Automatyzacja eksperymentów ChIP-seq w celu wygenerowania profili epigenetycznych na 10 000 komórek HeLa

Podsumowanie

Metody mapowania interakcji białko-DNA in vivo stają się kluczowe dla każdego aspektu badań genomicznych, ale są pracochłonne, kosztowne i czasochłonne. W artykule przedstawiono dostępny na rynku zrobotyzowany system obsługi cieczy, który automatyzuje immunoprecypitację chromatyny w celu mapowania in vivo interakcji białko-DNA z ograniczoną liczbą komórek.

Streszczenie

Immunoprecypitacja chromatyny, a następnie sekwencjonowanie nowej generacji (ChIP-seq) jest techniką z wyboru do badania interakcji białko-DNA. ChIP-seq został wykorzystany do mapowania interakcji białko-DNA i przypisywania modyfikacji histonów. Procedura jest żmudna i czasochłonna, a jednym z głównych ograniczeń jest zapotrzebowanie na duże ilości materiału wyjściowego, zwykle miliony komórek. Automatyzacja testów immunoprecypitacji chromatyny jest możliwa, gdy procedura opiera się na wykorzystaniu kulek magnetycznych. Skuteczne zautomatyzowane protokoły immunoprecypitacji chromatyny i przygotowania biblioteki zostały specjalnie zaprojektowane w dostępnym na rynku zrobotyzowanym systemie obsługi cieczy, przeznaczonym głównie do automatyzacji testów epigenetycznych. W pierwszej kolejności przedstawiono walidację zautomatyzowanych testów ChIP-seq przy użyciu przeciwciał skierowanych przeciwko różnym modyfikacjom histonów, a następnie optymalizację zautomatyzowanych protokołów przeprowadzania immunoprecypitacji chromatyny i przygotowania biblioteki, zaczynając od niskiej liczby komórek. Celem tych eksperymentów jest dostarczenie cennego narzędzia do przyszłej analizy epigenetycznej określonych typów komórek, subpopulacji i próbek biopsyjnych.

Wprowadzenie

Ponieważ technologie sekwencjonowania nowej generacji (NGS) stały się powszechne i bardziej dostępne, podstawową metodą mapowania całego genomu interakcji białko-DNA jest teraz immunoprecypitacja chromatyny, a następnie detekcja NGS (ChIP-seq), która umożliwia odkrycie miejsc wiązania czynnika transkrypcyjnego lub wzorców modyfikacji histonów. ChIP-seq jest korzystny w dostarczaniu danych o wysokiej przepustowości całego genomu, które można wykorzystać do ilościowej i jakościowej analizy interakcji białko-DNA poprzez pomiar wzbogaconych fragmentów DNA. Istnieją jednak pewne wady standardowych eksperymentów ChIP-seq, takie jak trudność w uzyskaniu wystarczającej ilości materiału do stworzenia biblioteki sekwencjonowania.

Eksperymenty ChIP dzielą się na sześć podstawowych etapów, w tym: 1) sieciowanie regionów wiążących białko-DNA, 2) przygotowanie próbki, które obejmuje lizę komórek i ścinanie chromatyny przez sonikację, 3) tworzenie immunokompleksów, 4) wytrącanie immunokompleksów, 5) mycie immunokompleksów, oraz 6) elucję wzbogaconego materiału i analizę za pomocą qPCR i NGS.

Sukces testu ChIP zależy od trzech głównych czynników: dobrego przygotowania chromatyny, ilości antygenu w oryginalnej próbce oraz specyficzności i powinowactwa przeciwciała do pokrewnego antygenu. Głównym ograniczeniem jest wymóg dużej ilości początkowej liczby komórek w celu uzyskania wystarczającej ilości wzbogaconego DNA do stworzenia biblioteki sekwencjonowania. Dla naukowców, którzy pracują z ograniczonymi ilościami próbek, takimi jak próbki z biopsji lub subpopulacje komórek, eksperymenty ChIP-seq są bardzo trudne. Ostatnie badania wykazały, że testy ChIP-seq można wykonywać podczas pracy z małą liczbą komórek^{1, 2}. Firma Diagenode opracowała zrobotyzowany system obsługi cieczy, który może w pełni zautomatyzować eksperymenty z sekwencją ChIP, gdy zaczyna się od ograniczonej liczby komórek.

Automatyzacja zapewnia wiele zalet w porównaniu z ręcznym przygotowywaniem próbek ChIP-seq, ponieważ zmniejsza błędy ludzkie, zmniejsza zmienność i zmniejsza koszty eksperymentów. Opisano półautomatyczne protokoły immunoprecypitacji chromatyny i przygotowania biblioteki, ale żadne z tych badań nie wykazało danych przy użyciu niskiej liczby komórek^{3, 4, 5, 6}.

W tym artykule opisano kompletny zautomatyzowany przepływ pracy zarówno dla testów immunoprecypitacji chromatyny, jak i przygotowania biblioteki w zrobotyzowanym systemie obsługi cieczy, który wykorzystuje technologię opartą na kulkach magnetycznych i który może adresować wiele parametrów w optymalizacji protokołu. W tym przypadku z powodzeniem przeprowadzono zautomatyzowane eksperymenty ChIP-seq na ograniczonej liczbie komórek w celu uproszczenia, standaryzacji i zapewnienia niezawodnego rozwiązania do badania profili epigenetycznych w populacjach małych komórek. Zautomatyzowany protokół ChIP opisany w tym artykule został zoptymalizowany na komórkach HeLa przy użyciu specyficznych przeciwciał histonowych i odczynników, ale przepływ pracy można dostosować do innych linii komórkowych i przeciwciał z odpowiednią optymalizacją eksperymentalną.

Protokół

1. Standardowe eksperymenty ChIP

1. Pobieranie komórek i sieciowanie DNA-białko.
   1. Wyhoduj komórki HeLa-S3 do konfluencji 80%-90%. Usunąć pożywkę hodowlaną, umyć naczynie dwukrotnie 10 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) i dodać trypsynę-EDTA (1x) do płytki hodowlanej. Inkubować maksymalnie 2 minuty, aby oderwać komórki od naczynia. Zebrać komórki i przemyć dwukrotnie 10 ml PBS.
      UWAGA: Dłuższy czas inkubacji doprowadzi do uszkodzenia komórek.
   2. Odwirować komórki przez 5 minut przy 500 x g i ponownie zawiesić komórki w 20 ml PBS. Kontynuuj liczenie komórek.
   3. Odwirować komórki przez 5 minut przy 500 x g, odrzucić supernatant i dodać 500 μl PBS. Optymalna liczba komórek na etapie utrwalania to 10 milionów komórek na 500 μl PBS.
   4. Dodać 13,5 μl świeżego 37% formaldehydu do każdej podwielokrotności 500 μl zawiesiny komórek. Utrwalaj komórki przez 8 minut w temperaturze pokojowej.
   5. Dodać 57 μl 1,25 M roztworu glicyny, aby zatrzymać utrwalanie. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej ze stałym mieszaniem za pomocą delikatnego wiru. Od tego momentu pracuj na lodzie.
   6. Odwirować komórki przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant bez naruszania osadu komórkowego.
   7. Umyj komórki dwukrotnie 1 ml PBS. Delikatnie odrzucić supernatant i utrzymać osad komórkowy na lodzie.
2. Liza komórek i ścinanie chromatyny
   1. Dodać 10 ml lodowatego buforu do lizy iL1 do osadu komórkowego (1 ml buforu do lizy na 1 milion komórek to optymalna proporcja). Kilkakrotnie pipetować w górę i w dół i inkubować przez 10 minut w temperaturze 4 °C, delikatnie mieszając.
   2. Odwirowywać lizat przez 5 minut w temperaturze 500 x g i temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
   3. Dodać 10 ml lodowatego buforu do lizy iL2 do lizatów i delikatnie wymieszać, pipetując w górę i w dół. Inkubować lizaty przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
   4. Wirować przez 5 minut przy 500 x g i temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.
   5. Przygotuj kompletny bufor ścinający, dodając 200-krotny koktajl inhibitorów proteazy () do buforu ścinającego iS1. Trzymaj bufor na lodzie przez 5 minut, a następnie pracuj na lodzie. Dodać 1 ml kompletnego buforu ścinającego iS1 do każdej osadki zawierającej 10 milionów komórek i delikatnie wymieszać, pipetując w górę iw dół. Przed przystąpieniem do sonikacji należy inkubować próbki na lodzie przez 10 minut, aby zmniejszyć lepkość próbki.
   6. Ścinanie 300 μl podwielokrotności chromatyny przez sonikację przy użyciu sonikatora w łaźni wodnej przez 2 do 3 zestawów po 10 cykli każdy. Cykl składa się z 30 sekund "ON" i 30 sekund "OFF" przy ustawieniu wysokiej mocy. Alternatywnie, użyj urządzenia piko-sonikacyjnego o krótszym czasie sonikacji wynoszącym od 5 do 10 cykli po 30 sekund "ON", 30 sec "OFF". Krótko zwiruj i zakręć rurkami między biegami. W przypadku korzystania z innych typów sonikatorów należy postępować zgodnie z odpowiednimi instrukcjami producenta dotyczącymi ścinania chromatyny.
   7. Odwirować ściętą chromatynę o stężeniu 16 000 x g przez 10 minut i zebrać supernatant do natychmiastowego użycia na etapie IP. Alternatywnie należy przechowywać chromatynę w temperaturze -80 °C przez okres do 2 miesięcy do wykorzystania w przyszłości.
   8. Przeanalizuj skuteczność ścinania chromatyny przed etapem immunoprecypitacji przy użyciu 1-1,5% żeli agarozowych TAE lub bionalizatora. Optymalne rozmiary fragmentów chromatyny wahają się w zakresie 100-600 pz.

2. Eksperymenty z ChIP o niskiej liczbie komórek

1. Pobieranie komórek i sieciowanie DNA-białko
   1. Wyhoduj komórki HeLa-S3 do konfluencji 80%-90%. Usuń pożywkę hodowlaną, umyj naczynie dwukrotnie 10 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i dodaj 1x Trypsynę-EDTA do płytki hodowlanej. Inkubować maksymalnie 2 minuty, aby oderwać komórki od naczynia.
      UWAGA: Dłuższy czas inkubacji doprowadzi do uszkodzenia komórek.
   2. Zebrać komórki, dodając 1 ml pożywki hodowlanej zawierającej surowicę do probówki wirówkowej o pojemności 1 ml. Policz komórki.
   3. Odwirowywać komórki przez 5 minut przy 500 x g. Doprowadzić liczbę komórek do 10 000 komórek na ml pożywki hodowlanej w celu utrwalenia.
   4. Dodaj 27 μl 36,5% świeżo przygotowanego formaldehydu do każdej probówki w celu utrwalenia. Odwrócić probówkę dwa lub trzy razy i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
   5. Dodać 115 μl 1,25 M roztworu glicyny do próbki, odwrócić probówkę dwa lub trzy razy i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Od tego momentu pracować na lodzie.
   6. Odwirować komórki w stężeniu 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić sklarowany osad powoli.
   7. Umyj komórki 1 ml lodowatego HBSS z (200x, stężenie końcowe 1x). Odwrócić probówkę dwa lub trzy razy w celu ponownego zawieszenia komórek i odwirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Delikatnie odrzucić supernatant i utrzymać osad komórek na lodzie.
2. Liza komórek i ścinanie chromatyny
   1. Dodać 25 μl kompletnego buforu do lizy tL1 (bufor do lizy tL1 +) na 10 000 komórek i ręcznie zamieszać dno probówki w celu ponownego zawieszenia komórek. Inkubować na lodzie przez 5 minut.
   2. Dodać 75 μl pełnego buforu HBSS (HBSS +) do każdej podwielokrotności zawierającej 10 000 komórek.
   3. Ścinanie 100 μl podwielokrotności 10 000 komórek metodą sonikacji dla 5 zestawów po 5 cykli każdy. Cykl składa się z 30 sekund "ON" i 30 sekund "OFF" przy ustawieniu wysokiej mocy. Alternatywnie, użyj urządzenia piko-sonikacyjnego używanego z krótszym czasem sonikacji wynoszącym 5 cykli po 30 sekund "ON", 30 sec "OFF". Optymalne rozmiary fragmentów chromatyny wahają się w zakresie 100-600 pz. Należy pamiętać, że preparaty chromatyny, typy komórek i różne sonikatory wymagają oddzielnych eksperymentów optymalizacyjnych ścinania.
   4. Odwirować ściętą chromatynę przy 14 000 x g przez 10 minut, aby odrzucić nierozpuszczalny materiał i zebrać supernatant do natychmiastowego użycia na etapie IP. Alternatywnie należy przechowywać chromatynę w temperaturze -80 °C przez okres do 2 miesięcy do wykorzystania w przyszłości.
   5. Przeanalizuj skuteczność ścinania chromatyny przed etapem immunoprecypitacji za pomocą 1-1,5% żeli agarozowych TAE lub bionalizatora. Potraktuj próbki RNazą przed analizą żelu agarozowego, aby poprawić wizualną ocenę ścinania. Optymalne rozmiary fragmentów chromatyny wahają się w zakresie 100-600 pz.

3. Immunoprecypitacja chromatyny i przygotowanie biblioteki

1. W przypadku standardowych eksperymentów zautomatyzowanych ChIP
   1. Dodać 120 μl buforu ChIP H (bufor ChIP H +) do 100 μl ściętej chromatyny. Użyć 200 μl dla IP i zachować od 2 μl do 20 μl jako próbkę wejściową.
   2. Wybierz zautomatyzowany protokół ChIP 200 μl w przyrządzie automatyki. Przepustowość protokołu wynosi od 1 do 16 próbek na przebieg.
   3. Przeprowadź zautomatyzowany eksperyment ChIP przy użyciu chromatyny odpowiadającej 1-2 milionom komórek, 1-2 μg króliczych przeciwciał poliklonalnych anty-H3K79me3, -H3K27me3, -H3K4me3, -H3K4me2, -H3K9ac, -H3K9/14ac, -H3K36me3 i H3K9me3 ChIP-seq klasy ChIP-seq. Optymalne ilości przeciwciał różnią się w zależności od modyfikacji histonów oraz powinowactwa i swoistości odpowiedniego przeciwciała.
      1. Stosować równe ilości nieimmunologicznej IgG królika jako przeciwciała kontrolnego izotypu. Alternatywnie, użyj niepowlekanych kulek lub specyficznego zablokowanego przeciwciała jako kontroli ChIP. Dodać 20 μl kulek magnetycznych pokrytych białkiem A do każdej reakcji.
   4. Użyj zautomatyzowanych odczynników ChIP-seq kit do przeprowadzania zautomatyzowanych eksperymentów ChIP z przeciwciałami poliklonalnymi anty-H3K79me3 i -H3K4me2. Użyj idealnych odczynników z zestawu ChIP-seq do przeprowadzenia eksperymentów ChIP z anty-H3K27me3, -H3K4me3, -H3K9ac, -H3K9/14ac, -H3K36me3 i -H3K9me3.
   5. Wybierz zautomatyzowany protokół ChIP zgodnie z instrukcjami oprogramowania zaimplementowanymi w urządzeniu automatyki. Ustawić parametry eksperymentalne ChIP na 4 godziny dla etapu powlekania przeciwciałem i 15 godzin dla etapu immunoprecypitacji. Etap odwrotnego sieciowania odbywa się w automatycznym urządzeniu w temperaturze 65 °C przez 4 godziny.
   6. Oczyść usieciowane DNA w zautomatyzowanym systemie. Wybierz automatyczne protokoły oczyszczania DNA za pomocą protokołu lub zestawu wykorzystującego oczyszczanie DNA oparte na kulkach magnetycznych. Eluować DNA w 25 μl wody.
   7. Określ ilościowo DNA wytrącone immunologicznie, ekstrahując 10% DNA wytrąconego immunologicznie. Wydajność immunoprecypitowanego DNA zależy od jakości chromatyny i przeciwciała, typu komórki i docelowej modyfikacji histonów. Określić ilościowo DNA za pomocą zestawu do oznaczania zgodnie z instrukcjami producenta.
   8. Przeanalizuj jakość immunoprecypitowanego DNA za pomocą ilościowego PCR przy użyciu starterów dla co najmniej 1 dodatnich i 1 ujemnych regionów genomowych kontroli. Nie należy używać więcej niż 10% całkowitego immunoprecypitowanego DNA do oceny wzbogacenia ChIP.
      1. Przygotuj reakcje qPCR. Dodać 10 μl 2x SyberGreen qPCR master mix, 1 μl mieszanki starterów, 1-5 μl immunoprecypitowanego lub wejściowego DNA i sterylną wodę do 20 μl końcowej objętości reakcyjnej. Program qPCR obejmuje wstępny etap denaturacji w temperaturze 95 °C przez 5-10 minut, w zależności od dostawcy polimerazy Taq, a temperatury wyżarzania należy ustawić zgodnie z wybranymi starterami.
   9. Użyj zautomatyzowanych protokołów przygotowania biblioteki kompatybilnych z dostępnymi na rynku odczynnikami do przygotowania biblioteki Illumina ChIP-seq, aby zbudować biblioteki przy użyciu zarówno DNA ChIP, jak i zapisanego DNA wejściowego z tego samego preparatu chromatyny. Użyj 10-20 ng immunoprecypitowanego DNA z każdego przeciwciała do przygotowania biblioteki. Przygotuj do 16 zautomatyzowanych bibliotek na przebieg.
   10. Sekwencjonuj biblioteki i generuj klastry zgodnie z instrukcjami producenta Illumina. Wykonaj podstawową analizę bioinformatyczną (filtrowanie klastrów, wywoływanie bazy itp.) zgodnie ze standardowym potokiem Illumina, przefiltruj i dostosuj odczyty do najnowszego zestawu ludzkiego genomu (obecna wersja to GRCh38) za pomocą nakładki ELAND. Użyj SICER⁷ lub MACS⁸ do wywoływania szczytów i wykonuj dalsze analizy pików za pomocą Homer⁹, BEDTools¹⁰ lub preferowanego oprogramowania.
2. Do zautomatyzowanych eksperymentów ChIP o niskiej liczbie komórek
   1. Dodać 120 μl pełnego buforu ChIP tC1 (ChIP Buffer tC1 +) do 100 μl ściętej chromatyny. Użyj 200 μl dla IP i zachowaj 20 μl jako dane wejściowe.
   2. Wybierz zautomatyzowany protokół ChIP 200 μl w systemie automatyki. Przepustowość protokołu wynosi od 1 do 16 próbek na przebieg.
   3. Przeprowadź zautomatyzowany eksperyment ChIP-seq przy użyciu zautomatyzowanych odczynników ChIP i przeciwciał klasy ChIP zoptymalizowanych do pracy z niskimi ilościami chromatyny. Użyj chromatyny odpowiadającej 10 000 komórek i 100 000 komórek, 0,5 μg anty-H3K27me3, 0,25 μg -H3K4me3, 0,1 μg -H3K27ac, 0,25 μg -H3K9me3 królikowi Premium ChIP-seq królicze przeciwciała poliklonalne klasy ChIP-seq. Optymalne ilości przeciwciał różnią się w zależności od modyfikacji histonów oraz powinowactwa i swoistości odpowiedniego przeciwciała.
      1. Użyj równej ilości nieimmunologicznej króliczej IgG jako przeciwciała kontrolnego izotypu. Alternatywnie, użyj niepowlekanych kulek lub specyficznego zablokowanego przeciwciała jako kontroli ChIP. Dodać 10 μl kulek magnetycznych pokrytych białkiem A do każdej reakcji.
   4. Wybierz zautomatyzowany protokół ChIP zgodnie z instrukcjami oprogramowania zaimplementowanymi w urządzeniu automatyki. Ustawić parametry eksperymentalne ChIP na 4 godziny dla etapu powlekania przeciwciałem i 15 godzin dla etapu immunoprecypitacji. Etap odwrotnego sieciowania odbywa się w automatycznym urządzeniu w temperaturze 65 °C przez 4 godziny.
   5. Odwrócony usieciowany DNA należy oczyścić za pomocą kolumn wirowych zgodnie z instrukcjami producenta i wymyć w objętościach od 6 μl do 25 μl wody.
   6. Określić ilościowo DNA za pomocą dostępnego w handlu zestawu do oznaczania. Przeanalizuj wyniki za pomocą qPCR przy użyciu starterów dla dodatnich i ujemnych regionów kontrolnych w celu oceny jakości ChIP.
   7. Użyj zestawu do przygotowania biblioteki ze zoptymalizowanymi odczynnikami do przygotowania biblioteki, aby przygotować biblioteki o niskiej ilości DNA. Użyj 30 pg i 300 pg DNA ChIP (co odpowiada odpowiednio eksperymentom na 10 000 i 100 000 komórek) do przygotowania biblioteki. Przygotuj biblioteki przy użyciu automatycznego protokołu kompatybilnego z odczynnikami do przygotowania bibliotek. Przepływność automatycznego przygotowywania biblioteki wynosi od 1 do 48 bibliotek na przebieg.
   8. Po końcowej naprawie dwuniciowych matryc DNA, podwiązuj rozszczepialne adaptery pętli macierzystej zawierające miejsca starterów sekwencjonowania. Po etapie przedłużania DNA amplifikuj próbkę metodą amplifikacji o wysokiej wierności opisaną w protokole zestawu do przygotowania biblioteki.
   9. Po amplifikacji biblioteki należy określić ilościowo i oczyścić biblioteki zgodnie z wytycznymi dotyczącymi zestawu do przygotowania biblioteki. Należy pamiętać, że wybór rozmiaru po oczyszczeniu nie jest konieczny.
   10. Sekwencjonuj biblioteki i generuj klastry zgodnie z instrukcjami producenta. Wykonaj podstawową analizę bioinformatyczną (filtrowanie klastrów, wywoływanie bazy itp.) zgodnie ze standardowym potokiem producenta, przefiltruj i dostosuj odczyty do najnowszego zestawu ludzkiego genomu (obecna wersja to GRCh38) za pomocą nakładki ELAND⁷. Użyj SICER⁸ lub MACS⁹ do wywoływania szczytów i wykonuj dalsze analizy pików za pomocą Homera, BEDTools¹⁰ lub dowolnego preferowanego oprogramowania.

Rysunek 1. Zrzuty ekranu oprogramowania pokazujące, jak skonfigurować automatyczne eksperymenty ChIP w IP-Star Compact. Oprogramowanie zapewnia elastyczność w doborze ilości próbek w serii, a także w zmianie kluczowych parametrów eksperymentalnych (powlekanie przeciwciałami, IP i płukanie) zgodnie z potrzebami badacza. Zautomatyzowana procedura umożliwia równoległe testowanie różnych warunków (tj. różnych typów i ilości przeciwciał, różnych typów i ilości komórek, a nawet różnych typów i ilości kulek magnetycznych w tym samym przebiegu). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Zrzuty ekranu oprogramowania pokazujące, jak skonfigurować automatyczne przygotowanie biblioteki do sekwencjonowania nowej generacji przy użyciu zestawu bibliotek w systemie automatyki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wyniki

Optymalizacja zautomatyzowanych eksperymentów ChIP-seq dla ośmiu różnych markerów histonowych

W celu pomyślnego opracowania i walidacji zautomatyzowanych protokołów ChIP, wybrano przeciwciała klasy ChIP-seq, które zostały wcześniej zweryfikowane w ręcznych eksperymentach ChIP-Seq (dane nie pokazane). Do tego badania wybrano następujące przeciwciała klasy ChIP-seq: anty-H3K79me3, -H3K27me3, -H3K4me3, -H3K4me2, -H3K9ac, -H3K9/14ac, -H3K36me3 i -H3K9me3. Swoistość wszystkich przeciwciał klasy ChIP-seq została wcześniej potwierdzona przez eksperymenty dot blot, peptydowe i Western Blot (dane nie pokazane). Przeprowadzono pilotażowe eksperymenty ChIP-qPCR ze zwiększającymi się ilościami przeciwciał w celu określenia czułości przeciwciał (ryc. 3). Przeanalizowano qPCR z co najmniej dwoma dodatnimi i dwoma ujemnymi celami kontrolnymi, a profile ze wzbogaceniem celu dodatniego nad ujemnym wyższym niż pięciokrotnie kwalifikowano do eksperymentów sekwencjonowania. Ważne jest, aby przeprowadzać eksperymenty ChIP i ChIP-seq z wysoką jakością ściętej chromatyny. Wszystkie eksperymenty ChIP przedstawione w tej publikacji zostały przeprowadzone przy użyciu świeżej chromatyny. Możliwe jest również zamrożenie utrwalonych komórek w temperaturze -80 °C i przystąpienie do przygotowania i ścinania chromatyny w innym dniu. Jednak chromatyna przygotowana z zamrożonych utrwalonych komórek może zachowywać się inaczej niż chromatyna świeżo przygotowana i dlatego warunki sonikacji mogą wymagać optymalizacji dla każdego preparatu chromatyny. Podczas pracy z różnymi typami ogniw można stosować ścinające o różnych składach detergentów (SDS). Typy komórek, takie jak pierwotne linie komórkowe lub komórki hodowane w zawiesinie, są komórkami trudnymi do ścinania i będą wymagały wysokich stężeń SDS (1%), podczas gdy linie komórkowe, które są łatwe do ścinania, takie jak HeLa, będą wymagały niskich stężeń SDS (0,1%) w ścinających.

Rysunek 3. Walidacja przeciwciał klasy ChIP przy użyciu systemu automatyzacji. ChIP przeprowadzono z przeciwciałami poliklonalnymi królika anty-H3K79me3, -H3K27me3, -H3K4me3, -H3K4me2, -H3K9ac, H3K9/14ac, -H3K36me3 i -H3K9me3 królików na ściętej chromatynie z 1 miliona komórek HeLa-S3 w zależności od modyfikacji histonów. Zautomatyzowane protokoły ChIP z objętością roboczą 200 μl wykorzystano w przyrządzie do automatyzacji eksperymentów z miareczkowaniem przeciwciał. Ilości przeciwciał 1, 2, 5 i 10 μg badano w każdym eksperymencie ChIP, a 2 μg IgG stosowano jako kontrolę negatywną w każdym eksperymencie. Wzbogacenia oceniano metodą qPCR. Wyniki są przedstawiane jako % danych wejściowych (względna ilość DNA poddanego immunoprecypitacji w porównaniu z DNA wejściowym po analizie qPCR). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Po walidacji i określeniu optymalnych ilości przeciwciał klasy ChIP do użycia w systemie automatyzacji, przeprowadzono zautomatyzowane eksperymenty ChIP-seq w celu wygenerowania profili sekwencjonowania dla każdej modyfikacji histonu (Rysunek 4).

Rysunek 4. Profile histonowe ChIP-seq generowane przez zautomatyzowane eksperymenty ChIP-seq. Rysunek przedstawia profile ChIP-seq w różnych regionach genomu dla H3K4me3, H3K9ac i H3K9/14acH3K4me2, H3K79me3 i H3K36me3. 4A pokazuje szczytowy rozkład wzdłuż całego chromosomu X, a 4B rozkład w regionie 75 kb otaczającym gen GAPDH. 4C pokazuje profile H3K27me3, H3K36me3 i H3K4me3 w regionie 500 kb otaczającym gen MYT1, a 4D pokazuje rozmieszczenie H3K9me3 w regionie 200 kb otaczającym ZNF12. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wygenerowano profile epigenetyczne histonów dla sześciu różnych modyfikacji histonów związanych z ekspresją genów (H3K4me3, H3K9ac, H3K9/14ac, H3K4me2, H3K79me3 i H3K36me3). Rysunek 4A przedstawia profile ChIP-seq wzdłuż chromosomu X dla różnych markerów histonowych. Silna korelacja szczytowa obserwowana między 6 różnymi profilami histonów wskazuje na możliwości zautomatyzowanego systemu do generowania dokładnych i wiarygodnych danych. Ryciny 4B, 4C i 4D pokazują rozkład pików dla różnych modyfikacji histonów w określonych regionach genomu.

Eksperymenty z automatycznym immunoprecypitacją chromatyny do 200 komórek

Minimalna ilość komórek, która może być użyta w eksperymentach ChIP, zależy od jakości chromatyny, specyficzności i wrażliwości przeciwciała oraz obfitości modyfikacji histonów lub badanego białka. Wybór dobrych przeciwciał klasy ChIP-seq jest ważny podczas pracy z ograniczoną ilością próbki, a wybór optymalnych odczynników i różnych nośników poprawia efektywność odzyskiwania DNA i przyczynia się do sukcesu eksperymentu ChIP. Aby określić minimalną liczbę komórek, które może przetworzyć zautomatyzowany protokół ChIP, w zautomatyzowanym systemie IP-Star przetestowano różne ilości chromatyny, przeciwciał i kulek magnetycznych przy użyciu odczynników ChIP specjalnie zoptymalizowanych do pracy z małymi ilościami chromatyny.

Po pierwsze, chromatyna z 10 000 komórek została poddana sonikacji zgodnie z opisem w protokole. Wyniki ChIP zostały potwierdzone za pomocą qPCR (Figura 5A), która wykazuje znaczne wzbogacenie przeciwciałem H3K4me3 w regionach kontroli dodatniej i znikomy sygnał w regionach kontroli ujemnej. Dla porównania i dowodu spójności przedstawiono dodatkowe dane uzyskane za pomocą przeciwciał H3K27ac, H3K9me3 i H3K27me3 przy użyciu 10 000 komórek.

Przeprowadzono eksperymenty Automated ChIP, aby zademonstrować możliwości automatycznego systemu do pracy z małą ilością komórek przy użyciu tego samego przeciwciała H3K4me3. Zautomatyzowany ChIP działał dobrze, co wykazano za pomocą serii dziesięciu reakcji IP, które były powtarzalne i wysoce porównywalne z ręcznymi wynikami ChIP (Rysunek 5B). Przeprowadzono eksperymenty ręczne i automatyczne, a korzyści płynące z protokołów automatycznych zaobserwowano w zmniejszaniu zmienności między eksperymentami (Rysunek 5C).

Rysunek 5. Optymalizacja eksperymentów ChIP i Auto ChIP na 10 000 komórek Ręczne eksperymenty ChIP przeprowadzono na 10 000 komórkach i przy użyciu 0,25 μg H3K4me3, 0,1 μg H3K27ac, 0,5 μg H3K9me3 i 0,25 μg przeciwciał H3K27me3. Identyczne ilości króliczej IgG zastosowano jako kontrolę. qPCR przeprowadzono ze starterami dla dwóch dodatnich loci i dwóch ujemnych loci dla każdego testu ChIP. Rysunek 5A przedstawia odzysk wyrażony jako procent danych wejściowych (względna ilość DNA wytrąconego immunologicznie w porównaniu z DNA wejściowym po analizie qPCR). Rysunek 5B przedstawia 10 reakcji ChIP przeprowadzonych na IP-Star Compact przy użyciu 0,25 μg przeciwciała poliklonalnego H3K4me3 i 0,25 μg króliczej IgG jako przeciwciała kontroli ujemnej. Następnie przeprowadzono analizę qPCR ze starterami dla dodatniego loci promotora EIF4A2 i GAPDH TSS oraz ujemnych loci eksonu mioglobiny2 i Sat2. Rysunek przedstawia odzysk wyrażony jako procent danych wejściowych (względna ilość DNA wytrąconego immunologicznie w porównaniu z DNA wejściowym po analizie qPCR). Rysunek 5C przedstawia dane H3K4me3 ChIP z 10 ręcznych eksperymentów ChIP w porównaniu z 10 automatycznymi eksperymentami ChIP. Słupki błędów reprezentują odchylenia standardowe każdej z dziesięciu powtórzeń. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Aby zrozumieć czułość automatycznych protokołów ChIP, przeprowadzono eksperymenty z użyciem ilości komórek, która wahała się od 100 000 do 200 komórek na IP. Zastosowano przeciwciało anty-H3K27me3, ponieważ jest to bardzo powszechna modyfikacja histonów. Stosowanie innych przeciwciał histonowych lub niehistonowych może wymagać większej lub mniejszej liczby komórek, w zależności od obfitości epitopu i jakości przeciwciała. Eksperymenty zostały zwalidowane za pomocą ilościowego PCR i zaobserwowano, że poprzez zmniejszenie ilości kulek i przeciwciał tło w eksperymentach jest zmniejszone, co pozwala na pomyślne wyniki ChIP-qPCR przy zaledwie 200 komórkach przeciwciała (Figura 6).

Rysunek 6. Zautomatyzowane testy ChIP na 200 komórkach. Komórki Hela-S3 i przeciwciało skierowane przeciwko H3K27me3. Chromatynę ścinano z 1 miliona komórek i stosowano seryjne rozcieńczenia tej chromatyny (od 100 000 do 200 równoważników komórek) na reakcję ChIP. 1 μg H3K27me3 i 10 μl kulek magnetycznych powlekanych białkiem A użyto w eksperymencie na 100 000 komórek, 0,5 μg H3K27me3 i 10 μl kulek na 10 000 i 1000 komórek oraz 0,25 μg H3K27me3 i 5 μl kulek z 500 i 200 komórkami. 1 μg i 0,5 μg króliczej IgG zastosowano jako przeciwciało kontroli ujemnej podczas wykonywania eksperymentów odpowiednio na 100 000 i 1 000 komórek. 6A pokazuje obłożenie genów TSH2B i GAPDH w % nad wejściem. 6B pokazuje względne obłożenie TSH2B w porównaniu z ujemnym regionem genomowym kontroli GAPDH.

Dalsza analiza wyników sekwencji ChIP na 10 000 komórek

Aby ocenić ogólną jakość zautomatyzowanych eksperymentów ChIP-seq z niską początkową liczbą komórek, przeprowadzono automatyczne testy ChIP-seq z 0,25 μg przeciwciała H3K4me3 na 10 000 komórek HeLa, a eksperymenty ChIP na 100 000 komórek HeLa-S3 zostały użyte jako kontrola pozytywna dla eksperymentu. Zautomatyzowane biblioteki zostały przygotowane przy użyciu odczynników z zestawu do przygotowania biblioteki MicroPlex dostosowanych do przygotowanych bibliotek o niskiej zawartości DNA. Zauważ, że nawet jeśli możliwe jest przeprowadzenie udanych eksperymentów z ChIP na mniej niż 10 000 komórek, ilości ściągniętego DNA nie wystarczą do przygotowania bibliotek przy użyciu zestawu odczynników. Generowanie i sekwencjonowanie klastrów zostało wykonane zgodnie z instrukcjami producenta. Analizy bioinformatyczne przeprowadzone po sekwencjonowaniu wykazały znakomite wyniki z próbek ChIP o niskiej liczbie komórek. Zestaw danych 30 pg (odpowiadający 10 000 komórek materiału wyjściowego) zawiera niski poziom szumu tła i wysoce wiarygodne piki wzbogacenia, które są potwierdzone zarówno przez zestaw danych 300 pg (odpowiadający 100 000 komórek materiału wyjściowego), jak i zestaw danych H3K4me3 wygenerowany przez Broad Institute dla projektu ENCODE, który został wykorzystany jako odniesienie zewnętrzne. Ważne jest, aby zwrócić uwagę na dane dotyczące współczynnika nakładania się Top 40, które odnoszą się do standardowej metody zastosowanej w projekcie ENCODE¹¹, w której sekwencja ChIP-seq jest uważana za odtwarzalną, jeśli porównując dwa zestawy danych, istnieje co najmniej 80% pokrywanie się najlepszych 40% szczytów uszeregowanych według oceny istotności. Zbiór danych 30 pg spełnia te kryteria w porównaniu zarówno ze zbiorem danych 300 pg (uwzględniającym wszystkie jego szczyty, a nie tylko najlepsze 40%), jak i danymi Broad Institute (tabela 1). Zestaw danych 300 pg pokazuje prawie identyczne szczyty z danymi Broad Institute ze współczynnikiem nakładania się Top 40 na poziomie 98% (Rysunek 7).

Rysunek 7. Testy ChIP i generowanie bibliotek na 10 000 komórkach Eksperymenty ChIP-seq przeprowadzono na 10 000 i 100 000 komórkach HeLa-S3 przy użyciu przeciwciała H3K4me3 (0,25 μg/μl). Znaczniki 35 pz zostały zmapowane do ludzkiego genomu za pomocą nakładek ELAND. Podczas kolejnych szczytowych połączeń SICER był w stanie niezawodnie zidentyfikować wzbogacenia na podstawie niskiej liczby komórek, a także na podstawie milionów komórek. Zestawy danych zostały przeanalizowane i porównane ze sobą oraz z danymi referencyjnymi wygenerowanymi przez Broad Institute. Próbki o niskiej liczbie komórek są spójne i mają bardzo duże podobieństwo. Próbka o masie 30 pg spełnia kryterium ENCODE¹¹ (min. 80% górnych 40% pików powinno się na siebie nakładać). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1.

Dyskusja

Immunoprecypitacja chromatyny, po której następuje sekwencjonowanie, jest obecnie standardową procedurą. W tym miejscu przedstawiono zautomatyzowany protokół ChIP-seq, który może generować profile epigenetyczne chromatyny przy użyciu zaledwie 10 000 komórek materiału wyjściowego.

Automatyzacja testów ChIP i przygotowania bibliotek pozwala na standaryzację procedury optymalizacji ChIP i zmniejszenie zmienności eksperymentalnej. Przedstawiony tutaj system obsługi cieczy eliminuje wiele ręcznych procedur związanych z ChIP, skracając czas pracy wskazówek do zaledwie 30 minut, minimalizuje straty próbki i umożliwia dokładny sekwencjonat ChIP przy zaledwie kilku pikogramach danych wejściowych z biblioteki. Aby osiągnąć udane zautomatyzowane eksperymenty ChIP-seq, kluczowe jest również stosowanie wysokiej jakości preparatów chromatyny ścinanej i przeciwciał klasy ChIP-seq w każdym eksperymencie System wykorzystuje technologię opartą na kulkach magnetycznych i oferuje elastyczność w zakresie zmiany głównych parametrów eksperymentalnych, takich jak czas inkubacji dla etapów powlekania przeciwciałem i immunoprecypitacji lub modyfikacja warunków mycia, umożliwiając badaczowi przeprowadzenie wszystkich niezbędnych eksperymentów w celu optymalizacji ChIP-seq. Zautomatyzowany system jest "otwartą" platformą, która umożliwia również równoległe porównywanie wielu odczynników w celu optymalizacji warunków eksperymentalnych dla każdej pojedynczej linii komórkowej i przeciwciała oraz umożliwia bezpośrednie porównanie różnych typów i stężeń chromatyny, różnych przeciwciał, a nawet różnych typów kulek magnetycznych.

Jednym z ograniczeń zautomatyzowanego systemu jest konieczność automatyzacji wszystkich protokołów w objętościach od 5 μl do 200 μl. Jednak miniaturyzacja eksperymentów w tej zautomatyzowanej platformie umożliwia również oszczędność kosztów odczynników.

Oprócz protokołów opisanych w tym badaniu, system jest elastyczny, a także automatyzuje wiele innych zastosowań opartych na kulkach magnetycznych, takich jak immunoprecypitacja i wychwytywanie metylowanego DNA (technologie MeDIP i MethylCap), immunoprecypitacja hydroksylometylowanego DNA (hMEDIP), sekwencyjna immunoprecypitacja chromatyny (ReChIP), immunoprecypitacja RNA (RNA-IP), konwersja wodorosiarczynów i testy oczyszczania DNA.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
PBS	Technologie życiowe	14190-094
Trypsyna-EDTA	Sigma	T3924-100ML
Formaldehyd 37%	Sigma	F8775-25
1,25 M Roztwór glicyny	Diagenoda	C01020010	Składnik idealnego zestawu ChIP-seq
Bufor do lizy iL1	Diagenoda	C01020010	Składnik idealnego zestawu ChIP-seq
Bufor do lizy iL2	Diagenode	C01020010	Składnik idealnego zestawu ChIP-seq
Bufor ścinający iS1	Diagenode	C01020010	Składnik idealnego zestawu ChIP-seq
Mieszanka inhibitorów proteazy (200x)	Diagenode	C01010130	Składnik zestawu Auto True Micro ChIP
HBSS (bez wapnia, bez magnezu, bez czerwieni fenolowej)	Life technologies	14175-053
Bufor do lizy tL1	Diagenode	C01010130	Komponent zestawu Auto True Micro ChIP
Bufor ChIP tC1	Diagenode	C01010130	Składnik zestawu Auto True Micro ChIP
idealny zestaw ChIP-seq	Diagneode	C01010051
ChIP-Buffer H	Diagenode	C01010020	Składnik zestawu Auto Histone ChIP-seq
Auto Histone Zestaw sekwencyjny	Diagenode	C01010020
Zestaw Auto True Micro ChIP Przeciwciało	C01010130		Diagenode
H3K79me3-Klasyczne Przeciwciało	poliklonalne Diagenode	C15310068
H3K27me3-Klasyczne Przeciwciało poliklonalne	Diagenode	C15410069
H3K4me3-Klasyczne		Przeciwciało
H3K4me2-Klasyczne	Przeciwciało poliklonalne Diagenode	C15410035
H3K9ac-Premium	Diagenode	C15410004
Przeciwciało poliklonalne H3K9/14ac-Premium	Diagenode	C15410200
Przeciwciało poliklonalne H3K36me3-Premium	Diagenode	C15410058
Przeciwciało poliklonalne H3K9me3-Premium	Diagenode	C15410193
IgG królika	Kulki paramagnetyczne powlekane C15410206
	Diagenode Białko A Diagenode	C01010020
Auto IPure	Diagenode	C03010010
MicroChIP Kolumny DiaPure	Diagenode	C03040001
Universal SyberGreenMaster Mix 1,25 ml	Diagenode	DMMLD2D100
Quant-IT dsDNA	Invitrogen	Q32854
Zestaw do przygotowania próbki Illumina do Genomic DNA	Illumina	FC-121-3001
Zestaw Illumina True-seq Zestaw do przygotowania biblioteki ChIP	Illumina	IP-202-1012
Zestaw do przygotowania biblioteki MicroPlex	Diagenode	C05010010
Koraliki Agencourt AMPure XP	Beckman Coulter	A63881
Zestaw do analizy ilościowej Illumina Library	Kapa Biosystems	KK4844
IP-Star Compact  Zautomatyzowany system	Diagenode	B03000002
Bioruptor Plus	Diagenode	B01020001
Bioruptor Pico	Diagenode	B01060001
Qubit system	Invitrogen	Q32857
Illumina Systemy Hiseq	Illumina