Artykuł metodologiczny

Automatyzacja eksperymentów ChIP-seq w celu wygenerowania profili epigenetycznych na 10 000 komórek HeLa

19.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52150

⸱

10 grudnia 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Diagenode S.A., 2Diagenode Inc.

W tym artykule

Podsumowanie

Metody mapowania interakcji białko-DNA in vivo stają się kluczowe dla każdego aspektu badań genomicznych, ale są pracochłonne, kosztowne i czasochłonne. W artykule przedstawiono dostępny na rynku zrobotyzowany system obsługi cieczy, który automatyzuje immunoprecypitację chromatyny w celu mapowania in vivo interakcji białko-DNA z ograniczoną liczbą komórek.

Streszczenie

Immunoprecypitacja chromatyny, a następnie sekwencjonowanie nowej generacji (ChIP-seq) jest techniką z wyboru do badania interakcji białko-DNA. ChIP-seq został wykorzystany do mapowania interakcji białko-DNA i przypisywania modyfikacji histonów. Procedura jest żmudna i czasochłonna, a jednym z głównych ograniczeń jest zapotrzebowanie na duże ilości materiału wyjściowego, zwykle miliony komórek. Automatyzacja testów immunoprecypitacji chromatyny jest możliwa, gdy procedura opiera się na wykorzystaniu kulek magnetycznych. Skuteczne zautomatyzowane protokoły immunoprecypitacji chromatyny i przygotowania biblioteki zostały specjalnie zaprojektowane w dostępnym na rynku zrobotyzowanym systemie obsługi cieczy, przeznaczonym głównie do automatyzacji testów epigenetycznych. W pierwszej kolejności przedstawiono walidację zautomatyzowanych testów ChIP-seq przy użyciu przeciwciał skierowanych przeciwko różnym modyfikacjom histonów, a następnie optymalizację zautomatyzowanych protokołów przeprowadzania immunoprecypitacji chromatyny i przygotowania biblioteki, zaczynając od niskiej liczby komórek. Celem tych eksperymentów jest dostarczenie cennego narzędzia do przyszłej analizy epigenetycznej określonych typów komórek, subpopulacji i próbek biopsyjnych.

Wprowadzenie

Ponieważ technologie sekwencjonowania nowej generacji (NGS) stały się powszechne i bardziej dostępne, podstawową metodą mapowania całego genomu interakcji białko-DNA jest teraz immunoprecypitacja chromatyny, a następnie detekcja NGS (ChIP-seq), która umożliwia odkrycie miejsc wiązania czynnika transkrypcyjnego lub wzorców modyfikacji histonów. ChIP-seq jest korzystny w dostarczaniu danych o wysokiej przepustowości całego genomu, które można wykorzystać do ilościowej i jakościowej analizy interakcji białko-DNA poprzez pomiar wzbogaconych fragmentów DNA. Istnieją jednak pewne wady standardowych eksperymentów ChIP-seq, takie jak trudność w uzyskaniu wystarczającej ilości materiału do stworzenia biblioteki sekwencjonowania.

Eksperymenty ChIP dzielą się na sześć podstawowych etapów, w tym: 1) sieciowanie regionów wiążących białko-DNA, 2) przygotowanie próbki, które obejmuje lizę komórek i ścinanie chromatyny przez sonikację, 3) tworzenie immunokompleksów, 4) wytrącanie immunokompleksów, 5) mycie immunokompleksów, oraz 6) elucję wzbogaconego materiału i analizę za pomocą qPCR i NGS.

Sukces testu ChIP zależy od trzech głównych czynników: dobrego przygotowania chromatyny, ilości antygenu w oryginalnej próbce oraz specyficzności i powinowactwa przeciwciała do pokrewnego antygenu. Głównym ograniczeniem jest wymóg dużej ilości początkowej liczby komórek w celu uzyskania wystarczającej ilości wzbogaconego DNA do stworzenia biblioteki sekwencjonowania. Dla naukowców, którzy pracują z ograniczonymi ilościami próbek, takimi jak próbki z biopsji lub subpopulacje komórek, eksperymenty ChIP-seq są bardzo trudne. Ostatnie badania wykazały, że testy ChIP-seq można wykonywać podczas pracy z małą liczbą komórek1, 2. Firma Diagenode opracowała zrobotyzowany system obsługi cieczy, który może w pełni zautomatyzować eksperymenty z sekwencją ChIP, gdy zaczyna się od ograniczonej liczby komórek.

Automatyzacja zapewnia wiele zalet w porównaniu z ręcznym przygotowywaniem próbek ChIP-seq, ponieważ zmniejsza błędy ludzkie, zmniejsza zmienność i zmniejsza koszty eksperymentów. Opisano półautomatyczne protokoły immunoprecypitacji chromatyny i przygotowania biblioteki, ale żadne z tych badań nie wykazało danych przy użyciu niskiej liczby komórek3, 4, 5, 6.

W tym artykule opisano kompletny zautomatyzowany przepływ pracy zarówno dla testów immunoprecypitacji chromatyny, jak i przygotowania biblioteki w zrobotyzowanym systemie obsługi cieczy, który wykorzystuje technologię opartą na kulkach magnetycznych i który może adresować wiele parametrów w optymalizacji protokołu. W tym przypadku z powodzeniem przeprowadzono zautomatyzowane eksperymenty ChIP-seq na ograniczonej liczbie komórek w celu uproszczenia, standaryzacji i zapewnienia niezawodnego rozwiązania do badania profili epigenetycznych w populacjach małych komórek. Zautomatyzowany protokół ChIP opisany w tym artykule został zoptymalizowany na komórkach HeLa przy użyciu specyficznych przeciwciał histonowych i odczynników, ale przepływ pracy można dostosować do innych linii komórkowych i przeciwciał z odpowiednią optymalizacją eksperymentalną.

Protokół

1. Standardowe eksperymenty ChIP

  1. Zbiór komórek i sieciowanie białko-DNA.
    1. Hodować komórki HeLa-S3 do osiągnięcia konfluencji 80%-90%. Usunąć pożywkę hodowlaną, dwukrotnie przemyć naczynie 10 ml 1x soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS) i dodać Trypsynę-EDTA (1x) do płytki z hodowlą. Inkubować przez maksymalnie 2 min, aby odlepić komórki od naczynia. Zebrać komórki i dwukrotnie przemyć 10 ml PBS.
      UWAGA: Dłuższy czas inkubacji doprowadzi do uszkodzenia komórek.
    2. Wirować komórki przez 5 min przy 500 x g i resuspender w 20 ml PBS. Następnie przystąpić do liczenia komórek.
    3. Wirować komórki przez 5 min przy 500 x g, odrzucić nadsącz i dodać 500 μl PBS. Optymalna liczba komórek dla etapu fiksacji to 10 milionów komórek na 500 μl PBS.
    4. Do każdej porcji 500 μl zawiesiny komórkowej dodać 13,5 μl świeżego 37% formaldehydu. Fiksować komórki przez 8 min w RT.
    5. Dodać 57 μl 1,25 M roztworu glicyny, aby zatrzymać fiksację. Inkubować przez 5 min w RT, stale mieszając za pomocą delikatnego wortexowania. Od tego momentu pracować na lodzie.
    6. Wirować komórki przy 500 x g przez 5 min w 4 °C i usunąć nadsącz, nie naruszając granulatu komórkowego.
    7. Przemyć komórki dwukrotnie 1 ml PBS. Delikatnie usunąć nadsącz i przechowywać granulat komórkowy na lodzie.
  2. Liza komórek i fragmentacja chromatyny
    1. Do granulatu komórkowego dodać 10 ml schłodzonego na lodzie buforu do lizy iL1 (optymalny stosunek to 1 ml buforu do lizy na 1 milion komórek). Kilkukrotnie pipetować w górę i w dół, a następnie inkubować przez 10 min w 4 °C przy delikatnym mieszaniu.
    2. Wirować lizat przez 5 min przy 500 x g i 4 °C. Odrzucić nadsącz.
    3. Do lizatów dodać 10 ml schłodzonego na lodzie buforu do lizy iL2 i delikatnie wymieszać poprzez pipetowanie w górę i w dół. Inkubować lizaty przez 10 min w 4 °C.
    4. Wirować przez 5 min przy 500 x g i 4 °C i odrzucić nadsącz.
    5. Przygotować kompletny bufor do fragmentacji, dodając 200x koktajl inhibitorów proteaz (PIC) do buforu do fragmentacji iS1. Przechowywać bufor na lodzie przez 5 min, a następnie kontynuować pracę na lodzie. Do każdego granulatu 10 milionów komórek dodać 1 ml kompletnego buforu do fragmentacji iS1 i delikatnie wymieszać poprzez pipetowanie w górę i w dół. Przed sonikacją inkubować próbki na lodzie przez 10 min w celu zmniejszenia lepkości próbki.
    6. Fragmentować 300 µl porcje chromatyny za pomocą sonikacji w sonikatorze kąpielowym przez 2 do 3 serii po 10 cykli każda. Cykl składa się z 30 s włączenia („ON”) i 30 s wyłączenia („OFF”) przy wysokim ustawieniu mocy. Alternatywnie można użyć urządzenia do piko-sonikacji z krótszym czasem sonikacji: 5 do 10 cykli po 30 s „ON” i 30 s „OFF”. Krótko wortexować i wirować probówki pomiędzy seriami. W przypadku korzystania z innych typów sonikatorów należy postępować zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi fragmentacji chromatyny.
    7. Wirować sfragmentowaną chromatynę przy 16 000 x g przez 10 min i zebrać nadsącz do natychmiastowego użycia w etapie IP. Alternatywnie chromatynę można przechowywać w -80 °C do 2 miesięcy do późniejszego wykorzystania.
    8. Przed etapem immunoprecypitacji przeanalizować wydajność fragmentacji chromatyny, używając żeli agarozowych 1-1,5% TAE lub bioanalizatora. Optymalna wielkość fragmentów chromatyny mieści się w zakresie 100-600 bp.

2. Eksperymenty ChIP z niską liczbą komórek

  1. Zbiór komórek i sieciowanie DNA-białko
    1. Hodować komórki HeLa-S3 do konfluencji 80%-90%. Usunąć pożywkę hodowlaną, przemyć naczynie dwukrotnie 10 ml 1x soli fizjologicznej w PBS, a następnie dodać do płytki z hodowlą 1x Trypsynę-EDTA. Inkubować przez maksymalnie 2 min, aby odlepić komórki od naczynia.
      UWAGA: Dłuższy czas inkubacji doprowadzi do uszkodzenia komórek.
    2. Zebrać komórki, dodając 1 ml pożywki hodowlanej z surowicą do probówki do wirowania o pojemności 1 ml. Policzyć komórki.
    3. Wirować komórki przez 5 min przy 500 x g. Dostosować liczbę komórek do poziomu 10 000 komórek na 1 ml pożywki hodowlanej do utrwalania.
    4. Do każdej probówki dodać 27 μl świeżo przygotowanej 36,5% formaldehydu w celu utrwalenia. Odwrócić probówkę dwa lub trzy razy i inkubować przez 10 min w RT.
    5. Do próbki dodać 115 μl 1,25 M roztworu glicyny, odwrócić probówkę dwa lub trzy razy i inkubować przez 5 min w RT. Od tego momentu pracować w lodzie.
    6. Wirować komórki przy 300 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C. Powoli usunąć nadsącz.
    7. Przemyć komórki 1 ml schłodzonego do temperatury lodowej roztworu HBSS z PIC (200x, stężenie końcowe 1x). Odwrócić probówkę dwa lub trzy razy, aby resuspendować komórki, i wirować przy 300 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C. Ostrożnie usunąć nadsącz i przechowywać granulat komórkowy w lodzie.
  2. Lizy komórkowa i fragmentacja chromatyny
    1. Dodać 25 μl kompletnego buforu do lizy tL1 (Lysis Buffer tL1 + PIC) na 10 000 komórek i ręcznie wymieszać dno probówki, aby resuspendować komórki. Inkubować w lodzie przez 5 min.
    2. Do każdej alikwoty zawierającej 10 000 komórek dodać 75 μl kompletnego buforu HBSS (HBSS + PIC).
    3. Fragmentować 100 μl alikwoty 10 000 komórek poprzez sonikację w 5 seriach po 5 cykli każda. Cykl składa się z 30 s „ON” i 30 s „OFF” przy ustawieniu wysokiej mocy. Alternatywnie można użyć urządzenia do piko-sonikacji z krótszym czasem sonikacji: 5 cykli po 30 s „ON” i 30 s „OFF”. Optymalna wielkość fragmentów chromatyny mieści się w zakresie 100-600 bp. Należy pamiętać, że preparaty chromatyny, typy komórek i różne sonikatory wymagają oddzielnych eksperymentów optymalizujących fragmentację.
    4. Wirować sfragmentowaną chromatynę przy 14 000 x g przez 10 min, aby usunąć materiał nierozpuszczalny i zebrać nadsącz do natychmiastowego użycia w etapie IP. Alternatywnie można przechowywać chromatynę w temperaturze -80 °C do 2 miesięcy do późniejszego wykorzystania.
    5. Przed etapem immunoprecypitacji przeanalizować wydajność fragmentacji chromatyny, używając żeli agarozowych 1-1,5% TAE lub bioanalizatora. Przed analizą na żelu agarozowym potraktować próbki RNazą, aby poprawić wizualną ocenę fragmentacji. Optymalna wielkość fragmentów chromatyny mieści się w zakresie 100-600 bp.

3. Immunoprecypitacja chromatyny i przygotowanie biblioteki

  1. W przypadku standardowych zautomatyzowanych eksperymentów ChIP
    1. Dodaj 120 μl Buforu ChIP H (Bufor ChIP H + PIC) do 100 μl rozdrobnionej chromatyny. Wykorzystaj 200 μl do IP i zachowaj od 2 μl do 20 μl jako próbkę wejściową (input).
    2. Wybierz zautomatyzowany protokół ChIP 200 μl w urządzeniu automatyzacyjnym. Przepustowość protokołu wynosi od 1 do 16 próbek na jeden cykl.
    3. Przeprowadź zautomatyzowany eksperyment ChIP, wykorzystując chromatynę odpowiadającą 1-2 milionom komórek oraz 1-2 μg króliczych przeciwciał poliklonalnych klasy ChIP-seq przeciwko H3K79me3, -H3K27me3, -H3K4me3, -H3K4me2, -H3K9ac, -H3K9/14ac, -H3K36me3 i H3K9me3. Optymalne ilości przeciwciał różnią się w zależności od modyfikacji histonów oraz powinowactwa i specyficzności odpowiedniego przeciwciała.
      1. Jako przeciwciało kontrolne izotypowe zastosuj równoważne ilości nieimmunologicznego królika IgG. Alternatywnie, jako kontrole ChIP wykorzystaj niepowlekane kuleczki lub specyficznie blokowane przeciwciało. Do każdej reakcji dodaj 20 μl magnetycznych kuleczek powlekanych Proteiną A.
    4. Użyj odczynników z zautomatyzowanego zestawu do histone ChIP-seq, aby przeprowadzić zautomatyzowane eksperymenty ChIP z poliklonalnymi przeciwciałami przeciwko H3K79me3 i -H3K4me2. Użyj idealnych odczynników z zestawu ChIP-seq do przeprowadzenia eksperymentów ChIP z przeciwciałami przeciwko H3K27me3, -H3K4me3, -H3K9ac, -H3K9/14ac, -H3K36me3 i -H3K9me3.
    5. Wybierz zautomatyzowany protokół ChIP zgodnie z instrukcjami oprogramowania zaimplementowanego w urządzeniu automatyzacyjnym. Ustaw parametry eksperymentu ChIP na 4 h dla etapu powlekania przeciwciałem i 15 h dla etapu immunoprecypitacji. Etap odwrócenia sieciowania odbywa się w urządzeniu automatycznym w temperaturze 65 °C przez 4 h.
    6. Oczyść DNA po odwróceniu sieciowania w systemie zautomatyzowanym. Wybierz zautomatyzowane protokoły oczyszczania DNA z wykorzystaniem protokołu lub zestawu opartego na magnetycznych kuleczkach. Eluuj DNA w 25 μl wody.
    7. Oznacz ilościowo immunoprecypitowane DNA, ekstrahując 10% immunoprecypitowanego DNA. Wydajność immunoprecypitowanego DNA zależy od jakości chromatyny i przeciwciała, typu komórek oraz docelowej modyfikacji histonów. Oznacz ilość DNA za pomocą zestawu analitycznego zgodnie z instrukcjami producenta.
    8. Przeanalizuj jakość immunoprecypitowanego DNA za pomocą ilościowego PCR, stosując primery dla co najmniej jednego pozytywnego i jednego negatywnego regionu kontrolnego genomu. Do oceny wzbogaceń ChIP nie wykorzystuj więcej niż 10% całkowitego immunoprecypitowanego DNA.
      1. Przygotuj reakcje qPCR. Dodaj 10 μl 2x SyberGreen qPCR master mix, 1 μl mieszanki primerów, 1-5 μl immunoprecypitowanego DNA lub DNA wejściowego oraz sterylną wodę do końcowej objętości reakcji 20 µl. Program qPCR obejmuje wstępny etap denaturacji w 95 °C przez 5-10 min, w zależności od dostawcy polimerazy Taq, a temperatury przyłączania powinny być ustawione zgodnie z wybranymi primerami.
    9. Użyj zautomatyzowanych protokołów przygotowania bibliotek kompatybilnych z dostępnymi komercyjnie odczynnikami Illumina do przygotowania bibliotek ChIP-seq, wykorzystując zarówno DNA z ChIP, jak i zachowane DNA wejściowe z tej samej preparacji chromatyny. Do przygotowania biblioteki użyj 10-20 ng immunoprecypitowanego DNA z każdego przeciwciała. Przygotuj do 16 zautomatyzowanych bibliotek na jeden cykl.
    10. Przeprowadź sekwencjonowanie bibliotek i wygeneruj klastry zgodnie z instrukcjami producenta Illumina. Wykonaj podstawową analizę bioinformatyczną (filtrowanie klastrów, odczyt zasad, itp.) zgodnie ze standardowym schematem Illumina, przefiltruj i dopasuj odczyty do najnowszej wersji genomu ludzkiego (aktualna wersja to GRCh38) za pomocą alignera ELAND. Do wyznaczania piku (peak calling) użyj SICER7 lub MACS8 i przeprowadź dalsze analizy piku za pomocą programu Homer9, BEDTools10 lub innego preferowanego oprogramowania.
  2. W przypadku zautomatyzowanych eksperymentów ChIP z małą liczbą komórek
    1. Dodaj 120 μl kompletnego buforu ChIP tC1 (Bufor ChIP tC1 + PIC) do 100 μl rozdrobnionej chromatyny. Wykorzystaj 200 μl do IP i zachowaj 20 μl jako input.
    2. Wybierz zautomatyzowany protokół ChIP 200 μl w systemie automatyzacyjnym. Przepustowość protokołu wynosi od 1 do 16 próbek na jeden cykl.
    3. Przeprowadź zautomatyzowany eksperyment ChIP-seq, wykorzystując zautomatyzowane odczynniki ChIP i przeciwciała klasy ChIP zoptymalizowane do pracy z niskimi ilościami chromatyny. Wykorzystaj chromatynę odpowiadającą 10 000 komórek i 100 000 komórek oraz 0,5 μg przeciwciała przeciwko H3K27me3, 0,25 μg przeciwko -H3K4me3, 0,1 μg przeciwko -H3K27ac, 0,25 μg przeciwko -H3K9me3 (królicze poliklonalne przeciwciała klasy Premium ChIP-seq). Optymalne ilości przeciwciał różnią się w zależności od modyfikacji histonów oraz powinowactwa i specyficzności odpowiedniego przeciwciała.
      1. Jako przeciwciało kontrolne izotypowe zastosuj równoważną ilość nieimmunologicznego królika IgG. Alternatywnie, jako kontrole ChIP wykorzystaj niepowlekane kuleczki lub specyficznie blokowane przeciwciało. Do każdej reakcji dodaj 10 μl magnetycznych kuleczek powlekanych Proteiną A.
    4. Wybierz zautomatyzowany protokół ChIP zgodnie z instrukcjami oprogramowania zaimplementowanego w urządzeniu automatyzacyjnym. Ustaw parametry eksperymentu ChIP na 4 h dla etapu powlekania przeciwciałem i 15 h dla etapu immunoprecypitacji. Etap odwrócenia siecikowania odbywa się w urządzeniu automatycznym w temperaturze 65 °C przez 4 h.
    5. Oczyść DNA po odwróceniu sieciowania za pomocą kolumienek wirówkowych zgodnie z instrukcjami producenta i eluuj w objętościach od 6 μl do 25 μl wody.
    6. Oznacz ilość DNA za pomocą komercyjnego zestawu analitycznego. Przeanalizuj wyniki za pomocą qPCR, stosując primery dla pozytywnych i negatywnych regionów kontrolnych, aby ocenić jakość ChIP.
    7. Użyj zestawu do przygotowania bibliotek z zoptymalizowanymi odczynnikami, aby przygotować biblioteki z niskimi ilościami DNA. Do przygotowania bibliotek użyj 30 pg i 300 pg DNA z ChIP (odpowiednio dla eksperymentów z 10 000 i 100 000 komórek). Przygotuj biblioteki zgodnie z zautomatyzowanym protokołem kompatybilnym z odczynnikami do przygotowania bibliotek. Zautomatyzowana przepustowość przygotowania bibliotek wynosi od 1 do 48 bibliotek na jeden cykl.
    8. Po naprawie końców dwuniciowych matryc DNA, liguj rozszczepialne adaptory pętli stem-loop zawierające miejsca primerów sekwencjonujących. Po etapie wydłużania DNA, namnóż próbkę za pomocą metody wysokowiernej amplifikacji opisanej w protokole zestawu do przygotowania bibliotek.
    9. Po amplifikacji biblioteki, oznacz ilościowo i oczyść biblioteki zgodnie z wytycznymi zestawu do przygotowania bibliotek. Uwaga: selekcja rozmiaru po oczyszczaniu nie jest konieczna.
    10. Przeprowadź sekwencjonowanie bibliotek i wygeneruj klastry zgodnie z instrukcjami producenta. Wykonaj podstawową analizę bioinformatyczną (filtrowanie klastrów, odczyt zasad, itp.) zgodnie ze standardowym schematem producenta, przefiltruj i dopasuj odczyty do najnowszej wersji genomu ludzkiego (aktualna wersja to GRCh38) za pomocą alignera ELAND7. Do wyznaczania piku użyj SICER8 lub MACS9 i przeprowadź dalsze analizy piku za pomocą programu Homer, BEDTools10 lub dowolnego preferowanego oprogramowania.

Protokół immunoprecypitacji chromatyny (ChIP); konfiguracja mikropłytek; analiza wiązania DNA-białko.
Rycina 1. Zrzuty ekranu z oprogramowania pokazujące, jak konfigurować zautomatyzowane eksperymenty ChIP w urządzeniu IP-Star Compact. Oprogramowanie zapewnia elastyczność w wyborze liczby próbek na jeden cykl, a także możliwość zmiany kluczowych parametrów eksperymentalnych (nakładanie przeciwciał, immunoprecypitację i przemywanie) zgodnie z potrzebami badacza. Zautomatyzowana procedura umożliwia równoległe testowanie różnych warunków (i.e., różnych rodzajów i ilości przeciwciał, różnych typów i ilości komórek, a nawet różnych rodzajów i ilości kulek magnetycznych w jednym cyklu). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Protokoły, przygotowanie próbek i układ dla PCR w interfejsie oprogramowania laboratoryjnego. Sprzęt Diagenode.
Rycina 2. Zrzuty ekranu z oprogramowania pokazujące, jak skonfigurować zautomatyzowane przygotowanie bibliotek do sekwencjonowania nowej generacji przy użyciu zestawu do bibliotek w systemie automatyzacji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Wyniki

Optymalizacja zautomatyzowanych eksperymentów ChIP-seq dla ośmiu różnych markerów histonowych

W celu pomyślnego opracowania i walidacji zautomatyzowanych protokołów ChIP wybrano przeciwciała klasy ChIP-seq, które zostały wcześniej zwalidowane w manualnych eksperymentach ChIP-Seq (dane nie zostały przedstawione). Do niniejszego badania wybrano następujące przeciwciała klasy ChIP-seq: anty-H3K79me3, -H3K27me3, -H3K4me3, -H3K4me2, -H3K9ac, -H3K9/14ac, -H3K36me3 oraz -H3K9me3. Specyficzność wszystkich przeciwciał klasy ChIP-seq została wcześniej potwierdzona za pomocą techniki dot blot, macierzy peptydowych oraz eksperymentów Western Blot (dane nie zostały przedstawione). Przeprowadzono pilotażowe eksperymenty ChIP-qPCR z zastosowaniem zwiększających się ilości przeciwciał w celu określenia ich czułości (Rysunek 3). Przeanalizowano qPCR z co najmniej dwoma pozytywnymi i dwoma negatywnymi celami kontrolnymi; profile, w których wzbogacenie celu pozytywnego względem negatywnego było ponad pięciokrotne, zakwalifikowano do eksperymentów sekwencjonowania. Ważne jest przeprowadzanie eksperymentów ChIP i ChIP-seq z użyciem wysokiej jakości fragmentowanej chromatyny. Wszystkie eksperymenty ChIP przedstawione w niniejszej publikacji wykonano przy użyciu świeżej chromatyny. Możliwe jest również zamrożenie utrwalonych komórek w temperaturze -80 °C i przystąpienie do przygotowania oraz fragmentacji chromatyny w innym dniu. Jednakże chromatyna przygotowana z zamrożonych utrwalonych komórek może zachowywać się inaczej niż chromatyna przygotowana na świeżo, w związku z czym warunki sonikacji mogą wymagać optymalizacji dla każdej partii chromatyny. Podczas pracy z różnymi typami komórek można stosować bufory do fragmentacji o różnym składzie detergentów (SDS). Typy komórek, takie jak pierwotne linie komórkowe lub komórki hodowane w zawiesinie, są trudne do fragmentacji i wymagają wysokich stężeń SDS (1%), natomiast linie komórkowe łatwe do fragmentacji, takie jak HeLa, wymagają niskich stężeń SDS (0,1%) w buforach do fragmentacji.

Wykres analizy modyfikacji histonów; wykres słupkowy porównujący poziomy H3K27me3, H3K9ac, H3K36me3.
Rysunek 3. Walidacja przeciwciał klasy ChIP przy użyciu systemu automatycznego. ChIP przeprowadzono z zastosowaniem króliczych przeciwciał poliklonalnych przeciwko H3K79me3, -H3K27me3, -H3K4me3, -H3K4me2, -H3K9ac, H3K9/14ac, -H3K36me3 oraz -H3K9me3 na fragmentowanej chromatynie z 1 miliona komórek HeLa-S3, w zależności od modyfikacji histonów. W urządzeniu automatycznym do eksperymentów z mianowania przeciwciał wykorzystano zautomatyzowane protokoły ChIP z objętościami roboczymi 200 µl. W każdym eksperymencie ChIP przetestowano ilości przeciwciał wynoszące 1, 2, 5 i 10 μg, a jako kontrolę negatywną zastosowano 2 μg IgG. Wzbogacenia oceniono za pomocą qPCR. Wyniki przedstawiono jako % inputu (względna ilość immunoprecypitowanego DNA w porównaniu do DNA wejściowego po analizie qPCR). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Po walidacji i wyznaczeniu optymalnych ilości przeciwciał klasy ChIP do wykorzystania w systemie automatycznym, przeprowadzono zautomatyzowane eksperymenty ChIP-seq w celu wygenerowania profili sekwencjonowania dla każdej modyfikacji histonów (Rysunek 4).

Profilemodyfikacji chromatyny; znaki epigenetyczne; metylacja histonów; loci genowe; wizualizacja na wykresie słupkowym.
Rysunek 4. Profile ChIP-seq histonów wygenerowane przez zautomatyzowane eksperymenty ChIP-seq. Rysunek przedstawia profile ChIP-seq w różnych regionach genomicznych dla H3K4me3, H3K9ac i H3K9/14acH3K4me2 H3K79me3 oraz H3K36me3. 4A pokazuje rozkład piku wzdłuż całego chromosomu X, a 4B rozkład w regionie 75 kb otaczającym gen GAPDH. 4C przedstawia profile H3K27me3, H3K36me3 i H3K4me3 w regionie 500 kb otaczającym gen MYT1, a 4D pokazuje rozkład H3K9me3 w regionie 200 kb otaczającym ZNF12. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wygenerowano profile epigenetyczne dla sześciu różnych modyfikacji histonów związanych z ekspresją genów (H3K4me3, H3K9ac, H3K9/14ac, H3K4me2, H3K79me3 oraz H3K36me3). Rycina 4A przedstawia profile ChIP-seq wzdłuż chromosomu X dla różnych markerów histonowych. Wysoka korelacja pików zaobserwowana pomiędzy 6 różnymi profilami histonowymi wskazuje na zdolność systemu zautomatyzowanego do generowania dokładnych i wiarygodnych danych. Rycina 4B, 4C i 4D przedstawiają rozkład pików dla różnych modyfikacji histonowych w określonych regionach genomicznych.

Zautomatyzowane eksperymenty immunoprecypitacji chromatyny dla próbek obejmujących nawet 200 komórek

Minimalna liczba komórek, którą można wykorzystać w eksperymentach ChIP, zależy od jakości chromatyny, specyficzności i czułości przeciwciała oraz poziomu badanego białka lub modyfikacji histonów. Wybór wysokiej jakości przeciwciał klasy ChIP-seq jest kluczowy przy pracy z ograniczoną ilością próbki, a dobór optymalnych odczynników i różnych nośników zwiększa wydajność odzysku DNA i przyczynia się do sukcesu eksperymentu ChIP. Aby określić minimalną liczbę komórek, którą może przetworzyć zautomatyzowany protokół ChIP, w systemie zautomatyzowanym IP-Star przetestowano różne ilości chromatyny, przeciwciał oraz kulek magnetycznych, stosując odczynniki do ChIP specjalnie zoptymalizowane pod kątem pracy z niskimi ilościami chromatyny.

W pierwszej kolejności chromatynę z 10 000 komórek poddano sonikacji zgodnie z opisem w protokole. Wyniki ChIP potwierdzono za pomocą qPCR (Rysunek 5A), który wykazuje znaczące wzbogacenie z użyciem przeciwciał H3K4me3 w regionach kontroli pozytywnej oraz pomijalny sygnał w regionach kontroli negatywnej. Dla porównania i w celu potwierdzenia spójności przedstawiono dodatkowe dane uzyskane z zastosowaniem przeciwciał H3K27ac, H3K9me3 oraz H3K27me3 przy użyciu 10 000 komórek.

Następnie przeprowadzono zautomatyzowane eksperymenty ChIP, aby zademonstrować zdolność zautomatyzowanego systemu do pracy z niewielkimi ilościami komórek przy użyciu tego samego przeciwciała przeciwko H3K4me3. Zautomatyzowany ChIP działał sprawnie, co wykazała seria dziesięciu reakcji IP, które były powtarzalne i wysoce porównywalne z wynikami ręcznego ChIP (Rycina 5B). Przeprowadzono eksperymenty ręczne i zautomatyzowane, a korzyści z zastosowania protokołów zautomatyzowanych przejawiły się w zmniejszeniu zmienności między poszczególnymi eksperymentami (Rycina 5C).

Wykresy słupkowe ChIP-seq przedstawiające modyfikację histonów (H3K4me3) przy zastosowaniu zautomatyzowanych i manualnych metod ChIP.
Rycina 5. Optymalizacja eksperymentów ChIP i Auto ChIP na 10 000 komórek Manualne eksperymenty ChIP przeprowadzono na 10 000 komórek, stosując 0,25 μg przeciwciał H3K4me3, 0,1 μg H3K27ac, 0,5 μg H3K9me3 oraz 0,25 μg H3K27me3. Jako kontrolę zastosowano identyczne ilości IgG króliczego. qPCR przeprowadzono z użyciem starterów dla dwóch loci pozytywnych i dwóch loci negatywnych dla każdego analizowanego ChIP. Rycina 5A przedstawia odzysk, wyrażony jako procent DNA wejściowego (relatywna ilość DNA immunoprecypitowanego w porównaniu do DNA wejściowego po analizie qPCR). Rycina 5B przedstawia 10 reakcji ChIP przeprowadzonych na systemie IP-Star Compact z użyciem 0,25 μg poliklonalnego przeciwciała H3K4me3 oraz 0,25 μg IgG króliczego jako negatywnego przeciwciała kontrolnego. Następnie wykonano analizę qPCR z użyciem starterów dla loci pozytywnych (promotor EIF4A2 i TSS GAPDH) oraz loci negatywnych (ekson 2 Myoglobiny i Sat2). Rycina przedstawia odzysk, wyrażony jako procent DNA wejściowego (relatywna ilość DNA immunoprecypitowanego w porównaniu do DNA wejściowego po analizie qPCR). Rycina 5C przedstawia dane ChIP dla H3K4me3 z 10 manualnych eksperymentów ChIP w porównaniu do 10 zautomatyzowanych eksperymentów ChIP. Słupki błędów reprezentują odchylenia standardowe dla każdego z dziesięciu powtórzeń. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

W celu oceny czułości zautomatyzowanych protokołów ChIP przeprowadzono eksperymenty z wykorzystaniem liczby komórek w zakresie od 100 000 do 200 komórek na jedną reakcję IP. Zastosowano przeciwciało anty-H3K27me3, ponieważ jest to bardzo powszechna modyfikacja histonowa. Użycie innych przeciwciał antyhistonowych lub nieantyhistonowych może wymagać większej lub mniejszej liczby komórek, w zależności od obfitości epitopu oraz jakości przeciwciała. Eksperymenty zwalidowano za pomocą ilościowego PCR, w wyniku czego zaobserwowano, że zmniejszenie ilości kulek oraz przeciwciał redukuje tło w badaniach, co pozwala na uzyskanie pomyślnych wyników ChIP-qPCR przy użyciu nawet 200 komórek z przeciwciałem (Rysunek 6).

Wykres słupkowy immunoprecypitacji chromatyny; analiza wzbogacenia H3K27me3 w porównaniu GAPDH i TSH2B.
Rysunek 6. Zautomatyzowane analizy ChIP na 200 komórkach. Komórki HeLa-S3 i przeciwciało skierowane przeciwko H3K27me3. Chromatynę poddano fragmentacji z 1 miliona komórek, a następnie do każdej reakcji ChIP wykorzystano rozcieńczenia szeregowe tej chromatyny (od równowartości 100 000 do 200 komórek). W doświadczeniu na 100 000 komórek zastosowano 1 µg H3K27me3 oraz 10 μl magnetycznych kulek pokrytych białkiem A; w przypadku 10 000 i 1 000 komórek zastosowano 0,5 µg H3K27me3 oraz 10 µl kulek; natomiast dla 500 i 200 komórek użyto 0,25 µg H3K27me3 oraz 5 µl kulek. Jako przeciwciało kontrolne negatywne zastosowano odpowiednio 1 µg i 0,5 µg króliczego IgG podczas przeprowadzania doświadczeń z 100 000 i 1 000 komórek. 6A przedstawia stopień zajętości genów TSH2B i GAPDH w % względem inputu. 6B przedstawia względną zajętość TSH2B w stosunku do negatywnego kontrolnego regionu genomicznego GAPDH.

Analiza końcowa wyników ChIP-seq dla 10 000 komórek

W celu oceny ogólnej jakości zautomatyzowanych eksperymentów ChIP-seq przy niskiej początkowej liczbie komórek, przeprowadzono zautomatyzowane analizy ChIP-seq z zastosowaniem 0,25 µg przeciwciała H3K4me3 na 10 000 komórek HeLa, natomiast eksperymenty ChIP na 100 000 komórek HeLa-S3 posłużyły jako kontrola pozytywna eksperymentu. Zautomatyzowane biblioteki przygotowano przy użyciu odczynników z zestawu do przygotowania bibliotek MicroPlex, dostosowanych do bibliotek o niskiej zawartości DNA. Należy zauważyć, że mimo możliwości przeprowadzenia pomyślnych zautomatyzowanych eksperymentów ChIP z liczbą komórek mniejszą niż 10 000, ilość wyizolowanego DNA nie będzie wystarczająca do przygotowania bibliotek przy użyciu odczynników z zestawu. Generowanie klastrów oraz sekwencjonowanie przeprowadzono zgodnie z instrukcjami producenta. Analizy bioinformatyczne po sekwencjonowaniu wykazały wyjątkowe wyniki dla próbek ChIP o niskiej liczbie komórek. Zbiór danych 30 pg (odpowiadający 10 000 komórek materiału wyjściowego) charakteryzuje się niskim szumem tła i wysoce wiarygodnymi pikami wzbogacenia, które zostały potwierdzone zarówno przez zbiór danych 300 pg (odpowiadający 100 000 komórek materiału wyjściowego), jak i zbiorem danych H3K4me3 wygenerowanym przez Broad Institute dla projektu ENCODE, który posłużył jako referencja zewnętrzna. Istotne jest zwrócenie uwagi na dane dotyczące współczynnika nakładania się Top 40, który odnosi się do standardowej metody stosowanej w projekcie ENCODE11; w tej metodzie ChIP-seq uznaje się za powtarzalny, jeśli przy porównaniu dwóch zbiorów danych występuje co najmniej 80% nakładania się najlepszych 40% pików uszeregowanych według wyniku istotności. Zbiór danych 30 pg spełnia te kryteria w porównaniu zarówno ze zbiorem danych 300 pg (uwzględniając wszystkie jego piki, a nie tylko najlepsze 40%), jak i z danymi Broad Institute (Tabela 1). Zbiór danych 300 pg wykazuje niemal identyczne piki jak dane Broad Institute, przy współczynniku nakładania się Top 40 wynoszącym 98% (Rysunek 7).

Wykres dostępności chromatyny; wyniki sekwencjonowania DNA; piki odczytów; porównanie próbek komórkowych.
Rycina 7. Analizy ChIP i generowanie bibliotek z 10 000 komórek Eksperymenty ChIP-seq przeprowadzono na 10 000 i 100 000 komórkach HeLa-S3 z wykorzystaniem przeciwciała H3K4me3 (0,25 µg/µl). Tagi o długości 35 bp zmapowano do genomu ludzkiego za pomocą alignera ELAND. Podczas następczego wyznaczania pików (peak calling) program SICER mógł wiarygodnie zidentyfikować wzbogacenia zarówno z małej liczby komórek, jak i z milionów komórek. Zestawy danych zostały przeanalizowane i porównane ze sobą oraz z danymi referencyjnymi wygenerowanymi przez Broad Institute. Próbki z niską liczbą komórek są spójne i wykazują bardzo wysokie podobieństwo. Próbka 30 pg spełnia kryteria ENCODE11 (min. 80% z górnych 40% pików powinno nakładać się na siebie). Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Tabela z wynikami analizy dostępności chromatyny, porównująca parametry piku dla 10 tys. i 100 tys. komórek.
Tabela 1.

Dyskusja

Immunoprecypitacja chromatyny, po której następuje sekwencjonowanie, jest obecnie standardową procedurą. W tym miejscu przedstawiono zautomatyzowany protokół ChIP-seq, który może generować profile epigenetyczne chromatyny przy użyciu zaledwie 10 000 komórek materiału wyjściowego.

Automatyzacja testów ChIP i przygotowania bibliotek pozwala na standaryzację procedury optymalizacji ChIP i zmniejszenie zmienności eksperymentalnej. Przedstawiony tutaj system obsługi cieczy eliminuje wiele ręcznych procedur związanych z ChIP, skracając czas pracy wskazówek do zaledwie 30 minut, minimalizuje straty próbki i umożliwia dokładny sekwencjonat ChIP przy zaledwie kilku pikogramach danych wejściowych z biblioteki. Aby osiągnąć udane zautomatyzowane eksperymenty ChIP-seq, kluczowe jest również stosowanie wysokiej jakości preparatów chromatyny ścinanej i przeciwciał klasy ChIP-seq w każdym eksperymencie System wykorzystuje technologię opartą na kulkach magnetycznych i oferuje elastyczność w zakresie zmiany głównych parametrów eksperymentalnych, takich jak czas inkubacji dla etapów powlekania przeciwciałem i immunoprecypitacji lub modyfikacja warunków mycia, umożliwiając badaczowi przeprowadzenie wszystkich niezbędnych eksperymentów w celu optymalizacji ChIP-seq. Zautomatyzowany system jest "otwartą" platformą, która umożliwia również równoległe porównywanie wielu odczynników w celu optymalizacji warunków eksperymentalnych dla każdej pojedynczej linii komórkowej i przeciwciała oraz umożliwia bezpośrednie porównanie różnych typów i stężeń chromatyny, różnych przeciwciał, a nawet różnych typów kulek magnetycznych.

Jednym z ograniczeń zautomatyzowanego systemu jest konieczność automatyzacji wszystkich protokołów w objętościach od 5 μl do 200 μl. Jednak miniaturyzacja eksperymentów w tej zautomatyzowanej platformie umożliwia również oszczędność kosztów odczynników.

Oprócz protokołów opisanych w tym badaniu, system jest elastyczny, a także automatyzuje wiele innych zastosowań opartych na kulkach magnetycznych, takich jak immunoprecypitacja i wychwytywanie metylowanego DNA (technologie MeDIP i MethylCap), immunoprecypitacja hydroksylometylowanego DNA (hMEDIP), sekwencyjna immunoprecypitacja chromatyny (ReChIP), immunoprecypitacja RNA (RNA-IP), konwersja wodorosiarczynów i testy oczyszczania DNA.

Oświadczenia

Autorzy tego artykułu, w chwili jego pisania, są zatrudnieni przez Diagenode S.A. oraz Diagenode, Inc., producenta opisywanego systemu automatycznego.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez grant BLUERPINT EU (BLUEPRINT – A BLUEPRINT of Haematopoietic Epigenomes). Dziękujemy również Regionowi Walonii (DG06) za wsparcie finansowe.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
PBS Technologie życiowe14190-094
Trypsyna-EDTASigmaT3924-100ML
Formaldehyd 37%SigmaF8775-25
1,25 M Roztwór glicynyDiagenodaC01020010Składnik idealnego zestawu ChIP-seq
Bufor do lizy iL1DiagenodaC01020010Składnik idealnego zestawu ChIP-seq
Bufor do lizy iL2DiagenodeC01020010Składnik idealnego zestawu ChIP-seq
Bufor ścinający iS1DiagenodeC01020010Składnik idealnego zestawu ChIP-seq
Mieszanka inhibitorów proteazy (200x)DiagenodeC01010130Składnik zestawu Auto True Micro ChIP
HBSS (bez wapnia, bez magnezu, bez czerwieni fenolowej)Life technologies14175-053
Bufor do lizy tL1DiagenodeC01010130Komponent zestawu Auto True Micro ChIP
Bufor ChIP tC1DiagenodeC01010130Składnik zestawu Auto True Micro ChIP
idealny zestaw ChIP-seqDiagneodeC01010051
ChIP-Buffer HDiagenodeC01010020Składnik zestawu Auto Histone ChIP-seq
Auto Histone Zestaw sekwencyjnyDiagenodeC01010020
Zestaw Auto True Micro ChIP PrzeciwciałoC01010130Diagenode
H3K79me3-Klasyczne Przeciwciałopoliklonalne DiagenodeC15310068
H3K27me3-Klasyczne Przeciwciało poliklonalneDiagenodeC15410069
H3K4me3-KlasycznePrzeciwciało
H3K4me2-KlasycznePrzeciwciało poliklonalne DiagenodeC15410035
H3K9ac-PremiumDiagenodeC15410004
Przeciwciało poliklonalne H3K9/14ac-PremiumDiagenodeC15410200
Przeciwciało poliklonalne H3K36me3-PremiumDiagenodeC15410058
Przeciwciało poliklonalne H3K9me3-PremiumDiagenodeC15410193
IgG królikaKulki paramagnetyczne powlekane C15410206
Diagenode Białko A DiagenodeC01010020
Auto IPureDiagenodeC03010010
MicroChIP Kolumny DiaPureDiagenodeC03040001
Universal SyberGreenMaster Mix 1,25 mlDiagenodeDMMLD2D100 
Quant-IT dsDNAInvitrogenQ32854
Zestaw do przygotowania próbki Illumina do Genomic DNAIlluminaFC-121-3001
Zestaw Illumina True-seq Zestaw do przygotowania biblioteki ChIPIlluminaIP-202-1012
Zestaw do przygotowania biblioteki MicroPlexDiagenodeC05010010
Koraliki Agencourt AMPure XPBeckman CoulterA63881
Zestaw do analizy ilościowej Illumina LibraryKapa BiosystemsKK4844
IP-Star Compact  Zautomatyzowany systemDiagenodeB03000002
Bioruptor PlusDiagenodeB01020001
Bioruptor PicoDiagenodeB01060001
Qubit systemInvitrogenQ32857
Illumina Systemy HiseqIllumina
poliklonalne poliklonalne C15410030

Bibliografia

  1. Dahl, J. A., Collas, P. A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (microChIP). Nature Protocols. 3, 1032-1045 (2008).
  2. Adli, M., Bernstein, B. E. Whole-genome chromatin profiling from limited numbers of cells using nano-ChIP-seq. Nature Protocols. 6, 1656-1668 (2011).
  3. Blecher-Gonen, R., et al. High-throughput chromatin immunoprecipitation for genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions and epigenomic states. Nature Protocols. 8, 539-554 (2013).
  4. Aldridge, S., et al. AHT-ChIP-seq: a completely automated robotic protocol for high-throughput chromatin immunoprecipitation. Genome Biology. 14, 124(2013).
  5. Farias-Hesson, E., et al. Semi-automated library preparation for high-throughput DNA sequencing platforms. Journal of Biomedicin., & Biotechnology. 2010, (2010).
  6. Callejas, S., Alvarez, R., Benguria, A., Dopazo, A. AG-NGS: a powerful and user-friendly computing application for the semi-automated preparation of next-generation sequencing libraries using open liquid handling platforms. BioTechniques. 56, 28-35 (2014).
  7. Zang, C., et al. A clustering approach for identification of enriched domains from histone modification ChIP-Seq data. Bioinformatics. 25, Oxford, England. 1952-1958 (2009).
  8. Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biology. 9, 137(2008).
  9. Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Molecular Cell. 38, 576-589 (2010).
  10. Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics (Oxford, England). 26, 841-842 (2010).
  11. Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Research. 22, 1813-1831 (2012).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Automatyzacja ChIP seqprofilowanie epigenetyczneChIP przy niskiej liczbie kom rekimmunoprecypitacja na koralikach magnetycznychautomatyczne przygotowywanie bibliotekanaliza modyfikacji histon wwalidacja za pomoc ilo ciowego PCRsekwencjonowanie nast pnej generacjisystem IP Star Compactepigenetyka kom rek HeLa
Automatyzacja eksperymentów ChIP-seq w celu wygenerowania profili epigenetycznych na 10 000 komórek HeLa
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.