Opisujemy protokół wyprowadzania opartych na lentiwirusach, przeprogramowanych i scharakteryzowanych, bezczynnikowo indukowanych ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych i przekształcania ich w domniemane warunki kliniczne.
Artykuł metodologiczny
Opisujemy protokół wyprowadzania opartych na lentiwirusach, przeprogramowanych i scharakteryzowanych, bezczynnikowo indukowanych ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych i przekształcania ich w domniemane warunki kliniczne.
Ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC) mogą być generowane za pomocą metodologii przeprogramowania opartej na lentiwirusach. Jednak ślady genów potencjalnie onkogennych pozostające w aktywnie transkrybowanych regionach genomu ograniczają ich potencjał do wykorzystania w zastosowaniach terapeutycznych u ludzi1. Ponadto antygeny inne niż ludzkie, pochodzące z przeprogramowania lub różnicowania komórek macierzystych w pochodne istotne z terapeutycznego punktu widzenia, uniemożliwiają zastosowanie tych hiPSC w kontekście klinicznym u ludzi2. W tym filmie przedstawiamy procedurę przeprogramowania i analizy hiPSC wolnych od czynników zewnętrznych. Te hiPSC mogą być następnie analizowane pod kątem nieprawidłowości ekspresji genów w specyficznym intronie zawierającym lentiwirusa. Analizę tę można przeprowadzić przy użyciu czułej ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), która ma przewagę nad mniej czułymi technikami stosowanymi wcześniej do wykrywania różnic w ekspresji genów3. Pełna konwersja do warunków dobrej praktyki wytwarzania (GMP) klasy klinicznej pozwala na kliniczne znaczenie dla ludzi. Nasz protokół oferuje inną metodologię – pod warunkiem, że obecne kryteria "bezpiecznej przystani" zostaną rozszerzone i obejmą charakteryzowane pochodne hiPSC do zastosowań terapeutycznych u ludzi – do wyprowadzania hiPSC klasy GMP, co powinno wyeliminować wszelkie ryzyko immunogenności spowodowane antygenami innymi niż ludzkie. Protokół ten ma szerokie zastosowanie do przeprogramowanych komórek lentiwirusowych dowolnego typu i zapewnia powtarzalną metodę przekształcania przeprogramowanych komórek w warunki klasy GMP.
Wykazano, że dorosłe komórki ludzkie są zdolne do przechodzenia epigenetycznej przebudowy i przeprogramowania, w wyniku opartej na lentiwirusie ekspresji czterech kluczowych czynników transkrypcyjnych4,5. Ważnym postępem w dziedzinie przeprogramowania było zastosowanie pojedynczej kasety z lentiwirusowymi komórkami macierzystymi (STEMCCA) podlegającej karetce, w której znajdowały się wszystkie cztery czynniki transkrypcyjne przeprogramowywania, co umożliwiło precyzyjny stosunek stechiometryczny ekspresji białka6. Dodatkowo, po transdukcji w określonej liczbie zakresów infekcji, STEMCCA może prowadzić głównie do pojedynczych zdarzeń integracji gen....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
UWAGA: Ta metoda została użyta w badaniach opisanych w Awe et al.Rozdział 10.
1. Przeprogramowanie fibroblastów skórnych dorosłego człowieka za pomocą STEMCCA
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedstawiamy protokół otrzymywania hiPSC klasy klinicznej, wolnych od czynników, z wykorzystaniem metody reprogramowania opartej na lentiwirusie STEMCCA. Rycina 1A przedstawia reprezentacyjny obraz trzech różnych linii hiPSC po wycięciu transgenów, po reprogramowaniu metodą STEMCCA na warstwie MEF. Główną zaletą podejścia STEMCCA jest powtarzalność sukcesu reprogramowania osiągana przez wielu naukowców w różnych grupach badawczych i lokalizacjach. Rycina 1B przedstawia żel po odwrotnej .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Opisujemy metodologię wyprowadzania hiPSC wolnych od czynników i nadawania im znaczenia klinicznego poprzez przekształcanie tych komórek w warunki klasy GMP w celu dalszego różnicowania komórek w przyszłych terapiach dla ludzi. Chociaż protokół ten ma szerokie zastosowanie do różnych typów komórek, zdecydowaliśmy się przeprogramować ludzkie fibroblasty skórne ze względu na łatwość ekstrakcji od pacjenta i możliwość ich zastosowania w spersonalizowanych terapiach dla ludzi. Po usunięciu ograniczeń w zakresie pełnego różni.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
James A. Byrne (JAB) i Agustin Vega-Crespo otrzymują fundusze na badania od Fibrocell Science, Inc. JAB jest konsultantem naukowym Fibrocell Science, Inc. Żaden inny autor nie ma żadnych konkurencyjnych interesów do ujawnienia.
Chcielibyśmy podziękować Patrickowi C. Lee, Cyrilowi Ramathalowi i Saravananowi Karumbayaramowi (SK) za pomoc w przeprowadzeniu eksperymentów z wyprowadzaniem i charakteryzacją iPSC; Aaronowi Cooperowi za przeprowadzenie eksperymentów z analizą iPSC; Vittorio Sebastiano i Renee A. Reijo Pera za kierowanie początkowymi pracami nad przeprogramowaniem; SK, Williamowi E. Lowry'emu, Jerome'owi A. Zackowi i Donaldowi B. Kohnowi za kierowanie utworzeniem obiektów GMP UCLA, pozwalających na konwersję i charakterystykę iPSC klasy klinicznej; Gustavo Mostoslavsky'emu za dostarczenie nam policistronicznego wektora przeprogramowania STEMCCA. Praca ta opiera się na współpracy bada....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Pożywki i odczynniki | |||
| DMEM/F12 (podłoże podstawowe) | Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) | 11330057 | |
| Surowica bydlęca | płodu Invitrogen | 16000044 | |
| Minimum essential medium (MEM) aminokwasy endogenne (NEAA), 100x | Invitrogen | 11140050 | |
| Glutamax, 100x | Invitrogen | 35050-061 | |
| PenStrep, penicylina-streptomycyna, 100x | Invitrogen | 15140-122 | Rozmrażanie w 4 &stopni; C, podwielokrotność i przechowywać w − 20 &stopni; C |
| Zamiennik serum nokautującego | Invitrogen | 10828028 | Rozmrażanie w 4 &stopniach; C, podwielokrotność i przechowywać w − 20 &stopni; C |
| Trypsyna / EDTA, 0,5% | Invitrogen | 15400-054 | Rozcieńczyć zapas do 0,05% w 1x PBS |
| Podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów | GlobalStem (Rockville, MD, USA) | GSR-2001 | Repuszcza do 10 &mikro; g/ml zapasu w 0,1% albuminy surowicy bydlęcej rozpuszczonej w 1x PBS i przechowywać w temperaturze − 80 stopni Celsjusza; C |
| β-merkaptoetanol | Millipore (Billerica, MA, USA) | ES-007-E | |
| Matrigel (matryca błony podstawnej) | BD Biosciences (San Jose, CA, USA) | 356231 | Rozcieńczyć fiolkę Matrigel w 10 ml DMEM/F12 na lodzie w celu rozcieńczenia 1:2. Podwielokrotność i przechowywać w − 20 stopni Celsjusza. |
| CELLstart (Podłoże syntetyczne) | Invitrogen | A1014201 | |
| Stemmolecule Y27632 | Stemgent (Cambridge, MA, USA) | 04-0012-02 | |
| Puromycin | Invitrogen | A1113802 | |
| LightCycler 480 Probes Master | Roche (Bazylea, Szwajcaria) | 4707494001 | |
| ProFreeze-CDM Medium/medium do zamrażania | Lonza (Bazylea, Szwajcaria) | 12-769E | |
| Dimetylosulfotlenek | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | D8418 | |
| PBS | Invitrogen | 14190-250 | |
| 100 BP DNA Ladder | Invitrogen | 15628019 | |
| SYBR Bezpieczny barwnik żelowy DNA 10,000x | Invitrogen | S33102 | |
| Agarose | Bio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, CA, USA) | 161-3101 | |
| Żelatyna ze skóry wieprzowej | Sigma-Aldrich | G1890-100G | Sporządzić zapas w stężeniu 0,2% w PBS, autoklawie i przechowywać w temperaturze pokojowej. |
| mTeSR1 | StemCell Technologies (Vancouver, BC, Kanada) | 5850 | Połącz suplement 5x z podłożem podstawowym, podwielokrotnością i przechowuj w temperaturze 4 stopni; C do 2 tygodni. |
| Stemedia NutriStem XF/FF Pożywka | Stemgent | 05-100-1A | Rozmrozić w 4 & stopniach; C O/N, podwielokrotność i przechowywać w temperaturze 4 & deg; C do 2 tygodni. |
| Primocin | InvivoGen (San Diego, CA, USA) | ant-pm-1 | |
| Accutase (odczynnik dysocjacyjny) | Invitrogen | A1110501 | |
| Donkey anty-Chicken IgG AlexaFluor 488 | Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA, USA) | 703-546-155 | |
| Polybrene/środek transfekcyjny | Millipore | TR-1003-G | |
| Plasticware | |||
| 12-dołkowe płytki | VWR (West Chester, PA, USA) | 29442-038 | |
| Płytki 6-dołkowe | VWR | 29442-042 | |
| Płytki 10-centymetrowe | Igła Sigma-Aldrich | Z688819 | |
| o rozmiarze 18 Fisher | Scientific (Pittsburgh, PA, USA) | 148265D | |
| Igła o rozmiarze 21 Fisher | Scientific | 14-829-10D | |
| Equipment | |||
| BD LSRII Cytometr przepływowy | KSystem firmy Nikon (Tokio, Japonia) | ||
| BD FACSDiva Wersja 6.1.3 Oprogramowanie | BD Biosciences | ||
| Kits | |||
| PureLink Genomic DNA Mini Kit | Invitrogen | K182000 | |
| Zestaw do PCR KAPA HiFi Hotstart ReadyMix | KAPA Biosystems (Wilmington, MA, USA) | KK2601 | |
| Zestaw do syntezy pierwszej nici cDNA z transkryptorem | Roche | 4379012001 | |
| Sialix Anti-Neu5Gc Basic Pack Kit | Sialix (Newton, MA, USA) | Pakiet | |
| Media | |||
| Stemgent | Składa się w równych częściach z mTeSR1 i Nutristem | ||
| Combined media 2 | StemCell Technologies i Stemgent | Składa się z równych części TeSR2 i Nutristem | |
| HUF Media | Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s medium / F12 [DMEM / F12] uzupełniony o 10% płodową surowicę bydlęcą, 1x aminokwasy endogenne, 1x Glutamax i 1x Primocin | ||
| Human Pluripotent Stem Cell Media | DMEM / F12 uzupełnione o 20% zamiennik surowicy nokautującej, 1x Glutamax, 1x aminokwasy endogenne, 1x Primocin, 1x β-merkaptoetanol i 10 ng / ml zasadowego czynnika wzrostu fibroblastów. | ||
| DMEM/F12, Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s średni/F12; PBS, sól fizjologiczna buforowana fosforanami. | |||
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE
Poproś o pozwolenie