Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Produkcja i wykorzystanie lentiwirusa do selektywnej transdukcji pierwotnych komórek prekursorowych oligodendrocytów do testów mielinizacji in vitro

14.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52179

⸱

12 stycznia 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Anatomy and Neuroscience, The University of Melbourne, 2The Florey Institute of Neuroscience and Mental Health Research, The University of Melbourne

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokoły, które oferują elastyczną i strategiczną podstawę do wirusowego manipulowania komórkami prekursorowymi oligodendrocytów w celu nadekspresji interesujących białek w celu specyficznego zbadania ich roli w oligodendrocytach za pomocą modelu mielinizacji ośrodkowego układu nerwowego in vitro.

Streszczenie

Mielinizacja to złożony proces, który obejmuje zarówno neurony, jak i mielinę, tworząc komórki glejowe, oligodendrocyty w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) i komórki Schwanna w obwodowym układzie nerwowym (PNS). Używamy testu mielinizacji in vitro, uznanego modelu do badania mielinizacji OUN in vitro. W tym celu komórki prekursorowe oligodendrocytów (OPC) są dodawane do oczyszczonych pierwotnych neuronów zwoju korzenia grzbietowego gryzoni (DRG) w celu utworzenia mielinizujących się kokultur. W celu szczegółowego zbadania ról, jakie poszczególne białka wyrażane przez oligodendrocyty odgrywają w mielinizacji, opracowaliśmy protokoły, które selektywnie transdukują OPC przy użyciu lentiwirusa z nadekspresją białek dzikich, konstytutywnie aktywnych lub dominujących ujemnych przed ich wysiewem do neuronów DRG. To pozwala nam na szczegółowe zbadanie roli tych oligodendroglialnych białek w regulacji mielinizacji. Protokoły mogą być również stosowane w badaniu innych typów komórek, zapewniając w ten sposób podejście, które umożliwia selektywną manipulację białkami wyrażanymi przez pożądany typ komórek, takich jak oligodendrocyty, w celu ukierunkowanego badania mechanizmów sygnalizacji i kompensacji. Podsumowując, połączenie testu mielinizacji in vitro z OPC zakażonymi lentiwirusem stanowi strategiczne narzędzie do analizy mechanizmów molekularnych zaangażowanych w mielinizację.

Wprowadzenie

Mielinizacja aksonów jest kluczowa dla szybkiego i efektywnego przekazywania potencjałów czynnościowych zarówno w ośrodkowym, jak i obwodowym układzie nerwowym. Wyspecjalizowane komórki, komórki Schwanna w obwodowym układzie nerwowym i oligodendrocyty w ośrodkowym układzie nerwowym, owijają się wokół i otaczają aksony mieliną, skutecznie izolując nerw i ułatwiając przewodnictwo solne1. Proces mielinizacji można badać in vitro przy użyciu neuronów zwojowych siatkówki2, zmodyfikowanych nanowłókien3 lub neuronów zwoju grzbietowego korzenia współhodowanych z komórkami Schwanna4 lub oligodendrocytami5-7. Test mielinizacji in vitro jest uznanym modelem do badania mielinizacji układu nerwowego i replikuje wiele podstawowych procesów zachodzących podczas mielinizacji in vivo5-8. Test polega na kokulturze oczyszczonych populacji neuronów zwoju korzenia grzbietowego (DRG) z OPC (dla mielinizacji OUN) lub komórkami Schwanna (dla mielinizacji PNS). W określonych warunkach te mielinizujące się komórki otaczają aksony DRG w uporządkowanym, ultra strukturalnie zweryfikowanym, wielopłytkowym arkuszu izolującej błony plazmatycznej, która wyraża ten sam zestaw białek specyficznych dla mieliny obecnych in vivo.

Najczęściej używanym modelem komórkowym do badania mielinizacji OUN in vitro są kokultury neuronów DRG i OPC, które zostały z powodzeniem wykorzystane do badania wpływu czynników egzogennych, takich jak neurotrofiny, na mielinizację OUN in vitro5,6. Czynniki egzogenne, takie jak czynniki wzrostu lub małocząsteczkowe inhibitory farmakologiczne, są szeroko stosowane do badania roli szlaków sygnałowych w mielinizacji przy użyciu modelu kokultury DRG-OPC7,9. Jednak w mieszanych warunkach kohodowlanych, które zawierają zarówno neurony, jak i oligodendrocyty, formalnie możliwe było, że czynniki wzrostu lub inhibitory farmakologiczne mogły wywierać wpływ zarówno na neurony DRG, jak i oligodendrocyty (OL). Daje to możliwość specyficznego przeanalizowania ról, jakie białka wyrażane tylko przez DRG lub oligodendroglia wywierają na mielinizację przy użyciu tego podwójnego systemu komórkowego. Aby jednoznacznie potwierdzić, że szlak sygnałowy w oligodendroglialu bezpośrednio reguluje mielinizację, transdukcja lentiwirusowa OPC, przed wysiewem do neuronów DRG w teście mielinizacji in vitro, okazała się eleganckim sposobem na nadekspresję zarówno białek typu dzikiego, jak i zmutowanych, a także na obniżenie ekspresji konstytutywnie wyrażanych białek przez oligodendrocyty. W związku z tym podejście to oferuje drogę do specyficznego badania i manipulowania szlakami sygnałowymi w oligodendrocytach w celu badania mielinizacji9,10.

W tym artykule opisujemy metody, które opracowaliśmy w celu selektywnej nadekspresji interesującego białka w oligodendrocytach za pomocą podejścia lentiwirusowego do badania mielinizacji in vitro. Technika rozpoczyna się od wygenerowania wektorów ekspresyjnych zawierających interesujący gen, niezależnie od tego, czy jest to typ dziki, konstytutywnie aktywna lub dominująca forma ujemna, które są następnie klonowane do wektora pENTR (pENTR L1-L2 pENTR4IRES2GFP). Ten wektor (zawierający interesujący gen), dawca promotora CMV (pENTR L4-R1 pENTR-pDNOR-CMV) i lentiwektor 2K7 są łączone w reakcji enzymatycznej w celu wytworzenia wektora 2K7 zawierającego promotor CMV, gen będący przedmiotem zainteresowania, wewnętrzne rybosomalne miejsce wejścia i GFP (ryc. 1). Ten sklonowany przez Gateway konstrukt 2K7 w połączeniu z PMD2. Otoczka wirusa G i pakiet wirusa pBR8.91 mogą być kotransfekowane do komórek HEK293T w celu wytworzenia lentiwirusa, który może być następnie wykorzystany do transdukcji OPC. Po zakażeniu lentiwirusem OPC wyrażają wysoki poziom białka będącego przedmiotem zainteresowania. Te OPC mogą być następnie wysiewane w kulturach neuronów DRG i można zbadać wpływ, jaki ekspresja wysokiego poziomu pożądanego białka wywiera na mielinizację. Kokultury są oceniane pod kątem ekspresji białka mieliny za pomocą analizy western blot i wizualizowane pod kątem tworzenia mielinizowanych segmentów aksonalnych za pomocą immunocytochemii.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Wszystkie zwierzęta wykorzystane w tym badaniu były obu płci i hodowane w zapleczach dla zwierząt w Departamencie Anatomii i Patologii oraz w Instytucie Neurobiologii i Badań nad Zdrowiem Psychicznym Florey na Uniwersytecie w Melbourne. Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Komisje Etyki Eksperymentów na Zwierzętach na Uniwersytecie w Melbourne.

1. Klonowanie lentiwektora 2K7

  1. Przed sklonowaniem interesującego genu do wektora lentiwirusowego 2K7, należy podklonować gen do wektora pENTR (3637 bp, oporność na kanamycynę) przy użyciu standardowych technik molekularnych11. Do podklonowania należy wykorzystać miejsca restrykcyjne EcoRI i SacII.
  2. Amplifikacja lentiwektora 2K7
    1. Przetransformuj DNA lentiwektora 2K7, delikatnie mieszając 100 ng DNA plazmidowego z kompetentnymi komórkami, a następnie inkubuj na lodzie przez 30 min.
    2. Poddaj mieszaninę DNA i kompetentnych komórek szokowi termicznemu w temperaturze 42 °C przez 90 s, a następnie wysiej je na płytki LB-Agar zawierające ampicylinę (100 µg/ml) oraz chloramphenikol (15 µg/ml) i inkubuj w 37 °C przez 16-18 h.
      UWAGA: Chloramphenikol jest stosowany w celu zapobiegania rekombinacji między długimi powtórzeniami końcowymi.
    3. Następnego dnia wyhoduj wyselekcjonowane klony bakteryjne w pożywce LB zawierającej ampicylinę (100 µg/ml) i chloramphenikol (15 µg/ml) w temperaturze 37 °C przez 16-18 h. Wyizoluj DNA, korzystając z komercyjnego zestawu do Maxiprepu DNA plazmidowego zgodnie z instrukcją producenta.
  3. Podklonowanie z wektora pENTR do lentiwektora 2K7 (Rysunek 1)
    Schemat klonowania DNA, skład wektora z ERK1, GFP, IRES; pokazana metoda trawienia diagnostycznego.
    Rysunek 1: Schematyczny przebieg procesu rekombinacji Gateway. Geny interesujące, tutaj reprezentowane przez Flag-Erk1, są klonowane do wektora pENTR L1-L2. Jest on dodawany do wektora pENTR L4-R1 zawierającego promotor CMV i szkielet wektora 2K7. Te trzy wektory są rekombinowane przez enzym LR Clonase II Plus, aby wprowadzić interesujący gen i promotor do gotowego do produkcji wirusa wektora 2K7.
    1. Do probówki 1,5 ml dodaj następujące składniki i delikatnie wymieszaj:
      L4-R1 pENTR-pDNOR-CMV (promotor) (60 bng) 1-2,5 µl
      L1-L2 pENTR4IRES2GFP (z interesującym genem) (80 bng) 1-2,5 µl
      lentiwektor K7 (80 ng/µl) 1 µl
      bufor TE, pH 8,2 5 µl
      Łącznie 8 µl
    2. Wyjmij mieszaninę enzymu klonazy z -80 °C i rozmroź na lodzie przez 2 min. Upewnij się, że enzym pochodzi z nowej alikwoty z -80 °C, ponieważ powtarzane cykle zamrażania i rozmrażania znacznie obniżają wydajność klonowania.
    3. Dodaj 2 µl enzymu na każdą reakcję, dokładnie wymieszaj w wortexie, a następnie inkubuj mieszaninę reakcyjną klonazy w temperaturze 23-25 °C przez 6-24 h.
    4. Do mieszaniny reakcyjnej klonazy dodaj 1 µl roztworu proteinazy K (dołączonego do zestawu z enzymem) i inkubuj przez 10 min w 37 °C.
    5. Przetransformuj mieszaninę reakcyjną klonazy do kompetentnych komórek i wyhoduj wyselekcjonowane kolonie w pożywce LB zawierającej ampicylinę (100 µg/ml) w 37 °C przez 16-18 h.
    6. Wyizoluj i oczyść DNA, korzystając z komercyjnego zestawu do Miniprepu DNA plazmidowego zgodnie z instrukcją producenta.
    7. Potwierdź obecność DNA poprzez trawienie enzymami restrykcyjnymi Spe I i Sac II w odpowiednim buforze zgodnie z instrukcją producenta, aby wyciąć fragment zawierający promotor i interesujący gen.
      UWAGA: Ten krok jest krytyczny dla sprawdzenia, czy podklonowane DNA posiada prawidłowy insert interesującego genu z właściwym szkieletem wektora. Rozmiar samego wektora bez wstawionego fragmentu wynosi 6,7 kb. Rozmiar wyciętego insertu obejmuje zarówno promotor, jak i interesujący gen. Oblicz oczekiwane rozmiary fragmentów po trawieniu dla konkretnego genu za pomocą programu do edycji sekwencji DNA, np. APE – A Plasmid Editor.
    8. Sprawdź rozmiary szkieletu wektora DNA oraz wyciętego fragmentu, przeprowadzając elektroforezę na 1% żelu agarozowym w buforze 1x TAE (patrz Tabela roztworów roboczych) przy 100 V.
    9. Amplifikuj potwierdzone DNA, hodując bakterie w 500 ml pożywki LB zawierającej ampicylinę (100 µg/ml) w 37 °C przez 16-18 h.
    10. Wyizoluj i oczyść DNA, korzystając z komercyjnego zestawu do Maxiprepu DNA plazmidowego zgodnie z instrukcją producenta.
      UWAGA: Maxiprep zazwyczaj pozwala uzyskać ilość DNA wystarczającą do produkcji wirusa.
  4. Powtórz kroki 1.3.9-1.3.10, aby amplifikować następujące DNA do preparatów lentiwirusowych: wektor otoczki (PMD2.G, 6,1 kb), wektor opakowujący (pBR8.91, 12,5 kb) oraz pusty wektor lentiwirusowy jako kontrolę (GFP-CMV-2K7, 8,7 kb).

2. Produkcja wirusa 2K7

UWAGA: Dzień 1:

  1. W dniu transfekcji wysiej 32 mln komórek HEK293 T do kolby T175 zawierającej 25 ml pożywki dla komórek HEK293 T (patrz Tabela roztworów stokowych). Alternatywnie, jeśli w dniu transfekcji brakuje czasu, wysiej 16 mln komórek dzień wcześniej.
    UWAGA: Transfekcja może być równie skuteczna przy wysiewaniu komórek w dniu transfekcji lub dzień wcześniej. W obu przypadkach kluczowe jest upewnienie się, że komórki przylgnęły do powierzchni naczynia hodowlanego przed transfekcją.
    UWAGA: Dzień 2:
  2. Transfekcja
    1. Przed transfekcją rozcieńcz DNA do stężenia 1 µg/µl w buforze TE zawierającym 10 mM Tris pH 8, 1 mM EDTA pH 8 w wodzie dejonizowanej.
    2. W probówce 50 ml przygotuj mieszankę główną (Tabela 1) do transfekcji w kolbie T175. Dodaj DNA do podgrzanej pożywki Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) i wymieszaj dokładnie za pomocą wortexu, następnie dodaj sterylną polietyleniminę (PEI) (patrz Tabela roztworów stokowych), aby uniknąć przedwczesnego wytrącania.
      WektorStężenieObjętość
      pMDG.21 µg/µl5 µl
      pBR8.911 µg/µl15 µl
      Wektor 2K7 z GFP + genem zainteresowania1 µg/µl22 µl
      Sterylna polietylenimina (PEI)1 g/L500 µl
      DMEM2 100 µl
      Tabela 1: Przygotowanie mieszanki do transfekcji wirusa 2K7.
    3. Wymieszaj dokładnie, odwracając probówkę 3-4 razy, i inkubuj przez 15 min w temperaturze pokojowej (RT).
    4. Wykonaj całkowitą wymianę pożywki komórek HEK293T. Całkowicie odessaj pożywkę hodowlaną z komórek i dodaj podgrzaną pożywkę do hodowli komórek HEK293T (25 ml na kolbę T175).
    5. Dodawaj mieszankę transfekcyjną (mieszankę DNA/PEI) kroplami do monowarstwy komórek. Delikatnie poruszaj, aby dobrze wymieszać, i inkubuj transfektowane komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO2, przez noc.
      UWAGA: Dzień 3:
    6. Aby upewnić się, że transfekcja przebiegła pomyślnie, sprawdź ekspresję GFP 24 h po transfekcji za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
      UWAGA: Ekspresja GFP w ponad 50% komórek zazwyczaj wskazuje na dobrą transfekcję.
      UWAGA: Dzień 4:
  3. W 48 h po transfekcji zbierz nadsącz wirusowy i zastąp go świeżą pożywką dla komórek HEK293 T (25 ml na kolbę T175).
    1. Wirowarkuj nadsącz wirusowy przy 1 140 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C, aby usunąć resztki komórkowe z nadsączu. Przenieś oczyszczony nadsącz do probówki 50 ml i przechowuj w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Dzień 5:
  4. W 72 h po transfekcji zbierz drugą partię nadsączu wirusowego. Powtórz krok 2.3.1 i połącz oczyszczone nadsącze z 48. i 72. godziny.
  5. Aby skoncentrować wirusa, wirowarkuj nadsącz wirusowy przy 170 000 x g przez 90 min w temperaturze 4 °C, używając probówek do ultrawirowania 30 ml.
  6. Odrzuć nadsącz i powtarzaj krok 2.6, aż cały oczyszczony nadsącz zostanie odwirowany, pozostawiając (niewidoczny) osad wirusa wraz z wytrąconą PEI na dnie probówki.
  7. Aby resuspendować wirusa, dodaj 500 µl pożywki SATO (patrz Tabela roztworów stokowych) do probówek do ultrawirowania. Wymieszaj w vortexie przez 30 s i zdrap dno probówki końcówką pipety, aby mechanicznie rozluźnić wirusa. Powtórz ten krok 6 razy, aby rozbić osad wirusowy.
  8. Połącz resuspendowanego wirusa w probówkach do mikrocentryfugi i wiruj bardzo krótko, aby usunąć nierozpuszczalną PEI. Przefiltruj nadsącz przez filtr 0,45 µm, aby usunąć białka.
  9. Rozdziel wirusa na aliquoty po 20 µl, 50 µl i 100 µl i przechowuj w temperaturze -80 °C.

3. Oznaczanie miana wirusa w komórkach HEK293T

  1. Aby sprawdzić ekspresję białka docelowego i określić optymalne stężenie wirusa do doświadczeń, należy dodać szereg rozcieńczeń seryjnych zapasu wirusa (np. 0, 5, 10, 20, 40, 80 µl) w celu transdukcji komórek HEK293 T wysianych na płytkach 6-dołkowych, a następnie inkubować przez 24 hr w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Protokół ten zazwyczaj pozwala na otrzymanie wirusa, który może być stosowany w rozcieńczeniach od 1:50 do 1:200, co zapewnia silną ekspresję genu docelowego.
  2. 48 hr po transdukcji wirusowej należy poddać lizie komórki HEK293T w buforze TNE (patrz Tabela roztworów stokowych) z inhibitorami proteaz.
    1. Dołki należy przepłukać dwukrotnie schłodzonym DPBS, a następnie do każdego dołka dodać 150 µl buforu TNE.
    2. Komórki należy poddać lizie poprzez 5-10 krotne pipetowanie w górę i w dół. Lizaty całych komórek należy przenieść do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml i inkubować na lodzie przez 15-30 min.
    3. Lizaty należy wirować w temperaturze 4 °C przez 30 min z maksymalną prędkością (20 000 x g), a oczyszczony supernatant przenieść do nowej probówki w celu oznaczenia ilości białka metodą Bradforda i późniejszej analizy western blot.
  3. Poziom ekspresji białka docelowego należy określić za pomocą standardowej analizy western blot, stosując przeciwciała przeciwko samemu białku oraz do połączonego tagu (tj. Flag). Do dalszych doświadczeń należy wybrać takie rozcieńczenie wirusa, które daje >95% komórek GFP+ oraz silną ekspresję białka docelowego.

4. Izolacja i hodowla zwojów korzeni grzbietowych (DRG) (Rycina 2 kroki 1 i 2)

Schemat procesu hodowli neuronów DRG i OPC; układ współhodowli do analizy mielinizacji za pomocą Western Blot.
Rysunek 2: Schematyczny diagram testu mielinizacji in vitro. Neurony DRG są izolowane z młodych szczurów (P2-3), a następnie oczyszczane i hodowane przez dwa tygodnie (1-2). OPC są oczyszczane z mózgów szczurów (P7-9) przy użyciu immunopanningu (3). Następnie OPC są infekowane lentiwirusem i hodowane przez 48 hr (4). OPC są następnie wysiewane na neurony DRG i dodawane są interesujące czynniki wzrostu, takie jak BDNF (5). Współhodowle są następnie inkubowane przez 2 tygodnie, aby umożliwić różnicowanie się OPC i mielinizację aksonów (6). Na koniec współhodowle są poddawane lizie do analizy Western Blot lub utrwalane do immunocytochemii (7).

UWAGA: Dzień 1– 2 dni przed sekcją:

  1. Pokryć autoklawowane szkiełka nakrywki o wymiarach 22 mm x 22 mm Poly-L-ornityną (0,5 mg/ml) w płytce 6-dołkowej i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.
  2. Następnego dnia ponownie pokryć szkiełka lamininą (20 µg/ml w MEM) w temperaturze 37 °C przez noc, odessać nadmiar i suszyć przez 20 minut w dygestorze do hodowli tkankowych.
    UWAGA: Dzień 2: Disekcja i izolacja zwojów korzeni grzbietowych (DRG):
  3. Uśmiercić 12 szczurząt w wieku P2-P3 poprzez przerwanie rdzenia kręgowego (transekcja szyjna).
  4. Usunąć skórę pokrywającą mięśnie z grzbietu zwierzęcia. Za pomocą nożyczek typu Vannas otworzyć otwory kręgosłupa i delikatnie wyciągnąć rdzeń kręgowy za pomocą pęsety.
  5. Wyjąć DRG znajdujące się pomiędzy kręgami i odciąć przytwierdzone włókna nerwów rdzeniowych, a następnie umieścić DRG w szalce Petriego o średnicy 33 mm zawierającej 3 ml pożywki L-15. Zazwyczaj udaje się zebrać od 8 do 12 DRG z każdej strony rdzenia kręgowego.
  6. Przenieść zebrane DRG wraz z pożywką L-15 do probówki 15 ml i odwirować przy 180 x g przez 5 min.
  7. Odessać supernatant, dodać 2 ml 0,25% trypsyny do osadu DRG i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 min.
  8. Dodać 5 ml pożywki M1 (patrz Tabela roztworów stokowych) do osadu DRG, aby zatrzymać działanie trypsyny, i odwirować przy 180 x g przez 3 min w temperaturze pokojowej (RT).
  9. Odessać supernatant, zawiesić ponownie osad w 2 ml podgrzanej wcześniej pożywki M1 (bez czynników wzrostu). Rozbić osad zwojów poprzez 50-krotne pipetowanie lub aż do rozproszenia zwojów. Odwirować zawiesinę komórkową przy 180 x g przez 3 min.
  10. Zawiesić ponownie rozdzielone neurony w pożywce M1 i wysiać do płytki 6-dołkowej w ilości 5 zwojów na 100 µl na dołek.
  11. Aby usunąć proliferujące komórki nieneuronalne, po minimum 4-godzinnej inkubacji w celu ułatwienia adhezji, usunąć pożywkę M1 i dodać neuronom pożywkę M2 (patrz Tabela roztworów stokowych). Hodować neurony DRG w obecności NGF (100 ng/ml), aby otrzymać czystą kulturę DRG wykazujących ekspresję TrkA i zależnych od NGF. Alternatywnie, użyć BDNF (100 ng/ml), aby otrzymać czyste DRG wykazujące ekspresję TrkB i zależne od BDNF.
  12. Utrzymywać neurony w pożywce M1 (+NGF lub BDNF w stężeniu 100 ng/ml) naprzemiennie z antymitotyczną pożywką M2 przez 2 tygodnie zgodnie z poniższym schematem.
  13. Stosować pożywkę M1 (+NGF lub BDNF w stężeniu 100 ng/ml) w dniach: 4-6, 8-10, 12-14 oraz pożywkę M2 (+NGF lub BDNF w stężeniu 100 ng/ml) z FDU i urydyną w dniach 1-4, 6-8 oraz 10-12. Wymagane jest przeprowadzenie minimum 3 cykli oczyszczania pożywką M2.
  14. Utrzymywać DRG w samej pożywce M1 przez kolejny tydzień po zakończeniu 2-tygodniowego cyklu antymitotycznego. Wymieniać pożywkę M1 co 2-3 dni.

5. Izolacja i hodowla OPC (Rysunek 2 krok 3)

UWAGA: Dzień 1 – 2 dni przed sekcją:

  1. Pokryć płytki do hodowli tkankowej o średnicy 10 cm poli-D-lizyną (PDL, 10 µg/ml w sterylizowanej wodzie dejonizowanej) w temperaturze 4 °C przez noc.
    UWAGA: Dzień 2: 1 dzień przed sekcją:
  2. Płytki PDL płukać trzy razy sterylizowaną wodą dejonizowaną. Pozostawić do wyschnięcia przez ok. 6 godzin w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Jeśli płytki nie będą użyte natychmiast, zawinąć i przechowywać do 4 tygodni w temperaturze 4 °C.
  3. Przygotuj płytki z przeciwciałami wtórnymi do immunopanningu. Dla jednej sekcji mózgu przygotuj 2x płytki z IgG (z przeciwciałem Ran2 w celu usunięcia astrocytów oraz przeciwciałem O1 w celu usunięcia oligodendrocytów przedmielinizacyjnych), z 45 µl Kozie przeciwciała α mysie IgG w DPBS (15 ml) na szalkę Petriego 10 cm; 1x płytka IgM dla (przeciwciała O4 do selekcji komórek prekursorowych oligodendrocytów), 45 µl Przeciwciała kozie anty-mysie IgM w DPBS (15 ml) na jedną szalkę Petriego o średnicy 10 cm.
    UWAGA: Dzień 3: dzień sekcji:
  4. Dodaj 200 jednostek papainy w 10 ml buforu do papainy (Tabela 2), a następnie ogrzać do 37 °C aż do momentu, gdy bufor stanie się przejrzysty.
    Stężeniedo 250 mlStężenie końcowe
    roztwór zapasowy EBSS 10x25 ml1x
    MgSO₄4100 mM2,5 ml1 mM
    Glukoza30%3 ml0.46%
    EGTA0,5 M1 ml2 mM
    NaHCO331 M6,5 ml26 mM
    Dopełnić objętość do 250 ml wodą dejonizowaną i wysterylizować poprzez filtrowanie
    Tabela 2: Przygotowanie buforu papainowego.
  5. Przemyj wszystkie płytki z przeciwciałami wtórnymi trzykrotnie przy użyciu DPBS.
  6. Nalać przeciwciała Ran2 i O1 na płytki IgG oraz hybrydomę O4 na płytkę IgM. Inkubować wszystkie płytki z przeciwciałami pierwszorzędowymi przez ponad 2 h w temperaturze pokojowej.
  7. Wypreparuj jeden mózg szczura w 7. dniu po urodzeniu (P7). Wykonaj dekapitację młodego szczura za pomocą ostrych nożyczek, a następnie usuń nożyczkami skórę pokrywającą czaszkę.
    1. Wykonaj cięcie wokół czaszki, przechodząc od płata potylicznego, przez płat skroniowy, aż do płata czołowego. Usuń mózg z czaszki za pomocą pęsety i delikatnie przenieś go do 35-milimetrowej szalki Petriego zawierającej 1 ml DPBS.
    2. Pokrój mózg na małe kawałki, używając do tego celu nożyczek lub sterylnego ostrza.
  8. Przefiltrować uprzednio ogrzany bufor papainowy (10 ml) do nowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej kilka ziarenek L-cysteiny, a następnie dodać 200 µl DNazę (12 500 U/ml) do przefiltrowanego buforu z papainą.
  9. Wlej bufor z papainą na posiekane tkanki mózgu; inkubuj w 37 °C przez 90 min.
  10. Ostrożnie przenieś zdysocjowane tkanki mózgu do probówki o pojemności 50 ml za pomocą pipety 25 ml i pozostaw do sedymentacji.
  11. Usunąć bufor z papainą, dodać 2 ml Lo Ovo (owomukoidy) do tkanek mózgowych i pipetować 5–10 razy w celu rozbicia grudek tkanek mózgowych, odstawić do sedymentacji, a następnie przenieść górne 2 ml nadsączu do nowej probówki.
  12. Dodaj kolejne 2 ml Lo Ovo do tkanek mózgowych i powtarzaj krok 5.11, aż do całkowitego usunięcia grudek tkanki. Tytulacja może być przeprowadzana z coraz większą intensywnością.
  13. Odwiruj zawiesinę rozproszonych komórek przez 15 min przy 200 x g. Odessaj supernatant, a osad komórkowy resuspenduj w 10 ml Hi Ovo i odwiruj przez 15 min przy 200 x g.
  14. Przemyć pierwszą płytkę do immunopanningu (płytka Ran 2) buforem DPBS 3 razy. Odessać supernatant, resuspender komórki w 10 ml buforu do panningu (Tabela 2) i wlej na pierwszą płytkę do immunopanningu (płytka Ran 2). Inkubuj komórki przez 15 min w temperaturze pokojowej.
  15. Umyj drugą płytkę do immunopanningu (płytka O1) za pomocą DPBS (3x).
  16. Po inkubacji na pierwszej płytce do immunopanningu, przelej zawiesinę komórkową na drugą płytkę do immunopanningu (płytka O1). Wypłucz luźne komórki z powierzchni płytki, używając 1–3 ml buforu do panningu, i przenieś je pipetą na płytkę O1. Inkubuj komórki przez 15 min w temperaturze pokojowej.
  17. Przemyj trzecią płytkę do immunopanningu (płytka O4). Płytka ta służy do selekcji pozytywnej, gdzie OPC wiążą się z jej powierzchnią. Przemyj płytkę O4 za pomocą DPBS (3x).
  18. Po inkubacji na drugiej płytce do immunoselekcji (immunopanningu), przenieś komórki na końcową płytkę do immunoselekcji (płytka O4) i inkubuj komórki przez 45 min w temperaturze pokojowej. Krok ten pozwoli na wyselekcjonowanie komórek OPC O4+.
  19. Odssać supernatant z ostatniej płytki do immunopanningu (płytka O4) i wypłukać płytkę EBSS 6 razy.
  20. Aby usunąć OPC z płytki, inkubować komórki z 5 ml ciepłej 0,05% trypsyny-EDTA rozcieńczonej 1:10 w EBSS w temperaturze 37 °C przez 8 min.
  21. Dodać 5 ml 30% FBS (przygotowanego w EBSS), aby zneutralizować trypsynę. Zdjąć komórki z powierzchni płytki, pipetując je około 50 razy.
  22. Przenieść całą zawiesinę komórkową do nowej probówki i wirować przez 15 min przy 200 x g.
  23. Odrzucić supernatant i resuspendować osad komórkowy w 1 ml podgrzanego medium SATO, a następnie przeprowadzić liczenie komórek. Disekcja jednego mózgu może dostarczyć od 1,5 do 2 milionów OPC.
  24. Wysiać komórki na suche płytki powlekane PDL w zagęszczeniu od 1 x 105 oraz 5 x 105 na płytkę 10 cm w pożywce SATO (10 ml) zawierającej czynnik neurotroficzny rzęsek (CNTF, 10 ng/ml), czynnik wzrostu pochodzenia płytkowego (PDGF, 10 ng/ml), neurotrofinę 3 (NT3, 1 ng/ml) oraz forskolinę (4.2 µg/ml)2,12Hodować OPC w temperaturze 37 °C, 8% CO22.

6. Transdukcja OPC

  1. Hodować pierwotne OPC w pożywce SATO (10 ml/płytka 10 cm) z dodatkiem CNTF (10 ng/ml), PDGF (10 ng/ml), NT3 (1 ng/ml) oraz forskoliny (4,2 µg/ml) w temperaturze 37 °C i 8% CO2 przez 24 h po wycięciu tkanek.
  2. Całkowicie odessać pożywkę hodowlaną OPC, a następnie nakarmić komórki świeżo przygotowaną pożywką SATO (10 ml) z czynnikami wzrostu (patrz wyżej w kroku 6.1).
  3. Dodać wirusa do OPC w optymalnym stężeniu wyznaczonym w kroku 3 (Rycina 2, krok 4) i hodować OPC przez kolejne 48 h.

7. Wysiew OPC do mielinizujących kokultur (Rysunek 2, kroki 5 i 6)

  1. Aby usunąć OPC z powierzchni, najpierw przepłucz płytki z OPC 8 ml EBSS dwukrotnie, następnie inkubuj komórki z 5 ml ciepłej 0,05% Trypsyny-EDTA rozcieńczonej 1:10 w EBSS w temperaturze 37 °C przez 2 min.
  2. Zneutralizuj trypsynę za pomocą 30% FBS w EBSS (5 ml) i pobierz komórki z płytki za pomocą pipety. Przenieś zawiesinę komórkową do probówki 15 ml, odwiruj przy 180 x g przez 15 min w temperaturze pokojowej.
  3. Odsaj nadpłyn i resuspenduj osad komórkowy w 1 ml uprzednio ogrzanego medium SATO, a następnie przeprowadź zliczenie komórek.
  4. Przed wysiewaniem OPC całkowicie odessaj medium z płytki hodowlanej DRG. Delikatnie wysiej 200 000 OPC kroplami na neurony DRG, zgodnie z wcześniejszym opisem4-6.
    UWAGA: Całkowita objętość wysiewu OPC musi być mniejsza niż 200 µl na szkiełko okrywek 22 mm.
  5. Pozostaw komórki do osiadania w dygestorium przez 10 min bez przesuwania płytki, a następnie delikatnie dopełnij do 1 ml uprzednio ogrzanego medium SATO na studzienkę.
  6. Przesiej pozostałe siostrzane OPC w medium SATO z czynnikami wzrostu (patrz krok 6.1). Wykorzystaj te siostrzane OPC do weryfikacji ekspresji białka docelowego.
  7. Po 24 h zastąp medium SATO medium do kokultury (2 ml/studzienkę) składającym się z medium SATO (bez czynników) i neurobasal (v/v) z 1% B27. Utrzymuj kokultury przez 14 dni, wymieniając medium co 2-3 dni.
  8. Oceń ekspresję białek mieliny w kokulturach za pomocą analizy western blot i zwizualizuj tworzenie zmielinizowanych segmentów aksonalnych poprzez podwójne barwienie immunocytochemiczne z przeciwciałami przeciwko markerom podstawowego białka mieliny oraz markerom neuronalnym4-6.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Konstrukt kinazy regulowanej sygnałami zewnątrzkomórkowymi 1 z tagiem Flag (Flag-Erk1) wykorzystany do produkcji lentiwirusów został zweryfikowany poprzez trawienie enzymami restrykcyjnymi użytych konstruktów, w tym zarówno konstruktów 2K7, jak i konstruktów opakowujących i pomocniczych niezbędnych do produkcji wirusa (Rysunek 3).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Mielinizacja aksonów jest procesem kluczowym dla optymalnego funkcjonowania zarówno ośrodkowego, jak i obwodowego układu nerwowego kręgowców. Wytwarzanie i utrzymywanie mielinizowanych aksonów jest złożonym i skoordynowanym procesem obejmującym interakcje molekularne między białkami neuronalnymi, glejowymi (z komórek Schwanna lub oligodendrocytów) i zewnątrzkomórkowymi. Znaczenie i możliwość zastosowania tego protokołu polega na tym, że umożliwia on manipulowanie białkami w jednym określonym typie komórki w mieszanych wa...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie ma konfliktu interesów w związku z tymi badaniami.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Australijską Narodową Radę Zdrowia i Badań Medycznych (stypendium NHMRC #454330 dla JX, grant projektowy #628761 dla SM i APP1058647 dla JX), Multiple Sclerosis Research Research Australia (MSRA #12070 dla JX), University of Melbourne Research Grant Support Scheme i Melbourne Research CI Fellowship dla JX, a także Australia Postgraduate Scholarships dla HP i AF. Chcielibyśmy podziękować za Schemat Infrastruktury Operacyjnej Departament Innowacji, Przemysłu i Rozwoju Regionalnego, Wiktoria Australia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2K7 lentiwektor Miły prezent od dr Suter9
5-Fluoro-2′-deoksyurydynaSigma-AldrichF0503-100mg
Alexa Fluor 488 Koza anty-mysia IgGJackson Immunoresearch115545205
Alexa Fluor 488 koza anty-królicza IgG (H+L)Life TechnologiesA11008
Alexa Fluor 594 kozia anty-mysia IgG (H+L)Life TechnologieA11005
Alexa Fluor 594 kozia anty-królicza IgG (H+L)Life TechnologiesA11012
AmpicillinSigma-AldrichA9518-5G
B27 - NeuroCul SM1 Neuronal SuplementTechnologie komórek macierzystych 5711
BDNF (Człowiek)PeprotechPT450021000
Biotyna (d-Biotyna)Sigma AldrichB4639
Odczynnik BradfordSigma AldrichB6916-500ML   
BSASigma AldrichA4161
ChloramfenikolSigma-AldrichC0378-100G
CNTFPeprotech450-13020
DAKO fluorescencyjny nośnik montażowyDAKOS302380-2
DMEM, wysoka glukoza, pirogronian, bez glutaminyLife Technologies10313039
DNazaSigma-AldrichD5025-375KU
DPBSLife Technologies14190250
DPBS, wapń, magnezLife Technologies14040182
EBSSLife Technologies14155063
EcoRI-HFNEBR3101
Wektory wejściowe dla promotora i genu będącego przedmiotem zainteresowaniaGeneruj zgodnie z protokołami 1-2
Płodowa surowica bydlęcaSigma-Aldrich12003C
Forskolina Sigma AldrichF6886-50MG
Glukoza (D-glukoza)Sigma-AldrichG7528
GlycerolChem SupplyGL010-500MZobacz roztwory podstawowe
Kozia Anty-Mysia IgGJackson ImmunoResearch115005003
Koza Anty-Mysia IgM Jackson ImmunoResearch115005020
Kozia IgG Anty-SzczuraJacksonImmunoResearch 112005167
Hoechst 33342Life TechnologiesH3570
IgepalSigmaAldrich I3021-100ML 
Insulina Sigma AldrichI6634 
KanamycynaSigma-Aldrich60615
Laminin Life Technologies23017015
LB MediumZobacz roztwory podstawowe
LB-AgarZobacz roztwory podstawowe
L-CysteinaSigma-AldrichC-7477
Leibovitz's L-15 MediumLife Technologies11415064
L-glutaminianSigma-AldrichG1626
L-Glutamina- 200 mM (100x) płynLife Technologies25030081
LR Clonase II Plus enzymLife Technologies12538-120
MEM, NEAA, bez GlutamineLife Technologies10370088
Mouse α β III Tubulina PromegaG7121
i alfa; MBP (monoklonalny)MilliporeMAB381
Na pirogronian Life Technologies11360-070
NACSigma AldrichA8199
NcoI-HFNEBR3193S
NEBuffer 4 NEBB7004S
Neurobasal mediumLife Technologies21103049
NGF (mysz)Alomone LabsN-100
NT-3Peprotech  450-03
Przeciwciało O1 - Mysi anty-O1MilliporeMAB344Alternatywa, jeśli komórki hybrydoma O1 są niedostępne
hybrydoma O1Kondycjonowana pożywka zawierająca przeciwciało anty-O1 do stosowania do immunopanującego
przeciwciała O4 - Mysi anty-O4MilliporeMAB345Alternatywa, jeśli komórki hybrydoma O4 są niedostępne
Komórkihybrydoma O4Kondycjonowana pożywka zawierająca przeciwciało anty-O4 do stosowania do immunopanowania
Kompetentne komórkiLife TechnologiesA10460
One Shot Stbl kompetentne komórkiLife TechnologiesC7373-03
Zawiesina papainyWorthington/CooperLS003126
pBR8.91Uprzejmy prezent od dr Denham10
PDGF-AA (Człowiek)PeprotechPT10013A500   
Penicylina-streptomycyna 100x roztwórLife Technologies15140122
pENTRY4IRES2GFPInvitrogen11818-010 
pMD2.GAddgene12259
Poli-D-lizynaSigmaP6407-5MG
Polietylenina (PEI) Sigma-Aldrich408727-100ML
Poli-L-ornityna Sigma Aldrich P3655
Progesteron Sigma AldrichP8783
Tabletka inhibitora proteazy (kompletna mini)Roche11836153001
Proteinaza KDostarczana z enzymem klonazy
PutrescineSigma AldrichP-5780
Królik i alfaneurofilament MilliporeAB1987   
Królik i alfa; MBP (poliklonalne)MilliporeAB980
Komórki hybrydoma Ran2ATCCTIB-119Kondycjonowana pożywka zawierająca przeciwciało anty-Ran2 do stosowania do immunopanowania
Szczurze przeciwciało anty CD140A/PDGFRaBD Pharmingen558774
SacIINEBR0157
SOCDostarczane z kompetentnymi bakteriami
Selenin sodu Sigma AldrichS5261
Spe INEBR0133S
T4 Ligaza DNANEBM0202S
T4 Bufor ligazy DNANEBB0202S
podstawowe
99-175-CI
Transferyna (apo-Transferyna człowiek)Sigma-AldrichT1147
Triton X-100Sigma-AldrichT9284 
TrypsynaSigma-AldrichT9201-1G
Inhibitor trypsyny z białka jaja kurzegoRoche10109878001
Trypsin-EDTA (1x), czerwień fenolowa (0,05%)Life Technologies25300-054
Niesprzężona lektyna Griffonia simplicifolia BSL-1Laboratoria wektorowe L-1100
UridineSigma-AldrichU3003-5G
Mysz Komórki Bufor TE pH8 Zobacz roztwory Bufor do lizy TNE Pierwiastki śladowe B Cellgro 

Bibliografia

  1. Baumann, N., Pham-Dinh, D. Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system. Physiol Rev. 81 (2), 871-927 (2001).
  2. Watkins, T. A., Emery, B., Mulinyawe, S., Barres, B. A. Distinct stages of myelination regulated by gamma-secretase and astrocytes in a rapidly myelinating CNS coculture system. Neuron. 60 (4), 555-569 (2008).
  3. Lee, K., et al. MDGAs interact selectively with neuroligin-2 but not other neuroligins to regulate inhibitory synapse development. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (1), 336-341 (2013).
  4. Xiao, J., et al. BDNF exerts contrasting effects on peripheral myelination of NGF-dependent and BDNF-dependent DRG neurons. J Neurosci. 29 (13), 4016-4022 (2009).
  5. Chan, J. R., et al. NGF controls axonal receptivity to myelination by Schwann cells or oligodendrocytes. Neuron. 43 (2), 183-191 (2004).
  6. Xiao, J., et al. Brain-Derived Neurotrophic Factor Promotes Central Nervous System Myelination via a Direct Effect upon Oligodendrocytes. Neurosignals. 18 (3), 186-202 (2010).
  7. Lundgaard, I., et al. Neuregulin and BDNF induce a switch to NMDA receptor-dependent myelination by oligodendrocytes. PLoS Biology. 11 (12), e1001743(2013).
  8. Kleitman, N., W, P. M., Bunge, R. P. Tissue culture methodes for the study of myelination. , MIT Press. Cambridge, MA. (1991).
  9. Xiao, J., et al. Extracellular signal-regulated kinase 1/2 signaling promotes oligodendrocyte myelination in vitro. J Neurochem. 122 (6), 1167-1180 (2012).
  10. Wong, A. W., Xiao, J., Kemper, D., Kilpatrick, T. J., Murray, S. S. Oligodendroglial expression of TrkB independently regulates myelination and progenitor cell proliferation. The Journal of Neuroscience. 33 (11), 4947-4957 (2013).
  11. Li, Z., et al. Molecular cloning, Characterization and Expression of miR-15a-3p and miR-15b-3p in Dairy Cattle. Molecular and Cellular Probes. , (2014).
  12. Emery, B., et al. Myelin gene regulatory factor is a critical transcriptional regulator required for CNS myelination. Cell. 138 (1), 172-185 (2009).
  13. Murai, K., et al. Nuclear receptor TLX stimulates hippocampal neurogenesis and enhances learning and memory in a transgenic mouse model. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (25), 9115-9120 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Produkcja lentiwirus wtest mielinizacji in vitrotransdukcja wirusowaanaliza Western blotbarwienie immunofluorescencyjnehodowla neuron w z zwoj w korzeni grzbietowych DRGprotok ultrawirowaniaanaliza ekspresji GFPtechnika wysiewania kom rek
Produkcja i wykorzystanie lentiwirusa do selektywnej transdukcji pierwotnych komórek prekursorowych oligodendrocytów do testów mielinizacji in vitro
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.