Uzyskanie i charakterystyka wolnej od transgenów indukowanej przez człowieka pluripotencjalnej linii komórek macierzystych i konwersja do określonych stanów klinicznych

Podsumowanie

Opisujemy protokół wyprowadzania opartych na lentiwirusach, przeprogramowanych i scharakteryzowanych, bezczynnikowo indukowanych ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych i przekształcania ich w domniemane warunki kliniczne.

Streszczenie

Ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC) mogą być generowane za pomocą metodologii przeprogramowania opartej na lentiwirusach. Jednak ślady genów potencjalnie onkogennych pozostające w aktywnie transkrybowanych regionach genomu ograniczają ich potencjał do wykorzystania w zastosowaniach terapeutycznych u ludzi¹. Ponadto antygeny inne niż ludzkie, pochodzące z przeprogramowania lub różnicowania komórek macierzystych w pochodne istotne z terapeutycznego punktu widzenia, uniemożliwiają zastosowanie tych hiPSC w kontekście klinicznym u ludzi². W tym filmie przedstawiamy procedurę przeprogramowania i analizy hiPSC wolnych od czynników zewnętrznych. Te hiPSC mogą być następnie analizowane pod kątem nieprawidłowości ekspresji genów w specyficznym intronie zawierającym lentiwirusa. Analizę tę można przeprowadzić przy użyciu czułej ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), która ma przewagę nad mniej czułymi technikami stosowanymi wcześniej do wykrywania różnic w ekspresji genów³. Pełna konwersja do warunków dobrej praktyki wytwarzania (GMP) klasy klinicznej pozwala na kliniczne znaczenie dla ludzi. Nasz protokół oferuje inną metodologię – pod warunkiem, że obecne kryteria "bezpiecznej przystani" zostaną rozszerzone i obejmą charakteryzowane pochodne hiPSC do zastosowań terapeutycznych u ludzi – do wyprowadzania hiPSC klasy GMP, co powinno wyeliminować wszelkie ryzyko immunogenności spowodowane antygenami innymi niż ludzkie. Protokół ten ma szerokie zastosowanie do przeprogramowanych komórek lentiwirusowych dowolnego typu i zapewnia powtarzalną metodę przekształcania przeprogramowanych komórek w warunki klasy GMP.

Wprowadzenie

Wykazano, że dorosłe komórki ludzkie są zdolne do przechodzenia epigenetycznej przebudowy i przeprogramowania, w wyniku opartej na lentiwirusie ekspresji czterech kluczowych czynników transkrypcyjnych^4,5. Ważnym postępem w dziedzinie przeprogramowania było zastosowanie pojedynczej kasety z lentiwirusowymi komórkami macierzystymi (STEMCCA) podlegającej karetce, w której znajdowały się wszystkie cztery czynniki transkrypcyjne przeprogramowywania, co umożliwiło precyzyjny stosunek stechiometryczny ekspresji białka⁶. Dodatkowo, po transdukcji w określonej liczbie zakresów infekcji, STEMCCA może prowadzić głównie do pojedynczych zdarzeń integracji genomowej podczas procesu przeprogramowania⁷. Wprowadzenie akcyzowej wersji STEMCCA, która wykorzystuje technologię Cre/loxP, a następnie wycięcie wektora przeprogramowującego po wyprowadzeniu linii komórek macierzystych, umożliwiło wyprowadzenie linii indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC)^{bez czynników 8}. Ponadto, w celu zwiększenia zastosowań terapeutycznych hiPSC, konieczne było wdrożenie nowatorskiej, szybkiej i łatwej do zastosowania metodologii konwersji linii komórkowych klasy dobrej praktyki wytwarzania (GMP) z warunków zawierających ksenozę do warunków wolnych od ksenoterapii. W tym miejscu omawiamy odpowiednią metodologię, która dokładniej ocenia zintegrowane różnice w ekspresji genów, szczególnie po zintegrowaniu z intronem, oraz konwersję komórek klasy klinicznej do przypuszczalnych warunków GMP.

Poprzednie badania wykorzystywały tylko stosunkowo nieczułą analizę transkrypcyjną mikromacierzy do analizy różnic w ekspresji genów w zintegrowanych genach po transdukcji STEMCCA^3,9. W tym miejscu przedstawiamy metodologię czułej ilościowej analizy reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) w celu dalszego zbadania zintegrowanych różnic w ekspresji genów. Co ważne, obecne kryteria "bezpiecznej przystani" odrzucają hiPSC, które mają geny z integracją wirusową, ograniczając w ten sposób możliwość zastosowania tych komórek w dalszych terapiach komórkowych u ludzi⁹. Sugerujemy, że status quo może ulec zmianie przy użyciu w pełni scharakteryzowanych i wolnych od transgenów intronnie przeprogramowanych hiPSC. Dodatkowo wprowadzamy solidny protokół konwersji komórek klasy GMP, który można łatwo zastosować do wielu różnych typów komórek, które pierwotnie uzyskano w warunkach zawierających ksenotyp¹⁰. Stwarza to znaczące możliwości rozwoju przyszłych eksperymentów z przeprogramowywaniem komórek, które wymagają warunków klinicznych, aby zachować znaczenie terapeutyczne dla ludzi.

Te metodologie stanowią podstawę, na której obecne kryteria "bezpiecznej przystani" mogą zostać rozszerzone o scharakteryzowane przeprogramowane linie hiPSC STEMCCA, które utrzymują normalny profil ekspresji genów po wycięciu STEMCCA ze zintegrowanego intronu. Ponadto, pełna konwersja do warunków klinicznych, wolnych od antygenów zwierzęcych innych niż ludzie, pomoże włączyć znacznie więcej typów komórek, które wcześniej zostały przeprogramowane i scharakteryzowane tylko w warunkach zawierających kseno. Łączne te metodologie stanowią przekonującą podstawę dla amerykańskiej Agencji ds. Żywności i Leków (FDA) do rozważenia rozszerzenia swojego ograniczonego zatwierdzenia z terapii opartych na ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych (ESC) na terapie oparte na hiPSC¹¹.

Niedawno szczegółowo opisaliśmy wyprowadzenie wolnej od czynników linii hiPSC, która została w pełni scharakteryzowana i przekształcona w domniemane warunki kliniczne¹⁰. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół wyprowadzania hiPSC z wykorzystaniem lentiwirusa STEMCCA. Te komórki macierzyste są następnie poddawane procesowi wycinania, po którym następuje charakterystyka ekspresji genów. Na koniec hiPSC są przekształcane w warunki klasy GMP za pomocą metodologii powolnej konwersji.

Protokół

UWAGA: Ta metoda została użyta w badaniach opisanych w Awe et al.^{Rozdział 10}.

1. Przeprogramowanie fibroblastów skórnych dorosłego człowieka za pomocą STEMCCA

1. Rozmrażać dorosłe ludzkie fibroblasty skórne (HUF), pasaż 4 lub niższy, w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 2 minuty, uważając, aby nie zanurzyć górnej części fiolki w wodzie.
2. Umieścić 1 ml zawiesiny ludzkich fibroblastów w stożkowej fiolce o pojemności 15 ml i powoli umieścić 4 ml standardowej pożywki HUF, wstępnie podgrzanej do 37 °C, w sposób kroplami, w celu rozcieńczenia dimetylosulfotlenku (DMSO) i ponownego zawieszenia komórek.
3. Odwirować fiolkę przy 200 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w odpowiedniej objętości pożywki, aby utworzyć zawiesinę 100 000 komórek/ml, a następnie dodać 2 ml do jednego dołka sześciodołkowej płytki, wstępnie pokrytej przez 20 minut 0,2% żelatyną.
   UWAGA: Siostrzana studzienka z równą liczbą komórek na linię i warunkiem musi zostać zasiana w celu obliczenia zliczania komórek/wielokrotności infekcji (MOI).
4. Kołysz płytką na boki oraz w przód iw tył, aby równomiernie rozprowadzić komórki. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ w wilgotnym inkubatorze.
5. W dniu transdukcji należy pobrać liczbę komórek z siostrzanej studzienki (studzienek) siostrzanej po około 24 godzinach od wstępnego posiewu HUF.
6. Rozmrozić 2 x 10⁸ TU lub równoważny koncentrat lentiwirusowy (STEMCCA) i rozcieńczyć do 1 x 10⁸ TU/ml w pożywce HUF.
7. Transdukuj komórki w stosunku 10-MOI w pożywkach HUF uzupełnionych środkiem transfekcyjnym o stężeniu 8 μg/ml. Równomiernie wymieszać przebadane studzienki i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ w wilgotnym inkubatorze.
8. Około 24 godziny po transdukcji lentiwirusa należy zmienić pożywkę HUF na standardową pożywkę z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (PSC).
9. W dniach od 2 do 6 należy codziennie zmieniać pożywkę na pożywkę ludzką z PSC.
10. W dniu 6 umieść dwie 0,2% pokryte żelatyną 10-centymetrowe płytki o wymiarach od 1,5 do 1,75 x 10⁶ MEF pochodzących od myszy CF1 w pożywce HUF ¹².
11. W dniu 7, uważając, aby nie odwirować więcej niż 100 x g, użyj trypsyny w temperaturze pokojowej, aby usunąć przeprogramowane fibroblasty dnia 7 z jednego dołka płytki sześciodołkowej i przejść w stosunku 1:16, poprzez posiew wszystkich komórek równomiernie między dwiema 10-centymetrowymi płytkami, ze świeżymi ludzkimi pożywkami PSC, które zostały posiane MEF dzień wcześniej. Rozprowadzić agregaty komórek ruchem spiralnym zgodnie z ruchem wskazówek zegara i umieścić na noc w inkubatorze z wilgotnością 37 °C i 5% CO₂
.
12. Około 48 godzin po wysianiu przeprogramowanych komórek na MEF, a następnie każdego dnia, należy wymienić zużyte ludzkie pożywki PSC na świeże pożywki.
13. Po 3 do 4 tygodniach wybierz pojedyncze kolonie o typowej morfologii podobnej do ESC za pomocą igły o rozmiarze 21 i subklonuj do 24-dołkowej płytki, umieszczając około 8 do 10 pojedynczych kawałków określonych kolonii w indywidualnych dołkach na 24-dołkowej płytce pokrytej żelatyną o grubości 0,2%, wstępnie wysianej MEF pochodzącymi od myszy CF1 w ludzkim pożywce PSC.
    UWAGA: Po ekspansji wybranych kolonii, kolonie muszą zostać scharakteryzowane jako pluripotencjalne poprzez tworzenie ciała zarodkowego i analizę ekspresji markerów pluripotencji na poziomie białka.

2. Analiza miejsca integracji wektorów i wycinanie STEMCCA

1. Przeanalizuj miejsce integracji STEMCCA za pomocą nierestrykcyjnej amplifikacji liniowej PCR, jak opisano¹⁰.
2. Po wykonaniu testu w celu zapewnienia jednej integracji z pożądanym obszarem genomu, należy wyciąć STEMCCA poprzez odsysanie starej ludzkiej pożywki ESC. Następnie połączyć 45 μl skoncentrowanego wirusa Adeno-Cre-PuroR z 8 μg/ml środka do transfekcji w 3 ml standardowej pożywki PSC przez 24 godziny.
3. Po 24-godzinnym okresie inkubacji należy odessać mieszany supernatant wirusowy i dwukrotnie przemyć komórki ludzką pożywką PSC. Umieść świeżą ludzką pożywkę PSC wraz z 2 μg/ml puromycyny na okres 5 dni, codziennie zmieniając pożywkę na świeżą pożywkę i antybiotyk.
4. Po 5 dniach sklonuj pozostałe kolonie za pomocą igły o rozmiarze 21 do studzienek pokrytych żelatyną o grubości 0,2%, na 12-dołkowej płytce wstępnie pokrytej MEF pochodzącymi z myszy CF1 i rozpręż się, jak opisano powyżej.
   UWAGA: Po wystarczającym rozprężeniu w celu uzyskania zamrożonego materiału wymagane jest przełączenie na warunki wolne od karmienia. Spodziewaj się co najmniej 95% śmierci kolonii komórek macierzystych, ponieważ większość komórek nie zostanie pomyślnie przetransdukowana i ulegnie antybiotykowi w ciągu 5-dniowego okresu inkubacji. Chociaż Adeno-Cre-PuroR integruje się z wydajnością 0,001-1% z chromosomami gospodarza zakażonych komórek, ponowne wystawienie próbki kolonii wolnych od czynników na działanie puromycyny w celu zapewnienia 100% śmierci komórki potwierdzi, że nie nastąpiła integracja¹³.
5. Rozmrozić jedną fiolkę wstępnie podzielonego na lód podłoża komórkowego przez okres około 2 godzin (zalecenia producenta) do momentu, aż matryca stanie się cieczą i rozcieńczyć do końcowego stężenia 1:30 w zimnej pożywce podstawowej. Pokryj żądaną liczbę dołków na płytce sześciodołkowej po 1 ml na studzienkę. Odstawić w temperaturze pokojowej na 1 godzinę.
6. Zakreskuj krzyżowo (za pomocą igły o rozmiarze 18 lub szklanej lub plastikowej "końcówki") co najmniej 20 do 30 kolonii ze studni uprzednio pokrytej MEF. Uważaj, aby zmniejszyć uniesienie MEF i przeniesienie z talerza.
   1. Urządzenie do kreskowania krzyżowego można wygenerować na wiele różnych sposobów, od bardziej skomplikowanego podgrzewania, wyciągania i wykańczania szklanej pipety Pasteura na otwartym ogniu, po proste użycie sterylnej plastikowej końcówki do pipety lub, jak w naszym przypadku, igieł o rozmiarze 21 i/lub 18.
7. Po inkubacji odessać matrycę z powleczonej studni.
8. Usunąć kawałki kolonii przez delikatne zeskrobanie ze starej płytki za pomocą pipetora o pojemności 200 μl i ostrożnie umieścić w 3 ml świeżej pożywki połączonej 1 na płytce pokrytej matrycą. Inkubować przez noc w inkubatorze z wilgotnością 37 °C i 5% CO_{2 .} Zmień nośnik 48 godzin po pasażu.
9. Ekstrakcja genomowego DNA z przetworzonych hiPSC po wycięciu i bez podawania, przy ponad 80% konfluencji, przy użyciu komercyjnych zestawów do ekstrakcji DNA.
10. Analizuj pod kątem prawidłowego wycięcia za pomocą starterów specyficznych dla egzogennych integracji lentiwirusa STEMCCA: gDNA-hendo-MycS-naprzód, 5′-acgagcacaagctcacctct-3′; gDNA-hWPRE-reverse, 5′-tcagcaaacagtgcacacc-3′. Rozpuść liofilizowane startery w wodzie klasy PCR do roztworu podstawowego 10 μM.
11. Przeprowadzić PCR z następującym pięcioetapowym protokołem: początkowa denaturacja w temperaturze 95 °C przez 3 minuty; 35 cykli każdego z poniższych: denaturacja w temperaturze 98 °C przez 20 sekund, wyżarzanie startera w temperaturze 62 °C przez 15 sekund i przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 15 sekund, a następnie końcowe przedłużenie w jednym cyklu w temperaturze 72 °C przez 3 minuty.
12. Przygotuj 3% żel agarozowy, ważąc 1,5 grama agarozy i umieszczając go w 50 ml 1x buforu Tris-acetate-EDTA. Kuchenkę mikrofalową, aż agaroza się rozpuści i umieść w barwieniu żelu DNA w odpowiednim rozcieńczeniu, wymieszaj i dozuj odpowiednią objętość do kasety żelowej, aby zestalić się na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
13. Załaduj 12 μl produktu PCR zmieszanego z 3 μl barwnika ładującego do 3% żelu agarozowego. Uruchom żel na 30 minut przy napięciu 80 V.
14. Wizualizuj za pomocą światła ultrafioletowego brak pasma wskazującego na prawidłowe wycięcie.

3. Kwantyfikacja różnic w ekspresji genów za pomocą ilościowego PCR z hiPSC przed i po wycięciu

1. Ekstrakcja całkowitego RNA z przetworzonych hiPSC po wycięciu i bez podawania za pomocą komercyjnych zestawów do ekstrakcji RNA.
2. Odwrotna transkrypcja do 1 μg całkowitego RNA przy użyciu komercyjnych zestawów zgodnie z instrukcjami producenta. Użyj zakotwiczonych oligo(dT)₁₈ i losowych starterów heksamerowych.
   UWAGA: Upewnij się, że protokół PCR jest dostosowany do transkryptów genów o wielkości większej lub mniejszej niż 4 kb. Konieczne będzie wykonanie specjalnych starterów dla dowolnego genu, z którym STEMCCA jest pierwotnie zintegrowany.
3. Rozpuść liofilizowany starter w wodzie klasy PCR do roztworu podstawowego o stężeniu 20 μM.
4. Użyj 5 ng próbki na 20 μl reakcji, która składa się z sondy UPL 10 μM, 2x LightCycler 480 Probes Master oraz 20 μM starterów do przodu i do tyłu.

4. Konwersja do warunków klasy GMP

1. W pierwszym dniu po przejściu hiPSC po wycięciu do warunków klasy GMP, należy przygotować mieszankę pożywek składającą się z pożywek złożonych z pożywek złożonych PSC dla ludzi 1 (pożywka kombinowana 1) i pożywki zgodnej z dobrą praktyką wytwarzania (GMP) klasy klinicznej (pożywka kombinowana 2) w proporcji 80:20.
2. Odessać starą pożywkę pożywkę pożywką 1 i umieścić w niej 3 ml nowej pożywki złożonej 1 i 2, wstępnie podgrzanej, w stosunku 80:20. Zmieniaj media codziennie przez 3 dni z tym konkretnym stosunkiem. Umieścić komórki z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO_{2 .}
3. W dniu 4 ułóż połączone podłoża 1 i 2 w stosunku 50:50. Odessać starą pożywkę i zastąpić ją wstępnie podgrzaną pożywką, z pożywką połączoną 1 i 2 w stosunku 50:50. Zmieniaj media na 3 dni przy tym określonym stosunku. Umieścić komórki z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO_{2 .}
4. W dniu 7 ułóż połączone podłoża 1 i 2 w proporcji 20:80. Odessać starą pożywkę i zastąpić ją wstępnie podgrzaną pożywką, z pożywkami połączonymi 1 i 2 w proporcji 20:80. Zmieniaj media na 3 dni przy tym określonym stosunku. Umieścić komórki z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO_{2 .}
5. W dniu 10 przygotuj połączone pożywki 1 i 2 w stosunku 0:100. Odessać starą pożywkę i zastąpić ją wstępnie podgrzaną pożywką, z pożywką połączoną 1 i 2 w stosunku 0:100. Zmieniaj media codziennie w tym konkretnym stosunku. Komórki znajdują się teraz w całkowicie zdefiniowanym podłożu wolnym od kseno. Umieścić komórki z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5%_CO2.
   UWAGA: Podczas całego procesu konwersji konieczne jest rutynowe pasażowanie za pomocą igły o rozmiarze 18, aby utrzymać odpowiednią wielkość i gęstość kolonii. Zaplanuj pasażowanie komórek co 4 do 5 dni na podstawie wielkości kolonii, konfluencji i różnicowania.
6. Pokryj jedną studzienkę w płytce sześciodołkowej określonym substratem wolnym od kseno, zgodnie z zaleceniami producenta.
7. Mechanicznie przeprowadź zlewającą się studzienkę, już przekształconą w warunki wolne od ksenoizolacji, z sześciodołkowej płytki za pomocą igły o rozmiarze 18. Co ważne, umieść nowe podłoża (pożywki kombinowane 2) na komórkach z 1x inhibitorem ROCK na 1 godzinę, przed pasażowaniem w celu wstępnego kondycjonowania pożywki.
8. Odessać roztwór syntetycznego substratu z nowej płytki, na którą przenoszone są komórki. Usuń wszystkie podłoża zawierające grudki komórek macierzystych ze starej płytki i przenieś na nową płytkę.
9. Umieść komórki z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO₂ na 2 dni przy minimalnych zakłóceniach fizycznych (najlepiej płytki po wejściu do inkubatora nie są w żaden sposób bezpośrednio dotykane), aby umożliwić maksymalne przywiązanie.
   UWAGA: Ogniwa będą wymagały codziennej wymiany nośników. Ważne będzie ciągłe pasażowanie co 4 dni. Za pomocą igły o rozmiarze 21 przejdź tylko te części kolonii, które mają optymalną morfologię podobną do ESC (wysoki stosunek nukleocytoplazmatyczny). Zapewni to selekcję odpowiednich kolonii hiPSC, które będą dobrze rosły i ostatecznie dały jednorodne kolonie. Całkowity czas do wyprowadzenia kolonii podobnych do ESC wynosi od 15 do 20 dni po początkowej połączonej zmianie pożywki.
10. Zamrozić po wycięciu hiPSC klasy GMP, najpierw kreskując wszystkie kolonie za pomocą igły o rozmiarze 18. Za pomocą pipetora o pojemności 200 μl pobrać wszystkie kawałki i przenieść wszystkie podłoża zawierające komórki do stożkowej fiolki o pojemności 15 ml i odwirować przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
11. Podczas wirowania komórek należy przygotować pożywkę do zamrażania składającą się z równych objętości zimnej pożywki złożonej 2 i pożywki do zamrażania o końcowym stężeniu DMSO 7,5%.
12. Po granulowaniu komórek odessać stare podłoże i kroplami ponownie zawiesić osad za pomocą pożywki do zamrażania. Natychmiast przenieść do fiolek do zamrażania i umieścić w zamrażarce o temperaturze -80 °C.

5. Charakterystyka poprodukcyjnych hiPSC klasy GMP

1. Aby zapewnić prawidłową ekspresję markerów pluripotencji po konwersji, należy użyć QPCR do ilościowego określenia ekspresji kluczowych markerów pluripotencji (SOX2, OCT4 i NANOG) przy użyciu starterów wymienionych w tabeli 1 z tymi samymi krokami, jak wspomniano w kroku 3. Metodologie QPCR wykonują te same kroki, które wymieniono w kroku 3.
2. Za pomocą cytometrii przepływowej wykryć kwas sjalowy Neu5Gc (kwas N-glikolyloneuraminowy) zgodnie ze standardowymi warunkami wymienionymi w zestawie, jak wcześniej opublikowano¹⁰.
3. Delikatnie umyj płytki z kulturami komórkowymi za pomocą 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
4. Zdysocjuj kolonie za pomocą 1x odczynnika dysocjacyjnego przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
5. Podczas 5-minutowego czasu inkubacji, o którym mowa w kroku 5.4, przygotuj roztwór blokujący (dostarczony w zestawie), wytwarzając 0,5% środek blokujący w lodowatym PBS.
6. Oznaczyć następujący zestaw probówek do analizy cytometrii przepływowej: Niebarwione; 4′,6-diamidyno-2-fenyloindol (DAPI) DAPI; Przeciwciało kontrolne 1:200; Przeciwciało pierwszorzędowe 1:200; Przeciwciało drugorzędowe 1:200 IgG przeciwko kurczakom osła (H+L); Przykładowe MEF-y; Próbka komórek po wycięciu na matrycy; i Próbka komórek po wycięciu na podłożu syntetycznym.
7. Delikatnie usunąć agregaty komórkowe z kroku 5.4, dodając 2 ml roztworu blokującego i przenieść zawartość do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Wirować przy 80 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
8. Przemyć komórki dwukrotnie roztworem blokującym i odwirować, jak podano w kroku 5.7.
9. Delikatnie zawiesić około 1 x 10⁶ komórek w 100 μl roztworu blokującego z odpowiednią objętością rozcieńczenia każdego przeciwciała. Inkubować z delikatnym kołysaniem w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę.
10. Powtórz pranie trzy razy, jak w kroku 5.8.
11. Ponownie zawiesić osad komórkowy w 400 μl buforu rozcieńczalnika (z zestawu) z 1:100 DAPI dla probówek 2, 6, 7 i 8, jak podano w kroku 5.6.
12. Przecedzić komórki przez sitko 40 μM i przepuścić przez cytometr przepływowy.

Wyniki

Przedstawiamy protokół otrzymywania hiPSC klasy klinicznej, wolnych od czynników, z wykorzystaniem metody reprogramowania opartej na lentiwirusie STEMCCA. Rycina 1A przedstawia reprezentacyjny obraz trzech różnych linii hiPSC po wycięciu transgenów, po reprogramowaniu metodą STEMCCA na warstwie MEF. Główną zaletą podejścia STEMCCA jest powtarzalność sukcesu reprogramowania osiągana przez wielu naukowców w różnych grupach badawczych i lokalizacjach. Rycina 1B przedstawia żel po odwrotnej ...

Dyskusja

Opisujemy metodologię wyprowadzania hiPSC wolnych od czynników i nadawania im znaczenia klinicznego poprzez przekształcanie tych komórek w warunki klasy GMP w celu dalszego różnicowania komórek w przyszłych terapiach dla ludzi. Chociaż protokół ten ma szerokie zastosowanie do różnych typów komórek, zdecydowaliśmy się przeprogramować ludzkie fibroblasty skórne ze względu na łatwość ekstrakcji od pacjenta i możliwość ich zastosowania w spersonalizowanych terapiach dla ludzi. Po usunięciu ograniczeń w zakresie pełnego różni...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Pożywki i odczynniki
DMEM/F12 (podłoże podstawowe)	Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)	11330057
Surowica bydlęca	płodu Invitrogen	16000044
Minimum essential medium (MEM) aminokwasy endogenne (NEAA), 100x	Invitrogen	11140050
Glutamax, 100x	Invitrogen	35050-061
PenStrep, penicylina-streptomycyna, 100x	Invitrogen	15140-122	Rozmrażanie w 4 &stopni; C, podwielokrotność i przechowywać w − 20 &stopni; C
Zamiennik serum nokautującego	Invitrogen	10828028	Rozmrażanie w 4 &stopniach; C, podwielokrotność i przechowywać w − 20 &stopni; C
Trypsyna / EDTA, 0,5%	Invitrogen	15400-054	Rozcieńczyć zapas do 0,05% w 1x PBS
Podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów	GlobalStem (Rockville, MD, USA)	GSR-2001	Repuszcza do 10 &mikro; g/ml zapasu w 0,1% albuminy surowicy bydlęcej rozpuszczonej w 1x PBS i przechowywać w temperaturze − 80 stopni Celsjusza; C
β-merkaptoetanol	Millipore (Billerica, MA, USA)	ES-007-E
Matrigel (matryca błony podstawnej)	BD Biosciences (San Jose, CA, USA)	356231	Rozcieńczyć fiolkę Matrigel w 10 ml DMEM/F12 na lodzie w celu rozcieńczenia 1:2. Podwielokrotność i przechowywać w − 20 stopni Celsjusza.
CELLstart (Podłoże syntetyczne)	Invitrogen	A1014201
Stemmolecule Y27632	Stemgent (Cambridge, MA, USA)	04-0012-02
Puromycin	Invitrogen	A1113802
LightCycler 480 Probes Master	Roche (Bazylea, Szwajcaria)	4707494001
ProFreeze-CDM Medium/medium do zamrażania	Lonza (Bazylea, Szwajcaria)	12-769E
Dimetylosulfotlenek	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	D8418
PBS	Invitrogen	14190-250
100 BP DNA Ladder	Invitrogen	15628019
SYBR Bezpieczny barwnik żelowy DNA 10,000x	Invitrogen	S33102
Agarose	Bio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, CA, USA)	161-3101
Żelatyna ze skóry wieprzowej	Sigma-Aldrich	G1890-100G	Sporządzić zapas w stężeniu 0,2% w PBS, autoklawie i przechowywać w temperaturze pokojowej.
mTeSR1	StemCell Technologies (Vancouver, BC, Kanada)	5850	Połącz suplement 5x z podłożem podstawowym, podwielokrotnością i przechowuj w temperaturze 4 stopni; C do 2 tygodni.
Stemedia NutriStem XF/FF Pożywka	Stemgent	05-100-1A	Rozmrozić w 4 & stopniach; C O/N, podwielokrotność i przechowywać w temperaturze 4 & deg; C do 2 tygodni.
Primocin	InvivoGen (San Diego, CA, USA)	ant-pm-1
Accutase (odczynnik dysocjacyjny)	Invitrogen	A1110501
Donkey anty-Chicken IgG AlexaFluor 488	Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA, USA)	703-546-155
Polybrene/środek transfekcyjny	Millipore	TR-1003-G
Plasticware
12-dołkowe płytki	VWR (West Chester, PA, USA)	29442-038
Płytki 6-dołkowe	VWR	29442-042
Płytki 10-centymetrowe	Igła Sigma-Aldrich	Z688819
o rozmiarze 18 Fisher	Scientific (Pittsburgh, PA, USA)	148265D
Igła o rozmiarze 21 Fisher	Scientific	14-829-10D
Equipment
BD LSRII Cytometr przepływowy	KSystem firmy Nikon (Tokio, Japonia)
BD FACSDiva Wersja 6.1.3 Oprogramowanie	BD Biosciences
Kits
PureLink Genomic DNA Mini Kit	Invitrogen	K182000
Zestaw do PCR KAPA HiFi Hotstart ReadyMix	KAPA Biosystems (Wilmington, MA, USA)	KK2601
Zestaw do syntezy pierwszej nici cDNA z transkryptorem	Roche	4379012001
Sialix Anti-Neu5Gc Basic Pack Kit	Sialix (Newton, MA, USA)	Pakiet
Media
	Stemgent		Składa się w równych częściach z mTeSR1 i Nutristem
Combined media 2	StemCell Technologies i Stemgent		Składa się z równych części TeSR2 i Nutristem
HUF Media			Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s medium / F12 [DMEM / F12] uzupełniony o 10% płodową surowicę bydlęcą, 1x aminokwasy endogenne, 1x Glutamax i 1x Primocin
Human Pluripotent Stem Cell Media			DMEM / F12 uzupełnione o 20% zamiennik surowicy nokautującej, 1x Glutamax, 1x aminokwasy endogenne, 1x Primocin, 1x β-merkaptoetanol i 10 ng / ml zasadowego czynnika wzrostu fibroblastów.
DMEM/F12, Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s średni/F12; PBS, sól fizjologiczna buforowana fosforanami.