Artykuł metodologiczny

Szybka i solidna analiza polaryzacji komórkowej i molekularnej indukowanej przez sygnalizację chemokinową

DOI:

10.3791/52140

⸱

12 grudnia 2014

 , 
1Inserm U1016, Institut Cochin, 2Cnrs, UMR8104, 3Université Paris Descartes, Sorbonne Paris Cité

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sygnalizacja chemokiny wywołuje wyraźne zmiany w morfologii komórek i niektóre ważne redystrybucje białek wewnątrzkomórkowych. W tym przypadku dostarczany jest szybki i szczegółowy protokół do badania tych zdarzeń.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki reagują na stymulację chemokiną utratą swojego okrągłego kształtu w procesie zwanym polaryzacją oraz zmianą lokalizacji subkomórkowej wielu białek. Do badania tych zjawisk wykorzystano klasyczne techniki obrazowania. Wymagały one jednak ręcznego pozyskania wielu komórek, a następnie czasochłonnej kwantyfikacji morfologii i kolokalizacji barwienia dziesiątek komórek. W tym miejscu opisano szybką i potężną metodę badania tych zjawisk na próbkach składających się z kilku tysięcy komórek przy użyciu technologii obrazowania cytometrii przepływowej, która łączy zalety mikroskopu z zaletami cytometru. Wykorzystując limfocyty T stymulowane CCL19 i barwienie cząsteczek MHC klasy I i nitkowatej aktyny, przedstawiono strategię bramkowania w celu jednoczesnego pomiaru stopnia zmian kształtu i zakresu kolokalizacji markerów, na które wpływa sygnalizacja CCL19. Co więcej, ta strategia bramkowania pozwoliła nam zaobserwować segregację nitkowatych białek aktyny (z przodu) i fosforylowanych białek Ezrin-Radixin-Moesin (fosfo-ERM) (z tyłu) w spolaryzowanych limfocytach T po stymulacji CXCL12. Technika ta była również przydatna do obserwacji wpływu blokowania na polaryzację dwóch różnych elementów: hamowania polimeryzacji aktyny przez inhibitor farmakologiczny i ekspresji mutantów szlaku sygnałowego Par6/atypowy PKC. W ten sposób wykazano, że technika ta jest przydatna do analizy zarówno zmian morfologicznych, jak i redystrybucji białek.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chemokiny to małe rozpuszczalne białka, które przyciągają komórki do wyspecjalizowanych miejsc1. Dlatego uczestniczą w prawidłowym pozycjonowaniu komórek w tkankach, co jest kluczową funkcją w rozwoju i fizjologii. Układ odpornościowy nie jest wyjątkiem od tej reguły, ponieważ opiera się na działaniu wielu różnych typów komórek, które działają wspólnie, aby wytworzyć skuteczną odpowiedź immunologiczną. Kontrolując specyficzną lokalizację jednego typu komórek odpornościowych w danym stanie, chemokiny są wstępnie wymagane, zanim obce antygeny będą mogły zostać wykryte i zneutralizowane.

W szczególności w limfocytach T, chemokiny wi....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie limfocytów T

  1. Przygotować pierwotne mysie lub ludzkie limfocyty T zgodnie z opisem10,11.
  2. Hodować ludzkie limfocyty T w kompletnym pożywce RPMI z 10% ludzką surowicą AB o gęstości 2 - 3 x 106 komórek/ml.
    UWAGA: Użycie płodowej surowicy cielęcej (FCS) zamiast ludzkiej surowicy może wywołać spontaniczną polaryzację dużej części ludzkich limfocytów T w hodowli. Trzymaj te komórki w hodowli przez 4-5 dni i kontynuuj je w dowolnym momencie w tym okresie.
  3. Utrzymuj mysie limfocyty T w kompletnym pożywce RPMI uzupełnionej 10% FCS o podobnej gęstości komórek. Stosować natychmiast lub następnego dnia, p....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pierwszy wybrany tutaj przykład dotyczy użycia ludzkich pierwotnych limfocytów T stymulowanych CCL19. Jednak tę samą strategię można zastosować w przypadku pierwotnych mysich limfocytów T, linii komórek T lub dowolnego innego typu komórek reagujących na stymulację chemokinami. Przedstawiona tutaj strategia bramkowania obejmuje serię okien, które wybierają skoncentrowane zdarzenia, a następnie pojedyncze komórki. Wreszcie zakres intensywności fluorescencji jest tutaj śledzony jako przykład na dwóch markerach: MHC klasy I .......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykorzystując najnowszą technologię obrazowania cytometrii przepływowej, przedstawiono szybką i pouczającą strategię bramkowania do analizy zdarzeń komórkowych i molekularnych wywołanych stymulacją chemokin. Z pojedynczego eksperymentu można uzyskać dwa główne rodzaje informacji: zmiany w morfologii komórek wywołane stymulacją chemokiny oraz subkomórkową dystrybucję różnych białek podczas procesu polaryzacji. Co ciekawe, przedstawiono również dowody na możliwość analizy dużej liczby komórek, co pozwala na statystyczną so.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy bardzo dziękują Pierre'owi Bourdoncle'owi, Thomasowi Guilbertowi i Louise Rimbault z Cochin Imaging Facility. Prace te były wspierane przez Inserm, CNRS i Ligue Nationale contre le Cancer (Equipe labellisée).

....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
RPMIGibco61870-010
Surowica ludzka ABPAAC11-021Podgrzej wstępnie, aby dezaktywować dopełniacz.
Surowica cielęca płoduPAN BiotechP30-3300Podgrzej wstępnie, aby dezaktywować dopełniacz.
Zestaw nukleofactor ludzkich limfocytów TLonzaVCA-1002
Murine IL7Peprotech217-17
HBSSGibco14025-050Ciepły w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem.
HepesGibco15630-056
Murine CCL19Peprotech250-27BPodwielokrotności rozmraża się na lodzie przed dodaniem chemokiny do komórek.
CCL19Peprotech300-29Brozmraża się na lodzie przed dodaniem chemokiny do komórek.
Ludzkie CXCL12Peprotech300-28AAliquots są rozmrażane na lodzie przed dodaniem chemokiny do komórek. Ta chemokina może być również stosowana na mysich limfocytach T.
Mikroskopia elektronowaPFA157-8-100Jest to 8% roztwór PFA w wodzie. Wymieszaj objętość do objętości z 2x PBS, aby uzyskać 4% roztwór PFA w PBS.
BSASigmaA3059
SaponinFluka84510
Alexa Fluor 594 falloidynaInvitrogenA12381
FITC-przeciwciało anty-HLA-ABCBeckman CoulterIM1838klon B9.12.1
Przeciwciało anty-P-ERMTechnologia sygnalizacji komórkowej3149P
ImageStreamx Mark IIAmnis
Ludzkie podwielokrotności Nauki powiedział:

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rossi, D., Zlotnik, A. The biology of chemokines and their receptors. Annu Rev Immunol. 18, 217-242 (2000).
  2. Thelen, M., Stein, J. V. How chemokines invite leukocytes to dance. Nat Immunol. 9 (9), 953-959 (2008).
  3. Rougerie, P., Rho Delon, J.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Chemokine SignalingImaging Flow CytometryT Lymphocyte PolarizationActin SegregationMHC Class I StainingProtein Co localization AnalysisMorphological QuantificationPar6 PKC Pathway InhibitionCCL19 StimulationCXCL12 Stimulation

Powiązane artykuły