączeniem koralików kalibracyjnych i zanieczyszczeń (mały obszar) oraz dubletów (duży obszar). Dostosuj tę bramkę przy każdym przejęciu.
   UWAGA: Różnice w rozmiarze komórki będą miały wpływ na położenie bramy. Ponieważ mysie limfocyty T są mniejsze niż ludzkie limfocyty T, które same w sobie są mniejsze niż komórki CEM, powierzchnia każdego typu komórki będzie proporcjonalna do jej wielkości.
6. Biorąc pod uwagę pojedyncze, ostre komórki, które zostały bramkowane w poprzednich krokach, otwórz wykres punktowy składający się z Raw Max Pixel na barwieniu HLA-ABC (kanał 2, oś x) jako funkcja Raw Max Pixel na barwieniu falloidyny (Kanał 4, oś y). Utwórz bramkę, aby wykluczyć niezabarwione lub nasycone zdarzenia fluorescencyjne. Otwórz dwa histogramy przedstawiające Raw Max Pixel dla barwień HLA-ABC (kanał 2) i falloidyny (kanał 4).
7. W menu Analiza/Maski utwórz nową maskę o nazwie Erode(M02,2) z maski morfologicznej komórek barwionych HLA-ABC (Kanał 2), zerodowanej o 2 piksele. Następnie w menu Analiza/Obiekty utwórz nowy element składający się z parametru Kołowość, obliczonego na podstawie parametru Erode(M02,2).
   UWAGA: Ten parametr mierzy odchylenie kształtu komórki od okręgu. Dlatego idealnie okrągła komórka T będzie miała wysoką wartość kołowości, podczas gdy wydłużone spolaryzowane komórki będą wykazywać niski wskaźnik kołowości.
8. Następnie utwórz kolejny histogram, który będzie zawierał wartości funkcji Kolistość z wcześniej bramkowanych komórek. Użyj tego histogramu, aby bezpośrednio wykreślić rozkład pojedynczej, wyostrzonej populacji komórek zgodnie z wartością kołowości dla każdej pojedynczej komórki.
9. Patrząc na kształt histogramu dla komórek niestymulowanych, narysuj bramkę dla komórek spolaryzowanych, zaczynając od najniższej wartości kołowości aż do wartości granicznej kolistości, w której wykreślona jest większość komórek niestymulowanych. Spójrz na wyświetlane statystyki dotyczące procentu spolaryzowanych komórek w populacji bramkowanej (%bramkowanej).
   UWAGA: Ustawiliśmy tę bramkę dla wartości indeksu cyrkularności poniżej 13.
10. Aby przyjrzeć się polaryzacji barwienia aktyną w komórkach, należy wykreślić histogram dla wartości podobieństwa jasnych szczegółów R3, porównując barwienie HLA-ABC (kanał 2) i barwienie falloidyną (kanał 4).
    UWAGA: Im większa wartość tej cechy, tym bardziej nałożone na siebie są te dwie plamy.
11. Używając tej samej strategii bramkowania, co poprzednio, narysuj bramkę na niestymulowanych komórkach dla segregowanego barwienia, która pokazuje procent komórek ze spolaryzowanym barwieniem aktyny.
12. Po zakończeniu, odsetek komórek wykazujących segregację w rozkładzie MHC klasy I i barwienia falloidyną, procent spolaryzowanych komórek wraz ze średnimi wartościami wskaźników cyrkularności i podobieństwa wszystkich komórek ± SD są pokazane w odpowiednich panelach statystycznych.

Wyniki

Pierwszy wybrany tutaj przykład dotyczy użycia ludzkich pierwotnych limfocytów T stymulowanych CCL19. Jednak tę samą strategię można zastosować w przypadku pierwotnych mysich limfocytów T, linii komórek T lub dowolnego innego typu komórek reagujących na stymulację chemokinami. Przedstawiona tutaj strategia bramkowania obejmuje serię okien, które wybierają skoncentrowane zdarzenia, a następnie pojedyncze komórki. Wreszcie zakres intensywności fluorescencji jest tutaj śledzony jako przykład na dwóch markerach: MHC klasy I ...

Dyskusja

Wykorzystując najnowszą technologię obrazowania cytometrii przepływowej, przedstawiono szybką i pouczającą strategię bramkowania do analizy zdarzeń komórkowych i molekularnych wywołanych stymulacją chemokin. Z pojedynczego eksperymentu można uzyskać dwa główne rodzaje informacji: zmiany w morfologii komórek wywołane stymulacją chemokiny oraz subkomórkową dystrybucję różnych białek podczas procesu polaryzacji. Co ciekawe, przedstawiono również dowody na możliwość analizy dużej liczby komórek, co pozwala na statystyczną so...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
RPMI	Gibco	61870-010
Surowica ludzka AB	PAA	C11-021	Podgrzej wstępnie, aby dezaktywować dopełniacz.
Surowica cielęca płodu	PAN Biotech	P30-3300	Podgrzej wstępnie, aby dezaktywować dopełniacz.
Zestaw nukleofactor ludzkich limfocytów T	Lonza	VCA-1002
Murine IL7	Peprotech	217-17
HBSS	Gibco	14025-050	Ciepły w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem.
Hepes	Gibco	15630-056
Murine CCL19	Peprotech	250-27B	Podwielokrotności rozmraża się na lodzie przed dodaniem chemokiny do komórek.
CCL19	Peprotech	300-29B	rozmraża się na lodzie przed dodaniem chemokiny do komórek.
Ludzkie CXCL12	Peprotech	300-28A	Aliquots są rozmrażane na lodzie przed dodaniem chemokiny do komórek. Ta chemokina może być również stosowana na mysich limfocytach T.
Mikroskopia elektronowa	PFA	157-8-100	Jest to 8% roztwór PFA w wodzie. Wymieszaj objętość do objętości z 2x PBS, aby uzyskać 4% roztwór PFA w PBS.
BSA	Sigma	A3059
Saponin	Fluka	84510
Alexa Fluor 594 falloidyna	Invitrogen	A12381
FITC-przeciwciało anty-HLA-ABC	Beckman Coulter	IM1838	klon B9.12.1
Przeciwciało anty-P-ERM	Technologia sygnalizacji komórkowej	3149P
ImageStreamx Mark II	Amnis