Artykuł metodologiczny

Subklonowanie plus insercja (SPI) - nowatorska metoda rekombinacji do szybkiej budowy wektorów celowania w geny

17.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52155

⸱

8 stycznia 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, University of Leicester, 2Center for Fisheries, Environment and Aquaculture Sciences, 3ES Cell Facility, Centre for Core Biotechnology Services, University of Leicester

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Metodologie celowania w geny mogą być używane do generowania transgenicznych myszy z allelami knockout, knock-in i taged. W tym miejscu opisujemy ulepszoną metodę rekombinacji u E. coli, którą nazywamy "subklonowaniem plus insercją", która może być wykorzystana do szybkiego generowania niestandardowych wektorów docelowych genów.

Streszczenie

Targetowanie genów odnosi się do precyzyjnej modyfikacji locus genetycznego za pomocą rekombinacji homologicznej. Generowanie nowych linii komórkowych i transgenicznych modeli myszy przy użyciu tej metody wymaga budowy wektora "docelowego", który zawiera homologiczne sekwencje DNA do genu docelowego i przez wiele lat był etapem ograniczającym w tym procesie. Konstrukcję wektora można przeprowadzić in vivo w komórkach Escherichia coli przy użyciu rekombinacji homologicznej, w której pośredniczą rekombinacje fagowe, przy użyciu techniki zwanej rekombinacją. Rekombinacja jest preferowaną techniką subklonowania długich sekwencji homologii (>4kb) i różnych elementów docelowych, w tym markerów selekcyjnych, które są wymagane do pośredniczenia w efektywnej wymianie alleli między wektorem docelowym a pokrewnym locus genomowym. Typowe protokoły rekombinacji są zgodne z iteracyjnym schematem stopniowej integracji elementów docelowych i wymagają pośrednich etapów oczyszczania i transformacji. W tym miejscu przedstawiamy nowatorską metodologię rekombinacji składania wektorów przy użyciu podejścia multipleksowego. Naprawa luki plazmidowej odbywa się poprzez jednoczesne wychwycenie sekwencji genomowej z bibliotek sztucznych chromosomów bakteryjnych myszy i wprowadzenie podwójnych markerów selekcji bakteryjnej i ssaków. Ta metoda subklonowania i insercji jest bardzo wydajna i daje większość prawidłowych rekombinantów. Przedstawiamy dane do budowy różnych typów wektorów warunkowego nokautu genów lub knock-in oraz wektorów reporterowych BAC, które zostały skonstruowane tą metodą. Konstrukcja wektorów SPI znacznie rozszerza repertuar zestawu narzędzi do rekombinacji i zapewnia prostą, szybką i opłacalną metodę konstruowania tych wysoce złożonych wektorów.

Wprowadzenie

Rozwój technologii celowania w geny umożliwił budowę linii komórkowych i modeli mysich do badania różnych systemów biologicznych1-3. Kluczowym pierwszym etapem modyfikacji sekwencji genomowej jest zaprojektowanie i skonstruowanie genu ukierunkowanego na wektor4. Wektory celujące to konstrukty plazmidowe, które przenoszą interesujący nas allel zawierający pożądane modyfikacje otoczone markerem selekcyjnym (np. neomycyną) oraz długie regiony genomowe wymagane do wydajnej rekombinacji homologicznej w komórkach ssaków5. Precyzyjną modyfikację genu uzyskuje się poprzez wprowadzenie wektora docelowego do embrionalnych komórek macierzystych (ES)6 lub komórek somatycznych7, przy czym rekombinacja homologiczna między identycznymi odcinkami sekwencji DNA na wektorze docelowym a locus genomu powoduje przeniesienie zamierzonej modyfikacji do genomu w drodze konwersji genu8. Takie zmodyfikowane komórki ES można wstrzyknąć do mysich blastocyst w celu wytworzenia potomstwa (chimer), które może następnie przenosić te zmodyfikowane allele przez linię zarodkową9. Alternatywna droga do produkcji myszy transgenicznych polega na mikrowstrzyknięciu wektora ekspresji genu do jednokomórkowych zygot myszy, co prowadzi do losowej integracji wektora w genomie myszy10. Tradycyjne metody konstruowania wektorów opierały się na konwencjonalnym klonowaniu metodą "wytnij i wklej" przy użyciu enzymów restrykcyjnych i ligaz DNA w celu sklonowania różnych markerów selekcyjnych i fragmentów genomu do szkieletu wektora. Jednak nieodłącznym czynnikiem ograniczającym tradycyjne klonowanie jest umiejscowienie i wybór miejsc restrykcyjnych, zwłaszcza w przypadku dłuższych sekwencji DNA. Często wymaga to wielu etapów subklonowania, a także wprowadza obce sekwencje DNA do wektora, co często prowadzi do niższej skuteczności celowania w geny.

Rekombinowanie (inżynieria rekombinogenna) to technologia inżynierii DNA, która pokonuje te ograniczenia poprzez zastosowanie rekombinacji homologicznej (HR) za pośrednictwem białek rekombinacji fagów w komórkach E. coli 11,12. Ponieważ każdy region sekwencji homologicznej może służyć jako substrat rekombinacji, ograniczenia dostępności miejsc restrykcyjnych są usuwane. Duże sekwencje DNA mogą być bezproblemowo modyfikowane bezpośrednio in vivo, zachowując w ten sposób również ich integralność strukturalną13. Rekombinacja jest bardzo wydajna w przypadku krótkich homologii (50 pz)14 i dlatego ramiona homologiczne (HA) mogą być wygodnie włączone do syntetycznych sekwencji oligo. W typowym eksperymencie rekombinacyjnym oligo lub fragment dwuniciowego DNA (dsDNA) zawierający HA jest elektroporyzowany do rekombinujących kompetentnych komórek E. coli zawierających cel zlokalizowany na chromosomie lub plazmidzie15. Potencjał rekombinacji jest nadawany przez indukowaną ekspresję czerwonych białek rekombinacyjnych faga16,17 lub białek RecET profagarac 18. Egzonukleaza Red/RecE przekształca liniowe dsDNA w pośredni jednoniciowy DNA (ssDNA), który jest następnie wiązany przez swojego partnera, Red/RecT, jednoniciowe białko wyżarzające (SSAP)19. Wyżarzanie długiego ssDNA lub krótkiego oligo do jego komplementarnej sekwencji docelowej zachodzi na opóźnionej nici widełek replikacyjnych i prowadzi do włączenia sekwencji w miejscu docelowym. Rekombinacja ssDNA o opóźnionej nici jest podstawą wysokiej efektywności rekombinacji i może być opisana przez model rekombinacji "beta"20,21.

Typowy proces rekombinacji w celu zbudowania wektora celowania w geny obejmuje jedną z dwóch następujących tras. Jedna droga polega na subklonowaniu pożądanego regionu genomowego z mysiego klonu BAC do plazmidu, a następnie sekwencyjnym wstawianiu miejsc rekombinacji LoxP, markera selekcyjnego22 itp., lub alternatywna droga polega na celowaniu w locus genomu BAC za pomocą różnych docelowych elementów wektorowych poprzez wiele rund rekombinacji10,23, a następnie subklonowanie zmodyfikowanego locus do plazmidu poprzez klonowanie naprawy luk24,25. Wariacje na ten temat zostały wykorzystane w różnych potokach rekombinowania o wysokiej przepustowości w ramach dużych programów produkcji myszy26,27. Jednak procedury te obejmują skomplikowane i długotrwałe etapy, wymagają użycia wyspecjalizowanych wektorów i szczepów E. coli (np. komórek eksprymujących Cre) oraz wykorzystują jeden lub więcej pośrednich etapów oczyszczania i retransformacji DNA wektora (Tabela 1). Subklonowanie plus insercja (SPI) to nowatorska technika rekombinacji, która łączy rekombinację beta i klonowanie naprawy luk w jednym procesie (ryc. 1). Montaż wektorów SPI jest prosty, szybki i elastyczny i oferuje znaczną poprawę w stosunku do standardowych podejść do rekombinowania (Tabela 1). W tym miejscu pokazujemy łatwość i użyteczność wykorzystania SPI do różnych zastosowań konstrukcji wektorowych, ze szczególnym naciskiem na konstruowanie niestandardowych i wymagających projektów wektorowych. Przypadki testowe obejmowały konstrukcję fluorescencyjnego reporterowego wektora knockin, podwójnie znakowanego wektora knockin ekspresji białka, fluorescencyjnego wektora reporterowego BAC i warunkowego wektora knockout. Badali oni w różny sposób wymóg lokalizacji receptora na powierzchni komórki, oczyszczenia kompleksu białek jądrowych lub warunkowej ablacji ekspresji genu.

Protokół

1. Projekt celowania genowego

  1. Zamów odpowiedni klon BAC obejmujący interesujący nas region genomu. Upewnij się, że jest to izogeniczne w stosunku do typu komórek ES, które mają być modyfikowane, np. klonów BAC RPCI-23 i RPCI-24 do celowania w geny za pomocą komórek ES C57BL / 6.
  2. Zastosuj konwencjonalne kryteria celowania genów podczas projektowania wektora docelowego. Kluczowe parametry obejmują to, czy modyfikacja musi być konstytutywna czy warunkowa, definiowanie eksonów krytycznych (CE) dla delecji w strategii nokautu genów oraz odstępy i rozmieszczenie kaset intronowych.
    UWAGA: Każdy z nich został szczegółowo omówiony w innym miejscu10.
  3. Wybierz regiony genomu, z których każdy ma rozmiar 5-6 kb po bokach docelowego miejsca modyfikacji.
    UWAGA: Rozmiar subklonowanej wstawki wynosi zatem zwykle 10-12 kb, chociaż górna granica może wynosić nawet 80 kb w przypadku plazmidu subklonującego o niskiej kopii, takiego jak p15A, pBR322 itp., i do 200 kb w przypadku wektora BAC.

2. Multipleksowe Oligonukleotydy Rekombinujące

  1. Zaprojektuj oligonukleotydy dla szkieletu plazmidu (plazmid subklonujący) i markera wybieralnego (kaseta insercyjna). Zaprojektuj każdy oligo w taki sposób, aby zawierał 180 pz HA flankującego genomowe miejsce docelowe i 20 pz specyficznej sekwencji primingowej kasety insercyjnej lub plazmidu subklonującego (Figura 2).
    UWAGA: Ramiona Homology nie powinny zawierać żadnych powtarzających się elementów, obecność powtarzających się elementów będzie skutkowała nieprawidłowym celowaniem i subklonowaniem. Powtarzające się elementy można wykryć za pomocą narzędzi internetowych, takich jak ''Repeat Masker''.
  2. Uwzględnij unikalne miejsce enzymu restrykcyjnego (RE) na jednym z oligonukleotydów wektorowych, aby zlinearyzować wektor ukierunkowany na gen do celowania w komórki ES (ryc. 2).
  3. Sprawdź parametry oligo za pomocą programu do analizatora oligo. Uważaj, aby uniknąć drugorzędnych struktur w regionach gruntowania.
  4. Krótszy kwas hialuronowy (50 pz) kasety insercyjnej jest tolerowany i daje mniejszą liczbę rekombinantów, ale zapewnia, że plazmid podklonujący HA jest zawsze dłuższy (180 pz).
  5. Określ orientację wstawki genomowego DNA konkretnego klonu BAC za pomocą narzędzi internetowych, takich jak ''cloneDB''. Ustal kierunek replikacji z OriS, sprawdzając mapę szkieletu plazmidu BAC użytego w konstrukcji biblioteki BAC.
    UWAGA: OriS jest zwykle przeciwny do kierunku transkrypcji markera chloramfenikolu (Chl) dla wszystkich powszechnie stosowanych plazmidów BAC.
  6. Dodaj dwa końcowe wiązania fosforotionianu (PTO) do końca 5' oligo, który jest przeciwny do kierunku replikacji na klonie BAC. Dodać modyfikację 5' fosforanu do odwróconego oligo (rysunek 2).
    UWAGA: Asymetryczna, fosforonowana kaseta PCR po trawieniu na czerwono generuje produkt pośredni ssDNA, który może przygotować opóźnioną nić widełka replikacyjnego.
    UWAGA: Maksymalna częstotliwość rekombinacji multipleksu jest obserwowana w przypadku kaset zabezpieczonych opóźnionymi pasmami. Kasety zabezpieczone przed wiodącą nicią lub podwójnie zabezpieczone mogą nie wytwarzać równoważnej wydajności rekombinacji w niektórych loci.
  7. Zamów oligonukleotydy z oczyszczaniem PAGE lub HPLC.

3. Transformacja klonu BAC za pomocą plazmidu rekombinującego pSC101 BADgbaA.

  1. Aby szczep E. coli posiadający BAC był sprawny w rekombinacji, przekształć go za pomocą plazmidu pSC101 BADgbaA zawierającego geny Red16,
    UWAGA: Plazmid pSC101 BADgbaA zawiera geny Red i RecA pod kontrolą indukowalnego arabinozą promotora araC-PBAD, markera selekcyjnego tetracykliny i wrażliwego na temperaturę replikonu pSC101.
    1. Wbić sterylną końcówkę pipety do kultury agarowej BAC i zaszczepić 5,0 ml bulionu lizogenicznego (LB) o pH 8,0 zawierającego 12,5 μg ml-1 Chl. Rosnąć w temperaturze 37 °C przez 5 godzin, wstrząsając z prędkością 200 obr./min.
    2. Schłodzić 10% (v/v) roztwór glicerolu, probówki do mikrowirówek i kuwety do elektroporacji na lodzie. Schłodzić dużą wirówkę i mikrowirówkę z chłodzeniem do temperatury 4 °C.
    3. Oznaczyć gęstość optyczną (OD) kultury za pomocą spektrofotometru i zmierzyć absorbancję przy 600 nm. Przygotuj ogniwa elektrokompetentne (jak opisano poniżej), gdy zostanie osiągnięty odczyt OD600 od 0,3 do 0,8.
    4. Odwirowywać komórki w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml w dużej wirówce o sile 1,216 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    5. Przemyć komórki 1 ml schłodzonego 10% glicerolu i odwirować komórki w temperaturze 17,949 x g przez 20 sekund w temperaturze 4 °C. Wykonaj krok prania w sumie 3 razy.
    6. Ponownie zawiesić komórki w całkowitej objętości 50 μl 10% glicerolu i dodać 10-200 ng plazmidu rekombinującego pSC101 BADgbaA. Zawiesinę pojedynczej komórki należy uzyskać poprzez kilkukrotne pipetowanie w górę i w dół, a następnie przenieść komórki do wstępnie schłodzonej kuwety elektroporacyjnej o szczelinie 1 mm.
    7. Elektroporuj ogniwa z ustawieniem 1,8 kv, 25 μF i 200 Ω,
      UWAGA: Sprawdź prawidłowe ustawienia dla każdej marki elektroporatora. Stała czasowa elektroporacji mniejsza niż 4 wskazuje na obecność soli i innych zanieczyszczeń.
    8. Natychmiast odzyskać komórki w 1 ml LB i przenieść komórki do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.
    9. Hoduj kulturę BAC gbaA w temperaturze 30 °C przez 2 godziny wytrząsania z prędkością 200 obr./min.
      UWAGA: Plazmid pSC101 BADgbaA jest tracony, gdy komórki są hodowane w temperaturze 37 °C z powodu inaktywacji wrażliwego na temperaturę czynnika replikacji RepE. Hoduj komórki gbaA w temperaturze 30 °C, aby utrzymać funkcje rekombinacji.
    10. Dodać 9 ml LB zawierającego 12,5 μg ml-1 Chl i 4 μg ml-1 tetracykliny (Tet) do odzyskanej kultury BAC gbaA. Hoduj kulturę BAC gbaA O/N w temperaturze 30 °C, wstrząsając przy 200 obr./min.
      UWAGA: Wydajność przemiany elektroporacji superskręconego plazmidu gbaA jest wystarczająco wysoka, aby umożliwić wzrost nasycenia O/N w ciekłych ośrodkach.

4. Przygotowanie kaset inseryjnych i plazmidów do subklonowania

  1. Aby włączyć kwas hialuronowy do kasety insercyjnej (kaset insercyjnych) i plazmidu subklonującego, należy przeprowadzić reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) przy użyciu długich zmodyfikowanych oligonukleotydów, jak opisano poniżej.
    1. Opcjonalnie: aby zapobiec przenoszeniu plazmidu do reakcji rekombinacji, należy użyć matrycy plazmidu o pochodzeniu R6K lub podobnej wąskiej skali gospodarza do amplifikacji kasety insercyjnej.
    2. Alternatywnie, linearyzuj matrycę plazmidu za pomocą trawienia RE (Tabela 2). Wybierz RE, który wykracza poza obszar amplifikacji PCR i jest inaktywowany termicznie. Dezaktywuj RE na gorąco zgodnie z zaleceniami producenta.
    3. Skonfiguruj reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) przy użyciu systemu polimerazy DNA o wysokiej wierności w fazie gorącego startu. Przygotować wzorcową mieszankę PCR zgodnie z opisem (tabela 3). Wykonaj cykle termiczne, jak pokazano (Tabela 3).
  2. Analizuj produkty PCR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Załaduj 1-5 μl każdego PCR na 1% (w/v) żelu agarozowym zawierającym 0,5 mg ml-1 bromku etydyny (EtBR).
    UWAGA: Obecność niespecyficznych produktów amplifikacji nie zakłóca reakcji rekombinacji. Jednak w niektórych przypadkach dimery starterów mogą zmniejszać wydajność rekombinacji.
  3. Oczyść produkty PCR za pomocą zestawu do oczyszczania PCR.
    1. Opcjonalnie: usunąć matrycę plazmidu z PCR poprzez traktowanie DpnI, a następnie oczyszczanie PCR. Eluować DNA w minimalnej objętości sterylnej wody dejonizowanej (zgodnie z zaleceniami producenta).
      UWAGA: Dodanie DpnI do nieoczyszczonych reakcji PCR powoduje zmniejszenie efektywności rozszczepienia matrycy metylowanego plazmidu DNA.
  4. Określić ilościowo amplifikowane DNA metodą PCR za pomocą analizy w żelu agarozowym w porównaniu ze znanym zestawem wzorców DNA, np. trawienia λ HindIII lub przy użyciu spektrofotometru nanokropli.

5. Subklonowanie plus wstawianie

  1. Rozcieńczyć kulturę O/N BAC gbaA 50 razy, dodając 200 μl w 10 ml LB+Chl+Tet. Rosnąć w temperaturze 30 °C, wytrząsając z prędkością 200 obr./min przez 1 godzinę 50 min. Dołączyć próbkę, która ma być wykorzystana jako kontrola ujemna.
  2. Schłodzić wszystkie materiały i urządzenia do rekombinacji do temperatury 4 °C, jak opisano w kroku 3.1.2.
  3. Wlać płytki agaru LB o pH 8 zawierające odpowiednie stężenie odpowiedniego selektywnego antybiotyku (antybiotyków), który pozwoli na wybór wprowadzanego fragmentu DNA, jak również na wybór wektora subklonującego (Tabela 4).
    UWAGA: Niektóre antybiotyki są wrażliwe na pH. Z reguły używaj agaru LB o pH 8.
  4. Przygotować 10% (w/v) roztwór L-arabinozy. Filtr sterylizować przez filtr strzykawkowy 0,2 μm.
    UWAGA: Arabinoza indukuje ekspresję białek rekombinujących z plazmidu gbaA.
  5. Sprawdź OD kultury BAC gbaA za pomocą spektrofotometru. Po osiągnięciu OD600 0,25-0,3 indukuj białka rekombinujące zgodnie z opisem w następnym kroku.
  6. Dodać 200 μl 10% roztworu arabinozy do 10 ml kultury BAC, aby uzyskać końcowe stężenie arabinozy 0,2%. Obejmują nieindukowaną hodowlę (bez arabinozy), która ma być stosowana jako kontrola negatywna.
  7. Przenieść kulturę BAC do inkubatora z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C i wywołać ekspresję czerwieni przez 45 minut wstrząsania przy 230 obr./min.
    UWAGA: Ekspresja czerwonych białek jest nieefektywna w temperaturze 30 °C.
  8. Odkręć komórki i przemyj 10% glicerolem 3 razy, jak opisano w kroku 3.1.5.
  9. Dodaj 600-1,000 ng każdego z plazmidów subklonujących i kasety insercyjnej (kaset) insercyjnych do reakcji rekombinacji. Dołącz tylko wektor i wektor plus pojedyncze wstawki, aby sprawdzić sprawność i integralność rekombinacji wektora i kaset.
  10. Zawiesinę jednokomórkową można uzyskać, pipetując w górę i w dół. Przeprowadzić elektroporację zgodnie z opisem w kroku 3.1.7, a następnie odzysk w 1 ml LB w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę w przypadku plazmidów wielokopijnych lub w 10 ml LB w temperaturze 37 °C przez 3 godziny w przypadku wektorów BAC.
  11. Na płytki agarowe z podwójnej selekcji rozcieńczyć różne roztwory, np. 90%, 10%, 1% i rosnąć w temperaturze 37 °C przez 16 godzin.

6. Analiza rekombinantów

  1. Opcjonalnie: Wybierz od 6 do 12 kolonii i wykonaj PCR kolonii przy użyciu startera flankującego HA i startera specyficznego dla wkładki. Uwzględnij plazmid subklonujący i plazmid kasety insercyjnej, a także macierzysty klon BAC jako kontrole ujemne.
    1. Wykonaj analizę PCR kolonii w żelu agarozowym. Zidentyfikuj dodatnie klony na podstawie obecności jasnego pasma o oczekiwanym rozmiarze.
      UWAGA: Wysoka wydajność procesu klonowania SPI generuje w większości poprawne rekombinanty.
  2. Zebrać kolonie do 5 ml LB pH 8 zawierającego selektywny antybiotyk i wyhodować O/N w temperaturze 37 °C.
  3. Przygotuj minipreparaty DNA za pomocą zestawu do oczyszczania kolumny zgodnie z instrukcjami producenta.
  4. Przygotuj DNA miniprep BAC przy użyciu standardowej izolacji fenolu i chloroformu lub podobnego protokołu.
  5. Wykonaj trawienie RE na DNA miniprep. Oddziel DNA za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Analizuj wzorce RE, aby zidentyfikować klony zawierające oczekiwane rozmiary fragmentów prawidłowego wektora docelowego. Wybierz RE, który wyraźnie rozróżnia wektor bez wstawień i wektor zawierający te wstawienia.
  6. Opcjonalnie: aby uzyskać komórki pozbawione BAC, który jest nadal obecny w E. coli po rekombinacji, użyj plazmidowego DNA miniprep do transformacji komórek E. coli DH5alpha lub DH10B. coli.
  7. Wykonaj sekwencjonowanie DNA w kasecie HA i insercyjnej, aby sprawdzić błędy syntezy oligo.

Wyniki

Wektory typu knockin

Wektory docelowe typu knockin odzwierciedlają potrzebę wprowadzenia nowej sekwencji w genomie, w tym pojedynczej zamiany pary zasad w regionie kodującym białko, połączenia markera fluorescencyjnego lub znacznika powinowactwa z białkiem lub integracji kasety ekspresyjnej genu. Aby przetestować zastosowanie metody SPI w strategiach konstruowania wektorów knockin, przeanalizowano dwa różne przypadki testowe. Dnttip1 koduje białko oddziałujące z deoksynukleotydylotransferazą terminalną, izoformę 1A (TDIF1), które razem z deacetylazą histonów klasy I (HDAC) tworzy kompleks mitotycznej deacetylazy (MiDAC)28. Aby zbadać rolę Dnttip1 w podziale komórki, zastosowano podejście z podwójnym znacznikiem powinowactwa w celu izolacji białek oddziałujących z TDIF1. Poprzednie próby subklonowania fragmentu genu Dnttip1 przy użyciu wektora p15A zawierającego długie regiony homologii skutkowały niską efektywnością naprawy luki i częstym powstawaniem aberracyjnych produktów rekombinacji (dane nie pokazane). W związku z tym konstrukcja wektora knockin w locus Dnttip1 stanowiła trudne ćwiczenie rekombinowania. Zaprojektowano strategię SPI w celu subklonowania 12 kb fragmentu genu Dnttip1, obejmującego ostatni egzon (egzon 13), do wektora p15A o niskiej liczbie kopii oraz jednoczesnego wstawienia kasety selekcyjnej z podwójnym znacznikiem powinowactwa do egzonu 13, zastępując kodon stopu (Rycina 3A). Kaseta 2X FLAG-białko wiążące kalmodulinę (CBP) połączona z FRT-PGK-em7-neomycyna (Neo)-BGhpA-FRT (2,0 kb) została amplifikowana z plazmidu liniaryzowanego enzymem restrykcyjnym (RE) przy użyciu dwoistych oligonukleotydów z modyfikacją PTO, zawierających 120 bp homologii otaczającej kodon stopu genu Dnttip1. Skonstruowano wektor subklonowania p15A zeoDnttip1 (1,7 kb), zawierający regiony 200 bp homologiczne do końców sekwencji Dnttip1, która miała zostać subklonowana. Plazmid subklonowania Dnttip1 został liniaryzowany enzymem restrykcyjnym i poddany amplifikacji PCR przy użyciu zmodyfikowanych oligonukleotydów 20 bp, generujących wektor chroniony na nici prowadzącej. Produkty PCR poddano obróbce DpnI, oczyszczono i sko-elektroporowano do komórek E. coli z BAC Dnttip1 zdolnych do rekombinowania, a także do nieindukowanych komórek kontrolnych. Reakcje SPI posiano na szalki z podłożem agarowym zawierającym ziolecynę (Zeo) i kanamycynę (Kan) (Rycina 3B). Metoda SPI pozwoliła uzyskać poprawnie zmodyfikowany wektor knockin Dnttip1 we wszystkich 12 przebadanych rekombinantach (Rycina 3C). Sekwencjonowanie DNA potwierdziło brak błędów wynikających z syntezy oligonukleotydów lub amplifikacji PCR.

Kolejnym przykładem SPI było wbudowanie in-frame białka zielonego fluoryzującego typu poprawionego (enhanced yellow fluorescent protein, eYFP) powiązanego z kasety selekcyjnej w genie P2rx1. Gen P2rx1 koduje receptor sprzężony z białkiem G, który pełni funkcję kanału jonowego aktywowanego przez ATP29. Powiązanie z fluorescencją YFP umożliwia śledzenie receptora P2x1 na powierzchni komórki w różnych testach funkcyjnych. P2rx1 to kolejna trudna lokacja, która sprawia znaczne problemy w przypadku stosowania konwencjonalnych metod rekombinowania (dane niepokazane). Przy użyciu SPI, 12 kb fragment genu P2rx1 obejmujący egzon końcowy (egzon 12) został podklonowany do wektora p15A zeo i zmodyfikowany poprzez jednoczesne wbudowanie kasety eYFP-LoxP otoczonej kasetą Neo, zastępującą kodon stopu w egzonie 12, w celu skonstruowania wektora knock-in P2rx1-eYFP (Rycina 3D). W tym przykładzie wektor p15A chroniony przez nić opóźnioną (1,7 kb) zawierał 230 bp HA, a kasetę eYFP zawierała 50 bp HA i pozostawiono ją również niezmodyfikowaną. Kasetę wstawienia eYFP (2,7 kb) skonstruowano metodą PCR z nakładaniem się fragmentów (splicing overlap PCR) genu eYFP, amplifikowanego z pEYFP-C1, oraz kasety LoxP-PGK-em7-Neo-BGhpA-LoxP, amplifikowanej z pL452 (NCI, Frederick). Reakcja SPI wygenerowała setki kolonii (dane niepokazane). Analiza enzymów restrykcyjnych (RE) miniprep DNA przygotowanych z 11 klonów wykazała, że większość zawierała poprawnie skonstruowany wektor knock-in P2rx1-eYFP (Rycina 3E). Dodatkowa weryfikacja przez sekwencjonowanie DNA potwierdziła bezbłędne wbudowanie kasety eYFP. Jednak niektóre klony wykazały profile plazmidów z nieoznakowaną i oznakowaną naprawą luki w tej samej komórce (szczeliny 6–9). Kilka próbek zawierało również niepoprawnie naprawione luki (szczelina 2) lub niewłaściwie skierowane plazmidy (szczeliny 4 i 5). Niepowodzenie jednoczesnego podklonowania i kierowania w niektórych rekombinantach SPI podkreśla ograniczenia wydajności klonowania SPI przy użyciu dużych kaset (> 3 kb), co wynika z ograniczeń procesywności systemu Red dla długich fragmentów DNA30 lub przy stosowaniu krótkich HA. Rzeczywiście, zwiększenie długości HA kasety eYFP do 200 bp zwiększyło wydajność SPI oraz poprawność kierowania kasety (dane niepokazane). Kierowanie genu przy użyciu wektora knock-in P2rx1-eYFP w komórkach ES myszy JM8.N4 (linia C57BL/6) wygenerowało 6 pozytywnych klonów spośród 96, które zawierały poprawnie skierowaną sekwencję P2rx1-eYFP (Rycina 3F).

Wektory raportowe BAC

Klon BAC genu docelowego często zawiera wszystkie niezbędne elementy regulacyjne położone w kierunku wstępującym i niskiego. np. enhansery, UTR itp., a także endogenny promotor w celu napędzania ekspresji genu na naturalnym poziomie31W związku z tym wektor raportera BAC jest preferowanym nośnikiem do odtworzenia endogennego wzorca ekspresji genu32Jednak duża wielkość plazmidu BAC (do 200 kb) stwarza istotne problemy praktyczne związane z transfekcją nieuszkodzonego BAC-a do komórek33. Zmniejszanie rozmiaru genomowego fragmentu BAC poprzez przycinanie BAC-a34,35, zachowując jednocześnie niezbędne elementy regulacyjne genu, ułatwia obróbkę BAC i prowadzi do bardziej efektywnej transfekcji. Obecna technologia inżynierii BAC obejmuje wiele cykli rekombinowania w celu osiągnięcia tego celu35 W celu zademonstrowania przydatności SPI w obcinaniu BAC-ów, wykorzystano wektor BAC pBeloBAC11 do podklonowania 30 kb sekwencji genomowej zawierającej pełną długość P2rx1 gen z 168 kb P2rx1 BAC wraz z jednoczesnym wstawieniem eYFP kaseta w P2rx1 genRycina 4A). pBeloBAC11 zeo szkielet wektorowy (6,5 kb) zawierający 180 par zasad HA został namnożony metodą PCR za pomocą zmodyfikowanych oligonukleotydów, co wygenerowało wektor chroniony przed rozkładem nici opóźnionej. To samo eYFP kasetę Neo (3 kb), używaną wcześniej P2rx1 konstrukcja wektora knock-in, została amplifikowana metodą PCR przy użyciu oligonukleotydów chroniących nić opóźnioną zawierających 180 pz HA i kierowanych do P2rx1 egzon 12 zastępujący kodon stopu. Następnie połączona elektroporacja eYFP kasetę i pBeloBAC11 zeo wektor do wnętrza P2rx1 Komórki BAC ekspresyjne białka rekombinujące gbaA hodowano w 10 ml LB o pH 8 przez 3 godz. w 37°C w celu segregacji plazmidów BAC. Czyste rekombinanty wyselekcjonowano na płytach agarowych z Zeo i Kan, obserwując częstość występowania na poziomie 2 x 10-6. Analiza genotypowania metodą PCR z kolonii wykazała skuteczne przycinanie BAC w 3 spośród 6 przeanalizowanych klonów (Rycina 4B). Amplifikacja długozakresowa PCR przez eYFP miejsce insercji potwierdziło poprawne włączenie kasety w trzech pozytywnych klonach (Rycina 4B). Trzy klonów pozbawionych eYFP wstawka została również nieprawidłowo naprawiona w miejscu luki na końcu 5’, choć przyczyna błędnego kierunkowania eYFP kaseta w tych klonach może być oddzielona od poprawnego zamknięcia 5’ końca BAC. Trzy eYFP pozytywne klonie BAC poddano dodatkowej analizie z zastosowaniem trawienia enzymami restrykcyjnymi, które wykazało oczekiwany wzorzec poprawnie przyciętego produktu eYFP rekombinacyjny BAC (Rycina 4C). Analiza sekwencji ujawniła brak błędów w eYFP kaseta tylko w jednym klonie spośród trzech pozytywnych.

Wektory warunkowego knockoutu (cko)

Warunkowe usuwanie ekspresji genu jest ważnym narzędziem do badania procesów rozwojowych lub analizowania układów biologicznych w określonym momencie czasu. Strategia warunkowego knockoutu genu zwykle polega na umieszczeniu miejsc rekombinacji LoxP wokół kluczowego egzonu (KE). Usunięcie KE po ekspresji lub aktywacji Cre prowadzi do przesunięcia ramki odczytu i powstania przedwczesnego kodonu stopu, co skutkuje degradacją mRNA z powodu rozpadu wywołanego przez nonsens (NMD). Konstrukcja wektora docelowego dla warunkowego knockoutu genu jest zadaniem złożonym i obejmuje kilka etapów subklonowania, kierowania oraz transformacji22. SPI oferuje wygodną metodę upraszczającą ten proces. Jako przykład testowy skonstruowano allel warunkowy genu Zrsr2 przy użyciu metodyki SPI (Rycina 5A). Gen Zrsr2 koduje czynnik splicingu i występuje w pojedynczej kopii na chromosomie X. Stan warunkowego usunięcia genu jest szczególnie istotny w tym przypadku, aby wykluczyć możliwość adaptacji komórek do braku Zrsr2 podczas selekcji komórek ES w strategii kierowanego usunięcia genu w sposób konstytutywny. Wykonano SPI w celu subklonowania fragmentu 10 kb genu ZrSr2 z jednoczesnym wstawieniem dwóch różnych kasety selekcyjnych otoczonych LoxP. Kaseta FRT-PGK-em7-Neo-FRT-LoxP (2 kb) została amplifikowana metodą PCR z plazmidu pL451 rozszczepionego enzymem RE, przy użyciu ochronionych oligonukleotydów do strony opóźnionej zawierających 180 bp HA kierowanych do intronu 2 genu ZrSr2. Drugą kasetę zawierającą Rox-PGK-em7-Blasticidynę (Bsd)-Rox-LoxP (2 kb) amplifikowano metodą PCR z plazmidu R6K przy użyciu ochronionych oligonukleotydów do strony opóźnionej zawierających 180 bp HA identycznych z regionem leżącym dalej w intronie 3. Oba miejsca LoxP flankowały egzon 3, czyli kluczowy egzon, którego usunięcie po warunkowej aktywacji Cre prowadzi do przesunięcia ramki odczytu i wprowadzenia przedwczesnego kodonu stopu. Plazmid do subklonowania Zrsr2 (1,6 kb) został amplifikowany metodą PCR z liniaryzowanego enzymem RE plazmidu p15A zeo przy użyciu ochronionych oligonukleotydów do strony opóźnionej zawierających 180 bp HA pasujących do końców sekwencji Zrsr2 o długości 10 kb. Reakcje SPI przeprowadzono zgodnie z wcześniejszym opisem i posiano na płytki z Zeo+Neo+Bsd. Warunkowy wektor kierowania ZrSr2 został pomyślnie złożony w większości z 12 przebadanych rekombinantów (Rycina 5B). Dodatkowa analiza sekwencji DNA wykazała poprawne wstawienie obu znaczników selekcyjnych w wektorze cko ZrSr2.

Proces transformacji DNA, diagram klonowania BAC, kroki edycji plazmidu pSC101BADgbaA, miejsca loxP.
Rysunek 1. Klonowanie SPI. Schematyczny przegląd procesu klonowania SPI łączącego insercję kasety i podklonowanie w jednym etapie. (A) Klon BAC jest transformowany plazmidem pSC101 BADgbaA i hodowany w 30°C. (B) Po indukcji arabinozą w celu ekspresji białek Red, asymetryczna zmodyfikowana kasetę insercji oraz plazmid do podklonowania są wprowadzane do klonu BAC i selekcjonowane przy użyciu zarówno znaczników insercji, jak i podklonowania, w celu uzyskania wektora końcowego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat edycji genów pokazujący ramiona homologiczne, miejsce restrykcyjne i lokalizacje starterów.
Rycina 2. Schemat ilustrujący projekt oligonukleotydów do rekombinowania SPI. Plazmid do klonowania pośredniego oraz kaseta insercji są generowane metodą PCR przy użyciu kombinacji oligonukleotydów z modyfikacjami PTO i fosforanowymi na końcach. Fragment PCR po trawieniu Red in vivo tworzy pośredni produkt w postaci jednoniciowego DNA, który wiąże się z opóźnioną nicią widełek replikacyjnych. Specyficzne dla genu HA o długości 50–180 par zasad są wbudowywane w każdy oligonukleotyd, jak pokazano. Strzałka wskazuje kierunek replikacji DNA przez badany gen. Przerywana linia oznacza sekwencję plazmidu do klonowania pośredniego, która nie jest zawarta w produkcie PCR. RE – miejsce restrykcyjne służące do liniaryzacji wektora końcowego; F – sekwencja w kierunku do przodu (20 pz) specyficzna dla plazmidu do klonowania pośredniego lub kasety insercji; R – sekwencja komplementarna wsteczna (20 pz) plazmidu lub kasety; sm – znacznik selekcyjny. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Proces edycji genów z diagramami plazmidów, elektroforezą żelową i wynikami hodowli w szalce Petriego.
Rycina 3. SPI umożliwia konstrukcję trudnych wektorów knock-in. (A) Schemat strategii SPI wykorzystanej przy budowie podwójnie oznaczonego wektora Dnttip1. Strzałka wskazuje kierunek replikacji na klonie BAC. (B) Wyniki posiewów próbek nieindukowanych i indukowanych w eksperymencie SPI z Dnttip1. (C) Rozcieńczenie EcoRI klonów SPI Dnttip1. M, marker 1 kb (NEB); C, naprawiony plazmid p15A Dnttip1 pozbawiony kasety z podwójnym tagiem. Rozmiary fragmentów: oznaczone, 9,2+4,4+2,2 kb; kontrola: 9,2+4,6 kb. (D) Konstrukcja wektora knock-in P2rx1-eYFP oparta na SPI. (E) Rozcieńczenie EcoRI klonów SPI P2rx1-eYFP. M, marker 1 kb+ (Invitrogen); C, naprawiony plazmid p15A P2rx1 pozbawiony kasety eYFP. Rozmiary fragmentów: oznaczone, 8,3+4,4+3,1+0,03 kb; kontrola: 8,3+3,1+1,8+0,03 kb. (F) Analiza blottingu południowego (Southern blot) kierowania genu P2rx1-eYFP w komórkach ES JM8.N4. Górny panel: blotting południowy z sondą końcową 3’ z użyciem trawienia PshAI. Pokazano wyniki badania 5 klonów. Dolny panel: blotting południowy z użyciem sondy końcowej 5’ i trawienia SpeI pozytywnych klonów wybranych w badaniu końców 3’. Miejsce restrykcyjne PshAI; S, miejsce restrykcyjne SpeI. Przerywana linia oznacza koniec wektora HA. Czarny prostokąt oznacza sondę Southern. Oczekiwane fragmenty restrykcyjne to: PshAI: WT, 8,9 kb; eYFP-neo, 11,5 kb; SpeI: WT, 6,9 kb; eYFP-neo, 7,6 kb. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

pBeloBAC11zeo P2rx1 eYFP; schemat klonowania BAC; wyniki PCR; analiza elektroforezy.
Rycina 4. Uproszczone przycinanie BAC przy użyciu SPI. (A) Schemat ilustrujący koncepcję przycinania BAC za pomocą SPI. Objasnienie symboli znajduje się w Rycina 1. (B) PCR amplifikacja obejmująca końce 5’ i 3’ podklonowanego fragmentu oraz obszary P2rx1-eYFP miejsce insercji. Strategia selekcji przedstawiona jest dla każdego typu PCR. M (górny panel), Hyperladder 25 pz, (dolne panele), 1 kb+; P, P2rx1 BAC; S, pBeloBAC11 zeo plazmid do subklonowania (C) Trzy trawienia HindIII eYFP pozytywne klonów BAC SPI z (B); E, oczekiwany wzorzec cięcia enzymem ograniczającym HindIII po obcięciu eYFP BAC Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Diagram edycji genów; promotor Zrsr2, miejsca Rox i wyniki elektroforezy w żelu; analiza DNA.
Rycina 5. Generowanie wektora knockoutu warunkowego przy użyciu klonowania SPI. (A) Schemat jednoczesnego wstawienia dwóch różnych kasety selekcyjnych otoczonych LoxP podczas subklonowania allelu Zrsr2. Legenda symboli została opisana na Rycinie 1. (B) Trawienie EcoRI klonów SPI Zrsr2. L, marker 1 kb (NEB); C1, plazmid p15A ZrSr2 z naprawionym lukiem; C2, plazmid p15A ZrSr2 z naprawionym lukiem zawierający wstawkę neo; C3, plazmid p15A ZrSr2 z naprawionym lukiem zawierający wstawkę bsd. Rozmiary fragmentów: cko, 7,7+2,9+2,6+1,6 kb; C1, 7,7+4,0 kb; C2, 7,7+4,3+1,6 kb; C3, 7,7+2,9+2,3 kb. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Liczba krokówKonwencjonalny schemat rekombinowaniaaRekombinowanie wieloparametroweb
Krok 1Transformacja plazmidu do rekombinowania do gospodarza BACTransformacja plazmidu do rekombinowania do gospodarza BAC. Przygotowanie kasety docelowej i wektorów do klonowania podzespółu.
Krok 2Wprowadzenie kasety Gateway R1/R2Klonowanie naprawy luki wieloparametrowej
Krok 3Wprowadzenie kasety Kan z floxowanymi sekwencjamiKultura nocna z pojedynczych kolonii
Krok 4Naprawa luki w plazmidzie R3/R4Przygotowanie plazmidu i weryfikacja
Krok 5Transformacja do E. coli z genem Cre
Krok 6Przygotowanie plazmidu i weryfikacja
Krok 7Nocna reakcja trójstronna Gateway
Krok 8Transformacja reakcji trójstronnej Gateway do komórek E. coli DH10B
Krok 9Kultura nocna z pojedynczych kolonii
Krok 10Przygotowanie plazmidu i weryfikacja sekwencji
aSchemat konstrukcji wektorów o wysokiej przepustowości w programie tworzenia myszy z knockoutem (KOMP). Średni czas do potwierdzonego klonu wynosi 3 tygodnie26.
bŚredni czas do potwierdzonego klonu wynosi 4 dni

Tabela 1: Porównanie konwencjonalnego rekombinirowania z metodą SPI w konstruowaniu wektorów do wytwarzania warunkowych linii knock-out.

Pufer RE5 μl
DNK1 μg plazmidu lub oczyszczonych produktów PCR
RE1 μl (5 jednostek lub więcej)
TEuzupełnić do 50 μl
Inkubuj przy 37 °C przez co najmniej 1 godz. Inaktywuj termicznie zgodnie z instrukcjami producenta

Tabela 2: Trawienie enzymem RE.

Materiały do PCROstateczne stężenie
Bufor PCR1x
dNTP200 nM
MgSO41,5 mM
Betaina1,3 M
DMSO1%
Prymer w kierunku do przodu200 nM
Prymer w kierunku odwrotnym200 nM
Polimeraza DNA1 U
Matryca10 ng plazmidów o wielokrotnej liczbie kopii lub 2,5 μl DNA z miniprep do reakcji PCR typowania genetycznego
Wodauzupełnić do 50 μla
aDla standardowej reakcji PCR o objętości 50 μl z plazmidami o wielokrotnej liczbie kopii. Długozakresowe reakcje PCR typowania genetycznego przygotowywano w objętości 25 μl.
Warunki PCR
95°C2 min
92°C10 sek
55°C30 sek
72°C30 sek
30 cyklib
bLiczba cykli może być wydłużona do 35 w przypadku typowania genetycznego BAC metodą PCR

Tabela 3: Przygotowanie reakcji i warunki PCR.

AntybiotykiStężeniea (μg ml-1)
Ampicylina50
Blasticydynab40
Chloramfenikol12,5
Gentamycyna2
Higromycynac30
Kanamycynab15
Tetracyklina4
Trimetoprymc10
Zeocyna5
aZalecane do stosowania z BAC-ami i plazmidami o wielokrotnej liczbie kopii w połączeniach podczas rekombinacji wieloparametrowej
bBlasticydyna (35 μg ml-1) i kanamycyna (6 μg ml-1) stosowane razem w połączeniu
cHigromycyna i trimetoprym nie są zalecane do selekcji z BAC-ami o pojedynczej kopii.

Tabela 4. Zalecane stężenia antybiotyków do stosowania w eksperymentach SPI.

Dyskusja

Budowa linii komórkowych ES i modeli mysich historycznie obejmowała celowanie w geny przy użyciu konstruktów plazmidowych, które zawierały zmodyfikowany allel4. Jednak budowa tych złożonych wektorów ukierunkowanych na geny okazała się znaczącym wąskim gardłem w terminowej produkcji takich modeli. Opracowanie strategii konstruowania wektorów opartych na rekombinacji umożliwiło ulepszenie projektów wektorów i bardziej wydajny montaż wektorów. Niemniej jednak obecne protokoły rekombinacji nadal obejmują wiele etapów, wymagają pośredniego oczyszczania plazmidu i wykorzystują różne szczepy bakterii. Subklonowanie plus insercja oferuje nowatorskie podejście do budowy wektorów, które można przeprowadzić w jednym zdarzeniu elektroporacji w rezydentnym odkształceniu gospodarza BAC. Użyteczność SPI w celowaniu genowym została przetestowana w różnych zastosowaniach budowy wektorów. We wszystkich badanych przypadkach SPI okazał się skuteczny i wyprodukowano prawidłowy rekombinowany plazmid. W większości przypadków wiele różnych kaset zostało prawidłowo umieszczonych w wektorze docelowym. Duże kasety i wektory DNA zostały z łatwością umieszczone w protokole SPI i zademonstrowały elastyczność tego systemu.

SPI opiera się na wykorzystaniu długich sekwencji homologicznych i ochronie fosforotionianów (WOM) liniowych kaset DNA. Modyfikacja WOM zapewnia ochronę przed egzonukleazami liniowemu DNA20,21 , a długi kwas hialuronowy zwiększa wydajność rekombinacji, umożliwiając multipleksowanie. Jednak synteza dłuższych sekwencji oligonukleotydów zwiększa szanse na akumulację błędów, zwłaszcza delecji. Mutacje w oligonugolakugigancie mogą być szczególnie szkodliwe, jeśli obejmują regiony kodujące białka. Sekwencjonowanie DNA w poprzek HA i pokrycie całej długości wstawionej kasety jest wysoce zalecane w celu wyeliminowania klonów z jakimikolwiek zmianami sekwencji. Sugeruje się również stosowanie systemu polimerazy DNA o wysokiej wierności, aby uniknąć wprowadzenia jakichkolwiek błędów PCR. Długość i skład HA plazmidu subklonującego jest bardziej krytyczna w stosunku do kasety insercyjnej (dane nie pokazane). W przypadku szczególnie wrażliwych zastosowań, takich jak budowa wektorów knockin, gdzie wszelkie mutacje w regionach eksonów nie są tolerowane, kwas hialuronowy kasety insercyjnej można skrócić (50-120 pz), aby uniknąć problemów związanych z długimi oligonukleotydami. Kaseta insercyjna może być również pozostawiona w stanie niezmodyfikowanym lub podwójnie fosforoniana (gdzie wiedza na temat kierunku replikacji nie jest dostępna). Ale multipleksowanie w tych przypadkach nadal wymaga długo chronionych plazmidów subklonujących HA. Zastrzeżeniem tej konkretnej strategii jest obniżenie wydajności multipleksowania, co może potencjalnie wpłynąć na klonowanie SPI w różnych loci.

Długość kasety insercyjnej i plazmidu subklonującego jest kolejnym ważnym parametrem w klonowaniu SPI. Większe cząsteczki DNA elektrorazują się mniej wydajnie, a efekt kumuluje się, biorąc pod uwagę wymóg wprowadzenia wszystkich kaset do tej samej komórki (dane nie pokazane). Multipleksowanie jest najbardziej wydajne w przypadku mniejszych kaset wsuwanych. Fragmenty DNA większe niż 3 kb również ograniczają przetwarzanie ssDNA za pośrednictwem czerwieni, które jest najbardziej efektywne do 3 kb30. Kasety insercyjne o objętości przekraczającej 3 kb są podwójnie recięte i rekombinowane mniej efektywnie za pośrednictwem ścieżki niezależnej od beta20. Dlatego w takich przypadkach ważne staje się badanie przesiewowe wystarczającej liczby kolonii w celu zidentyfikowania właściwego klonu. Dłuższy czas trwania rekombinacji po elektroporacji zwiększa również szanse na odzyskanie prawidłowego klonu w trudnych ćwiczeniach SPI. W procesie SPI można jednocześnie włożyć do czterech małych kaset (< 1,5 kb), chociaż wydajność multipleksowania spada z każdą dodatkową kasetą (dane nie pokazane). Odzwierciedla to jednak wynik optymalnego eksperymentu SPI i zaleca się rozważenie ograniczeń multipleksowania w przypadku korzystania z wielu dużych kaset.

Rozwój narzędzi do edycji genomu, takich jak system endonukleazy CRISPR-cas9 z regularnie rozmieszczonymi krótkimi powtórzeniami palindromicznymi (CRISPR), umożliwił stworzenie nowatorskich modyfikacji genomu i doprowadził do bardziej wydajnej inżynierii genomu36. Jednak te nowsze technologie uzupełniły wektory ukierunkowane na geny, a nie je wyparły. Przewiduje się, że system CRISPR-cas może zastąpić selekcję antybiotyków i jeszcze bardziej udoskonalić protokół rekombinowania multipleksów.

Oświadczenia

T.R.R jest wynalazcą brytyjskiego wniosku patentowego dotyczącego technologii rekombinowania multipleksów.

Podziękowania

T.R.R wymyślił projekt, zaprojektował i przeprowadził eksperymenty oraz przygotował rękopis. E.J.K i S.E.M przeprowadzali eksperymenty. Wszyscy autorzy wnieśli intelektualny wkład w powstanie ostatecznego rękopisu. Praca ta została sfinansowana przez University of Leicester Innovation Fellowship dla SEM oraz przez UK Medical Research Council (MRC) Senior Research Fellowship dla S.M.C (MR/J009202/1). Sekwencjonowanie DNA zostało przeprowadzone przez Laboratorium Białek i Kwasów Nukleinowych (PNACL), Centrum Podstawowych Usług Biotechnologicznych, Uniwersytet w Leicester. Pragniemy podziękować A. Francisowi Stewartowi za dostarczenie plazmidów Rox i Dre. Plazmidy pL451 i pL452 uzyskano z National Cancer Institute (NCI), Frederick, USA.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Antybiotyki z wyjątkiem ZeocinSigma: http://www.sigmaaldrich.comAmpicillin, A9518-5G;
Chloramfenikol, C1919-5G; Blasticydyna, 15205-25MG; gentamycyna, G1264-50MG; Higromycyna, H3274-50MG; Kanamycyna,: K1876-1G;
Chlorowodorek tetracykliny, T7660-5G; Trimetoprim, 92131-1G
ZeocinInvivogen: ant-zn-1Zeocin jest również dostępny w klonach Life technologies/Fisher
C57BL/6 BACCHORI: https://bacpac.chori.org/ Biblioteki BAC RPCI-23 lub RPCI-24Klony BAC 129/Sv można uzyskać z Invivogen lub Life technologies/
Fisher KOD hotstart DNA polymeraseMillipore: https://www.merckmillipore.com71086-3
L-ArabinoseSigma: http://www.sigmaaldrich.comA3256-25G
Długie oligonukleotydyIDT: https://www.idtdna.com; Połączenie genowe: https://www.genelink.comIDT Ultramers lub Gene Link długie oligonukleotydyWOM i fosforan dostępne jako niestandardowe modyfikacje. Oczyszczanie PAGE zdecydowanie zalecane dla długich oligonukleotydów.
Zestaw do oczyszczania MinElute PCRQiagen: http://www.qiagen.com 28004Preferowane są zestawy do oczyszczania PCR z minimalną elucją.
Zestaw QIAPrep Spin Mini PrepQiagen: http://www.qiagen.com 27104Preferowana jest kolumna krzemionkowa lub podobne zestawy matryc.
Enzymy restrykcyjneNEB: https://www.neb.comDpnI: R0176LWykaz RE znajduje się na stronie internetowej NEB.
system

Bibliografia

  1. Dovey, O. M., Foster, C. T., Cowley, S. M. Histone deacetylase 1 (HDAC1), but not HDAC2, controls embryonic stem cell differentiation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 8242-8247 (2010).
  2. Harvey, M., et al. Spontaneous and carcinogen-induced tumorigenesis in p53-deficient mice. Nat. Genet. 5, 225-229 (1993).
  3. Waterhouse, P., et al. Lymphoproliferative disorders with early lethality in mice deficient in Ctla-4. Science. 270, 985-988 (1995).
  4. Thomas, K. R., Capecchi, M. R. Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem cells. Cell. 51, 503-512 (1987).
  5. Hasty, P., Rivera-Pérez, J., Bradley, A. The length of homology required for gene targeting in embryonic stem cells. Mol. Cell. Biol. 11, 5586-5591 (1991).
  6. Smithies, O., Gregg, R. G., Boggs, S. S., Koralewski, M. A., Kucherlapati, R. S. Insertion of DNA sequences into the human chromosomal beta-globin locus by homologous recombination. Nature. 317, 230-234 (1985).
  7. Hirata, R., Chamberlain, J., Dong, R., Russell, D. W. Targeted transgene insertion into human chromosomes by adeno-associated virus vectors. Nat. Biotechnol. 20, 735-738 (2002).
  8. Szostak, J. W., Orr-Weaver, T. L., Rothstein, R. J., Stahl, F. W. The double-strand-break repair model for recombination. Cell. 33, 25-35 (1983).
  9. Bradley, A., Evans, M., Kaufman, M. H., Robertson, E. Formation of germ-line chimaeras from embryo-derived teratocarcinoma cell lines. Nature. 309, 255-256 (1984).
  10. Fu, J., Teucher, M., Anastassiadis, K., Skarnes, W., Stewart, A. F. A recombineering pipeline to make conditional targeting constructs. Methods Enzymol. Soriano, P. M., Wassarman, P. M. 477, Academic Press. 125-144 (2010).
  11. Zhang, Y., Buchholz, F., Muyrers, J., Stewart, A. A new logic for DNA engineering using recombination in Escherichia coli. Nat. Genet. 20, 123-128 (1998).
  12. Copeland, N., Jenkins, N., Court, D. Recombineering: a powerful new tool for mouse functional genomics. Nat. Rev. Genet. 2, 769-779 (2001).
  13. Muyrers, J., Zhang, Y., Testa, G., Stewart, A. Rapid modification of bacterial artificial chromosomes by ET-recombination. Nucleic Acids Res. 27, 1555-1557 (1999).
  14. Yu, D., et al. An efficient recombination system for chromosome engineering in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97, 5978-5983 (2000).
  15. Sharan, S. K., Thomason, L. C., Kuznetsov, S. G., Court, D. L. Recombineering: a homologous recombination-based method of genetic engineering. Nature Protoc. 4, 206-223 (2009).
  16. Wang, J., et al. An improved recombineering approach by adding RecA to λ red recombination. Mol. Biotechnol. 32, 43-53 (2006).
  17. Datta, S., Costantino, N., Court, D. L. A set of recombineering plasmids for gram-negative bacteria. Gene. 379, 109-115 (2006).
  18. Fu, J., et al. Full-length RecE enhances linear-linear homologous recombination and facilitates direct cloning for bioprospecting. Nat. Biotechnol. 30, 440-446 (2012).
  19. Muyrers, J., Zhang, Y., Buchholz, F., Stewart, A. RecE/RecT and Redalpha/Redbeta initiate double-stranded break repair by specifically interacting with their respective partners. Genes Develop. 14, 1971-1982 (2000).
  20. Maresca, M., et al. Single-stranded heteroduplex intermediates in lambda Red homologous recombination. BMC Mol. Biol. 11, 54(2010).
  21. Mosberg, J. A., Lajoie, M. J., Church, G. M. Lambda Red recombineering in Escherichia coli occurs through a fully single-stranded intermediate. Genetics. 186, 791-799 (2010).
  22. Liu, P., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. A highly efficient recombineering-based method for generating conditional knockout mutations. Genome Res. 13, 476-484 (2003).
  23. Chan, W., et al. A recombineering based approach for high-throughput conditional knockout targeting vector construction. Nucleic Acids Res. 35, e64(2007).
  24. Zhang, Y., Muyrers, J. P. P., Testa, G., Stewart, A. F. DNA cloning by homologous recombination in Escherichia coli. Nat. Biotechnol. 18, 1314-1317 (2000).
  25. Lee, E. C., et al. A highly efficient Escherichia coli-based chromosome engineering system adapted for recombinogenic targeting and subcloning of BAC DNA. Genomics. 73, 56-65 (2001).
  26. Skarnes, W. C., et al. A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function. Nature. 474, 337-342 (2011).
  27. Valenzuela, D. M., et al. High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis. Nat. Biotechnol. 21, 652-659 (2003).
  28. Bantscheff, M., et al. Chemoproteomics profiling of HDAC inhibitors reveals selective targeting of HDAC complexes. Nat. Biotechnol. 29, 255-265 (2011).
  29. Mulryan, K., et al. Reduced vas deferens contraction and male infertility in mice lacking P2X1 receptors. Nature. 403, 86-89 (2000).
  30. Subramanian, K., Rutvisuttinunt, W., Scott, W., Myers, R. The enzymatic basis of processivity in lambda exonuclease. Nucleic Acids Res. 31, 1585-1596 (2003).
  31. Antoch, M. P., et al. Functional identification of the mouse circadian Clock gene by transgenic BAC rescue. Cell. 89, 655-667 (1997).
  32. Rostovskaya, M., et al. Transposon-mediated BAC transgenesis in human ES cells. Nucleic Acids Res. 40, e150(2012).
  33. Giraldo, P., Montoliu, L. Size matters: use of YACs, BACs and PACs in transgenic animals. Transgenic Res. 10, 83-103 (2001).
  34. Hill, F., et al. BAC trimming: minimizing clone overlaps. Genomics. 64, 111-113 (2000).
  35. Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection. Nucleic Acids Res. 33, e36(2005).
  36. Cong, L., et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science. 339, 819-823 (2013).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Naprawa przerwy w plazmidziebakteryjny sztuczny chromosompodwójne markery selekcyjnewektory do warunkowego knockoutuwektory reporterowe BACtransformacja metodą elektroporacjianaliza amplifikacji PCR
Subklonowanie plus insercja (SPI) - nowatorska metoda rekombinacji do szybkiej budowy wektorów celowania w geny
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.