Tymektomia gryzoni jest cenną techniką w badaniach immunologicznych. W tym miejscu opisano protokół całkowitej tymektomii u dorosłych szczurów przy użyciu mini-sternotomii wraz z nieinwazyjną intubacją i wentylacją nadciśnieniową w celu zminimalizowania zachorowalności i śmiertelności okołooperacyjnej.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Zakończ tymektomię u dorosłych szczurów z nieinwazyjną intubacją dotchawiczą
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Tymemektomia u noworodków gryzoni jest sprawdzoną i wiarygodną procedurą badań immunologicznych. Jednak u dorosłych szczurów powikłania krwotoku i odmy opłucnowej spowodowane zaburzeniem opłucnej mogą prowadzić do znacznej śmiertelności. Protokół ten jest prostą metodą tymektomii szczura, która wykorzystuje mini-sternotomię i intubację dotchawiczą. Intubacja odbywa się nieinwazyjną i łatwą do odtworzenia metodą i pozwala na wentylację nadciśnieniową w celu zapobiegania odmie opłucnowej i kontrolowanym drogom oddechowym, które dają wystarczająco dużo czasu na staranne wypreparowanie grasicy w celu zminimalizowania zaburzeń opłucnej. Nacięcie mostka o długości 1,5 cm zmniejsza kontakt z naczyniami śródpiersia i opłucną, zapewniając jednocześnie pełną wizualizację grasicy. Po odsłonięciu śródpiersia grasica jest usuwana przez rozwarstwienie w powiększeniu. Przestrzeń opłucnowa jest następnie uszczelniana poprzez zamknięcie szwem mięśni przedtchawiczych, a następnie nałożenie kleju chirurgicznego. Klatka piersiowa jest następnie zamykana przez zamknięcie szwem mostka, a następnie zamknięcie szwem skóry. Wszystkie tymektomia były kompletne, o czym świadczy immunohistochemiczne (IHC) barwienie tkanki śródpiersia i brak naiwnych limfocytów T w cytometrii przepływowej, a procedura miała 96% wskaźnik przeżycia. Ta metoda jest odpowiednia, gdy pożądana jest całkowita tymektomia z minimalnymi powikłaniami do dalszych badań immunologicznych u dorosłych szczurów atymicznym.
Wprowadzenie
Od początku lat sześćdziesiątych grasica jest uznawana za kluczową rolę w rozwoju centralnej tolerancji immunologicznej. Wykazano, że tymektomia gryzoni jest niezbędną procedurą w określaniu roli grasicy w różnicowaniu limfocytów, samotolerancji i immunotolerancji w przypadku przeszczepu allogenicznego i przerzutów nowotworowych. Usunięcie grasicy szczura pozwala na badania polegające na zubożeniu limfocytów T lub adoptywnym transferze określonych populacji limfocytów T bez ponownego pojawienia się natywnych naiwnych limfocytów T.
Tymektomia u noworodków gryzoni może być wykonana przy użyciu techniki ssania z wiarygodnymi wynikami1. U dorosłych szczurów technika ta wiąże się z około 20% śmiertelnością i często prowadzi do niepełnej tymektomii2. Aby konsekwentnie osiągnąć całkowitą tymektomię u dorosłych szczurów, wymagana jest otwarta ekspozycja śródpiersia przez sternotomię środkową. Jednak procedura ta wiąże się z powikłaniami, które obejmują uraz tchawicy, krwotok i odmę opłucnową, co prowadzi do ogólnej śmiertelności w zakresie od 1,5 do 6%2-4.
W ciągu ostatnich dwóch dekad ulepszenia technik tymektomii zmniejszyły liczbę powikłań okołooperacyjnych i poprawiły wskaźniki przeżycia. Intubacja dotchawicza, która pozwala na wentylację nadciśnieniową, zmniejszyła częstość występowania odmy opłucnowej5. Opisane wcześniej metody intubacji obejmują zarówno otwartą ekspozycję na tchawicę, jak i mniej inwazyjne metody wykorzystujące bezpośrednią wizualizację strun głosowych. Powikłania związane z procedurą intubacji obejmują uraz tchawicy, pęknięcie strun głosowych, niezamierzoną intubację przełyku oraz krwotok wynikający z nakłucia serca lub uszkodzenia żyły głównej górnej. Ponadto bliskie sąsiedztwo dolnych płatów grasicy do błony śluzowej opłucnej może powodować odmę opłucnową.
Tutaj opisujemy technikę tymektomii poprzez minimalnie inwazyjne 2 cm nacięcie skóry po prostej metodzie intubacji dotchawiczej przy użyciu cewnika naczyniochłonnego i przezskórnego oświetlenia tchawicy. Tymektomia polega na sternotomii o długości 1,5 cm i trójwarstwowym zamknięciu z nałożeniem kleju chirurgicznego w celu uszczelnienia śródpiersia i zminimalizowania częstości występowania krwotoku i powikłań oddechowych. Metoda ta niezawodnie prowadzi do całkowitej tymektomii, o czym świadczy zanik limfocytów T nieżyjących wcześniej CD4 + i CD8 + po tymektomii i brak tkanki grasicy na barwieniu IHC. Czas operacji i śmiertelność okołozabiegowa są ograniczone do minimum.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
UWAGA: Wszystkie procedury eksperymentalne z wykorzystaniem szczurów zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Uniwersytetu Duke'a.
1. Przygotowanie kaniuli intubacyjnej tchawicy
- Odetnij koniec igły 2-calowej igły angiocathether 14 G za pomocą szczypiec tnących.
- Ścisnąć światło igły zamknięte szczypcami z końcówkami.
- Przyciąć ściśnięty fragment do krawędzi części o otwartym prześwicie za pomocą szczypiec tnących, a następnie przyciąć krawędzie po obu stronach pozostałego końca pod kątem 30 - 45° do krawędzi igły.
- Umieść dolne 3 - 4 mm kaniuli w otwartej przestrzeni prostych szczypiec do złączek ślizgowych i pociągnij w górę, aż na końcu utworzy się lekka krzywizna w górę.
UWAGA: Ułatwi to skierowanie cewnika do tchawicy (ryc. 1). - Użyj drobnego papieru ściernego, aby wygładzić krawędzie na końcu kaniuli.
- Włóż stępiony instrument z powrotem do rurki angiocewnika. Upewnij się, że rurka jest nieco krótsza niż igła.
2. Zabiegi przedoperacyjne
- Przygotuj miejsce do zabiegu, umieszczając mikroskop operacyjny ustawiony na 10-krotne powiększenie nad obszarem operacyjnym.
- Umieść podkładkę rozgrzewającą w obszarze roboczym i przykryj czystą podkładką absorpcyjną.
- Ustaw monitor tętna i natlenienia krwi w pobliżu pola operacyjnego.
- Zważ szczura pod kątem dawkowania leków w zależności od masy ciała (np. znieczulenia pooperacyjnego, antybiotyków lub przeciwciał zubożających limfocyty).
UWAGA: Typowe dorosłe szczury ważą od 350 do 450 g. - Uspokoić szczura odparowanym 3% izofluranem-O2 (3 l / min) za pomocą komory indukcyjnej odpowietrzanej do systemu usuwania gazów znieczulających zawierających węgiel aktywny. Odczekaj 5 minut na indukcję znieczulenia, aby zapewnić głębokie znieczulenie niezbędne do intubacji dotchawiczej.
- Karprofen lub meloksykan (4,4 mg/kg) należy podać szczurowi podskórnie przed przystąpieniem do intubacji i operacji.
- Użyj elektrycznych maszynek do strzyżenia, aby ogolić szyję i klatkę piersiową znieczulonego szczura przed intubacją.
3. Intubacja
- Przygotuj zestaw do intubacji, wcierając niewielką ilość smaru (np. żelu K-Y) w koniec kaniuli intubacyjnej. Włączyć wentylator, aby rozpocząć przepływ izofluranu przez rurkę łączącą.
- Przenieś szczura do aparatu intubacyjnego i zawieś szczura na metalowym pręcie za górne siekacze (ryc. 2A).
UWAGA: Niektóre aparaty do intubacji można zakupić online. Pokazany tutaj model jest domowej roboty przy użyciu arkusza akrylowego uformowanego wokół odcinków odcinka lędźwiowego o wymiarach 2 x 4 cale za pomocą palnika butanowego, a wzmocnienia są przymocowane chloroformem. Pręt (lub metalowy drut) mocuje się poprzez wywiercenie otworów nad taśmą maskującą umieszczoną z boku akrylu, aby zapobiec odpryskiwaniu lub pękaniu. - Oświetlić szyję szczura, umieszczając elastyczne źródło światła o dużej intensywności w odległości 1-2 cm od brzusznej powierzchni szyi (ryc. 2B).
- Użyj pary kleszczyków o standardowym wzorze studenckim, aby delikatnie pociągnąć język w górę i na bok dolnych zębów. Chwyć język między kciukiem a palcem wskazującym jednej ręki, jednocześnie przykładając płaską wewnętrzną powierzchnię jednej strony kleszczy do dolnego końca języka. Naciśnij brzusznie, aby odsłonić nagłośnię i otwór krtani (ryc. 2C).
- Wizualizuj struny głosowe i prowadź odwrócony, stępiony koniec kaniuli intubacyjnej do przodu przez otwartą głośnię do tchawicy, aż piasta angiocewnika dotknie siekaczy.
- Zdejmij metalowy trzpień i przymocuj rurkę anestezjologiczną do otworu angiocewnika, aby rozpocząć wentylację izofluranem.
UWAGA: Typowe natężenie przepływu tlenu do respiratora wynosi 3 l/min z 3% izofluranem.- Ustaw wentylator na szybkość 60 oddechów/min w trybie wentylatora o kontrolowanej objętości, który osiąga ciśnienie ~12 - 14 mmHg. Stosować dodatnie ciśnienie wydechowe (PEEP) wynoszące 3 cm H2O.
- Obserwuj obustronne rozszerzanie się ściany klatki piersiowej w synchronizacji z respiratorem, aby zapewnić prawidłowe umieszczenie rurki dotchawiczej.
- Nałóż zalecaną przez weterynarza maść do oczu szczura, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.
- Nałóż maść weterynaryjną na oczy szczura, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.
- Przymocuj rurkę dotchawiczą do głowy szczura za pomocą paska taśmy z tkaniny. Upewnij się, że rurka dotchawicza jest dobrze połączona z rurką doprowadzającą środek znieczulający.
- Przymocuj monitor natlenienia krwi i tętna do stopy szczura i rozpocznij monitorowanie. Potwierdź prawidłowe znieczulenie, potwierdzając, że nie ma reakcji na uszczypnięcie palca u nogi.
4. Torakotomia i tymektomia
- Postępuj zgodnie ze standardową techniką aseptyczną przez cały czas trwania procedury.
- Oczyść obszar roboczy i stół operacyjny i zdezynfekuj 70% roztworem etanolu.
- Podczas zabiegu należy używać sterylnych rękawiczek chirurgicznych, a wszystkie narzędzia i materiały używane podczas zabiegu należy sterylizować w autoklawie.
- Nałóż jod prowidonu na całą powierzchnię klatki piersiowej i pozostaw do wyschnięcia. Następnie oczyść powierzchnię skóry 70% etanolem na gazie. Przykryj szczura przezroczystą folią, wycinając otwór, aby odsłonić sterylne pole operacyjne.
- Zidentyfikuj wcięcie nadmostkowe w górnej części klatki piersiowej. Wykonaj 2-centymetrowe nacięcie linii środkowej przez skórę, zaczynając 2-3 mm powyżej wcięcia nadmostkowego i rozciągając dystalnie linię środkową wzdłuż mostka za pomocą tępo zakończonych nożyczek Shea.
- Ponownie wykonaj 1,5 cm medianę sternotomii od wcięcia nadmostkowego za pomocą nożyczek Shea. Trzymaj dolną krawędź nożyczek tuż pod mostkiem i powoli przesuwaj się.
- Włóż mały retraktor Alm tuż pod oddzielonym mostkiem i otwórz, aby odsłonić mięśnie paska przedtchawicy (mięśnie mostkowo-gnykowe i mostkowo-tarczowe). Oddziel mięśnie paska przedtchawiczego za pomocą kleszczy Graefe. UWAGA: W tym momencie można zobaczyć tchawicę, a rurkę intubacyjną należy uwidocznić wewnątrz tchawicy.
- Umieść zęby małego retraktora Alm pod oddzielonymi mięśniami paska i mostkiem. Otwórz retraktor, aby odsłonić górny aspekt grasicy.
- Użyj cienkich kleszczy Dumonta, aby uwolnić boczne krawędzie tkanki grasicy i odsłonić dolne płaty grasicy.
- Delikatnie wciągnąć grasicę w otwarte miejsce nacięcia, uważając, aby uniknąć kontaktu z żyłą główną górną, naczyniami podobojczykowymi i szyjnymi oraz zminimalizować przerwanie delikatnej błony śluzowej opłucnej między grasicą a płucami.
- Gdy naczynia grasicy są preparowane i odsłaniane, użyj mikronożyczek, aby je podzielić. W razie potrzeby użyj bawełnianego wacika, aby przytrzymać nacisk na naczynia w celu hemostazy.
- Wprowadź dolne płaty grasicy do nacięcia, a następnie ostro zlikwiduj tylne przyczepy. Usuń nienaruszoną grasicę i dokładnie sprawdź usuniętą grasicę pod kątem brakujących sekcji.
UWAGA: Małe węzły chłonne piersiowe mogą być uwidocznione wokół grasicy i często są trudne do odróżnienia od tkanki grasicy. Będą to dyskretne okrągłe węzły o wyglądzie podobnym do tkanki grasicy, ale nie będą w ciągłości z grasicą. - Wyjmij retraktor Alm i zamknij mięśnie mostkowo-gnykowe i mostkowo-tydowe dwoma przerwanymi szwami Maxon 5-0.
- Nałóż 2 krople kleju tkankowego z cyjanoakrylanu klasy chirurgicznej na szwy, aby uszczelnić śródpiersie pod wentylacją pod nadciśnieniem.
UWAGA: Zmniejszy to częstość występowania odmy opłucnowej i krwiaka. - Zamknij mostek dwoma przerwanymi jedwabnymi szwami 4-0 na igle do cięcia. Wbić igłę przez szczeliny między żebrami, uważając, aby poprowadzić igłę tuż pod mostkiem, aby uniknąć leżącej pod spodem warstwy mięśniowej.
- Zamknij warstwę skóry za pomocą biegnącego szwu nylonowego 4-0. W tym momencie należy przerwać stosowanie izofluranu, aby skrócić okres rekonwalescencji po znieczuleniu pooperacyjnym.
- Oczyść miejsce nacięcia i otaczającą skórę gazą zwilżoną solą fizjologiczną.
- Nałóż kilka kropli bupiwakainy (0,25%) do znieczulenia miejscowego, a następnie 1-2 krople kleju cyjanoakrylowego na nacięcie, aby uszczelnić nacięcie.
- Kontynuuj wentylację, aż szczur wykaże oznaki niezależnego wysiłku oddechowego i zacznie poruszać kończynami. Ekstubować szczura i pozwolić mu dojść do siebie pod ścisłą obserwacją w klatce umieszczonej na podkładce rozgrzewającej.
- Buprenorfinę (0,01 - 0,05 mg/kg) podaje się podskórnie szczurowi bezpośrednio po operacji i powtarza co 8-12 godzin przez 48 godzin po operacji (zwykle 5 dawek całkowitych). Po 24 i 48 godzinach od operacji karprofen lub meloksykan (4,4 mg/kg) należy podawać podskórnie (3 dawki całkowite, w tym dawkę przedoperacyjną).
- Kontynuuj monitorowanie, aż szczur zacznie poruszać się po klatce. W przypadku jakichkolwiek objawów niewydolności oddechowej należy przeprowadzić ponowną intubację i ponowną eksplorację klatki piersiowej.
- Nie pozostawiaj zwierzęcia bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą na mostku.
- Nie należy zwracać zwierzęcia, które przeszło operację, do towarzystwa innych zwierząt, dopóki nie wyzdrowieje.
- Usuń szwy warstwy skóry 1 tydzień po operacji.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Procedurę przeprowadzono na dorosłych szczurach szczepu Lewis (n = 26). Średni czas operacji wynosił 15 ± 3 min. Nie odnotowano śmiertelności śródoperacyjnej. Średni czas intubacji – od umieszczenia szczura w aparacie do intubacji do nawiązania wentylacji – wynosił 45 ± 5 sec. 24 szczury całkowicie powróciły do zdrowia po operacji, bez oznak trudności oddechowych lub krwawień do 14. dnia po operacji (POD 14). U jednego szczura w 4. dniu po operacji (POD 4) wystąpiły trudności oddechowe, co wymagało reoperacji w celu zbad...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Obecny protokół całkowitej tymektomii zapewnia minimalnie inwazyjne podejście z trójwarstwowym zamknięciem nacięcia z nałożeniem kleju chirurgicznego, zaprojektowanym w celu zminimalizowania powikłań. Całkowite usunięcie grasicy wykazano przez utratę naiwnych limfocytów T oraz przez barwienie IHC tkanki limfatycznej śródpiersia na obecność cytokeratyny.
Procedura tymektomii u dorosłych szczurów została skomplikowana przez śmiertelność wahającą się od 1,5 do 20% z powodu powikłań okołooperacyjn...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez AI101263 z National Institutes of Health (T.V.B) oraz przez grant z The Hartwell Foundation (M.L.M). M.L.M. jest członkiem Duke Comprehensive Cancer Center.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 2-calowy cewnik | |||
| Mikroskop operacyjny | Zeiss Podkładka | ||
| rozgrzewająca | |||
| Monitor tętna i natlenienia krwi dla gryzoni z czujnikami stóp | Aparat Harvarda | ST1 72-8010, ST1 72-8098 (czujnik łapy szczura) | |
| Aparat do intubacji (plastikowy z metalowym prętem u góry) | Patrz Rysunek 2 | ||
| System znieczulenia małych zwierząt ze skrzynką indukcyjną, zbiornikiem izofluranu i zbiornikiem O2 | Aparat Harvarda | ST1 72-6420 | |
| Wentylator dla małych zwierząt z rurką | CWE | 12-02000 (respirator) i 12-04000 (zewnętrzny zespół zaworu dla myszy/szczurów) | |
| Oświetlacz światłowodowy o wysokiej intensywności | Dolan Jenner | EEG 2823M | |
| Kleszcze studenckie o standardowym wzorze | Narzędzia do nauki pięknej | 91100-16 | |
| Cienkie proste nożyczki | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Nożyczki shea z końcówką | Fine Science Tools | 14105-12 | |
| Mały zwijacz Alm (do mostka) | Fine Science Tools | 17008-07 | |
| kleszcze Graefe | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| Cienkie kleszcze Dumont | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| 5-0 Nici Maxon | Ethicon | ||
| 4-0 Nici jedwabne (z igłą do cięcia) | Ethicon | ||
| 6-0 Nici nylonowe | Ethicon | ||
| Klej cyjanoakrylowy (Endermil) | |||
| Żel nawilżający | Akorn Animal NDC Zdrowie | 17478-162-35 |
Bibliografia
- Hard, G. C. Thymectomy in the neonatal rat. Lab. Anim. 9 (2), 105-110 (1975).
- Kobayashi, E., et al. A technique for complete thymectomy in adult rats. J. Immunol. Methods. 1759 (94), 0-3 (1994).
- Delrivière, L., Gibbs, P., Kobayashi, E., Kamada, N., Gianello, P. New technique of complete thymectomy in adult rats without tracheal intubation. Microsurgery. 18 (1), 6-8 (1998).
- Walker, K. G., Jacques, B. C., Tweedle, J. R., Bradley, J. A. A simpler technique for open thymectomy in adult rats. J. Immunol. Methods. 175 (1), 141(1994).
- Na, N., Zhao, D., Huang, Z., Hong, L. An improved method for rat intubation and thymectomy. Chin. Med. J. (Engl). 124 (17), 2723-2727 (2011).
- Kastl, S., et al. Simplification of rat intubation on inclined metal plate). Adv. Physiol. Educ. 28 (1-4), 29-34 (2004).
- Weksler, B., Ng, B., Lenert, J., Burt, M. A simplified method for endotracheal intubation in the rat. J. Appl. Physiol. 76 (4), 1823-1825 (1994).
- Jou, I. M., et al. Simplified rat intubation using a new oropharyngeal intubation wedge. J. Appl. Physiol. 89 (5), 1766-1770 (2000).
- Rivard, A. L., et al. Rat intubation and ventilation for surgical research. J. Invest. Surg. 19 (4), 267-274 (2006).
- Zhao, D., et al. A model of isolated, vascular whole thymus transplantation in nude rats. Transplant Proc. 44 (5), 1394-1398 (2012).
- AbuAttieh, M., et al. Affinity maturation of antibodies requires integrity of the adult thymus. Eur. J. Immunol. 42 (2), 500-510 (2012).
- Reeves, J. P., Reeves, P. A., Chin, L. T. Survival surgery: removal of the spleen or thymus. Curr. Protoc. Immunol. 1 (Unit 1.10), (2001).
- Siemionow, M., Izycki, D., Ozer, K., Ozmen, S., Klimczak, A. Role of thymus in operational tolerance induction in limb allograft transplant model. Transplantation. 81 (11), 1568-1576 (2006).
- Satoh, E., et al. Immunosuppressive effect of long-term drainage of thoracic duct on immunological memory in adult thymectomized rats. Transplant. Proc. 37 (4), 1947-1948 (2005).
- Groen, H., Klatter, F., Pater, J., Nieuwenhuis, P., Rozing, J. Temporary, but Essential Requirement of CD8+ T Cells Early in the Pathogenesis of Diabetes in BB Rats as Revealed by Thymectomy and CD8 Depletion. Clin. Dev. Immunol. 10 (2-4), 141-151 (2003).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
