Artykuł metodologiczny

Regioselektywne celowanie biolistyczne w organotypowych wycinkach mózgu przy użyciu zmodyfikowanego pistoletu genowego

DOI:

10.3791/52148

⸱

24 października 2014

 ,  ,  , 
1Leslie Dan Faculty of Pharmacy, University of Toronto, 2MRC-Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, UK

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ostatnie ulepszenia w organotypowych preparatach do wycinania mózgu pozwoliły na ich wykorzystanie do zastosowań biotechnologicznych. Plastry organotypowe zachowują lokalne cechy strukturalne biologii in vivo, w tym funkcjonalne połączenia synaptyczne. Tutaj przedstawiamy regioselektywną biolistyczną metodę dostarczania do znakowania i genetycznej manipulacji tymi wycinkami.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transfekcja DNA była nieoceniona dla nauk biologicznych, a dzięki niedawnym postępom w organotypowych preparatach do wycinania mózgu, wpływ różnych heterologicznych genów może być łatwo badany, zachowując wiele aspektów biologii in vivo. Rośnie zainteresowanie transfekcyjnie różnicowanymi kończnie zróżnicowanymi neuronami, w przypadku których konwencjonalne metody transfekcji były obarczone trudnościami, takimi jak niska wydajność i znaczne straty żywotności. Transfekcja biolistyczna może obejść wiele z tych trudności, ale dopiero niedawno technika ta została zmodyfikowana tak, aby można ją było stosować w tkankach ssaków.

Nowe modyfikacje komory akceleratora zwiększyły precyzję strzelania pistoletu genowego i zwiększyły jego głębokość penetracji, jednocześnie pozwalając na użycie niższego ciśnienia gazu (50 psi) bez utraty efektywności transfekcji, a także pozwoliły na skoncentrowane regioselektywne rozprzestrzenianie się cząstek z dokładnością do 3 mm. Ponadto technika ta jest prosta i szybsza do wykonania niż żmudne mikroiniekcje. Zarówno przejściowa, jak i stabilna ekspresja jest możliwa przy bombardowaniu nanocząstkami, gdzie ekspresję episomalną można wykryć w ciągu 24 godzin, a przeżycie komórek okazało się lepsze lub co najmniej równe konwencjonalnym metodom. Technika ta ma jednak jedną zasadniczą zaletę: pozwala na zlokalizowanie transfekcji w pojedynczym ograniczonym promieniu, umożliwiając w ten sposób użytkownikowi anatomiczną izolację efektów heterologicznego genu. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół przygotowania żywotnych dorosłych plastrów organotypowych i poddania ich regioselektywnej transfekcji przy użyciu ulepszonego pistoletu genowego.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pierwotnie technika biolistyczna, co jest zwrotem od "balistyki biologicznej", została stworzona do transferu genów do komórek roślinnych za pośrednictwem cząsteczek1. Ta fizyczna metoda transformacji komórek przyspiesza mikro- lub nanocząstki z dużą prędkością, aby pokonać fizyczne bariery nieprzepuszczalnych błon komórkowych w celu dostarczenia ładunków, takich jak DNA lub barwniki. Ponieważ nie zależy to od specyficznych receptorów ligandowych i/lub właściwości biochemicznych błon powierzchniowych komórek, transfer genów za pośrednictwem cząstek może być łatwo stosowany do różnych systemów biologicznych, takich jak organotypowe wycinki mózgu.

Używanie plastrów organotypowych ma przewagę nad innymi platformami in vitro, ponieważ zachowują wiele właściwości anatomicznych i biochemicznych, które są istotne dla biologii in vivo 2-4. Plastry w większości zachowują lokalne cechy architektoniczne, z których pochodzą, oraz zachowują aktywność neurochemiczną i łączność synaps. Wykorzystanie wycinków mózgu do badań podstawowych i w przedsięwzięciach farmaceutycznych wzrosło jednocześnie z liczbą możliwych manipulacji biotechnologicznych w celu pomiaru i monitorowania neurobiologicznych zachowań mózguw kontekście podobnym do in vivo. Główną zaletą stosowania organotypowych systemów oznaczania opartych na warstwach jest to, że zapewniają one łatwą kontrolę eksperymentalną i umożliwiają precyzyjne manipulacje środowiskami zewnątrzkomórkowymi.

Owocnie, organotypowe systemy hodowli plastrów zostały stworzone z różnych obszarów mózgu, takich jak, ale nie tylko, kora mózgowa, rdzeń kręgowy i móżdżek8-10. Ponadto wykazano szereg kokultur, które pozwalają na ocenę komunikacji międzykomórkowej w dystalnych obszarach mózgu, a także między neuronami a komórkami patologicznymi11,12. Ustanowiono już wiele protokołów, aby z powodzeniem hodować plastry organotypowe i mogą utrzymać długoterminową żywotność, a wiele ostatnich badań wykorzystuje obecnie metody interfejsu błonowego i różne modyfikacje go13. Zasada ta utrzymuje plastry organotypowe na granicy faz między pożywką a nawilżoną atmosferą inkubatora poprzez umieszczenie plastrów na porowatym filtrze membranowym. Pożywka może zatem dostarczyć wystarczającą ilość składników odżywczych, aby odżywić plastry organotypowe za pomocą ruchu kapilarnego. Zazwyczaj plastry przygotowywane są ze zwierząt we wczesnym okresie pourodzenia (w wieku 3 - 9 dni; P3 - 9). Jednak tkanki mózgowe z tych wycinków wykazują wysoki poziom plastyczności komórkowej i mają wrodzoną odporność na naprężenia mechaniczne, co jest pomocne w uzyskaniu żywotnych kultur, jednak dojrzałe synapsy i obwody neuroanatomiczne nie rozwinęły się w pełni in vivo do 2 do 3 tygodni w wieku14 lat. Na przykład wcześniejsze obserwacje wykazały, że wycinki hipokampa uzyskane od noworodków P0-1, choć wysoce żywotne po przygotowaniu, stopniowo traciły pewne cechy morfologiczne. Zasadniczo wykazano, że nie nadają się do długoterminowych hodowli, co sugeruje, że niedojrzałe komórki były bardziej skłonne do dedyferencjacji w porównaniu z kulturami organotypowymi od starszych zwierząt15,16. Z tego powodu nasza metoda została zoptymalizowana dla dorosłych organotypowych wycinków mózgu, w których dojrzewanie i rozwój architektoniczny osiągnęły swoje końcowe etapy13,17-21. Niemniej jednak metoda ta nadaje się również do plastrów organotypowych noworodków i młodocianych.

Po wyprodukowaniu żywych wycinków organotypowych, cała płytka zawierająca plastry może zostać przeniesiona do wierzchowca biolistycznego i poddana regioselektywnemu dostarczaniu i transfekcji. Prawidłowe zamontowanie pistoletu genowego (jak opisano na rysunku 1), ustawionego pod kątem 90° w odległości 10 mm bezpośrednio nad plastrami (od otworu do tkanki), pozwala na szybkie biolistyczne dostarczenie ładunku pokrytego cząstkami złota o długości 40 nm. Ładunki te, takie jak barwniki i fluorescencyjne wektory DNA, a także wszelkie interesujące geny, są łatwo dostarczane do żywotnych plastrów. Metoda ta opisuje zatem protokół niezbędny do dostarczenia, w sposób regioselektywny, nanocząstek złota pokrytych ładunkiem do żywotnych organotypowych wycinków mózgu. Lufę pistoletu genowego i optymalne mocowanie można zobaczyć na rysunku 1. Więcej informacji na temat ulepszonej balistyki luf i nanocząstek można znaleźć w O'Brien, et al.Rozdział 17.

Kolejne udoskonalenia są również wskazane dla użytkownika w celu optymalizacji warunków, takich jak odpowiednia ilość złota dostarczanego na obszar docelowy, zdefiniowana jako Ilość Obciążenia Mikronośnika (MLQ), oraz określenie ilości załadowanego DNA na mg złota, zdefiniowanej jako Współczynnik Obciążenia DNA (DLR). Przed wytrąceniem DNA na cząsteczki złota i załadowaniem ich do rurki Tefzel, która zawiera właściwe "wkłady" pistoletu genowego, konieczne jest obliczenie ilości DNA i złota wymaganej do każdej transfekcji, która może się nieznacznie różnić w zależności od tkanek i warunków (należy zachować stosunek 1 mg złota i 1 μg DNA do 1:5). Niezbędne jest przygotowanie odpowiedniej proporcji MLQ do DLR, ponieważ w przeciwnym razie cząsteczki złota pokryte DNA mogą przylegać do siebie, tworząc większą niż oczekiwano aglomerację, co może zmniejszyć ogólną jednorodność rozprzestrzeniania się biolistycznego, a także zwiększyć uszkodzenie tkanek i cytotoksyczność.

Ta metoda pokazuje ostatnie ulepszenia w dostarczaniu biolistycznym, które zostały przetestowane i uznane za podatne na organotypowe wycinki mózgu noworodków, młodych i dorosłych. Co więcej, wykorzystując zmniejszone rozprzestrzenianie się biolistyczne lufy pistoletu genowego, użytkownik jest teraz w stanie selektywnie transfekować punktowy obszar w mózgu. Po odpowiednim czasie inkubacji ekspresję białek fluorescencyjnych, która osiąga maksymalną szybkość między 24 a 48 godzin, można uwidocznić za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej i konfokalnej. Fluorofory te umożliwiają analizę morfologiczną i lokalizację poszczególnych komórek w biologicznie istotnych strukturach. Jednak regioselektywna modulacja wycinków organotypowych przez inne geny heterologiczne może być również monitorowana za pomocą wszelkich innych testów podatnych na te preparaty. Możliwe strategie pracy dla zlokalizowanego dostarczania genu przedstawiono na rycinie 2.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykorzystanie zwierząt i tkanek zwierzęcych powinno ściśle przestrzegać zgody komisji etycznej zgodnie z lokalnymi zasadami i regulacjami. Wszystkie tkanki uzyskane podczas tego badania były zgodne z wytycznymi MRC-LMB dotyczącymi eksperymentów na zwierzętach.

1. Przygotowanie materiałów i podłoży hodowlanych

  1. Przygotować wszystkie roztwory przy użyciu wody Millipore; używać tylko odczynników o czystości analitycznej. Przygotuj i przechowuj wszystkie odczynniki w temperaturze pokojowej (chyba że wskazano inaczej).
  2. Przygotować 500 ml soli fizjologicznej buforowanej przez HEPES (10 mM HEPES, 120 mM NaCl pH 7,2). Przefiltrować przez sterylną jednostkę filtrującą 0,2 μm. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  3. Przygotować 500 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS; 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, pH 7,4). Sterylizuj w autoklawie.
  4. Przygotuj pożywkę neuronalną, uzupełniając DMEM (zmodyfikowaną pożywkę orła Dulbecco) 25 mM HEPES, 10% płodową surowicę cielęcą, 30 mM glukozy, suplement 1:100 N2, penicylinę-streptomycynę 1,100 U/ml; pH 7,2. Filtr ze sterylną jednostką filtrującą 0,2 μm. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  5. Przygotować roztwór podstawowy poliwinylopirolidonu (PVP) z 20 mg PVP w 1 ml 100% etanolu. Podzielić to na 1 ml ilości, zamrozić i przechowywać w temperaturze -20 °C. Roztwór roboczy ma moc 0,05 mg/ml, dlatego dodać 10 μl roztworu podstawowego PVP na każde 4 ml 100% etanolu.
  6. Przygotować 0,05 M roztwór podstawowy spermidyny w wodzie Millipore; dostosować pH do 7,2.
  7. Przygotować 2% roztwór agarozy w DMEM (2 g agarozy klasy do elektroforezy w 100 ml DMEM w wysterylizowanej butelce z zakrętką). Podgrzewaj to w kuchence mikrofalowej, aż agaroza się rozpuści. W razie potrzeby przechowywać w lodówce w temperaturze 4°C przez kilka tygodni.

2. Przygotowanie plastrów organotypowych

  1. Poddaj eutanazji myszy C57 Black 6 w pożądanym wieku przez uduszenie CO2, a następnie ścięcie. Usuń mózg za pomocą bocznych nacięć czaszki, zaczynając od otworu wielkiego, a kończąc na płatach węchowych. Delikatnie unieś czaszkę od tyłu, aby odsłonić mózg.
  2. Przecięcie między płatami węchowymi a korą czołową i rostralne do móżdżku. Delikatnie unieś rostralną część mózgu i przetnij nerwy wzrokowe. Na koniec usuń mózg i umieść go na szalce Petriego wypełnionej lodowatą solą fizjologiczną buforowaną przez HEPES na lodzie.
  3. Używając mikroskopu preparacyjnego, oderwij pia za pomocą cienkich kleszczy; ostrożnie usuń naczynia krwionośne i opony mózgowe wokół mózgu.
  4. Umieść świeży mózg w małej foremce do odbioru i przykryj go roztworem agarozy schłodzonym do temperatury nieco powyżej RT. Następnie szybko schłodzić formę do 4 °C, umieszczając ją na lodzie.
    UWAGA: Przetwarzaj plastry tak szybko, jak to możliwe, aby uniknąć utraty żywotności.
  5. Gdy agaroza stwardnieje (5 - 10 min), wyjmij mózg zatopiony w agarozie z formy (przytnij w razie potrzeby), a następnie przyklej go do platformy wibrokrajalnicy. Umieść go w komorze wibrokrajalnicy zawierającej sterylny, lodowaty PBS. Zdezynfekuj komorę wibroslicer przed użyciem 70% etanolem, aby zminimalizować późniejsze zanieczyszczenia.
  6. Wytnij mózg za pomocą specjalnie zbudowanego wibrokrajalnika lub komercyjnego odpowiednika. Koncepcja modelu polegała na zaprojektowaniu krajalnicy do tkanek, która mogłaby generować ruchy o dużej amplitudzie i wysokiej częstotliwości w poziomie do krawędzi ostrza, jednocześnie minimalizując drgania pionowe.
  7. Stosować częstotliwość oscylacji 90 Hz, amplitudę 1,5 - 2,0 mm, a ostrze tnące ustawić pod kątem 15° do płaszczyzny poziomej; ustawić blok montażowy przytrzymujący mózg osadzony w agarozie tak, aby poruszał się z prędkością 1,7 mm/min w kierunku ostrza. Zebrać skrawki (150 μm) do komory zawierającej lodowate pożywki hodowlane (DMEM Pen/Strep + 10% FCS). Zobacz wycinanie i manipulowanie wycinkami tkanek jako film uzupełniający w Arsenault i O'Brien13.
  8. Delikatnie umieścić plastry we wkładkach do hodowli komórkowych (0,4 μm, średnica 30 mm) w 6-dołkowej tacy z pożywką hodowlaną na zewnątrz wkładki i inkubować w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2,
    UWAGA: Aby zapewnić prawidłową żywotność tkanek, należy zachować szczególną delikatność podczas przenoszenia i manipulowania plastrami. Ponadto zbyt duża ilość płynu zapobiegnie przyleganiu plastrów organotypowych do membrany wkładu filtrującego. Jeśli tak się stanie, ponownie usuń nadmiar płynu lub płytki.
  9. Chociaż plastry organotypowe można hodować przez kilka tygodni, należy przystąpić do transfekcji nie później niż 4 dni po posiewie, aby uzyskać najlepsze plony transfekcji.
    UWAGA: Aby uniknąć przerostu gleju w długotrwałych warunkach hodowli, użyj pożywki AraC lub pożywki wolnej od surowicy2.

3. Przygotowanie mikro i nano-pocisków pokrytych DNA

  1. Przygotuj nanopociski z użyciem cząsteczek złota o średnicy 40 nm. Na krótko dodać 50 μl 0,05 M spermidyny i 10 μl DNA o stężeniu 1 mg/ml (pEYFP-N1) do 10 mg cząstek złota.
    1. Dodaj wapń i spermidynę do mieszaniny roztworu podczas przygotowywania mikrocząstek DNA-złota, aby pomóc w wiązaniu cząsteczek DNA z nanocząstkami złota.
      UWAGA: Ilość zużytego DNA na mg nośników złota (DLR) powinna wynosić od 1 do 5 μg DNA na 1 mg złota. Co więcej, ilość cząstek nośnika złota, które zostaną wystrzelone na nabój (MLQ), powinna sama w sobie wynosić od 0,1 do 0,5 mg złota. DLR i MLQ powinny być wypróbowane i zoptymalizowane dla każdego użytkownika, w zależności od konkretnego badanego systemu, a także rodzaju używanego pistoletu cząsteczkowego i genowego.
  2. Wymieszać za pomocą wiru, powoli dodając 50 μl 1 M CaCl2 we frakcjach 10 - 15 μl. Po 5 minutach sporadycznego wirowania, odwirować przy 1 000 x g przez 30 sekund, a następnie usunąć supernatant. Zawieś ponownie granulkę cząstek złota w 3,5 ml 0,075 M PVP.
  3. Narysować zawiesinę do rurki (o średnicy wewnętrznej 2,36 mm) za pomocą strzykawki. Umieść rurkę w stacji przygotowania przewodów. Pozwolić, aby cząsteczki złota opadły i usunąć supernatant przez aspirację za pomocą strzykawki. Obróć rurkę, aby równomiernie rozprowadzić cząsteczki złota, które następnie wysuszono przy stałym przepływie azotu w tempie 5 l na minutę.
  4. Aby stworzyć kule DNA, przetnij rurkę za pomocą obcinaka do rurek na 1 cm długości. Natychmiast włożyć do wkładu pistoletu genowego lub przechowywać w stanie wysuszonym (4 °C) do czasu, gdy będzie to wymagane.

4. Transfekcja biolistyczna na wycinkach organotypowych

  1. Wykonaj następujące czynności w sterylnym okapie z przepływem laminarnym.
  2. Włóż baterię 9 V i pusty uchwyt na naboje do pistoletu genowego Helios.
  3. Przymocuj pistolet genowy do zbiornika helu za pomocą węża helowego. Wystrzel 2-3 ślepe naboje (puste sloty) pod ciśnieniem 50 psi, aby zwiększyć ciśnienie w wężu helowym i zbiornikach w pistolecie.
  4. Załaduj naboje zawierające złoto pokryte DNA do uchwytów nabojów i załaduj uchwyt do pistoletu genowego.
  5. Odkręć przekładkę pistoletu genowego i przymocuj zmodyfikowaną lufę pistoletu genowego do pistoletu genowego.
  6. Za pomocą sterylnych kleszczyków umieść wkład filtrujący zawierający plasterek organotypowy w sterylnym plastikowym naczyniu.
  7. Usuń pożywkę z plasterków organotypowych.
  8. Ustaw ciśnienie gazu na 50 psi.
    UWAGA: Ochrona oczu jest niezbędna i zalecana jest ochrona słuchu.
  9. Umieść pistolet genowy w odpowiednich odległościach, korzystając z mocowania mierzonego do 10 mm. Ostrożnie skieruj środek lufy na żądany obszar dostarczania genów.
  10. Po wypaleniu wkładki należy ponownie umieścić w naczyniu na świeżych pożywkach i przywrócić je do normalnych warunków wzrostu, tj. 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5%CO2
    11. .
  11. Po zakończeniu zamknij zbiornik helu, zwolnij ciśnienie z pistoletu genowego i odłącz pistolet genowy od zbiornika helu.
  12. Wyjmij uchwyt na naboje i wyrzuć wkłady, a następnie wyczyść pistolet genowy.
  13. Sprawdź tkankę pod kątem morfologii i udanej penetracji, wizualizując plastry za pomocą odwróconego mikroskopu. Jeśli używasz mikrocząstek, równomiernie rozprowadź złoto; Na plasterku nie powinny być widoczne żadne gęste obszary cząsteczek złota. Nanocząstki ze względu na swoje niewielkie rozmiary nie mogą być postrzegane jako pojedyncze jednostki za pomocą konwencjonalnych technik mikroskopowych.
  14. Po upływie odpowiedniego odstępu czasu (zwykle 1 - 2 dni) utrwalić plastry w 4% paraformaldehydzie (PFA) do obserwacji mikroskopowej.
    UWAGA: Mocowanie w PFA nie zawsze jest pożądane. W przypadku obrazowania żywych komórek należy unikać tego kroku.

5. Naprawianie i wizualizacja wycinków mózgu

  1. Po transfekcji biolistycznej umyj plastry dwukrotnie w PBS przez 2 min.
  2. Utrwal plastry poprzez inkubację w świeżo przygotowanym, lodowatym 4% PFA w PBS przez 20 minut.
  3. Plastry myć dwukrotnie w PBS przez 2 minuty.
  4. Delikatnie przeciąć podpory membrany za pomocą skalpela, nie naruszając zamontowanych na nich plastrów. Użyj kleszczyków, aby umieścić każdą podporę/plasterek membrany na szkiełku mikroskopowym. Oprzyj plastry organotypowe na membranie na szkiełku podstawowym.
  5. Nałożyć jedną kroplę podłoża montażowego na plasterek i delikatnie nałożyć szkiełko nakrywkowe, bez użycia siły bezpośrednio stykającej się z plastrem organotypowym.
  6. Zabezpiecz szkiełko nakrywkowe cienką warstwą lakieru do paznokci.
  7. Zobacz plastry pod odpowiednim mikroskopem.

6. Zastosowania konfokalne

  1. Wizualizacja plastrów za pomocą pionowego skaningowego laserowego mikroskopu konfokalnego z soczewką obiektywową zanurzeniową z aperturą numeryczną 60x/1,4 (NA).
    UWAGA: Najbardziej problematyczną cechą mikroskopu konfokalnego jest rozmiar otworka (ustawiony na 1 AU), który jest w stanie wyizolować i zebrać płaszczyznę ostrości, eliminując w ten sposób nieostre "zamglenie" zwykle widoczne w próbce fluorescencyjnej. Drobne szczegóły są często przesłonięte przez tę mgłę i nie można ich wykryć w mikroskopie niekonfokalnym.
  2. Ustaw laser argonowy na długość fali wzbudzenia 488 nm i zoptymalizuj pod kątem zbierania emitowanego światła w paśmie od 500 do 520 nm. Zazwyczaj zbiera się obrazy o wymiarach 1,024 x 1,024 pikseli i ze stosami przekrojów z w odstępach 0,5 μm, aby objąć pełną szerokość każdej analizowanej komórki nerwowej.
    1. Aby zaobserwować morfologię jądra, przeciwdziałaj barwieniu tych komórek za pomocą DAPI (długość fali wzbudzenia ustawiona na 405 nm i światło emisyjne zebrane między 420 - 4 40 nm). Na koniec, aby zbadać czerwoną fluorescencję, ustaw laser na 561 nm dla wzbudzenia i 565 - 620 nm dla emisji.
  3. Zazwyczaj obrazy pozyskiwano przy użyciu 4-krotnego zoomu skanowania, który obejmował obszar 57,6 μm2; rozmiary obrazów mieściły się w obszarze 1 024 x 1 024 pikseli. Rejestruj stosy przekrojów Z w odstępach 0,5 μm i projekcje 5 - 8 klatek łącznie.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Żywotność warstw organotypowych może być monitorowana za pomocą aktywności dehydrogenazy mleczanowej, znakowania jodku propidyny i barwienia dUTP, jak to było wcześniej zgłaszane13,22. Oczywiste jest, że żywotność i integralność plastrów są ważne dla długotrwałej, trwałej ekspresji dostarczonego ładunku genetycznego. Po biolistycznym dostarczeniu do wycinków organotypowych, ekspresję fluorescencyjnego genu heterologicznego monitorowano za pomocą mikroskopii konfokalnej. Szczelność rozsiewu biolistycznego przy użyciu zmodyfikowanej lufy można zobaczyć na rysunku 3A. Rycina 3B przedstawia reprezentatywny obraz transfekowanego regionu hipokampa przy użyciu nanocząstek złota pokrytych DNA. Rycina 4 przedstawia reprezentatywne zdjęcia transfekowanych wycinków organotypowych dorosłych myszy. Jak widać na rycinie 4A, neuron Purkinjego z niezwykłym portem dendrytycznym znajdującym się na styku warstwy Purkinjego i warstwy molekularnej móżdżku wykazuje wyraźne znakowanie po przejściowej transfekcji biolistycznej z pEGFP-N1. Rycina 4B pokazuje większe powiększenie tych dendrytów, w których można zaobserwować kolce. Rycina 4C przedstawia komórkę piramidalną znajdującą się w regionie CA1 hipokampa po biolistycznym dostarczeniu nanocząstek złota pokrytych pDSredFP.

Barwniki zamiast fluorescencyjnie kodowanych ładunków DNA mogą być również używane w podobny sposób do wizualizacji cech morfologicznych w warstwach organotypowych. DiO, który znakuje błony plazmatyczne, może szybciej nakreślić morfologie poszczególnych komórek lub może być stosowany w połączeniu z biolistyczną powłoką DNA dostarczoną do tego samego regionu w celu potwierdzenia regiosselekcji. Jak widać na rycinie 5A, neuron zabarwiony DiO w hipokampie ma również długie dendryty z licznymi kolcami. Strzałka wskazuje akson, który jest identyfikowany przez obecność bultonów synaptycznych w porównaniu z kolcami dentrytycznymi na innych neurytach. Rysunek 5B pokazuje inny przykład CA1, który podkreśla liczne projekcje hipokampa z barwieniem przeciwstawnym DAPI w celu oznaczenia jądra. Rysunek 5C pokazuje większe powiększenie tego typu dendrytów równoległych z licznymi kolcami.

Ewidentnie, te obrazy ilustrują cechy morfologiczne po znakowaniu komórkowym. Nic nie stoi na przeszkodzie, aby tę samą metodologię zastosować do dostarczenia dowolnej liczby genów egzogennych pokrytych nanocząstkami złota. Aby umożliwić wizualne potwierdzenie udanej transfekcji, można skonstruować pojedynczy plazmid, który będzie wykazywał koekspresję zarówno genu będącego przedmiotem zainteresowania, jak i fluorescencyjnego białka reporterowego na tym samym wektorze.

figure-results-1
Rysunek 1. Lufa i mocowanie pistoletu genowego.(A) Ulepszona lufa opracowana przez dr O'Briena w MRC-LMB, która ma ograniczony rozrzut biolistyczny, który minimalizuje uszkodzenia tkanek poprzez obniżenie wymaganego ciśnienia do przyspieszenia cząstek. (B) Widok z boku zoptymalizowanego mocowania pistoletu genowego opracowanego przez dr Hendersona i dr Andrasa Nagya z Uniwersytetu w Toronto. Mocowanie utrzymuje pistolet genowy dokładnie pod kątem 90° prostopadle do plastrów organotypowych, umożliwiając jednocześnie użytkownikowi dokładną kontrolę odległości dostarczania biologicznego. W celu uzyskania optymalnych warunków biologicznych, otwór lufy należy umieścić bezpośrednio nad obszarem zainteresowania w odległości 10 mm od plastrów organotypowych. (C) Widok z tyłu mocowania pistoletu genowego. Obszar zainteresowania, który ma być transfekowany, musi być umieszczony bezpośrednio pod otworem lufy. Celowanie można potwierdzić za pomocą barwnika (diolistyczny) lub fluorescencyjnego transfekcji białek (biolistyczny). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rycina 2. Przygotowanie plastrów organotypowych i celowanie regioselektywne.(A) Wbudowany w DMEM mózg dorosłej myszy gotowy do krojenia. (B) Forma była przyklejona do mocowania wibrokrajalnicy z ostrzem gotowym do przecięcia plastra. (C) Regioselektywne heterologiczne strategie ekspresji genów do biolistycznego dostarczania do koronalnych organotypowych wycinków mózgu. Obrazy przygotowane na podstawie zdjęć uzyskanych z atlasu anatomicznego Allen Brain Atlas23. Lewy panel pokazuje dwa różne obszary mózgu jako przykład. Aby ograniczyć ekspresję genu (1) do obszaru korowego lewej półkuli. Aby ograniczyć heterologiczną ekspresję genów (2) do obszaru podwzgórza mózgu. Środkowy panel pokazuje, że ekspresję dwóch heterologicznych genów (3 i 4) można wyizolować i porównuje hipokamp dwóch półkul w tym samym wycinku organotypowym, zasadniczo eliminując wszelkie odchylenia wynikające z używania różnych sekcji i / lub dając możliwość zajęcia się dystalnymi przesłuchami z efektów tych genów. Prawy panel pokazuje możliwe nakładanie się transgenicznego dostarczania w celu ekspresji pierwszego genu (5) w precyzyjnym regionie korowym, podczas gdy ekspresja innego genu (6) w różnym, ale nakładającym się obszarze korowym. Pozwala to na analizę wpływu modulacji genetycznej każdego heterologicznego genu osobno, a także w połączeniu w tym samym wycinku. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3. Biolistyczny wzór rozproszenia widoczny na bibule filtracyjnej i obrazie w małym powiększeniu.(A) Ulepszoną lufę wystrzeliwano na bibułę filtracyjną w celu określenia rozprzestrzeniania się cząstek złota. Lewa strona pokazuje rozkład ulepszonej lufy, podczas gdy prawy panel pokazuje normalną lufę. pasek: 1 cm. Zdjęcie zaczerpnięte z O'Brien, et al.17. (B) Obraz w małym powiększeniu przedstawiający stochastyczny wzór transfekcji w obrębie 3 mm biolistycznego rozrzutu w okolicy hipokampa 6-tygodniowych myszy. Biały pasek: 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rycina 4. Biolistyczne dostarczanie fluorescencyjnego DNA kodowanego białkiem do organotypowych wycinków 6-tygodniowych myszy.(A) Odwrócone obrazy konfokalne nieruchomego organotypowego wycinka móżdżku transfekowanej komórki Purkinjego pokrytych pEGFP-N1 cząstek złota. Zdjęcie zostało wykonane w 40-krotnym powiększeniu. pasek: 30 μm. (B) Pokazuje 60-krotne powiększenie portu dentrytycznego innej komórki Purkinjego w celu uwydatnienia kolców. pasek: 5 μm. (C) Pokazuje konfokalny obraz nieruchomych wycinków pobranych z obszaru hipokampa w 60-krotnym powiększeniu czterech transfekowanych komórek piramidalnych DSredFP. pasek: 10 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5. Diolistyczne dostarczanie barwników fluorescencyjnych znakujących błonę do plastrów organotypowych.(A) pokazuje obrazowanie na żywo neuronu hipokampa oznaczonego DiO pod 20-krotnym powiększeniem. Kolce dentrytyczne można wyraźnie zaobserwować, podobnie jak akson, co można zidentyfikować po braku kolców dentrytycznych i obecności boutonów synaptycznych wskazanych białą strzałką. Biały pasek: 30 μm. (B) Wyraźne zabarwienie obszaru hipokampa oznaczone DiO i wybarwione przeciwstawnie DAPI. Biały pasek: 30 μm. (C) Większe powiększenie (60x) kolców dentrytycznych znajdujących się w regionie CA1 hipokampa. Biały pasek: 5 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół opisuje podejścia do dostarczania barwników i materiałów genetycznych do dorosłych wycinków organotypowych przy użyciu ulepszonego pistoletu genowego. Zasadniczo rodzaje barwników i różnorodność możliwych genów sprawiają, że metoda ta jest wieloaspektowa i może odpowiedzieć na szeroki zakres pytań biologicznych. Zastosowana metoda regioselektywnego dostarczania, w tym przypadku do określonego regionu mózgu, otwiera nowe możliwości eksperymentów, ponieważ heterologiczna modulacja genów zlokalizowanych obszarów w biologicznie istotnej architekturze nie była wcześniej łatwo wykonalna. Wcześniej ustaliliśmy, że metoda ta może być stosowana na dorosłych wycinkach organotypowych, w których dojrzałe synapsy są w pełni uformowane, ponieważ wykazała poprawę przeżywalności komórek i ekspresję genów heterologicznych przez wiele tygodni13. Wraz z pojawieniem się nowych i ulepszonych warunków hodowli mózgów ssaków, a także innych tkanek, zastosowanie regioselektywnych modulacji genetycznych stanie się coraz bardziej przydatne w szerokiej gamie analiz biochemicznych.

Jak podkreślimy w tym miejscu i jak już wcześniej wspomnieliśmyw innych 24 przypadkach, na dokładność i wiarygodność dostarczania danych biologicznych może mieć wpływ wiele różnych czynników. Po pierwsze, przygotowanie cząstki złota związanej z barwnikami lub DNA musi być odpowiednio zrównoważone, aby zapobiec agregacji i ułatwić wydalenie ładunku z naboju. Wapń i spermidyna w roztworze mikrocząstek DNA-złoto mogą wspomagać wiązanie cząsteczek DNA z nanocząstkami złota. Wcześniej określono zdolność nanocząstek do przenikania do komórek pod zmniejszonym ciśnieniem17. Po drugie, pistolet genowy musi być zamontowany tak stabilnie, jak to możliwe, pod odpowiednim kątem i w odpowiedniej odległości. Niezawodny manometr jest również niezbędny do odtwarzalności, utrzymania integralności tkanek i prawidłowego przyspieszenia cząsteczek złota do zamierzonych celów. Rzeczywiście, odległość, orientacja i stabilność sprzętu są również kluczowymi czynnikami dla celowania i precyzji dostarczania regioselektywnego. Ponieważ te struktury mózgu są bardzo małe, niewielkie zmiany kąta zapłonu mogą łatwo sprawić, że cała procedura będzie mniej wiarygodna. I wreszcie, przygotowanie i utrzymanie żywotnych plastrów organotypowych było najeżone trudnościami przez wiele dziesięcioleci, ale obecnie dostępne są liczne i wiarygodne protokoły dla różnych zwierząt, regionów mózgu, wieku i kokultur2,4,25,26. Procedury te powinny być zoptymalizowane pod kątem użytkownika przed poddaniem tkanek procedurom biolistycznym. Pozwoli to użytkownikowi na łatwiejsze bezstronne ustalenie wpływu cząstek biolistycznych i wpływu genu heterologicznego na jego własne hodowle. W tym celu wykorzystanie genów fluorescencyjnych, takich jak EYFP i EGFP, może zarówno umożliwić nowemu użytkownikowi przetestowanie precyzji celowania, jak i śledzenie żywotności komórek poprzez heterologiczną ekspresję genów przez dłuższy czas13. Wiele kluczowych kroków dla niezawodnego i powtarzalnego korzystania z tego protokołu zostało podkreślonych w poniższych trzech akapitach.

Aby transfekcja była skuteczna, stężenie DNA musi być odpowiednie. Zbyt niskie stężenia mogą utrudnić wydajność transfekcji, podczas gdy zbyt wysokie stężenia mogą powodować aglomerację nanocząstek. Agregaty złota mogą drastycznie zmniejszyć wydajność transfekcji, powodować nierównomierne rozkłady i mogą prowadzić do zwiększonej cytotoksyczności i stresu oksydacyjnego. Problemy z wydajnością powlekania są prawdopodobnie spowodowane wygaśnięciem roztworu spermidyny (należy go wymieniać co 2 do 3 miesięcy). Aby uzyskać odpowiedni rozkład biolistyczny, etykietowanie musi być równe. Niejednorodne znakowanie zawiesiny nanocząstki złota/DNA może być spowodowane roztworem PVP. Należy go również wymieniać co 2 do 3 miesięcy. Powlekanie nanocząstek złota można zaobserwować na elektroforezie w żelu agarozowym jako wyższe pasmo MW27.

Każdy badany system biologiczny, jak również każdy inny używany instrument, może wymagać niewielkich zmian ciśnienia gazu, aby osiągnąć zoptymalizowane poziomy transfekcji i rozprzestrzeniania się biologicznego. Krytycznym parametrem jest ciśnienie impulsu helu wymagane do usunięcia mikro- lub nanonośników z plastikowego wkładu i wprowadzenia ich do tkanki. Wysokie ciśnienie gazu wpłynie na przeżycie komórki, ponieważ wytworzy fale uderzeniowe w poprzek celu i przerwie lub oderwie tkankę od matrycy17. Wycelowanie w lufę pistoletu genowego i ustawienie aparatu dokładnie prostopadle do tkanki jest ważne dla dokładnego dostarczania biolistycznego. Wybrany obszar należy umieścić w bezpośrednim środku lufy, dokładnie w odległości 10 mm od zewnętrznego otworu. Powoduje to dostarczanie cząsteczek złota o średnicy 3 mm wokół epicentrum. Lufa pistoletu genowego powinna być czyszczona 70% etanolem po każdym użyciu. Aby chronić tkankę przed dużymi agregatami cząstek, lufa zawiera również nylonową siatkę, którą należy regularnie wymieniać, aby utrzymać optymalną wydajność. W celu wymiany siatki odkręć nakrętkę, a następnie włóż nową nylonową siatkę między nasadkę a O-ring.

Komórki znakowane fluorescencyjnie powinny być widoczne co najmniej 1 - 2 dni po transfekcji wokół epicentrum. Brak lub niewspółosiowość znakowania może wynikać z nieodpowiedniego przygotowania i niestabilności mocowania pistoletu genowego. Obserwacje komórek za pomocą mikroskopii konfokalnej zależą od wielu czynników: długości fali światła wzbudzenia/emisji, wielkości otworka, NA soczewki obiektywu, współczynnika załamania światła składowych na drodze światła, głębokości tkanki i ustawienia instrumentu. Czynniki te powinny być zoptymalizowane dla każdego badanego systemu.

Niedawne postępy w dziedzinie biolistyki zostały wykorzystane do sukcesu tej metody. Lufa pistoletu genowego użyta w tym badaniu została zmodyfikowana w celu zmniejszenia niezbędnego ciśnienia, a także skierowania biolistycznego wzoru rozproszenia do bardziej ograniczonego i specyficznego obszaru17,19. Inne modyfikacje lufy próbowały ograniczyć rozprzestrzenianie się broni biologicznej i zmniejszyć ciśnienie odpływu28, ale ta specjalnie zaprojektowana lufa pistoletu genowego zaprojektowana przez dr O'Briena jest pojedynczym elementem zamontowanym w standardowym pistolecie Helios Gene. Następnie submikrometrowe cząstki złota zostały użyte w celu zmniejszenia inwazyjności cząstek mikrometrowych, które, jak wcześniej ustaliliśmy, powodowały uszkodzenie komórek i ostatecznie utratę trwałej heterologicznej ekspresji genów. Te zmiany w procedurze biolistycznej poprawiły ogólną wykonalność i odtwarzalność metody13. Inne ulepszenia w przygotowywaniu plastrów, takie jak dogłębne rozwiązywanie problemów z procedurą krojenia, użycie matrycy DMEM-Agaroza w celu zachowania mózgu oraz wiele innych przydatnych postępów w organotypowym przygotowywaniu wycinków mózgu, o których wcześniej informowano13, umożliwiły nam zbadanie zastosowania dorosłych plastrów, które rozwinęły dojrzałe sieci synaptyczne.

W naszym badaniu wykorzystaliśmy głównie barwniki i fluorescencyjne geny heterologiczne do wizualizacji morfologii komórek jako odczytu wydajności transfekcji i zdolności do obrazowania cech morfologicznych neuronów w tkankach mózgowych myszy. Stosunek sygnału do szumu dostawy stochastycznej w określonym promieniu pozwolił nam całkowicie wyizolować port dentrytyczny pojedynczej komórki w jej naturalnym kontekście. Ze względu na to, że podejmowane są liczne wysiłki w celu zbadania tych cech morfologicznych, mapowania "konektomiki" lub oznaczania pojedynczych komórek do różnych analiz, metodę tę można łatwo połączyć z istniejącymi protokołami, takimi jak elektrofizjologia i pomiary neurytów29,30. Oczywiście, kombinacje fluorescencyjnych genów heterologicznych mogą umożliwić znacznie dokładniejsze wyznaczenie pojedynczych komórek jako stochastycznego rozkładu białek fluorescencyjnych, a ich kombinacja określiłaby kolor poszczególnych komórek31,32. Zastosowanie specyficznych dla komórek promotorów, takich jak synapsyna i białko kwasu fibrylarnego glejowego przed heterologicznym eksonem genu, może również ograniczyć ekspresję do subpopulacji33. Rzeczywiście, nieskończona różnorodność materiału genetycznego może być również dostarczana w sposób regioselektywny przez nanocząstki złota przy użyciu tej samej procedury. Całkowite transfekowane regiony można zatem analizować tradycyjnymi metodami, takimi jak rozbiór i poddanie tego regionu zachodniemu immunoblottingowi w celu przeanalizowania zlokalizowanego efektu genu heterologicznego.

Udoskonalenia w procedurach organotypowego plastrowania umożliwią również szersze wykorzystanie tkanek mózgowych do długoterminowych eksperymentów, a także umożliwią wykorzystanie innych tkanek i kokultur oraz ułatwią procedury transfekcji. Wcześniej donoszono, że transfekcja lipidów i polimerów wpływa na homeostazę błony, internalizację, przepuszczalność białek34 i często wykazuje bardzo niską skuteczność transfekcji końcowo zróżnicowanych neuronów. Celowanie w ładunek specyficzny dla komórki jest również podatne tylko na komórki, które wyrażają receptory powierzchniowe komórki potrzebne do internalizacji, i chociaż ta metoda może być wysoce selektywna, może nie mieć ukierunkowanej regioselektywności35. Poza tym wektory wirusowe są często trudne i kosztowne do wyprodukowania, wymagają rygorystycznych przepisów i czasami wykazują obawy dotyczące bezpieczeństwa. Dostarczanie biolistyczne ma zatem niezrównaną zdolność do regioselektywnej transfekcji neuronów i innych typów komórek w żywotnych tkankach. Ponieważ złoto jest nietoksyczne, dalsze postępy w stosowaniu biolistyki mogą utorować drogę do zastosowań biomedycznych, takich jak transdermalne dostarczanie farmaceutyków, nieinwazyjne dostarczanie genów in vivo , a także zlokalizowane niewirusowe terapie genowe.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dr John A. O'Brien posiada patenty na ulepszoną lufę pistoletu genowego. Patent amerykański o numerze 10/380,452 i patent europejski o numerze 01974517.3.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować warsztatom MRC-LMB za wyprodukowanie ulepszonej lufy pistoletu genowego. Chcielibyśmy również podziękować dr Davidowi R. Hampsonowi z Uniwersytetu w Toronto za wykorzystanie sprzętu i zasobów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
System pistoletów genowych HeliosBio Rad165-2431Pistolet genowy i stacja przygotowania probówek
HEPES Sigma83264-100ML-F
NaClSigmaS7653-250G
KClSigmaP9333-500G
Na2HPO4SigmaS7907-100G
KH2PO4SigmaP9791-100G
0.2 µ m sterylna jednostka filtrującaMilliporeSCGPU05REdo mediów filtracyjnych
DMEMGibco21885-025
Surowica cielęca płoduGibco10270-098
D-GlucoseSigmaG8270-100G
N2Life Technologies17502-048
Penicylina/StreptomycynaSigmap4333
PoliwinylopirolidonSigma856568-100G
Etanol Sigma277649-100ML
SpermidynaSigmaS2626
AgarozaBio Rad161-3100EDU
WibrokrajalnicaLaicaVT1200Użyliśmy niestandardowego projektu
MocowanieZbudowany w domu na Uniwersytecie T
Nawilżany inkubator
Nanocząstki złotacytodiagnostykaG-40-20
pEYFP-N1Clontech
Obcinak do rurekBio Rad165-2422
Rurka TefzelBio Rad165-2441
BeczkaWykonana na zamówienie przez LMB
Wkład do hodowli komórkowejMilliporePICM0RG50
ParaformaldehydSigma76240 Mikroskop
dla wygody
 
pistoletu genowego kultur komórkowych preparacyjny Fluka Mikroskop konfokalny zdefiniowany przez użytkownika do użytku Szkiełko podstawowe VWR 2588-CA48323-185 Szkło Microcover VWR 2448-CA48366-067-1 Nośniki montażowe Vectashield Laboratoria wektorowe H-1400 

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Klein, R. M., Wolf, E. D., Wu, R., Sanford, J. C. High-velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells. Biotechnology. 24, 384-386 (1987).
  2. Kim, H., Kim, E., Park, M., Lee, E., Namkoong, K. Organotypic hippocampal slice culture from the adult mouse brain: a versatile tool for translational neuropsychopharmacology. Progress in Neuro-Psychopharmacolog., & Biological Psychiatry. 41, 36-43 (2013).
  3. Morin-Brureau, M., De Bock, F., Lerner-Natoli, M. Organotypic brain slices: a model to study the neurovascular unit micro-environment in epilepsies. Fluids and Barriers of the CNS. 10, 11(2013).
  4. Millet, L. J., Gillette, M. U. Over a century of neuron culture: from the hanging drop to microfluidic devices. The Yale Journal of Biology and Medicine. 85, 501-521 (2012).
  5. Cho, S., et al. Spatiotemporal evidence of apoptosis-mediated ischemic injury in organotypic hippocampal slice cultures. Neurochemistry International. 45, 117-127 (2004).
  6. Daviaud, N., et al. Modeling nigrostriatal degeneration in organotypic cultures, a new ex vivo model of Parkinson's disease. Neuroscience. 256, 10-22 (2013).
  7. Drexler, B., Hentschke, H., Antkowiak, B., Grasshoff, C. Organotypic cultures as tools for testing neuroactive drugs - link between in-vitro and in-vivo experiments. Current Medicinal Chemistry. 17, 4538-4550 (2010).
  8. Oishi, Y., Baratta, J., Robertson, R. T., Steward, O. Assessment of factors regulating axon growth between the cortex and spinal cord in organotypic co-cultures: effects of age and neurotrophic factors. J Neurotrauma. 21, 339-356 (2004).
  9. Baratta, J., Marienhagen, J. W., Ha, D., Yu, J., Robertson, R. T. Cholinergic innervation of cerebral cortex in organotypic slice cultures: sustained basal forebrain and transient striatal cholinergic projections. Neuroscience. 72, 1117-1132 (1996).
  10. Barateiro, A., Domingues, H. S., Fernandes, A., Relvas, J. B., Brites, D. Rat Cerebellar Slice Cultures Exposed to Bilirubin Evidence Reactive Gliosis, Excitotoxicity and Impaired Myelinogenesis that Is Prevented by AMPA and TNF-alpha Inhibitors. Molecular Neurobiology. 49 (1), 424-439 (2013).
  11. Franke, H., Schelhorn, N., Illes, P. Dopaminergic neurons develop axonal projections to their target areas in organotypic co-cultures of the ventral mesencephalon and the striatum/prefrontal cortex. Neurochemistry International. 42, 431-439 (2003).
  12. Mingorance, A., et al. Regulation of Nogo and Nogo receptor during the development of the entorhino-hippocampal pathway and after adult hippocampal lesions. Molecular and Cellular Neurosciences. 26, 34-49 (2004).
  13. Arsenault, J., O'Brien, J. A. Optimized heterologous transfection of viable adult organotypic brain slices using an enhanced gene gun. BMC Research Notes. 6, 544(2013).
  14. De Simoni, A., Griesinger, C. B., Edwards, F. A. Development of rat CA1 neurones in acute versus organotypic slices: role of experience in synaptic morphology and activity. J Physiol. 550, 135-147 (2003).
  15. Laywell, E. D., et al. Neuron-to-astrocyte transition: phenotypic fluidity and the formation of hybrid asterons in differentiating neurospheres. J Comp Neurol. 493, 321-333 (2005).
  16. Walder, S., Zhang, F., Ferretti, P. Up-regulation of neural stem cell markers suggests the occurrence of dedifferentiation in regenerating spinal cord. Dev Genes Evol. 213, 625-630 (2003).
  17. Brien, J. A., Holt, M., Whiteside, G., Lummis, S. C., Hastings, M. H. Modifications to the hand-held Gene Gun: improvements for in vitro biolistic transfection of organotypic neuronal tissue. J Neurosci Methods. 112, 57-64 (2001).
  18. Brien, J., Unwin, N. Organization of spines on the dendrites of Purkinje cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 1575-1580 (2006).
  19. Brien, J. A., Lummis, S. C. Nano-biolistics: a method of biolistic transfection of cells and tissues using a gene gun with novel nanometer-sized projectiles. BMC Biotechnology. 11 (66), 1472-6750 (2011).
  20. Brien, J. A., Lummis, S. C. Diolistic labeling of neuronal cultures and intact tissue using a hand-held gene gun. Nature Protocols. 1, 1517-1521 (2006).
  21. Brien, J. A., Lummis, S. C. Diolistics: incorporating fluorescent dyes into biological samples using a gene gun. Trends in Biotechnology. 25, 530-534 (2007).
  22. Han, X., et al. Validation of an LDH assay for assessing nanoparticle toxicity. Toxicology. 287, 99-104 (2011).
  23. Lein, E. S., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445, 168-176 (2007).
  24. Woods, G., Zito, K. Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture. Journal of Visualized Experiments. 12, (2008).
  25. Su, T., Paradiso, B., Long, Y. S., Liao, W. P., Simonato, M. Evaluation of cell damage in organotypic hippocampal slice culture from adult mouse: a potential model system to study neuroprotection. Brain Research. 1385, 68-76 (2011).
  26. Mewes, A., Franke, H., Singer, D. Organotypic brain slice cultures of adult transgenic P301S mice--a model for tauopathy studies. PloS One. 7, 45017(2012).
  27. Ito, T., Ibe, K., Uchino, T., Ohshima, H., Otsuka, M. Preparation of DNA/Gold Nanoparticle Encapsulated in Calcium Phosphate. Journal of Drug Delivery. 2011, 647631(2011).
  28. Rinberg, D., Simonnet, C., Groisman, A. Pneumatic capillary gun for ballistic delivery of microparticles. Appl Phys Lett. 87, 014103(2005).
  29. Meijering, E. Neuron tracing in perspective. Cytometry. Part A : the Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77, 693-704 (2010).
  30. Sasaki, T., Matsuki, N., Ikegaya, Y. Targeted axon-attached recording with fluorescent patch-clamp pipettes in brain slices. Nature Protocols. 7, 1228-1234 (2012).
  31. Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Multicolor 'DiOlistic' labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations. Neuron. 27, 219-225 (2000).
  32. Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
  33. Gholizadeh, S., Tharmalingam, S., Macaldaz, M. E., Hampson, D. R. Transduction of the central nervous system after intracerebroventricular injection of adeno-associated viral vectors in neonatal and juvenile mice. Human Gene Therapy Methods. 24, 205-213 (2013).
  34. Arsenault, J., et al. Botulinum protease-cleaved SNARE fragments induce cytotoxicity in neuroblastoma cells. Journal of Neurochemistry. 129, 781-791 (2014).
  35. Arsenault, J., et al. Stapling of the botulinum type A protease to growth factors and neuropeptides allows selective targeting of neuroendocrine cells. Journal of Neurochemistry. 126, 223-233 (2013).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

transfekcja biolistycznamodyfikacja za pomoc armatki genowejcz steczki z ota powlekane DNAtargetowanie regioselektywnemikroskopia konfokalnakrojenie tkanekinserty do hodowli kom rkowychznakowanie bia kami fluorescencyjnymiheterologiczna ekspresja gen w

Powiązane artykuły