Opisujemy metodę generowania możliwego modelu wielotorbielowatości nerek dla danio pręgowanego. Użyliśmy ryb Tg(wt1b:GFP) do wizualizacji struktury nerek. Knockdown wnt5a nastąpił przez wstrzyknięcie morfolino. Powstawanie torbieli pronefrycznej po knockdownie wnt5a zaobserwowano u tego transgenicznego danio pręgowanego GFP.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Możliwy model wielotorbielowatości nerek u danio pręgowanego: knockdown wnt5a powoduje torbiele w nerkach danio pręgowanego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wielotorbielowatość nerek (PKD) jest jedną z najczęstszych przyczyn schyłkowej choroby nerek, wyniszczającej choroby, na którą nie ma lekarstwa. Mechanizmy molekularne prowadzące do powstawania torbieli w PKD pozostają nieco niejasne, ale uważa się, że zaangażowanych jest wiele genów. Wnt5a jest niekanoniczną glikoproteiną, która reguluje szeroki zakres procesów rozwojowych. Wnt5a działa poprzez szlak płaskiej polaryzacji komórek (PCP), który reguluje zorientowany podział komórek podczas wydłużania komórek kanalików nerkowych. Stwierdzono, że wady szlaku PCP powodują powstawanie torbieli nerki. W pracy opisano metodę opracowania modelu torbielowatej choroby nerek danio pręgowanego poprzez knockdown genu wnt5a za pomocą oligonukleotydów antysensownych morfolino (MO) wnt5a. Transgeniczne danio pręgowane Tg (wt1b: GFP) wykorzystano do wizualizacji struktury nerek i torbieli nerek po knockdown wnt5a. Zastosowano dwa odrębne antysensowne MO (AUG - i miejsce splicingu) i oba spowodowały fenotyp kędzierzawego ogona w dół i tworzenie się torbieli po knockdown wnt5a. Wstrzyknięcie mysiego mRNA Wnt5a, opornego na MO ze względu na różnicę w strukturze pierwszorzędowej pary zasad, uratowało nieprawidłowy fenotyp, wykazując, że fenotyp nie był spowodowany "niedocelowymi" efektami morfolino. Praca ta potwierdza zasadność wykorzystania modelu danio pręgowanego do badania funkcji wnt5a w nerkach.
Wprowadzenie
Zarodki danio pręgowanego (Danio rerio) były powszechnie używane jako model do badania rozwoju nerek i wielotorbielowatości nerek. Wykorzystanie danio pręgowanego jako modelu zwierzęcego ma wiele zalet: możliwość badania interakcji genetycznych, możliwość wykorzystania antysensownych morfolinosów (MO) do knockdownu białek, możliwość szybkiego oznaczania dużej liczby zarodków oraz łatwość oglądania fenotypów narządów u żywych larw 1. Przednercze jest pierwszą nerką, która rozwija się u kręgowców i jest funkcjonalna u larw danio pręgowanego 2. Struktura przednercza danio pręgowanego jest stosunkowo prosta w porównaniu z metanephros ssaków, trzecią i ostatnią nerką, która rozwija się u ssaków. Nefron jest jednostką roboczą nerki, przy czym każda ludzka nerka zawiera od 500 000 do 1 000 000 nefronów3,4, a każda nerka myszy ma około 13 000 nefronów5, co utrudnia obserwację pojedynczej struktury nefronu w nerkach ludzkich lub mysich. Danio pręgowany ma tylko dwa nefrony, a każdy nefron danio pręgowanego zawiera wszystkie główne składniki znajdujące się w kłębuszkach nerkowych i kanalikach myszy i ludzi6oraz podobne wyspecjalizowane typy komórek nerkowych. W porównaniu z innymi modelami kręgowców, takimi jak Xenopus, nefron danio pręgowanego bardziej przypomina nefron ssaków, ponieważ ma zamknięty system7.
W ostatnich latach genom danio pręgowanego został zsekwencjonowany, co pozwoliło na szerokie wprowadzenie narzędzi genetycznych, obszernych zasobów mutantów i kolekcji transgenicznych linii reporterowych w modelach danio pręgowanego. Przednercze danio pręgowanego tworzy się między 12 a 72 godzinami po zapłodnieniu (hpf) i można je łatwo uwidocznić w przezroczystych zarodkach. Białko nowotworowe Wilma WT1 jest niezbędnym czynnikiem rozwoju nerek. Transgeniczne linie danio pręgowanego wykazujące ekspresję białka zielonej fluorescencji (GFP) pod kontrolą promotora wt1b Tg (wt1b: GFP) wykazują ekspresję GFP specyficznie zlokalizowaną w regionach pronerkowych w zarodkach danio pręgowanego, począwszy od 17 hpf 8. Nefronooftoza (NPHP), autosomalna recesywna torbielowatość nerek, jest wywoływana przez mutacje genów NPHP 9. Powalenie NPHP4 przez morfolino spowodowało powstawanie cyst u ryb Tg(wt1b:GFP). 10 Dlatego ta transgeniczna ryba jest odpowiednim modelem do obserwacji struktur nerkowych i powstawania torbieli podczas rozwoju nerek. Co ważne, wpływ modulatorów na rozwój nerek można badać przy użyciu tego szczepu w sposób efektywny czasowo i pracochłonnie.
Nasz artykuł opisuje użycie ryb Tg(wt1b:GFP) jako modelu do wizualizacji powstawania torbieli nerki po modulacji genu. Użyliśmy MO antysensownych MO w miejscu startu i splicingu, aby powalić gen wnt5a u danio pręgowanego. Wnt5a jest niekanoniczną wydzielaną glikoproteiną z rodziny Wnt, która odgrywa ważną rolę w rozwoju różnych narządów i pourodzeniowych funkcjach komórkowych11. Wnt5a działa poprzez niekanoniczne szlaki Wnt, w tym szlak płaskiej polaryzacji komórek (PCP), który, jak stwierdzono, odgrywa rolę w zorientowanym podziale komórek podczas wydłużania kanalików nerkowych. Wnt5a reguluje szlak Wnt / PCP, tworząc kompleks z receptorem, takim jak kinaza tyrozynowa (Ryk), który dodatkowo transdukuje sygnalizację Wnt5a, tworząc kompleks z białkiem polarności komórek planarnych VANGL 2 (Vangl2), promując w ten sposób stabilność Vangl2 12. Wady szlaku PCP mogą powodować losowy podział komórek i powstawanie torbieli nerkowej. Użyliśmy linii zebry Tg(wt1b:GFP) do obserwacji powstawania torbieli nerki po knockdownie wnt5a. Model danio pręgowanego Tg(wt1b:GFP) umożliwia obrazowanie na żywo i obserwację struktury nerki w odpowiednim czasie. Po nokdaucie wnt5a stwierdzono tworzenie się torbieli nerki zaczynającej się od 24 hpf; Przy 72 hpf torbiele można znaleźć w kłębuszkach nerkowych i kanalikach proksymalnych. Metoda ta może być również wykorzystana do badań przesiewowych innych genów, które mogą powodować powstawanie torbieli nerki.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
UWAGA: Oświadczenie etyczne: Wszystkie eksperymenty z danio pręgowanym zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Wykorzystania w Szkole Medycznej Wschodniej Wirginii.
1. Przygotowanie Morpholino
- Zaprojektuj i zsyntetyzuj oligonukleotydy anty-sensowne morfolino (MO) blokujące translację (AUG-) i hamujące splice (Splice-) dla genu będącego przedmiotem zainteresowania zgodnie z instrukcjami producenta (Figura 1A). Proszę zapoznać się z informacjami producenta w tabeli 1.
UWAGA: MO są wysyłane jako liofilizowane zapasy w szklanych butelkach. - Dodaj sterylną wodę wysokiej jakości do szklanych butelek, aby ponownie zawiesić MO do końcowego stężenia 25 μg/μl. Upewnij się, że oligonukleotyd jest całkowicie rozpuszczony. Jeśli pozostanie jakaś substancja stała, podgrzać fiolkę zawierającą podstawowy roztwór oligonukleotydu w temperaturze 65 °C przez 5 do 10 minut i krótko przeprowadzić.
- Przechowywać roztwór podstawowy MO w temperaturze pokojowej. Nie przechowuj ich w temperaturze 4 °C lub -20 °C, ponieważ niższe temperatury mogą spowodować związanie oligonukleotydu MO ze ścianką pojemnika. Mierzyć stężenie roztworu podstawowego za pomocą spektrofotometru (patrz Tabela 1) za każdym razem, gdy sporządzany jest nowy roztwór podstawowy MO.
- Roztwór roboczy MO należy przygotować w dniu wstrzyknięcia, rozcieńczając roztwór podstawowy sterylną wodą o wysokiej jakości do pożądanej dawki. Dodaj 0,5% czerwieni fenolowej, aby osiągnąć stężenie 0,05%. Na przykład, aby przygotować 5 μl roztworu roboczego o stężeniu 15 ng/nL, dodaj 3 μl roztworu podstawowego MO i 0,5 μl 0,5% czerwieni fenolowej do 1,5 μl wody.
UWAGA: Przy tym stężeniu roboczym każda kropla (500 pl) iniekcji zawiera 7,5 ng MO, a dwie krople zawierają 15 ng MO.
2. Przygotowanie aparatu do iniekcji
- Kup szklane, wstępnie wyciągnięte igły (szczegółowe informacje znajdują się w Tabeli 1). Alternatywnie należy pociągnąć szklaną igłę do wstrzykiwań za pomocą ściągacza do igieł.
- Włącz sprężarkę powietrza i ustaw ciśnienie na 50 psi. Włącz źródło światła mikroskopu preparacyjnego i pompę mikroiniekcji Pico i dostosuj ustawienia w następujący sposób: ciśnienie podtrzymania 20 psi, ciśnienie wyrzutu 10 psi, wartość okresu 2,5 i zakres bramkowania 100 μs.
- Na szklaną igłę naciągniętą napełnić 5 μl roztworu do wstrzykiwań i ustawić igłę w pozycji pionowej z końcówką skierowaną w dół. Poczekaj, aż cały roztwór dotrze do końcówki igły bez widocznych pęcherzyków powietrza. Umieść uchwyt igły w odpowiedniej pozycji obok mikroskopu i włóż szklaną igłę do uchwytu. Ustaw kąt wtrysku na 45 stopni.
- Umieść końcówkę igły w polu widzenia pod mikroskopem, wysoko nad sceną i skup się na najcieńszym obszarze końcówki. Odłam końcówkę igły pęsetą z cienkim czubkiem.
- Umieść linijkę i rurkę kapilarną o średnicy wewnętrznej 0,15 mm obok siebie pod mikroskopem; wstrzyknąć roztwór na jeden koniec rurki kapilarnej, aby utworzyć kolumnę cieczy. Dostosuj czas wyrzutu, aby osiągnąć co 17 kropli na kolumnę cieczy o długości 1 mm, wtedy objętość każdej kropli wynosi 1 nl (objętość kropli = π x promień2 x długość (kolumny cieczy) / liczba (kropli).
UWAGA: Kropla o średnicy 0,1 mm daje objętość wtrysku około 500 pl (objętość kropli = 4/3 x π x promień3).
3. Przygotowanie zapłodnionych zarodków danio pręgowanego i wstrzyknięcie Morpholinosem
- Skonfiguruj transgeniczne pary hodowlane danio pręgowanego Tg(wt1b:GFP) zgodnie z opublikowanymi protokołami standardowej hodowli i utrzymania danio pręgowanego. Zbierz zarodki po naturalnym zaszczepieniu i trzymaj je na 10 cm szalce Petriego wypełnionej wodą E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mMMgSO4). Natychmiast rozpocząć wstrzykiwanie MO 13. Monitoruj morfologię zarodka pod mikroskopem i upewnij się, że wstrzyknięcie MO następuje w stadium jednokomórkowym lub nie później niż w stadium czterokomórkowym.
- Przenieś zarodki na 10-centymetrową szalkę Petriego z klinowymi korytami agarowymi. Odessaj nadmiar wody E3 i delikatnie wciśnij zarodki do koryt.
- Manipuluj zarodkami za pomocą mikropipety, aby uwidocznić zarodki w stadium 1-komórkowym pod mikroskopem preparacyjnym. Penetruj kosmówkę, a następnie żółtko, aby wstrzyknąć jedną lub dwie krople MO do żółtka (1 kropla = 500 pl). Przenieść wstrzyknięte zarodki na 10 cm szalkę Petriego z wodą E3 i inkubować w temperaturze 28,5 °C.
- Po wykonaniu wstrzyknięć należy usunąć martwe zarodki i zanotować liczbę wstrzykniętych zarodków. Wymieniaj wodę E3 w naczyniu co 24 do 48 godzin.
4. Eksperymenty z ratowaniem fenotypów
- Wybierz ortolog z innego gatunku, który ma inną strukturę pierwotnej pary zasad (zwykle 3-7 niezgodności par zasad) i dlatego jest odporny na MO, do ratunku. Na przykład w tym eksperymencie wybraliśmy mysz, ponieważ sekwencja mRNA myszy Wnt5a różni się od sekwencji danio pręgowanego.
- Zaprojektuj zestaw starterów z starterem do przodu zaczynającym się w miejscu translacji i starterem odwrotnym w pobliżu końca regionu kodującego mRNA. Dodaj sekwencję promotora T7 na końcu 5'- sekwencji startera do przodu. W tym eksperymencie użyliśmy następujących sekwencji starterów; Do przodu: 5'- TAA TAC GAC TCA CTA Tag gga CTA Tga TGA TGC TGA TGA TGA AGC TGA A- 3' i odwrotnie: 5'- TCA CTT GCA GAC GTA CTG GTC- 3'.
- Przeprowadzić 50 μl łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR) z zestawem starterów (0,5 μM każdego startera) zaprojektowanym powyżej i 0,1 μg matrycy DNA zawierającej mysią sekwencję cDNA Wnt5a za pomocą następującego programu PCR: 1 cykl w temperaturze 95 °C przez 5 minut; 35 cykli w 95 °C (30 sek), 58,5 °C (30 sek), 72 °C (1 min); i końcowy stopień przedłużania w temperaturze 72 °C przez 7 min.
- Po zakończeniu cyklu nałóż 2 μl produktu PCR na 1% żel agarozowy, aby upewnić się, że opaska ma odpowiedni rozmiar. Oczyść produkt PCR za pomocą zestawu do oczyszczania PCR zgodnie z instrukcjami producenta. Sprawdź stężenie DNA za pomocą spektrofotometru. Oczyszczony produkt PCR należy przechowywać w temperaturze -20 °C lub użyć bezpośrednio w transkrypcji RNA z czapeczką w następnym kroku.
- Zsyntetyzuj mRNA z czapeczką in vitro za pomocą zestawu do syntezy RNA z czapeczką zgodnie z instrukcjami producenta. Rozcieńczyć mRNA w 20 μl wody wolnej od RNaz i oznaczyć stężenie. Podwielokrotnić RNA i przechowywać w temperaturze -80 °C.
- W dniu wstrzyknięcia należy przygotować roztwór roboczy mRNA ze sterylną wodą wolną od RNazy. Należy zauważyć, że 40 pg jest na ogół najwyższą dawką RNA, przy której nie występują niespecyficzne lub toksyczne działanie RNA. Utrzymuj roztwór roboczy na lodzie. Wstrzyknij zarodkowi MO, a następnie ratunkowe mRNA lub wstrzyknij oba razem. Na przykład, jeśli stężenie mRNA przygotowanego w kroku 4.5 wynosi 0,6 μg/μl, dodaj 0,67 μl mRNA (0,4 μg) do 4,33 μl wody wolnej od RNazy, aby uzyskać końcowe stężenie 0,08 μg/μl, to jedna kropla (500 pl) każdego wstrzyknięcia zawiera 40 pg mRNA. Przygotuj MO zgodnie z opisem w kroku 3.
5. Przygotowanie wstrzykniętych zarodków do obrazowania fluorescencyjnego
- Po inkubacji w temperaturze 28,5 °C O/N dodać 0,003% N-fenylotiomocznika (PTU) do wody E3, aby zapobiec melanizacji, co wpływa na obserwację struktury przedkrzewów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Nie należy jednak dodawać PTU przed gastrulacją, ponieważ wpływa to na wczesny rozwój zarodkowy.
- Przy 48 hpf ręcznie zdekorionuj zarodki za pomocą cienkiej pęsety. Zrób zdjęcia 48 i 72 zarodków hpf pod mikroskopem rozwarstwiającym światłem.
UWAGA: Te zdjęcia można robić bez znieczulenia. - Około 10 minut przed obrazowaniem pod mikroskopem fluorescencyjnym należy znieczulić zarodki, umieszczając je na 10-centymetrowej szalce Petriego zawierającej 160 μg/ml buforowanej trikainy. Odczekaj 5-10 minut, a następnie lekko dotknij danio pręgowanego, aby potwierdzić, że się nie porusza i dlatego znieczulenie działa.
- Po znieczuleniu zarodków należy je obsadzić w 3% metylocelulozie i ustawić w pozycji leżącej pod mikroskopem preparacyjnym (patrz Tabela 1).
- Obserwuj strukturę przednercza pod mikroskopem fluorescencyjnym (patrz Tabela 1) i rób zdjęcia w różnych powiększeniach (10X i 20X).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Wnt5a knock down osiągnięto poprzez wprowadzenie MO blokującego translację (AUG-MO) lub MO blokującego splicing na granicy eksonu i intronu (splice-MO) do embrionów danio pręgowanego w stadium jednej komórki. AUG-MO celuje w kodon startowy, przez co hamuje zarówno matczyne, jak i zygotyczne mRNA wnt5a . Splice-MO celuje w trzecią stronę donora splicingu i hamuje wyłącznie zygotyczny transkrypt wnt5a (Rycina 1A). Morfanty AUG- i splice- wykazały analogiczne fenotypy z licznymi wadami, w ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Wielotorbielowatość nerek (PKD) jest jedną z głównych przyczyn schyłkowej niewydolności nerek u ludzi i charakteryzuje się postępującym tworzeniem torbieli, powiększeniem nerek i nieprawidłowym rozwojem kanalików 14. Autosomalna dominująca PKD (ADPKD) jest chorobą genetyczną, w której mutacja PKD1, kodującej policystynę-1 (PC1), lub PKD2, kodującej policystynę-2 (PC2), powoduje powstanie policystycznych nerek. Uważa się, że wiele innych genów, zwłaszcza tych kodujących białka znajdujące się w rzęsce pierwotnej...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez NIH (DK093625 do L.H., oraz DK069909 i DK047757 do J.H.L.) oraz VA (Merit Award I01BX000820 do J.H.L.). Chcielibyśmy podziękować dr Michaelowi Packowi i dr Jie He z University of Pennsylvania Zebrafish Core za udzielenie niezbędnego wsparcia.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 0,5% Phenol-Red | Sigma | P0290 | Kolorowy wskaźnik do wstrzykiwań |
| Morpholino | Genn Tools, LLC | (dostosowany) | Dostosowane zaprojektowane do interesującego genu |
| Wstępnie ciągnięta igła | Tritech Research | MINJ-PP | Jeśli wymagana jest duża ilość igły, możesz również kupić ściągacz do igieł i przygotować igłę w laboratorium |
| T7 mMessage Kit | Ambion | 1344 | Do transkrypcji in vitro w celu wytworzenia zamkniętego mRNA do eksperymentu ratunkowego |
| N-Phenylthiourea | Sigma | P7629 | Do zapobiegania melanizacji |
| Tricaine | Sigma | A5040 | Nazywany również 3-aminobenzoesanem etylu, do znieczulenia danio pręgowanego |
| Metyloceluloza | Sigma | M-0387 | Do pozycji danio pręgowanego |
| Zestaw do oczyszczania QIAquick PCR | Qiagen | 28104 | Do oczyszczania produktu PCR do syntezy RNA czape. |
| Mieszanka dNTP | Promega | U1511 | Do PCR |
| Tag Polimeraza DNA | Invitrogen | 10342-053 | Do |
| spektrofotometru PCR NanoDrop | Thermo Scientific | ND-1000 | Do pomiaru stężenia morfolina i RNA Sprężarka |
| powietrza | Werther International, Inc. | Panther Compact 106 | Źródło powietrza do wtrysku Pompa |
| mikroiniekcyjna Pico | World Precision Instruments Inc | PV830 Pnematic PicoPump | Można stosować inne rodzaje systemów mikroiniekcji. |
| Mikroproducent | World Precision Instruments Inc | MMJR | Praworęczny (MMJL dla leworęcznych) |
| Uchwyt igły | World Precision Instruments Inc | 5430-ALL | Do trzymania igły do mikromanipulacji |
| Pęseta Dumont | Drobne narzędzia chirurgiczne | 11253-20 | Do odłamywania końcówki igły |
| Mikroskop preparacyjny | Leica M205C | Do obserwacji i obrazowania zarodków danio pręgowanego | |
| Mikroskop fluorescencyjny | Zeiss Axio Obserer D1m | Do obrazowania przednercza danio pręgowanego | |
| Rurka kapilarna (średnica wewnętrzna 0,15 mm) | VitroCom | CV1525Q-100 | Do pomiaru objętości każdej wstrzykniętej kropli |
Bibliografia
- Choi, S. Y., et al. Cdc42 deficiency causes ciliary abnormalities and cystic kidneys. J Am Soc Nephrol. 24 (9), 1435-1450 (2013).
- Hostetter, C. L., Sullivan-Brown, J. L., Burdine, R. D. Zebrafish pronephros: a model for understanding cystic kidney disease. Dev Dyn. 228 (3), 514-522 (2003).
- Nyengaard, J. R., Bendtsen, T. F. Glomerular number and size in relation to age, kidney weight, and body surface in normal man. Anat Rec. 232 (2), 514-201 (1992).
- Keller, G., Zimmer, G., Mall, G., Ritz, E., Amann, K. Nephron number in patients with primary hypertension. N Engl J Med. 348 (2), 101-108 (2003).
- Cullen-McEwen, L. A., Kett, M. M., Dowling, J., Anderson, W. P., Bertram, J. F. Nephron number, renal function, and arterial pressure in aged GDNF heterozygous mice. Hypertension. 41 (2), 335-340 (2003).
- Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Kidney organogenesis in the zebrafish: insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 559-585 (2013).
- Igarashi, P. Overview: nonmammalian organisms for studies of kidney development and disease. J Am Soc Nephrol. 16 (2), 296-298 (2005).
- Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish. Am J Physiol Renal Physiol. 299 (5), 1040-1047 (2010).
- Liu, S., et al. A defect in a novel Nek-family kinase causes cystic kidney disease in the mouse and in zebrafish. Development. 129 (24), 5839-5846 (2002).
- Slanchev, K., Putz, M., Schmitt, A., Kramer-Zucker, A., Walz, G. Nephrocystin-4 is required for pronephric duct-dependent cloaca formation in zebrafish. Hum Mol Genet. 20 (16), 3119-3128 (2011).
- Huang, L., et al. The role of Wnt5a in prostate gland development. Dev Biol. 328 (2), 188-199 (2009).
- Andre, P., et al. The Wnt coreceptor Ryk regulates Wnt/planar cell polarity by modulating the degradation of the core planar cell polarity component Vangl2. J Biol Chem. 287 (53), 44518-44525 (2012).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Torres, V. E., Harris, P. C., Pirson, Y. Autosomal dominant polycystic kidney disease. Lancet. 369 (9569), 1287-1301 (2007).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
