Artykuł metodologiczny

Subklonowanie plus insercja (SPI) - nowatorska metoda rekombinacji do szybkiej budowy wektorów celowania w geny

DOI:

10.3791/52155

⸱

8 stycznia 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, University of Leicester, 2Center for Fisheries, Environment and Aquaculture Sciences, 3ES Cell Facility, Centre for Core Biotechnology Services, University of Leicester

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metodologie celowania w geny mogą być używane do generowania transgenicznych myszy z allelami knockout, knock-in i taged. W tym miejscu opisujemy ulepszoną metodę rekombinacji u E. coli, którą nazywamy "subklonowaniem plus insercją", która może być wykorzystana do szybkiego generowania niestandardowych wektorów docelowych genów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Targetowanie genów odnosi się do precyzyjnej modyfikacji locus genetycznego za pomocą rekombinacji homologicznej. Generowanie nowych linii komórkowych i transgenicznych modeli myszy przy użyciu tej metody wymaga budowy wektora "docelowego", który zawiera homologiczne sekwencje DNA do genu docelowego i przez wiele lat był etapem ograniczającym w tym procesie. Konstrukcję wektora można przeprowadzić in vivo w komórkach Escherichia coli przy użyciu rekombinacji homologicznej, w której pośredniczą rekombinacje fagowe, przy użyciu techniki zwanej rekombinacją. Rekombinacja jest preferowaną techniką subklonowania długich sekwencji homologii (>4kb) i różnych elementów docelowych, w tym markerów selekcyjnych, które są wymagane do pośredniczenia w efektywnej wymianie alleli między wektorem docelowym a pokrewnym locus genomowym. Typowe protokoły rekombinacji są zgodne z iteracyjnym schematem stopniowej integracji elementów docelowych i wymagają pośrednich etapów oczyszczania i transformacji. W tym miejscu przedstawiamy nowatorską metodologię rekombinacji składania wektorów przy użyciu podejścia multipleksowego. Naprawa luki plazmidowej odbywa się poprzez jednoczesne wychwycenie sekwencji genomowej z bibliotek sztucznych chromosomów bakteryjnych myszy i wprowadzenie podwójnych markerów selekcji bakteryjnej i ssaków. Ta metoda subklonowania i insercji jest bardzo wydajna i daje większość prawidłowych rekombinantów. Przedstawiamy dane do budowy różnych typów wektorów warunkowego nokautu genów lub knock-in oraz wektorów reporterowych BAC, które zostały skonstruowane tą metodą. Konstrukcja wektorów SPI znacznie rozszerza repertuar zestawu narzędzi do rekombinacji i zapewnia prostą, szybką i opłacalną metodę konstruowania tych wysoce złożonych wektorów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozwój technologii celowania w geny umożliwił budowę linii komórkowych i modeli mysich do badania różnych systemów biologicznych1-3. Kluczowym pierwszym etapem modyfikacji sekwencji genomowej jest zaprojektowanie i skonstruowanie genu ukierunkowanego na wektor4. Wektory celujące to konstrukty plazmidowe, które przenoszą interesujący nas allel zawierający pożądane modyfikacje otoczone markerem selekcyjnym (np. neomycyną) oraz długie regiony genomowe wymagane do wydajnej rekombinacji homologicznej w komórkach ssaków5. Precyzyjną modyfikację genu uzyskuje się poprzez wprowadzenie wektora docelowego do embrionalnych komórek macierzystych (ES)6 lub komórek somatycznych7, przy czym rekombinacja homologiczna między identycznymi odcinkami sekwencji DNA na wektorze docelowym a locus genomu powoduje przeniesienie zamierzonej modyfikacji do genomu w drodze konwersji genu8. Takie zmodyfikowane komórki ES można wstrzyknąć do mysich blastocyst w celu wytworzenia potomstwa (chimer), które może następnie przenosić te zmodyfikowane allele przez linię zarodkową9. Alternatywna droga do produkcji myszy transgenicznych polega na mikrowstrzyknięciu wektora ekspresji genu do jednokomórkowych zygot myszy, co prowadzi do losowej integracji wektora w genomie myszy10. Tradycyjne metody konstruowania wektorów opierały się na konwencjonalnym klonowaniu metodą "wytnij i wklej" przy użyciu enzymów restrykcyjnych i ligaz DNA w celu sklonowania różnych markerów selekcyjnych i fragmentów genomu do szkieletu wektora. Jednak nieodłącznym czynnikiem ograniczającym tradycyjne klonowanie jest umiejscowienie i wybór miejsc restrykcyjnych, zwłaszcza w przypadku dłuższych sekwencji DNA. Często wymaga to wielu etapów subklonowania, a także wprowadza obce sekwencje DNA do wektora, co często prowadzi do niższej skuteczności celowania w geny.

Rekombinowanie (inżynieria rekombinogenna) to technologia inżynierii DNA, która pokonuje te ograniczenia poprzez zastosowanie rekombinacji homologicznej (HR) za pośrednictwem białek rekombinacji fagów w komórkach E. coli 11,12. Ponieważ każdy region sekwencji homologicznej może służyć jako substrat rekombinacji, ograniczenia dostępności miejsc restrykcyjnych są usuwane. Duże sekwencje DNA mogą być bezproblemowo modyfikowane bezpośrednio in vivo, zachowując w ten sposób również ich integralność strukturalną13. Rekombinacja jest bardzo wydajna w przypadku krótkich homologii (50 pz)14 i dlatego ramiona homologiczne (HA) mogą być wygodnie włączone do syntetycznych sekwencji oligo. W typowym eksperymencie rekombinacyjnym oligo lub fragment dwuniciowego DNA (dsDNA) zawierający HA jest elektroporyzowany do rekombinujących kompetentnych komórek E. coli zawierających cel zlokalizowany na chromosomie lub plazmidzie15. Potencjał rekombinacji jest nadawany przez indukowaną ekspresję czerwonych białek rekombinacyjnych faga16,17 lub białek RecET profagarac 18. Egzonukleaza Red/RecE przekształca liniowe dsDNA w pośredni jednoniciowy DNA (ssDNA), który jest następnie wiązany przez swojego partnera, Red/RecT, jednoniciowe białko wyżarzające (SSAP)19. Wyżarzanie długiego ssDNA lub krótkiego oligo do jego komplementarnej sekwencji docelowej zachodzi na opóźnionej nici widełek replikacyjnych i prowadzi do włączenia sekwencji w miejscu docelowym. Rekombinacja ssDNA o opóźnionej nici jest podstawą wysokiej efektywności rekombinacji i może być opisana przez model rekombinacji "beta"20,21.

Typowy proces rekombinacji w celu zbudowania wektora celowania w geny obejmuje jedną z dwóch następujących tras. Jedna droga polega na subklonowaniu pożądanego regionu genomowego z mysiego klonu BAC do plazmidu, a następnie sekwencyjnym wstawianiu miejsc rekombinacji LoxP, markera selekcyjnego22 itp., lub alternatywna droga polega na celowaniu w locus genomu BAC za pomocą różnych docelowych elementów wektorowych poprzez wiele rund rekombinacji10,23, a następnie subklonowanie zmodyfikowanego locus do plazmidu poprzez klonowanie naprawy luk24,25. Wariacje na ten temat zostały wykorzystane w różnych potokach rekombinowania o wysokiej przepustowości w ramach dużych programów produkcji myszy26,27. Jednak procedury te obejmują skomplikowane i długotrwałe etapy, wymagają użycia wyspecjalizowanych wektorów i szczepów E. coli (np. komórek eksprymujących Cre) oraz wykorzystują jeden lub więcej pośrednich etapów oczyszczania i retransformacji DNA wektora (Tabela 1). Subklonowanie plus insercja (SPI) to nowatorska technika rekombinacji, która łączy rekombinację beta i klonowanie naprawy luk w jednym procesie (ryc. 1). Montaż wektorów SPI jest prosty, szybki i elastyczny i oferuje znaczną poprawę w stosunku do standardowych podejść do rekombinowania (Tabela 1). W tym miejscu pokazujemy łatwość i użyteczność wykorzystania SPI do różnych zastosowań konstrukcji wektorowych, ze szczególnym naciskiem na konstruowanie niestandardowych i wymagających projektów wektorowych. Przypadki testowe obejmowały konstrukcję fluorescencyjnego reporterowego wektora knockin, podwójnie znakowanego wektora knockin ekspresji białka, fluorescencyjnego wektora reporterowego BAC i warunkowego wektora knockout. Badali oni w różny sposób wymóg lokalizacji receptora na powierzchni komórki, oczyszczenia kompleksu białek jądrowych lub warunkowej ablacji ekspresji genu.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Projekt celowania genowego

  1. Zamów odpowiedni klon BAC obejmujący interesujący nas region genomu. Upewnij się, że jest to izogeniczne w stosunku do typu komórek ES, które mają być modyfikowane, np. klonów BAC RPCI-23 i RPCI-24 do celowania w geny za pomocą komórek ES C57BL / 6.
  2. Zastosuj konwencjonalne kryteria celowania genów podczas projektowania wektora docelowego. Kluczowe parametry obejmują to, czy modyfikacja musi być konstytutywna czy warunkowa, definiowanie eksonów krytycznych (CE) dla delecji w strategii nokautu genów oraz odstępy i rozmieszczenie kaset intronowych.
    UWAGA: Każdy z nich został szczegółowo omówiony w innym miejscu10.
  3. Wybierz regiony genomu, z których każdy ma rozmiar 5-6 kb po bokach docelowego miejsca modyfikacji.
    UWAGA: Rozmiar subklonowanej wstawki wynosi zatem zwykle 10-12 kb, chociaż górna granica może wynosić nawet 80 kb w przypadku plazmidu subklonującego o niskiej kopii, takiego jak p15A, pBR322 itp., i do 200 kb w przypadku wektora BAC.

2. Multipleksowe Oligonukleotydy Rekombinujące

  1. Zaprojektuj oligonukleotydy dla szkieletu plazmidu (plazmid subklonujący) i markera wybieralnego (kaseta insercyjna). Zaprojektuj każdy oligo w taki sposób, aby zawierał 180 pz HA flankującego genomowe miejsce docelowe i 20 pz specyficznej sekwencji primingowej kasety insercyjnej lub plazmidu subklonującego (Figura 2).
    UWAGA: Ramiona Homology nie powinny zawierać żadnych powtarzających się elementów, obecność powtarzających się elementów będzie skutkowała nieprawidłowym celowaniem i subklonowaniem. Powtarzające się elementy można wykryć za pomocą narzędzi internetowych, takich jak ''Repeat Masker''.
  2. Uwzględnij unikalne miejsce enzymu restrykcyjnego (RE) na jednym z oligonukleotydów wektorowych, aby zlinearyzować wektor ukierunkowany na gen do celowania w komórki ES (ryc. 2).
  3. Sprawdź parametry oligo za pomocą programu do analizatora oligo. Uważaj, aby uniknąć drugorzędnych struktur w regionach gruntowania.
  4. Krótszy kwas hialuronowy (50 pz) kasety insercyjnej jest tolerowany i daje mniejszą liczbę rekombinantów, ale zapewnia, że plazmid podklonujący HA jest zawsze dłuższy (180 pz).
  5. Określ orientację wstawki genomowego DNA konkretnego klonu BAC za pomocą narzędzi internetowych, takich jak ''cloneDB''. Ustal kierunek replikacji z OriS, sprawdzając mapę szkieletu plazmidu BAC użytego w konstrukcji biblioteki BAC.
    UWAGA: OriS jest zwykle przeciwny do kierunku transkrypcji markera chloramfenikolu (Chl) dla wszystkich powszechnie stosowanych plazmidów BAC.
  6. Dodaj dwa końcowe wiązania fosforotionianu (PTO) do końca 5' oligo, który jest przeciwny do kierunku replikacji na klonie BAC. Dodać modyfikację 5' fosforanu do odwróconego oligo (rysunek 2).
    UWAGA: Asymetryczna, fosforonowana kaseta PCR po trawieniu na czerwono generuje produkt pośredni ssDNA, który może przygotować opóźnioną nić widełka replikacyjnego.
    UWAGA: Maksymalna częstotliwość rekombinacji multipleksu jest obserwowana w przypadku kaset zabezpieczonych opóźnionymi pasmami. Kasety zabezpieczone przed wiodącą nicią lub podwójnie zabezpieczone mogą nie wytwarzać równoważnej wydajności rekombinacji w niektórych loci.
  7. Zamów oligonukleotydy z oczyszczaniem PAGE lub HPLC.

3. Transformacja klonu BAC za pomocą plazmidu rekombinującego pSC101 BADgbaA.

  1. Aby szczep E. coli posiadający BAC był sprawny w rekombinacji, przekształć go za pomocą plazmidu pSC101 BADgbaA zawierającego geny Red16,
    UWAGA: Plazmid pSC101 BADgbaA zawiera geny Red i RecA pod kontrolą indukowalnego arabinozą promotora araC-PBAD, markera selekcyjnego tetracykliny i wrażliwego na temperaturę replikonu pSC101.
    1. Wbić sterylną końcówkę pipety do kultury agarowej BAC i zaszczepić 5,0 ml bulionu lizogenicznego (LB) o pH 8,0 zawierającego 12,5 μg ml-1 Chl. Rosnąć w temperaturze 37 °C przez 5 godzin, wstrząsając z prędkością 200 obr./min.
    2. Schłodzić 10% (v/v) roztwór glicerolu, probówki do mikrowirówek i kuwety do elektroporacji na lodzie. Schłodzić dużą wirówkę i mikrowirówkę z chłodzeniem do temperatury 4 °C.
    3. Oznaczyć gęstość optyczną (OD) kultury za pomocą spektrofotometru i zmierzyć absorbancję przy 600 nm. Przygotuj ogniwa elektrokompetentne (jak opisano poniżej), gdy zostanie osiągnięty odczyt OD600 od 0,3 do 0,8.
    4. Odwirowywać komórki w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml w dużej wirówce o sile 1,216 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    5. Przemyć komórki 1 ml schłodzonego 10% glicerolu i odwirować komórki w temperaturze 17,949 x g przez 20 sekund w temperaturze 4 °C. Wykonaj krok prania w sumie 3 razy.
    6. Ponownie zawiesić komórki w całkowitej objętości 50 μl 10% glicerolu i dodać 10-200 ng plazmidu rekombinującego pSC101 BADgbaA. Zawiesinę pojedynczej komórki należy uzyskać poprzez kilkukrotne pipetowanie w górę i w dół, a następnie przenieść komórki do wstępnie schłodzonej kuwety elektroporacyjnej o szczelinie 1 mm.
    7. Elektroporuj ogniwa z ustawieniem 1,8 kv, 25 μF i 200 Ω,
      UWAGA: Sprawdź prawidłowe ustawienia dla każdej marki elektroporatora. Stała czasowa elektroporacji mniejsza niż 4 wskazuje na obecność soli i innych zanieczyszczeń.
    8. Natychmiast odzyskać komórki w 1 ml LB i przenieść komórki do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.
    9. Hoduj kulturę BAC gbaA w temperaturze 30 °C przez 2 godziny wytrząsania z prędkością 200 obr./min.
      UWAGA: Plazmid pSC101 BADgbaA jest tracony, gdy komórki są hodowane w temperaturze 37 °C z powodu inaktywacji wrażliwego na temperaturę czynnika replikacji RepE. Hoduj komórki gbaA w temperaturze 30 °C, aby utrzymać funkcje rekombinacji.
    10. Dodać 9 ml LB zawierającego 12,5 μg ml-1 Chl i 4 μg ml-1 tetracykliny (Tet) do odzyskanej kultury BAC gbaA. Hoduj kulturę BAC gbaA O/N w temperaturze 30 °C, wstrząsając przy 200 obr./min.
      UWAGA: Wydajność przemiany elektroporacji superskręconego plazmidu gbaA jest wystarczająco wysoka, aby umożliwić wzrost nasycenia O/N w ciekłych ośrodkach.

4. Przygotowanie kaset inseryjnych i plazmidów do subklonowania

  1. Aby włączyć kwas hialuronowy do kasety insercyjnej (kaset insercyjnych) i plazmidu subklonującego, należy przeprowadzić reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) przy użyciu długich zmodyfikowanych oligonukleotydów, jak opisano poniżej.
    1. Opcjonalnie: aby zapobiec przenoszeniu plazmidu do reakcji rekombinacji, należy użyć matrycy plazmidu o pochodzeniu R6K lub podobnej wąskiej skali gospodarza do amplifikacji kasety insercyjnej.
    2. Alternatywnie, linearyzuj matrycę plazmidu za pomocą trawienia RE (Tabela 2). Wybierz RE, który wykracza poza obszar amplifikacji PCR i jest inaktywowany termicznie. Dezaktywuj RE na gorąco zgodnie z zaleceniami producenta.
    3. Skonfiguruj reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) przy użyciu systemu polimerazy DNA o wysokiej wierności w fazie gorącego startu. Przygotować wzorcową mieszankę PCR zgodnie z opisem (tabela 3). Wykonaj cykle termiczne, jak pokazano (Tabela 3).
  2. Analizuj produkty PCR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Załaduj 1-5 μl każdego PCR na 1% (w/v) żelu agarozowym zawierającym 0,5 mg ml-1 bromku etydyny (EtBR).
    UWAGA: Obecność niespecyficznych produktów amplifikacji nie zakłóca reakcji rekombinacji. Jednak w niektórych przypadkach dimery starterów mogą zmniejszać wydajność rekombinacji.
  3. Oczyść produkty PCR za pomocą zestawu do oczyszczania PCR.
    1. Opcjonalnie: usunąć matrycę plazmidu z PCR poprzez traktowanie DpnI, a następnie oczyszczanie PCR. Eluować DNA w minimalnej objętości sterylnej wody dejonizowanej (zgodnie z zaleceniami producenta).
      UWAGA: Dodanie DpnI do nieoczyszczonych reakcji PCR powoduje zmniejszenie efektywności rozszczepienia matrycy metylowanego plazmidu DNA.
  4. Określić ilościowo amplifikowane DNA metodą PCR za pomocą analizy w żelu agarozowym w porównaniu ze znanym zestawem wzorców DNA, np. trawienia λ HindIII lub przy użyciu spektrofotometru nanokropli.

5. Subklonowanie plus wstawianie

  1. Rozcieńczyć kulturę O/N BAC gbaA 50 razy, dodając 200 μl w 10 ml LB+Chl+Tet. Rosnąć w temperaturze 30 °C, wytrząsając z prędkością 200 obr./min przez 1 godzinę 50 min. Dołączyć próbkę, która ma być wykorzystana jako kontrola ujemna.
  2. Schłodzić wszystkie materiały i urządzenia do rekombinacji do temperatury 4 °C, jak opisano w kroku 3.1.2.
  3. Wlać płytki agaru LB o pH 8 zawierające odpowiednie stężenie odpowiedniego selektywnego antybiotyku (antybiotyków), który pozwoli na wybór wprowadzanego fragmentu DNA, jak również na wybór wektora subklonującego (Tabela 4).
    UWAGA: Niektóre antybiotyki są wrażliwe na pH. Z reguły używaj agaru LB o pH 8.
  4. Przygotować 10% (w/v) roztwór L-arabinozy. Filtr sterylizować przez filtr strzykawkowy 0,2 μm.
    UWAGA: Arabinoza indukuje ekspresję białek rekombinujących z plazmidu gbaA.
  5. Sprawdź OD kultury BAC gbaA za pomocą spektrofotometru. Po osiągnięciu OD600 0,25-0,3 indukuj białka rekombinujące zgodnie z opisem w następnym kroku.
  6. Dodać 200 μl 10% roztworu arabinozy do 10 ml kultury BAC, aby uzyskać końcowe stężenie arabinozy 0,2%. Obejmują nieindukowaną hodowlę (bez arabinozy), która ma być stosowana jako kontrola negatywna.
  7. Przenieść kulturę BAC do inkubatora z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C i wywołać ekspresję czerwieni przez 45 minut wstrząsania przy 230 obr./min.
    UWAGA: Ekspresja czerwonych białek jest nieefektywna w temperaturze 30 °C.
  8. Odkręć komórki i przemyj 10% glicerolem 3 razy, jak opisano w kroku 3.1.5.
  9. Dodaj 600-1,000 ng każdego z plazmidów subklonujących i kasety insercyjnej (kaset) insercyjnych do reakcji rekombinacji. Dołącz tylko wektor i wektor plus pojedyncze wstawki, aby sprawdzić sprawność i integralność rekombinacji wektora i kaset.
  10. Zawiesinę jednokomórkową można uzyskać, pipetując w górę i w dół. Przeprowadzić elektroporację zgodnie z opisem w kroku 3.1.7, a następnie odzysk w 1 ml LB w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę w przypadku plazmidów wielokopijnych lub w 10 ml LB w temperaturze 37 °C przez 3 godziny w przypadku wektorów BAC.
  11. Na płytki agarowe z podwójnej selekcji rozcieńczyć różne roztwory, np. 90%, 10%, 1% i rosnąć w temperaturze 37 °C przez 16 godzin.

6. Analiza rekombinantów

  1. Opcjonalnie: Wybierz od 6 do 12 kolonii i wykonaj PCR kolonii przy użyciu startera flankującego HA i startera specyficznego dla wkładki. Uwzględnij plazmid subklonujący i plazmid kasety insercyjnej, a także macierzysty klon BAC jako kontrole ujemne.
    1. Wykonaj analizę PCR kolonii w żelu agarozowym. Zidentyfikuj dodatnie klony na podstawie obecności jasnego pasma o oczekiwanym rozmiarze.
      UWAGA: Wysoka wydajność procesu klonowania SPI generuje w większości poprawne rekombinanty.
  2. Zebrać kolonie do 5 ml LB pH 8 zawierającego selektywny antybiotyk i wyhodować O/N w temperaturze 37 °C.
  3. Przygotuj minipreparaty DNA za pomocą zestawu do oczyszczania kolumny zgodnie z instrukcjami producenta.
  4. Przygotuj DNA miniprep BAC przy użyciu standardowej izolacji fenolu i chloroformu lub podobnego protokołu.
  5. Wykonaj trawienie RE na DNA miniprep. Oddziel DNA za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Analizuj wzorce RE, aby zidentyfikować klony zawierające oczekiwane rozmiary fragmentów prawidłowego wektora docelowego. Wybierz RE, który wyraźnie rozróżnia wektor bez wstawień i wektor zawierający te wstawienia.
  6. Opcjonalnie: aby uzyskać komórki pozbawione BAC, który jest nadal obecny w E. coli po rekombinacji, użyj plazmidowego DNA miniprep do transformacji komórek E. coli DH5alpha lub DH10B. coli.
  7. Wykonaj sekwencjonowanie DNA w kasecie HA i insercyjnej, aby sprawdzić błędy syntezy oligo.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wektory knockin

Wektory celowania w knockin odzwierciedlają potrzebę wprowadzenia nowej funkcji sekwencji w genomie, w tym substytucji pojedynczej pary zasad w regionie kodującym białka, fuzji markera fluorescencyjnego lub znacznika powinowactwa do białka lub integracji kasety ekspresji genów. Aby przetestować zastosowanie SPI w strategiach konstruowania wektorów knockin, zbadano dwa różne przypadki testowe. Dnttip1 koduje deoksynukleotydylotransferazę, końcowe, oddziałujące białko 1A (TDIF1), które wraz z deacetylazą histonów klasy I (HDAC) tworzą mitotyczny kompleks deacetylazy (MiDAC)28. Aby zbadać rolę Dnttip1 w podziale komórki, zastosowano podejście do znakowania tandemowego w celu wyizolowania białek oddziałujących z TDIF1. Wcześniejsze próby subklonacji części genu Dnttip1 przy użyciu wektora p15A zawierającego długie regiony homologii skutkowały niską wydajnością naprawy luk i częstymi nieprawidłowymi produktami rekombinacji (dane nie pokazane). W związku z tym konstrukcja wektora knockin w locus Dnttip1 stanowiła wyzwanie dla rekombinacji. Zaprojektowano strategię SPI polegającą na subklonowaniu 12 kb odcinka genu Dnttip1 obejmującego ostatni ekson (ekson 13) do wektora p15A o niskiej kopii i jednoczesnym wstawieniu kasety wyboru znacznika o podwójnym powinowactwie do eksonu 13, zastępując kodon stop (Figura 3A). Kaseta 2X FLAG-kalmodulina wiążąca białko (CBP) sprzężona z FRT-PGK-em7-neomycyną (Neo)-BGhpA-FRT (2,0 kb) amplifikowano z linearyzowanego plazmidu RE przy użyciu podwójnych oligonukleotydów zmodyfikowanych PTO, które zawierały 120 pz HA flankujące kodon stop Dnttip1. Skonstruowano wektor subklonowania p15A zeoDnttip1 (1,7 kb), który zawierał 200 regionów pz homologicznych do końców sekwencji Dnttip1, która miała zostać sklonowana. Plazmid subklonujący Dnttip1 poddano linearyzacji RE i amplifikacji PCR przy użyciu zmodyfikowanych oligonukleotydów o wartości 20 pz, które wygenerowały wektor chroniony przez wiodącą nić. Produkty PCR poddano obróbce DpnI, oczyszczono i poddano koelektrolizacji w celu rekombinowania kompetentnych komórek Dnttip1 BAC E. coli, a także nieindukowanych komórek kontrolnych. Reakcje SPI poczyniono na płytkach agarowych zawierających zeocynę (Zeo) i kanamycynę (Kan) (ryc. 3B). W ramach projektu SPI uzyskano prawidłowo zmodyfikowany wektor knockin Dnttip1 we wszystkich 12 analizowanych rekombinantach (ryc. 3C). Sekwencjonowanie DNA potwierdziło brak jakichkolwiek błędów wynikających z syntezy oligo lub amplifikacji PCR.

Innym przykładem SPI było wstawienie w ramce wzmocnionej kasety selekcyjnej połączonej z białkiem żółtej fluorescencji (eYFP) do genu P2rx1. Gen P2rx1 koduje receptor sprzężony z białkiem G, który działa jako kanał jonowy bramkowany ATP29. Powiązanie z fluorescencją YFP umożliwia śledzenie receptora P2x1 na powierzchni komórki w różnych testach funkcjonalnych. P2rx1 to kolejny trudny locus, który stwarza poważne problemy z konwencjonalnymi metodologiami rekombinowania (dane nie pokazane). Korzystając z SPI, 12 kb segment genu P2rx1 obejmujący końcowy ekson (ekson 12) został subklonowany do wektora zeo p15A i zmodyfikowany przez skoordynowaną insercję kasety Neo po bokach eYFP-LoxP, zastępując kodon stop w eksonie 12 w celu skonstruowania wektora knockin P2rx1-eYFP (Figura 3D). W tym przykładzie wektor p15A chroniony przez opóźnioną nić (1,7 kb) zawierał 230 bp HA, a kaseta eYFP zawierała 50 bp HA i również pozostała niezmodyfikowana. Kaseta insercyjna eYFP (2,7 kb) została złożona przez splicing nakładającego się PCR genu eYFP, PCR amplifikowanego z pEYFP-C1 i kasety LoxP-PGK-em7-Neo-BGhpA-LoxP, PCR amplifikowanej z pL452 (NCI, Frederick). W wyniku reakcji SPI powstały setki kolonii (dane nie pokazane). Analiza RE minipreparatów DNA przygotowanych z 11 klonów wykazała, że większość z nich zawierała prawidłowo złożony wektor knockin P2rx1-eYFP (Figura 3E). Dodatkowa walidacja za pomocą sekwencjonowania DNA wykazała bezbłędne wprowadzenie kasety eYFP. Jednak niektóre z klonów wykazywały profile naprawionej nieoznakowanej luki i naprawionych plazmidów oznaczonej luki w tej samej komórce (pasy 6-9). Kilka próbek zawierało również nieprawidłowo naprawione szczeliny (tor 2) lub błędnie ukierunkowane plazmidy (pasy 4 i 5). Niepowodzenie jednoczesnego subklonowania i celowania w niektórych rekombinantach SPI uwypukla ograniczenia skutecznego klonowania SPI przy użyciu dużych kaset (> 3 kb), które wynikają z ograniczeń procesywności czerwonej długich fragmentów DNA30 lub w przypadku stosowania krótkiego HA. Rzeczywiście, zwiększenie HA kasety eYFP do 200 pz zwiększyło wydajność SPI i prawidłowe ukierunkowanie kasety (dane nie pokazane). Celowanie genowe za pomocą wektora knockin P2rx1-eYFP w JM8. Mysie komórki ES N4 (szczep C57BL / 6) wygenerowały 6 dodatnich klonów z 96, które zawierały prawidłowo ukierunkowaną sekwencję P2rx1-eYFP (Figura 3F).

Wektory reportera BAC

Klon BAC docelowego genu często zawiera wszystkie niezbędne elementy regulatorowe w górę i w dół, np. wzmacniacze, UTR-y itp., a także endogenny promotor do napędzania ekspresji genów na naturalnych poziomach31. Wektor reporterowy BAC jest zatem preferowanym nośnikiem do podsumowania endogennego wzorca ekspresji genu32. Jednak duży rozmiar plazmidu BAC (do 200 kb) stwarza poważne problemy praktyczne z transfekcją nienaruszonego BAC do komórek33. Zmniejszenie rozmiaru wstawki genomowej BAC poprzez przycinanie BAC34,35, przy jednoczesnym zachowaniu niezbędnych elementów regulatorowych genu, umożliwia łatwiejszą obsługę BAC i skutkuje bardziej wydajną transfekcją. Obecna technologia inżynieryjna BAC obejmuje wiele rund rekombinacji, aby osiągnąć ten cel35 . Aby zademonstrować użyteczność SPI w przycinaniu BAC, wektor BAC pBeloBAC11 został użyty do subklonowania sekwencji genomowej o długości 30 kb, w tym genu P2rx1 o pełnej długości z 168 kb P2rx1 BAC wraz z jednoczesną insercją kasety eYFP w genie P2rx1 (Figura 4A). Szkielet wektora zeo pBeloBAC11 (6,5 kb) zawierający 180 pz HA został amplifikowany metodą PCR zmodyfikowanymi oligonukleukleotydami, które wygenerowały wektor chroniony opóźnioną nicią. Ta sama kaseta eYFP Neo (3 kb), użyta w poprzedniej konstrukcji wektora knockin P2rx1, została amplifikowana PCR przy użyciu oligonukleotydów chronionych opóźnioną nicią zawierającą 180 bp HA i była ukierunkowana na ekson 12 P2rx1, zastępując kodon stop. Po połączonej elektroporacji kasety eYFP i wektora zeo pBeloBAC11 do komórek BAC P2rx1 eksprymujących białka rekombinujące gbaA, hodowlę odzyskano w 10 ml LB pH 8 przez 3 godziny w temperaturze 37C w celu segregacji plazmidów BAC. Czyste rekombinanty wybrano na płytkach agarowych Zeo i Kan i obserwowano z częstotliwością 2 x 10-6. Analiza genotypowania Colony PCR wykazała udane przycinanie BAC w 3 z 6 analizowanych klonów (Figura 4B). Amplifikacja PCR dalekiego zasięgu w miejscu insercji eYFP potwierdziła prawidłowe włączenie kasety do trzech dodatnich klonów (Figura 4B). Trzy klony pozbawione wkładki eYFP zostały również nieprawidłowo naprawione w szczelinie na końcu 5', chociaż przyczyna błędnego nakierowania kasety eYFP w tych klonach może być niezależna od prawidłowego zamknięcia końca 3' BAC. Trzy klony BAC z dodatnim wynikiem eYFP poddano dalszej analizie za pomocą trawień RE i wykazano oczekiwany wzór prawidłowo przyciętego rekombinowanego BAC eYFP (Figura 4C). Analiza sekwencji wykazała brak błędów w kasecie eYFP tylko w 1 z 3 pozytywów.

Wektory warunkowego nokautu (cko)

Warunkowa ablacja ekspresji genów jest ważnym narzędziem do badania procesów rozwojowych lub badania systemów biologicznych w określonym punkcie czasowym. Strategia warunkowego nokautu genów zazwyczaj polega na umieszczeniu miejsc rekombinacji LoxP otaczających krytyczny ekson (CE). Delecja CE po ekspresji lub aktywacji Cre powoduje przesunięcie ramki i przedwczesny kodon stop, co skutkuje degradacją mRNA z powodu rozpadu za pośrednictwem nonsensu (NMD). Skonstruowanie warunkowego wektora celowania genowego jest złożonym zadaniem i obejmuje kilka etapów subklonowania, celowania i transformacji22. SPI oferuje wygodną drogę do uproszczenia tego procesu. Jako przypadek testowy warunkowy allel genu Zrsr2 został skonstruowany przy użyciu metodologii SPI (ryc. 5A). Gen Zrsr2 koduje czynnik splicingowy, a pojedyncza kopia znajduje się na chromosomie X. Warunkowy status delecji genu jest w tym przypadku szczególnie ważny dla kontroli możliwości przystosowania się komórek do braku Zrsr2 podczas selekcji komórek ES w konstytutywnej strategii ukierunkowanej na delecję genu. SPI przeprowadzono w celu subklonacji 10 kb części genu ZrSr2 z jednoczesną insercją dwóch różnych kaset selekcyjnych flankowanych LoxP. Kaseta FRT-PGK-em7-Neo-FRT-LoxP (2 kb) została amplifikowana metodą PCR z przetworzonego RE pL451 przy użyciu chronionych oligonukleotydów o opóźnionej nici, które zawierały 180 pz HA ukierunkowane na intron 2 ZrSr2. Druga kaseta zawierająca Rox-PGK-em7-Blasticidin (Bsd)-Rox-LoxP (2 kb) została amplifikowana metodą PCR z plazmidu R6K z opóźnionymi oligonukleotydami chronionymi nicią zawierającą 180 pz HA identyczną z dolnym regionem w intronie 3. Dwa miejsca LoxP otaczały ekson 3, CE, którego delecja po warunkowej aktywacji Cre powoduje przesunięcie ramki i wprowadza przedwczesny kodon stop. Subklonujący plazmid Zrsr2 (1,6 kb) amplifikowano metodą PCR z zlinearyzowanego plazmidu zeo p15A RE przy użyciu oligonukleotydów chronionych opóźnioną nicią zawierających 180 pz HA pasujących do końców sekwencji Zrsr2 o długości 10 kb. Reakcje SPI przeprowadzono zgodnie z wcześniejszym opisem i posiano na płytkach Zeo+Neo+Bsd. Warunkowy wektor celowania ZrSr2 został pomyślnie złożony w większości z 12 badanych rekombinantów (ryc. 5B). Dalsza analiza sekwencjonowania DNA wykazała prawidłową insercję obu markerów selekcyjnych w wektorze ZrSr2 cko.

figure-results-1
Rysunek 1. Klonowanie SPI. Omówienie procesu klonowania SPI łączącego wstawianie kasety i subklonowanie w jednym kroku. (A) Klon BAC jest przekształcany za pomocą plazmidu pSC101 BADgbaA i hodowany w temperaturze 30C. (B) Po indukcji arabinozy w celu ekspresji białek czerwonych, asymetryczna zmodyfikowana kaseta insercyjna i plazmid subklonujący są wprowadzane do klonu BAC i wybierane zarówno za pomocą markerów insercji, jak i subklonowania, aby wygenerować końcowy wektor. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2. Schemat ilustrujący konstrukcję oligonukleotydów rekombinujących SPI. Plazmid subklonujący i kaseta insercyjna są generowane przez PCR przy użyciu kombinacji końcowych przystawki PTO i oligonukleotydów modyfikowanych fosforanami. Fragment PCR po trawieniu na czerwono in vivo wytwarza półprodukt ssDNA, który wygrzewa się do opóźnionej nici widełek replikacyjnych. Specyficzny dla genu kwas hialuronowy o stężeniu 50-180 pz jest wprowadzany do każdego oligolakugigantycznego, jak pokazano. Strzałka wskazuje kierunek replikacji DNA w genie kandydującym. Linia przerywana reprezentuje sekwencję plazmidu subklonującego, która nie jest włączona do produktu PCR. miejsce RE, miejsce enzymu restrykcyjnego linearyzacji końcowego wektora; F, sekwencja do przodu (20 pz) specyficzna dla plazmidu subklonującego lub kasety insercyjnej; R, odwrotna sekwencja dopełniacza (20 pz) plazmidu lub kasety; sm, znacznik zaznaczenia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3. SPI umożliwia konstruowanie trudnych wektorów knockin. (A) Schemat strategii SPI zastosowanej w konstrukcji wektora podwójnie oznakowanego Dnttip1. Strzałka wskazuje kierunek replikacji klonu BAC. (B) Wyniki posiewu nieindukowanych i indukowanych próbek w eksperymencie SPI Dnttip1. (C) Trawienie EcoRI klonów SPI Dnttip1. M, drabinka 1 kb (NEB); C, p15A Plazmid z naprawą szczeliny Dnttip1 bez kasety z podwójnym znacznikiem. Rozmiary fragmentów to: oznaczone, 9.2+4.4+2.2 kb; kontrola; 9,2+4,6 kb. (D) Konstrukcja wektora knockin P2rx1-eYFP oparta na SPI. (E) Fermentacja EcoRI klonów SPI P2rx1-eYFP. M, 1 kb+ drabinka (Invitrogen); C, p15A P2rx1 naprawiony plazmid szczelinowy bez kasety eYFP. Rozmiary fragmentów to: oznaczone, 8.3+4.4+3.1+0.03 kb; kontrola; 8,3+3,1+1,8+0,03 KB. (F) Analiza Southern blot ukierunkowanego na gen P2rx1-eYFP w JM8. Komórki N4 ES. Górny panel, Southern blot z sondą końcową 3' wykorzystującą skrót PshAI. Pokazany jest wynik badań przesiewowych 5 klonów. Dolny panel, Southern blot przy użyciu sondy końcowej 5' i trawienie SpeI dodatnich wyników zidentyfikowanych na podstawie przesiewu końca 3'. Witryna PshAI RE; S, strona SpeI RE. Linia przerywana reprezentuje koniec wektora HA. skrzynka oznacza sondę południową. Oczekiwane fragmenty ograniczeń to: PshAI: WT, 8.9 kb; eYFP-neo, 11,5 kb; SpeI: WT, 6.9 kb; eYFP-neo, 7.6 kb. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4. Uproszczone przycinanie BAC za pomocą SPI. (A) Schemat ilustrujący koncepcję korekcji BAC z wykorzystaniem SPI. Klucz do symboli jest opisany na rysunku 1. (B) Amplifikacja PCR na końcach 5' i 3' subklonowanej wstawki oraz w poprzek miejsca insercji P2rx1-eYFP. Strategia badań przesiewowych jest przedstawiona dla każdego typu PCR. M (górny panel), Hyperladder 25 bp, (dolne panele), 1kb+; P, P2rx1 BAC; S, pBeloBAC11 plazmid do subklonowania zeo. (C) HindIII trawienie trzech klonów eYFP dodatnich SPI BAC z (B); E, oczekiwany wzór ograniczeń HindIII przyciętego eYFP BAC. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5. Warunkowe generowanie wektora nokautu przy użyciu klonowania SPI. (A) Schemat jednoczesnego wstawiania dwóch różnych kaset selekcyjnych z flankami LoxP podczas subklonowania allelu Zrsr2. Klucz do symboli jest opisany na rysunku 1. (B) Fermentacje EcoRI klonów Zrsr2 SPI. L, 1 kb drabinka (NEB); C1, p15A ZrSr2 plazmid naprawiony luki, C2, p15A ZrSr2 naprawiony plazmid luki zawierający wstawkę neo; C3, p15A ZrSr2 naprawiony plazmid szczelinowy zawierający wstawkę bsd. Rozmiary fragmentów to: cko, 7,7+2,9+2,6+1,6 kb; C1, 7,7+4,0 kb; C2, 7,7+4,3+1,6 kb; C3, 7,7 + 2,9 + 2,3 kb. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Liczba stopniKonwencjonalny rurociąg do rekombinacjiRekombinacja multipleksówb
Krok 1Transformacja rekombinującego plazmidu w gospodarza BACTransformacja rekombinującego plazmidu w gospodarza BAC. Przygotowanie kaset celowniczych i wektorów subklonowania.
Krok 2Wstawianie kasety bramki R1/R2Klonowanie naprawy luk multipleksowych
Krok 3Wstawianie floksowanej kasety KanKultura O/N z pojedynczych kolonii
Krok 4Naprawa szczeliny w plazmidzie R3/R4Przygotowanie i weryfikacja plazmidu
Krok 5Przemiana w Cre+ E. coli
Krok 6Przygotowanie i weryfikacja plazmidu
Krok 7Trójstronna reakcja bramki O/N
Krok 8Transformacja trójstronnej reakcji Gateway w komórki DH10B E. coli
Krok 9Hodowla nocna z pojedynczych kolonii
Krok 10Przygotowanie plazmidu i weryfikacja sekwencji
program myszy Knockout (KOMP) potok budowy wektorówo wysokiej przepustowości. Średni czas 3 tygodnie do zweryfikowanego klonu26.
bŚredni czas 4 dni do zweryfikowanego klonu

Tabela 1: Porównanie konwencjonalnego rekombinowania z SPI w konstrukcji wektorów warunkowego nokautu.

Bufor RE5 μl
DNA1 μg plazmidu lub oczyszczonych produktów PCR
Ponownie1 μl (5 lub więcej jednostek)
TEdo 50 μl
Inkubować w temperaturze 37 °C przez co najmniej 1 godzinę. Rozpocząć podgrzewanie zgodnie z instrukcjami producenta

Tabela 2: Skrót RE.

.
Materiały PCRKońcowe stężenie
Bufor PCR1x
Protokół dNTP200 nM
MgSO41,5 mM
betaina1,3 mln
Dmso1 proc
Podkład do przodu200 nM
Odwrócony podkład200 nM
Polimeraza DNA1 U
szablon10 ng plazmidów wielokopijnych lub 2,5 μl DNA miniprep do genotypowania PCR
Wodado 50 μlA
aDla standardowej reakcji PCR 50 μl z wielokopijnymi plazmidami. Genotypowanie dalekiego zasięgu przeprowadzono w 25 μl reakcji PCR.
warunki PCR
95°CCzas trwania: 2 min
92°C10 sekund
55°C30 sekund
72°C30 sekund
30 cyklib
bCykl nr może być przedłużony do 35 dla genotypowania BAC PCR

Tabela 3: Konfiguracja i warunki PCR.

Rozdział )
antybiotykiStężeniea (μg ml-1)
Ampicllin (Wzmacniacz)50
BlastycydynabRozdział 40
chloramfenikolRozdział 12,5
Gentamycynacyfra arabska
HigromycynacRozdział 30
Kanamycynab15
Tetracykliny4
Trimetoprimc10
Zeocin (Zeocyna5
aZalecane do użycia z BAC i plazmidami wielokopijnymi, gdy są używane w kombinacjach w rekombinacji multipleksowej
bBlasticydyna (35 μg ml-1) i Kanamycyna (6 μg ml-1) stosowane razem
cHigromycyna i trimetoprim nie są zalecane do selekcji z pojedynczą kopią BAC.

Tabela 4. Zalecane stężenia antybiotyków do stosowania w eksperymentach SPI.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Budowa linii komórkowych ES i modeli mysich historycznie obejmowała celowanie w geny przy użyciu konstruktów plazmidowych, które zawierały zmodyfikowany allel4. Jednak budowa tych złożonych wektorów ukierunkowanych na geny okazała się znaczącym wąskim gardłem w terminowej produkcji takich modeli. Opracowanie strategii konstruowania wektorów opartych na rekombinacji umożliwiło ulepszenie projektów wektorów i bardziej wydajny montaż wektorów. Niemniej jednak obecne protokoły rekombinacji nadal obejmują wiele etapów, wymagają pośredniego oczyszczania plazmidu i wykorzystują różne szczepy bakterii. Subklonowanie plus insercja oferuje nowatorskie podejście do budowy wektorów, które można przeprowadzić w jednym zdarzeniu elektroporacji w rezydentnym odkształceniu gospodarza BAC. Użyteczność SPI w celowaniu genowym została przetestowana w różnych zastosowaniach budowy wektorów. We wszystkich badanych przypadkach SPI okazał się skuteczny i wyprodukowano prawidłowy rekombinowany plazmid. W większości przypadków wiele różnych kaset zostało prawidłowo umieszczonych w wektorze docelowym. Duże kasety i wektory DNA zostały z łatwością umieszczone w protokole SPI i zademonstrowały elastyczność tego systemu.

SPI opiera się na wykorzystaniu długich sekwencji homologicznych i ochronie fosforotionianów (WOM) liniowych kaset DNA. Modyfikacja WOM zapewnia ochronę przed egzonukleazami liniowemu DNA20,21 , a długi kwas hialuronowy zwiększa wydajność rekombinacji, umożliwiając multipleksowanie. Jednak synteza dłuższych sekwencji oligonukleotydów zwiększa szanse na akumulację błędów, zwłaszcza delecji. Mutacje w oligonugolakugigancie mogą być szczególnie szkodliwe, jeśli obejmują regiony kodujące białka. Sekwencjonowanie DNA w poprzek HA i pokrycie całej długości wstawionej kasety jest wysoce zalecane w celu wyeliminowania klonów z jakimikolwiek zmianami sekwencji. Sugeruje się również stosowanie systemu polimerazy DNA o wysokiej wierności, aby uniknąć wprowadzenia jakichkolwiek błędów PCR. Długość i skład HA plazmidu subklonującego jest bardziej krytyczna w stosunku do kasety insercyjnej (dane nie pokazane). W przypadku szczególnie wrażliwych zastosowań, takich jak budowa wektorów knockin, gdzie wszelkie mutacje w regionach eksonów nie są tolerowane, kwas hialuronowy kasety insercyjnej można skrócić (50-120 pz), aby uniknąć problemów związanych z długimi oligonukleotydami. Kaseta insercyjna może być również pozostawiona w stanie niezmodyfikowanym lub podwójnie fosforoniana (gdzie wiedza na temat kierunku replikacji nie jest dostępna). Ale multipleksowanie w tych przypadkach nadal wymaga długo chronionych plazmidów subklonujących HA. Zastrzeżeniem tej konkretnej strategii jest obniżenie wydajności multipleksowania, co może potencjalnie wpłynąć na klonowanie SPI w różnych loci.

Długość kasety insercyjnej i plazmidu subklonującego jest kolejnym ważnym parametrem w klonowaniu SPI. Większe cząsteczki DNA elektrorazują się mniej wydajnie, a efekt kumuluje się, biorąc pod uwagę wymóg wprowadzenia wszystkich kaset do tej samej komórki (dane nie pokazane). Multipleksowanie jest najbardziej wydajne w przypadku mniejszych kaset wsuwanych. Fragmenty DNA większe niż 3 kb również ograniczają przetwarzanie ssDNA za pośrednictwem czerwieni, które jest najbardziej efektywne do 3 kb30. Kasety insercyjne o objętości przekraczającej 3 kb są podwójnie recięte i rekombinowane mniej efektywnie za pośrednictwem ścieżki niezależnej od beta20. Dlatego w takich przypadkach ważne staje się badanie przesiewowe wystarczającej liczby kolonii w celu zidentyfikowania właściwego klonu. Dłuższy czas trwania rekombinacji po elektroporacji zwiększa również szanse na odzyskanie prawidłowego klonu w trudnych ćwiczeniach SPI. W procesie SPI można jednocześnie włożyć do czterech małych kaset (< 1,5 kb), chociaż wydajność multipleksowania spada z każdą dodatkową kasetą (dane nie pokazane). Odzwierciedla to jednak wynik optymalnego eksperymentu SPI i zaleca się rozważenie ograniczeń multipleksowania w przypadku korzystania z wielu dużych kaset.

Rozwój narzędzi do edycji genomu, takich jak system endonukleazy CRISPR-cas9 z regularnie rozmieszczonymi krótkimi powtórzeniami palindromicznymi (CRISPR), umożliwił stworzenie nowatorskich modyfikacji genomu i doprowadził do bardziej wydajnej inżynierii genomu36. Jednak te nowsze technologie uzupełniły wektory ukierunkowane na geny, a nie je wyparły. Przewiduje się, że system CRISPR-cas może zastąpić selekcję antybiotyków i jeszcze bardziej udoskonalić protokół rekombinowania multipleksów.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

T.R.R jest wynalazcą brytyjskiego wniosku patentowego dotyczącego technologii rekombinowania multipleksów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

T.R.R wymyślił projekt, zaprojektował i przeprowadził eksperymenty oraz przygotował rękopis. E.J.K i S.E.M przeprowadzali eksperymenty. Wszyscy autorzy wnieśli intelektualny wkład w powstanie ostatecznego rękopisu. Praca ta została sfinansowana przez University of Leicester Innovation Fellowship dla SEM oraz przez UK Medical Research Council (MRC) Senior Research Fellowship dla S.M.C (MR/J009202/1). Sekwencjonowanie DNA zostało przeprowadzone przez Laboratorium Białek i Kwasów Nukleinowych (PNACL), Centrum Podstawowych Usług Biotechnologicznych, Uniwersytet w Leicester. Pragniemy podziękować A. Francisowi Stewartowi za dostarczenie plazmidów Rox i Dre. Plazmidy pL451 i pL452 uzyskano z National Cancer Institute (NCI), Frederick, USA.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Antybiotyki z wyjątkiem ZeocinSigma: http://www.sigmaaldrich.comAmpicillin, A9518-5G;
Chloramfenikol, C1919-5G; Blasticydyna, 15205-25MG; gentamycyna, G1264-50MG; Higromycyna, H3274-50MG; Kanamycyna,: K1876-1G;
Chlorowodorek tetracykliny, T7660-5G; Trimetoprim, 92131-1G
ZeocinInvivogen: ant-zn-1Zeocin jest również dostępny w klonach Life technologies/Fisher
C57BL/6 BACCHORI: https://bacpac.chori.org/ Biblioteki BAC RPCI-23 lub RPCI-24Klony BAC 129/Sv można uzyskać z Invivogen lub Life technologies/
Fisher KOD hotstart DNA polymeraseMillipore: https://www.merckmillipore.com71086-3
L-ArabinoseSigma: http://www.sigmaaldrich.comA3256-25G
Długie oligonukleotydyIDT: https://www.idtdna.com; Połączenie genowe: https://www.genelink.comIDT Ultramers lub Gene Link długie oligonukleotydyWOM i fosforan dostępne jako niestandardowe modyfikacje. Oczyszczanie PAGE zdecydowanie zalecane dla długich oligonukleotydów.
Zestaw do oczyszczania MinElute PCRQiagen: http://www.qiagen.com 28004Preferowane są zestawy do oczyszczania PCR z minimalną elucją.
Zestaw QIAPrep Spin Mini PrepQiagen: http://www.qiagen.com 27104Preferowana jest kolumna krzemionkowa lub podobne zestawy matryc.
Enzymy restrykcyjneNEB: https://www.neb.comDpnI: R0176LWykaz RE znajduje się na stronie internetowej NEB.
system

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dovey, O. M., Foster, C. T., Cowley, S. M. Histone deacetylase 1 (HDAC1), but not HDAC2, controls embryonic stem cell differentiation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 8242-8247 (2010).
  2. Harvey, M., et al. Spontaneous and carcinogen-induced tumorigenesis in p53-deficient mice. Nat. Genet. 5, 225-229 (1993).
  3. Waterhouse, P., et al. Lymphoproliferative disorders with early lethality in mice deficient in Ctla-4. Science. 270, 985-988 (1995).
  4. Thomas, K. R., Capecchi, M. R. Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem cells. Cell. 51, 503-512 (1987).
  5. Hasty, P., Rivera-Pérez, J., Bradley, A. The length of homology required for gene targeting in embryonic stem cells. Mol. Cell. Biol. 11, 5586-5591 (1991).
  6. Smithies, O., Gregg, R. G., Boggs, S. S., Koralewski, M. A., Kucherlapati, R. S. Insertion of DNA sequences into the human chromosomal beta-globin locus by homologous recombination. Nature. 317, 230-234 (1985).
  7. Hirata, R., Chamberlain, J., Dong, R., Russell, D. W. Targeted transgene insertion into human chromosomes by adeno-associated virus vectors. Nat. Biotechnol. 20, 735-738 (2002).
  8. Szostak, J. W., Orr-Weaver, T. L., Rothstein, R. J., Stahl, F. W. The double-strand-break repair model for recombination. Cell. 33, 25-35 (1983).
  9. Bradley, A., Evans, M., Kaufman, M. H., Robertson, E. Formation of germ-line chimaeras from embryo-derived teratocarcinoma cell lines. Nature. 309, 255-256 (1984).
  10. Fu, J., Teucher, M., Anastassiadis, K., Skarnes, W., Stewart, A. F. A recombineering pipeline to make conditional targeting constructs. Methods Enzymol. Soriano, P. M., Wassarman, P. M. 477, Academic Press. 125-144 (2010).
  11. Zhang, Y., Buchholz, F., Muyrers, J., Stewart, A. A new logic for DNA engineering using recombination in Escherichia coli. Nat. Genet. 20, 123-128 (1998).
  12. Copeland, N., Jenkins, N., Court, D. Recombineering: a powerful new tool for mouse functional genomics. Nat. Rev. Genet. 2, 769-779 (2001).
  13. Muyrers, J., Zhang, Y., Testa, G., Stewart, A. Rapid modification of bacterial artificial chromosomes by ET-recombination. Nucleic Acids Res. 27, 1555-1557 (1999).
  14. Yu, D., et al. An efficient recombination system for chromosome engineering in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97, 5978-5983 (2000).
  15. Sharan, S. K., Thomason, L. C., Kuznetsov, S. G., Court, D. L. Recombineering: a homologous recombination-based method of genetic engineering. Nature Protoc. 4, 206-223 (2009).
  16. Wang, J., et al. An improved recombineering approach by adding RecA to λ red recombination. Mol. Biotechnol. 32, 43-53 (2006).
  17. Datta, S., Costantino, N., Court, D. L. A set of recombineering plasmids for gram-negative bacteria. Gene. 379, 109-115 (2006).
  18. Fu, J., et al. Full-length RecE enhances linear-linear homologous recombination and facilitates direct cloning for bioprospecting. Nat. Biotechnol. 30, 440-446 (2012).
  19. Muyrers, J., Zhang, Y., Buchholz, F., Stewart, A. RecE/RecT and Redalpha/Redbeta initiate double-stranded break repair by specifically interacting with their respective partners. Genes Develop. 14, 1971-1982 (2000).
  20. Maresca, M., et al. Single-stranded heteroduplex intermediates in lambda Red homologous recombination. BMC Mol. Biol. 11, 54(2010).
  21. Mosberg, J. A., Lajoie, M. J., Church, G. M. Lambda Red recombineering in Escherichia coli occurs through a fully single-stranded intermediate. Genetics. 186, 791-799 (2010).
  22. Liu, P., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. A highly efficient recombineering-based method for generating conditional knockout mutations. Genome Res. 13, 476-484 (2003).
  23. Chan, W., et al. A recombineering based approach for high-throughput conditional knockout targeting vector construction. Nucleic Acids Res. 35, e64(2007).
  24. Zhang, Y., Muyrers, J. P. P., Testa, G., Stewart, A. F. DNA cloning by homologous recombination in Escherichia coli. Nat. Biotechnol. 18, 1314-1317 (2000).
  25. Lee, E. C., et al. A highly efficient Escherichia coli-based chromosome engineering system adapted for recombinogenic targeting and subcloning of BAC DNA. Genomics. 73, 56-65 (2001).
  26. Skarnes, W. C., et al. A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function. Nature. 474, 337-342 (2011).
  27. Valenzuela, D. M., et al. High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis. Nat. Biotechnol. 21, 652-659 (2003).
  28. Bantscheff, M., et al. Chemoproteomics profiling of HDAC inhibitors reveals selective targeting of HDAC complexes. Nat. Biotechnol. 29, 255-265 (2011).
  29. Mulryan, K., et al. Reduced vas deferens contraction and male infertility in mice lacking P2X1 receptors. Nature. 403, 86-89 (2000).
  30. Subramanian, K., Rutvisuttinunt, W., Scott, W., Myers, R. The enzymatic basis of processivity in lambda exonuclease. Nucleic Acids Res. 31, 1585-1596 (2003).
  31. Antoch, M. P., et al. Functional identification of the mouse circadian Clock gene by transgenic BAC rescue. Cell. 89, 655-667 (1997).
  32. Rostovskaya, M., et al. Transposon-mediated BAC transgenesis in human ES cells. Nucleic Acids Res. 40, e150(2012).
  33. Giraldo, P., Montoliu, L. Size matters: use of YACs, BACs and PACs in transgenic animals. Transgenic Res. 10, 83-103 (2001).
  34. Hill, F., et al. BAC trimming: minimizing clone overlaps. Genomics. 64, 111-113 (2000).
  35. Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection. Nucleic Acids Res. 33, e36(2005).
  36. Cong, L., et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science. 339, 819-823 (2013).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Naprawa przerwy w plazmidziebakteryjny sztuczny chromosompodw jne markery selekcyjnewektory do warunkowego knockoutuwektory reporterowe BACtransformacja metod elektroporacjianaliza amplifikacji PCR

Powiązane artykuły