Method Article

Modelowanie kandydozy błony śluzowej u larw danio pręgowanego przez wstrzyknięcie do pęcherza pławnego

DOI:

10.3791/52182

⸱

November 27th, 2014

 ,  , 
1Department of Molecular and Biomedical Sciences, University of Maine, 2Graduate School of Biomedical Sciences and Engineering, University of Maine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In vivo czasoprzestrzenne interakcje patogenów i obrony immunologicznej na poziomie błony śluzowej nie są łatwe do zobrazowania u istniejących kręgowców gospodarzy. Przedstawiona metoda opisuje wszechstronną platformę do badania kandydozy błony śluzowej u żywych kręgowców przy użyciu pęcherza pławnego młodego danio pręgowanego jako miejsca zakażenia.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wczesna obrona przed patogenami błony śluzowej składa się zarówno z bariery nabłonkowej, jak i wrodzonych komórek odpornościowych. Kompetencja immunologiczna obu tych czynników i ich wzajemna komunikacja mają zasadnicze znaczenie dla ochrony przed infekcjami. Interakcje nabłonkowych i wrodzonych komórek odpornościowych z patogenem najlepiej badać in vivo, gdzie złożone zachowanie rozwija się w czasie i przestrzeni. Istniejące modele nie pozwalają jednak na łatwe obrazowanie czasoprzestrzenne walki z patogenami na poziomie błony śluzowej.

Opracowany tutaj model tworzy infekcję błony śluzowej poprzez bezpośrednie wstrzyknięcie patogenu grzybowego, Candida albicans, do pęcherza pławnego młodego danio pręgowanego. Powstała infekcja umożliwia obrazowanie w wysokiej rozdzielczości zachowania nabłonka i wrodzonych komórek odpornościowych przez cały okres rozwoju choroby błony śluzowej. Wszechstronność tej metody pozwala na przesłuchanie gospodarza w celu zbadania szczegółowej sekwencji zdarzeń immunologicznych prowadzących do rekrutacji fagocytów oraz zbadania roli poszczególnych typów komórek i szlaków molekularnych w ochronie. Ponadto zachowanie patogenu w funkcji ataku immunologicznego można obrazować jednocześnie za pomocą fluorescencyjnego C. albicans wykazującego ekspresję białka. Zwiększona rozdzielczość przestrzenna interakcji gospodarz-patogen jest również możliwa przy użyciu opisanej techniki szybkiej sekcji pęcherza pławnego.

Opisany tutaj model infekcji błony śluzowej jest prosty i wysoce powtarzalny, co czyni go cennym narzędziem do badania kandydozy błony śluzowej. System ten może być również szeroko przenoszony na inne patogeny błony śluzowej, takie jak prątki, drobnoustroje bakteryjne lub wirusowe, które normalnie infekują przez powierzchnie nabłonka.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Infekcje błony śluzowej mogą prowadzić do zagrażających życiu zakażeń krwi z powodu uszkodzenia bariery nabłonkowej, która umożliwia patogenom dostęp do środowiska ogólnoustrojowego1,2. Ponadto infekcje błony śluzowej mogą również powodować znaczną immunopatologię, nawet jeśli są zawarte na zewnątrz3-5. Komensalny grzyb jednokomórkowy Candida albicans występuje u większości populacji w jamie ustnej i innych miejscach błony śluzowej6-9. Chociaż zwykle są one powstrzymywane przez wrodzoną i nabytą odpowiedź immunologiczną, wrodzone defekty immunologiczne i interwencje medyczne mogą prowadzić do ciężkiej kandydozy błony śluzowej. Atak na barierę nabłonkową skutkuje zwiększonym ryzykiem zagrażającej życiu choroby rozsianej, a także immunopatologii, podobnie jak w przypadku kandydozy sromu i pochwy, dodatkowo kolonizacja C. albicans została powiązana z homeostazą immunologiczną płuc10,11. Rozsiana kandydoza jest obecnie czwartym najczęstszym zakażeniem krwi na oddziałach intensywnej terapii12, a śmiertelność sięgająca 40% sprawia, że jest to poważny problem. Ze względu na wzrost leczenia immunomodulującego u pacjentów z chorobami autoimmunologicznymi, nowotworami lub przeszczepami narządów, konieczne jest zrozumienie interakcji między tym patogenem a przedziałem immunologicznym błony śluzowej.

Większość biologicznych osiągnięć komórek dotyczących interakcji C. albicans-komórka na poziomie błony śluzowej pochodzi z modeli in vitro13-15 i mysich16-18. Oba te podejścia mają wyraźne zalety, ale możliwość obrazowania żywych komórek w wysokiej rozdzielczości w nienaruszonym gospodarzu ograniczyła czasową i przestrzenną charakterystykę infekcji. W przypadku tych badań potrzebny jest model in vivo, w którym można uwidocznić interakcję patogenu, wrodzonych komórek odpornościowych i nabłonkowych w nienaruszonym żywicielu kręgowców.

Danio pręgowany stał się nieocenionym narzędziem do zrozumienia ludzkich chorób, głównie ze względu na jego przejrzystość i podatność na manipulacje genetyczne. Rozwój komórek i narządów został zobrazowany w najdrobniejszych szczegółach, co doprowadziło do opisu nowych zachowań komórek odpornościowych, takich jak zachowanie limfocytów T w rozwijającej się grasicy19 lub walka między wewnątrzkomórkowymi prątkami a fagocytami20-22. Ostatnie prace opisały interakcje mikroorganizm-gospodarz w jelitach u danio pręgowanego i wykazały, że mikrobiologiczna kolonizacja przewodu pokarmowego wpływa na fizjologię jelit gospodarza i odporność na inne infekcje23,24. Ponadto infekcja przez nabłonek jelitowy została opisana dla kilku patogenów.

W przeciwieństwie do przewodu pokarmowego, pęcherz pławny reprezentuje bardziej izolowany i komplementarny model błony śluzowej. Narząd ten jest przedłużeniem rozwijającej się cewy jelitowej i tworzy się z przodu do wątroby i trzustki25,26. Wytwarza środki powierzchniowo czynne, śluz i peptydy przeciwdrobnoustrojowe27,28, a anatomicznie, a także ontogenetycznie narząd ten jest uważany za homolog płuc ssaków29,30. Ponieważ przewód pneumatyczny pozostaje połączony z jelitem u danio pręgowanego, pozwala to na naturalne wystąpienie infekcji przez zanurzenie. Co ciekawe, jedynymi znanymi naturalnie występującymi infekcjami ryb gatunkami Candida są infekcje C. albicans w pęcherzu pławnym31. Niedawno opisaliśmy eksperymentalny model infekcji immersyjnej, w którym C. albicans infekuje pęcherz pławny i stwierdziliśmy, że ta infekcja podsumowuje niektóre cechy charakterystyczne interakcji C. albicans z nabłonkiem in vitro32,33.

W przedstawionej tutaj metodzie, oryginalny model infekcji immersyjnej jest ulepszany poprzez bezpośrednie wstrzyknięcie C. albicans do pęcherza pływackiego zebry pręgowanego 4 dni po zapłodnieniu (dpf). Pozwala to na precyzyjną kontrolę czasową infekcji, a także na wysoce powtarzalne inokulum. Pozwala to na szczegółowe obrazowanie przyżyciowe w połączeniu z wszechstronnością modelu danio pręgowanego. Jako przykład tego, co można zrobić za pomocą tej metody, przedstawiamy czasoprzestrzenną dynamikę wzrostu C. albicans wraz z rekrutacją neutrofili do miejsca infekcji. Ponieważ tkanka pęcherza pławnego danio pręgowanego jest trudna do zobrazowania śródżyłowego, przedstawiamy również technikę szybkiej sekcji pęcherza pławnego, która poprawia sygnał fluorescencyjny i rozdzielczość mikroskopową. Metody te poszerzają zestaw narzędzi do badań nad grzybami, immunologią i akwakulturą, a także opisują nową drogę infekcji, którą można przełożyć na modelowanie innych infekcji grzybiczych, bakteryjnych lub wirusowych powierzchni błony śluzowej.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Wszystkie protokoły opieki nad danio pręgowanym i eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi NIH zgodnie z protokołem Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) A2012-11-03.

1. Hodowla danio pręgowanego do 4 dni po zapłodnieniu

  1. Zbierz AB danio pręgowanego lub inne linie transgeniczne w ciągu pierwszych 3 godzin po zapłodnieniu, jak pokazano na innym filmie34.
  2. Inkubować 120 jaj na 15-centymetrowych szalkach Petriego zawierających 150 ml pożywki E3 (5 mM NaCl; 0,17 mM KCl; 0,33 mM CaCl2; 0,33 mM MgCl2; 2 mM HEPES; pH 6,8) z błękitem metylenowym (0,3 μg/ml stężenie końcowe) w inkubatorze o temperaturze 33 °C z fotoperiodem 12/12 jasny/ciemny
    3. .
  3. Po 6 godzinach zastąp pożywkę E3 + PTU (1-fenylo-2-tiomocznik, końcowe stężenie 10 μg/ml) i usuń martwe jaja.
  4. Inkubować przez 4 dni w temperaturze 33 °C, wymieniając pożywkę na świeżą pożywkę E3 + PTU po 2 dniach.

2. Przygotowanie mikroigieł do iniekcji

  1. Pociągnij kapilę borokrzemianową (średnica zewnętrzna 1,2 mm; ID 0,69 mm) do mikroigły za pomocą ściągacza igłowego z następującymi ustawieniami (550 Ciepło; 0 Ciągnięcie; 130 Prędkość; 110 Czas).
    UWAGA: Ustawienia będą się różnić w zależności od filamentu, aby uzyskać mikroigły o podobnym kształcie (patrz Rysunek 1) i będą musiały być ponownie regulowane za każdym razem, gdy instalowany jest nowy filament.
  2. Napełnij mikroigłę 3 μl soli fizjologicznej z przefiltrowanym buforem fosforanowym o stężeniu 0,4 μm (PBS; 137 mM NaCl; 2,7 mM KCl; 10 mM Na2HPO4; 1,8 mM KH2PO4; pH 7,4) za pomocą końcówki do pipety z mikroładowarką o pojemności 20 μl.
  3. Ustawić mikroigłę na uchwycie mikropipety na mikromanipulatorze podłączonym do ciśnieniowego systemu iniekcyjnego. Ustaw ciśnienie wtrysku na 30 PSI, a czas trwania impulsu na 30 ms.
  4. Używając szalki Petriego z wodą destylowaną, opuść mikroigłę, aż 1/5 igły znajdzie się w wodzie. Przytnij mikroigłę delikatną pęsetą tuż pod poziomem wody. Wyjmij mikroigłę z wody i naciśnij pedał kilka razy, aż pojawi się bolus.
  5. Zmierz średnicę bolusa, opuszczając mikroigłę na hemocytometrze pokrytym jedną kroplą olejku immersyjnego typu A. Dostosuj czas trwania impulsu, aby uzyskać żądaną głośność (patrz Tabela 1).
  6. Ustawić ciśnienie wsteczne, aby bolus pozostał stabilny w oleju (zmniejszyć ciśnienie, jeśli bolus zwiększa objętość, i zwiększyć ciśnienie wsteczne, jeśli objętość bolusa maleje). Zapisz czas trwania impulsu dla każdej mikroigły.
  7. Wyjmij PBS z mikroigły, zasysając ją za pomocą końcówki pipety do mikroładowarki i wyrzuć resztki PBS, umieszczając je z powrotem na wtryskiwaczu i obracając przełącznik impulsów ciągłych. Zarezerwuj każdą mikroigłę.

3. Przygotowanie do Candidy

  1. Smuga Candida albicans przekształcona za pomocą zoptymalizowanego pod kątem kodonów dTomato, GFP, BFP, EOS lub Far Red z zamrożonego wywaru (-80 °C bulion w 25% glicerolu) za pomocą sterylnego drewnianego kołka na płytce agarowej z dekstrozą peptynową (YPD) (10 g/l ekstraktu drożdżowego, 20 g/l peptonu, 20 g/l dekstrozy, 20 g/l agaru; autoklawowane i wlane 25 ml na szalki Petriego) i inkubować przez noc w temperaturze 30 °C.
  2. Pobrać jedną kolonię za pomocą sterylnego drewnianego kołka i zaszczepić 5 ml płynu YPD (10 g/l ekstraktu drożdżowego, 20 g/l peptonu, 20 g/l dekstrozy, autoklawowane i aseptycznie porcjowane w 5 ml w szklanych probówkach hodowlanych o wymiarach 16 x 150 mm).
  3. Inkubować przez noc w temperaturze 30 °C w bębnie rolkowym z prędkością 60 obr./min.
  4. Zebrać 1 ml kultury C. albicans i przenieść do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 1,7 ml.
  5. Wirować przy 5 000 x g przez kilka sekund. Opróżnić supernatant i dodać 1 ml sterylnego PBS, dokładnie odmieszać. Powtórz to dwa razy.
  6. Policzyć kolonie za pomocą hemocytometru, rozcieńczając 1 ml bulionu w stosunku 1:1,000 w sterylnym PBS.

4. Wstrzykiwanie danio pręgowanego do pęcherza pławnego

  1. Ogrzewać naczynie iniekcyjne (2% agarozy) przez 30 minut w inkubatorze o temperaturze 33 °C.
  2. W pożądanym czasie należy pobrać 100 ze 150 ml E3 + PTU z 15 cm płytki Petriego zawierającej rybę do wstrzyknięcia za pomocą pipety o pojemności 25 ml, nie odsysając danio pręgowanego.
  3. Znieczulić 4 dpf danio pręgowanego, dodając 2 ml buforowanego bulionu sulfonianu metanu trikainy (TR) o stężeniu 4 mg/ml do pozostałych 50 ml pożywki (stężenie końcowe 200 μg/ml) i odczekać 15 minut.
  4. Pod mikroskopem preparacyjnym wybierz ryby z napompowanym pęcherzem pławnym. W tym czasie ryby mogą być również badane pod kątem jednorodnego fenotypu, takiego jak rozmieszczenie neutrofili w linii mpo:GFP za pomocą mikroskopu preparacyjnego epifluorescencji.
  5. Rozcieńczyć zapas C. albicans od jego pierwotnego stężenia (krok 3.8) do 1,5 x 107 jednostek tworzących kolonie na ml (jtk/ml) w PBS.
  6. Przenieś 30 danio pręgowanego na naczynie iniekcyjne za pomocą plastikowej pipety transferowej i usuń nadmiar pożywki.
  7. Za pomocą narzędzia z drutu wędkarskiego (żyłka o średnicy 0,012 cala wklejona w kapilę borokrzemianową) wykonaj 3 linie po 10 ryb, trzymając naczynie iniekcyjne pionowo i ustaw rybę pionowo.
  8. Usuń nadmiar nośnika.
  9. Dokładnie przemieszać probówkę z 1,5 x 107 jtk/ml C. albicans.
  10. Napełnij jedną mikroigłę 3 μl C. albicans za pomocą nowej końcówki do pipety mikroładowarki i ustaw czas trwania impulsu na odpowiednie ustawienie (patrz krok 2.9).
  11. Obrócić naczynie iniekcyjne tak, aby uzyskać kąt 20° między mikroigłą a głową ryby, kierując się w stronę tylnej części pęcherza pławnego (Rysunek 3A).
  12. Wciśnij mikroigłę do pęcherza pławnego, upewniając się, że otwór igły znajduje się w świetle i naciśnij raz pedał.
  13. Powtórzyć tę czynność dla każdej ryby i przenieść do naczynia regeneracyjnego (25 ml E3 + PTU), zalewając naczynie E3 i opróżniając je do naczynia regeneracyjnego.
  14. Przenieś kolejne 30 ryb do naczynia do wstrzykiwań.
  15. Powtórzyć wstrzyknięcie za pomocą nowej mikroigły wypełnionej dokładnie zawirowanymi C. albicans.
  16. Na koniec wstrzyknąć kontrolkę PBS, jeśli to konieczne, używając innego naczynia iniekcyjnego w celu uniknięcia zanieczyszczenia i przenieść do oddzielnego naczynia do odzyskiwania (krok 4.10).

5. Badanie ryb pod kątem pożądanego inokulum

  1. Przygotować 40 ml 0,4% niskotopliwego roztworu agarozy (LMA), dodając 160 mg niskotopliwej agarozy do 40 ml E3, gotując w kuchence mikrofalowej aż do rozpuszczenia i schładzając do 37 °C. Po schłodzeniu dodać 400 μl TR (stężenie końcowe 200 μg/ml).
  2. Po 30 minutach rekonwalescencji znieczulić rybę zgodnie z opisem (krok 4.3 przy użyciu tylko 1 ml TR w 25 ml E3 + PTU, końcowe stężenie 200 μg/ml).
  3. Przenieś 30 ryb (z jak najmniejszą ilością pożywki) do 2 ml LMA w łodzi obciążeniowej.
  4. Odessać poszczególne ryby za pomocą pipety transferowej i umieścić rybę na płytce z 1 kroplą LMA w 96-dołkowej płytce obrazowej, używając tylko 10 x 6 dołków centralnych.
  5. Powtarzaj tę czynność, aż wszystkie ryby do przesiewania zostaną załadowane na płytkę obrazową.
  6. Pozwól pożywce zestalić się w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
  7. Ułóż rybę na boku, upewniając się, że stykają się ze szklanym dnem.
  8. Używając obiektywu 20X w odwróconym mikroskopie epifluorescencyjnym/konfokalnym i odpowiednim filtrze, zapisz liczbę komórek drożdży C. albicans w pęcherzu pławnym każdej ryby.
  9. Wybierz rybę z 15-25 komórkami drożdży w pęcherzu pławnym (lub pożądanym inokulum), poddaj eutanazji niewybrane ryby (800 μg/ml TR w E3) i wróć wybrane ryby na głęboką szalkę Petriego z 50 ml E3 + PTU, dodając 3 krople E3 do płytki obrazowej wybrane studzienki i odsysając rybę plastikową pipetą transferową.
  10. Inkubować w temperaturze 33 °C przez żądany czas.

6. Obrazowanie ryb po badaniu przesiewowym

  1. W żądanym czasie usunąć 25 z 50 ml pożywki E3 + PTU z głębokiej szalki Petriego zawierającej rybę do zobrazowania.
  2. Znieczulić rybę zgodnie z opisem (krok 4.3 używając tylko 1 ml TR w 25 ml E3 + PTU pozostałe, końcowe stężenie 200 μg/ml).
  3. Umieść rybę na 96-dołkowej płytce obrazowej i odpowiednio ją umieść (kroki 5.3 - 5.7).
  4. Obraz za pomocą skaningowej mikroskopii konfokalnej z wykorzystaniem odpowiednich laserów i filtrów emisyjnych. Najpierw skup się na rybach za pomocą obiektywu 4X przy różnicowym kontraście interferencyjnym (DIC) i uzyskaj obrazy obszaru zainteresowania za pomocą obiektywu 20X za pomocą laserów konfokalnych w trybie skanowania z prędkością 2 μs/piksel i proporcjami pikseli 1024 x 600. Uzyskaj stosy Z z krokiem 1 μm, stosując tryb filtra Kalmana składający się z 3 klatek.
  5. Powrócić do głębokiej płytki Petriego z 50 ml E3 + PTU lub do indywidualnych studzienek (24-dołkowe szalka hodowlana, 3 ml E3 + PTU) i inkubować w temperaturze 33 °C.

7. Sekcja pęcherza pławnego

  1. Napełnić strzykawkę o pojemności 10 ml smarem wysokopróżniowym.
  2. Przygotować 2% LMA (krok 5.3 z 160 mg niskotopliwej agarozy w 8 ml E3).
  3. W pożądanym czasie znieczulij rybę (krok 5.2).
  4. Przenieść 10 ryb do probówki wirówkowej o pojemności 1,7 ml z 1 ml E3 i poddać eutanazji poprzez dodanie 200 μl 4 mg/ml trikainy (końcowe stężenie 800 μg/ml) do probówki wirówkowej i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Przygotować szkiełko obrazowe, umieszczając 4 krople smaru próżniowego w kwadracie w odległości 1 cm od siebie na mikroszkiełku (75 x 25 mm, Rysunek 2).
  6. Umieść 2 krople 2% LMA na środku kwadratu.
  7. Umieść jedną rybę na osobnym szklanym szkiełku pod mikroskopem preparacyjnym i sprawdź, czy serce przestało bić, usuń nadmiar wody.
  8. Za pomocą cienkiej pęsety rozetnij pęcherz płyński, utrzymując głowę w ustalonej pozycji za pomocą lewej pęsety i ciągnąc w dół przedni odcinek jelita za pomocą prawej pęsety (ryc. 4A).
  9. Podnieś pęcherz pławny za kanał pneumatyczny za pomocą lewej pęsety, oddzielając go od przewodu pokarmowego, i umieść go na środku 2% LMA, zanim zastygnie.
  10. Umieść szkiełko nakrywkowe (18 x 18 mm) na szkiełku obrazowym i dociśnij je, aż dotknie smaru próżniowego oraz LMA (Rysunek 2).
  11. Obraz w ciągu 10 minut od sekcji, jak opisano w kroku 6.4. Powtórz kroki 7.7 - 7.11 z innymi rybami.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroiniekcja w tylny pęcherz pławny

Przedstawiona tutaj metoda eksperymentalna opisuje wstrzykiwanie stałej dawki komórek drożdży C. albicans do pęcherza pławnego 4 dpf danio pręgowanego. Wcześniejsze prace z modelem immersyjnym sugerują, że odpowiedź immunologiczna pęcherza pławnego na C. albicans jest podobna do kandydozy błony śluzowej ssaków32. Tutaj pokazujemy zmodyfikowaną metodę infekcji, która jest prostsza, bardziej powtarzalna i szybka; W ciągu kilku godzin...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Postępy i ograniczenia modelu choroby mikroiniekcyjnej w pęcherzu pławnym

Prezentowany tutaj model jest rozszerzeniem modelu zanurzenia w kandydozie błony śluzowej opisanego w Gratacap et al. (2013); Dodaje korzyści w postaci kontrolowanego czasu infekcji, wysoce powtarzalnej dawki infekcji, a tym samym lepszej wydajności. Demonstrujemy tutaj nowe metody, które pozwalają na nieinwazyjną dokumentację czasową dynamiki infekcji w bardzo szczegółowy sposób, a także obrazowanie ex vivo

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Dr. Le Trinh i Dr. Tobinowi za hojne dostarczenie linii α-katenin:cytryn oraz Billowi Jackmanowi za umożliwienie nam filmowania w jego laboratorium. Autorzy wymieniają źródła finansowania: National Institutes of Health (granty 5P20RR016463, 8P20GM103423 i R15AI094406) oraz USDA (Projekt # ME0-H-1-00517-13). Rękopis ten został opublikowany jako publikacja Głównej Stacji Doświadczalnej Rolnictwa i Leśnictwa nr 3371.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Probówki 1,7 mlAxygenMCT-175-C
Głębokie szalki PetriegoFisher Scientific89107-632
Pipety transferoweFisher Scientific13-711-7M
Ekstrakt drożdżowyVWR Scientific90000-726
PeptonVWR Scientific90000-264
DekstrozaFisher ScientificD16-1
AgarVWR Scientific90000-760
Pęseta drobnoziarnista (Dumont Dumoxel #5)Fine Science Tools11251-30
Kołki drewnianeVWR Scientific10805-018
Agaroza niskotopliwaVWR Scientific12001-722
Ściągacz do mikropipet Flaming BrownSutter InstrumentsP-97
Kapilara borokrzemianowaSutter InstrumentsBF120-69-10
System iniekcyjny MPPI-3Stosowane oprzyrządowanie naukoweMPPI-3
Jednostka przeciwciśnieniaStosowane oprzyrządowanie naukowe
Stosowane oprzyrządowanie naukoweMPIP
Applied Scientific OprzyrządowanieFSW
MikromanipulatorStosowane oprzyrządowanie naukoweMM33
Podstawa magnetycznaZastosowane oprzyrządowanie naukowePodstawa
Sulfonian metanu trikainyWestern Chemical Inc.MS-222
Mikroskop preparacyjnyOlympusSZ61 górna podstawa SZX-ILLB2-100 Mikroskop
konfokalnyOlympusIX-81 z laserowym skaningowym systemem konfokalnym FV-1000
Eppendorf930001007
Szklane probówki hodowlane (16 x 150 mm)VWR Scientific60825-435
NaClVWR ScientificBDH4534-500GP
KClVWR ScientificBDH4532-500GP
MgSO4VWR ScientificBDH0246-500GP
HEPES (Corning)VWR ScientificBDH4520-500GP
Glinka dla dzieci (Play-Doh)Hasbro
CaCl2Fisher ScientificC69-500
Błękit metylenowyVWR ScientificVW6276-0
PTUSigmaP7629-10G
Szalki Petriego
( Hausser scientific)VWR Scientific15170-172
Olejek immersyjny typu ABlue Marble Products51935
WirówkaEppendorf5424
Vortex GenieVWR Scientific14216-184
Agaroza (Lonza)VWR Scientific12001-870
Na2HPO4 Fisher ScientificS374-500
KH2PO4Fisher ScientificP285-500
Drut wędkarskiStren
96-dołkowa płytka obrazowa (Sensoplate)Greiner Bio-One655892
Smar wysokopróżniowy (Dow Corning)VWR Scientific59344-055
Mikroszkiełko (25 x 75 mm)VWR Scientific48300-025
Szkiełko nakrywkowe (18 x 18 mm), nr 1,5VWR Scientific48366-045
Szalka Petriego 15 cm (tworzywa sztuczne Olympus)Genesee Scientific32-106
Glicerol (chemikalia EMD)VWR ScientificEMGX0185-5
24-dołkowe naczynie do hodowli (tworzywa sztuczne Olympus)Genesee Scientific25-107
Łodzie wagowe (8,9 cm)VWR Scientific89106-766
Zestaw uchwytów do mikropipet BPU Przełącznik nożny magnetyczna Obiektyw mikroskopowy 20X Olympus UPlanSApo 20x/0,75 Bęben rolkowy New Brunswick Scientific TC-7 Końcówki do pipet do mikroładowarek Hemocytometr FB0875712 Fisher Scientific

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Peterson, L. W., Artis, D. Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis. Nat Rev Immunol. 14 (3), 141-153 (2014).
  2. Elinav, E., Henao-Mejia, J., Flavell, R. A. Integrative inflammasome activity in the regulation of intestinal mucosal immune responses. Mucosal Immunol. 6 (1), 4-13 (2013).
  3. Sansonetti, P. J. To be or not to be a pathogen: that is the mucosally relevant question. Mucosal Immunol. 4 (1), 8-14 (2011).
  4. Tlaskalová-Hogenová, H., Stěpánková, R., et al. The role of gut microbiota (commensal bacteria) and the mucosal barrier in the pathogenesis of inflammatory and autoimmune diseases and cancer: contribution of germ-free and gnotobiotic animal models of human diseases. Cell Mol Immunol. 8 (2), 110-120 (2011).
  5. Pasparakis, M. Regulation of tissue homeostasis by NF-kappaB signalling: implications for inflammatory diseases. Nat Rev Immunol. 9 (11), 778-788 (2009).
  6. Scully, C., el-Kabir, M., Samaranayake, L. P. Candida and oral candidosis: a review. Crit Rev Oral Biol Med. 5 (2), 125-157 (1994).
  7. Reef, S. E., Lasker, B. A., et al. Nonperinatal nosocomial transmission of Candida albicans in a neonatal intensive care unit: prospective study. J Clin Microbiol. 36 (5), 1255-1259 (1998).
  8. Soll, D. R., Galask, R., Schmid, J., Hanna, C., Mac, K., Morrow, B. Genetic dissimilarity of commensal strains of Candida spp. carried in different anatomical locations of the same healthy women. J Clin Microbiol. 29 (8), (1991).
  9. Rindum, J. L., Stenderup, A., Holmstrup, P. Identification of Candida albicans types related to healthy and pathological oral mucosa. J Oral Pathol Med. 23 (9), 406-412 (1994).
  10. Mear, J. B., Gosset, P., et al. Candida albicans airway exposure primes the lung innate immune response against Pseudomonas aeruginosa infection through innate lymphoid cell recruitment and IL-22 associated mucosal response. Infect Immun. 82 (1), 306-315 (2013).
  11. Faro-Trindade, I., Willment, J. A., et al. Characterisation of innate fungal recognition in the lung. PLoS ONE. 7 (4), 35675(2012).
  12. Wisplinghoff, H., Bischoff, T., Tallent, S. M., Seifert, H., Wenzel, R. P., Edmond, M. B. Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study. Clin Infect Dis. 39 (3), 309-317 (2004).
  13. Schaller, M., Zakikhany, K., Naglik, J. R., Weindl, G., Hube, B. Models of oral and vaginal candidiasis based on in vitro reconstituted human epithelia. Nat Protoc. 1 (6), 2767-2773 (2006).
  14. Weindl, G., Naglik, J. R., et al. Human epithelial cells establish direct antifungal defense through TLR4-mediated signaling. Clin Invest. 117 (12), 3664-3672 (2007).
  15. Moyes, D. L., Runglall, M., et al. A biphasic innate immune MAPK response discriminates between the yeast and hyphal forms of Candida albicans in epithelial cells. Cell Host and Microbe. 8 (3), 225-235 (2010).
  16. Conti, H. R., Shen, F., et al. Th17 cells and IL-17 receptor signaling are essential for mucosal host defense against oral candidiasis. J Exp Med. 206 (2), 299-311 (2009).
  17. Hise, A. G., Tomalka, J., et al. An essential role for the NLRP3 inflammasome in host defense against the human fungal pathogen Candida albicans. Cell Host Microbe. 5 (5), 487-497 (2009).
  18. Gladiator, A. A., Wangler, N. N., Trautwein-Weidner, K. K., Leibundgut-Landmann, S. S. Cutting Edge: IL-17-Secreting Innate Lymphoid Cells Are Essential for Host Defense against Fungal Infection. J Immunol. 190 (2), 521-525 (2013).
  19. Hess, I., Boehm, T. Intravital imaging of thymopoiesis reveals dynamic lympho-epithelial interactions. Immunity. 36 (2), 298-309 (2012).
  20. Roca, F. J., Ramakrishnan, L. TNF Dually Mediates Resistance and Susceptibility to Mycobacteria via Mitochondrial Reactive Oxygen Species. Cell. 153 (3), 521-534 (2013).
  21. Tobin, D. M., Vary, J. C., et al. The lta4h locus modulates susceptibility to mycobacterial infection in zebrafish and humans. Cell. 140 (5), 717-730 (2010).
  22. Cambier, C. J., Takaki, K. K., et al. Mycobacteria manipulate macrophage recruitment through coordinated use of membrane lipids. Nature. 505 (7482), 218-222 (2014).
  23. Semova, I., Carten, J. D., et al. Microbiota regulate intestinal absorption and metabolism of fatty acids in the zebrafish. Cell Host and Microbe. 12 (3), 277-288 (2012).
  24. Rendueles, O., Ferrières, L., et al. A new zebrafish model of Oro-intestinal pathogen colonization reveals a key role for adhesion in protection by probiotic bacteria. PLoS Pathog. 8 (7), 1002815(2012).
  25. Field, H., Ober, E., Roeser, T., Stainier, D. Formation of the digestive system in zebrafish I. Liver morphogenesis. Dev Biol. 253 (2), 279-290 (2003).
  26. Field, H., Dong, P., Beis, D., Stainier, D. Formation of the digestive system in zebrafish. Dev Biol. 261 (1), 197-208 (2003).
  27. Sullivan, L., Daniels, C., Phillips, I., Orgeig, S., Whitsett, J. Conservation of surfactant protein A: evidence for a single origin for vertebrate pulmonary surfactant. J Mol Evol. 46 (2), 131-138 (1998).
  28. Oehlers, S. H., Flores, M. V., Chen, T., Hall, C. J., Crosier, K. E., Crosier, P. S. Topographical distribution of antimicrobial genes in the zebrafish intestine. Dev Comp Immunol. 35 (3), 385-391 (2011).
  29. Winata, C., Korzh, S., Kondrychyn, I., Zheng, W., Korzh, V., Gong, Z. Development of zebrafish swimbladder: The requirement of Hedgehog signaling in specification and organization of the three tissue layers. Dev Biol. 331 (2), 22-236 (2009).
  30. Zheng, W., Wang, Z., Collins, J. E., Andrews, R. M., Stemple, D., Gong, Z. Comparative transcriptome analyses indicate molecular homology of zebrafish swimbladder and mammalian lung. PLoS ONE. 6 (8), 24019(2011).
  31. Galuppi, R., Fioravanti, M., Delgado, M., Quaglio, F., Caffara, M., Tampieri, M. Segnalazione di due casi do micosi della vescica natatoria in Sparus aurata e Carrassius auratus. Bollettino Societa Italiana di Patologic. 32, 26-34 (2001).
  32. Gratacap, R. L., Rawls, J. F., Wheeler, R. T. Mucosal candidiasis elicits NF-κB activation, proinflammatory gene expression and localized neutrophilia in zebrafish. Dis Model Mech. 6 (5), 1260-1270 (2013).
  33. Brothers, K. M., Gratacap, R. L., Barker, S. E., Newman, Z. R., Norum, A., Wheeler, R. T. NADPH oxidase-driven phagocyte recruitment controls Candida albicans filamentous growth and prevents mortality. PLoS Pathog. 9 (10), (2013).
  34. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (25), (2009).
  35. Anaissie, E. J., Bodey, G. P. Fungal infections in patients with cancer. Pharmacotherapy. 10 (6 pt 3), 1648-1698 (1990).
  36. Fidel, P. L., Barousse, M., et al. An intravaginal live Candida challenge in humans leads to new hypotheses for the immunopathogenesis of vulvovaginal candidiasis. Infect Immun. 72 (5), 2939-2946 (2004).
  37. Akova, M., Akalin, H. E., et al. Efficacy of fluconazole in the treatment of upper gastrointestinal candidiasis in neutropenic patients with cancer: factors influencing the outcome. Clin Infect Dis. 18 (3), 298-304 (1994).
  38. Farah, C. S., Elahi, S., et al. T cells augment monocyte and neutrophil function in host resistance against oropharyngeal candidiasis. Infect Immun. 69 (10), 6110-6118 (2001).
  39. Renshaw, S. A., Loynes, C. A., Trushell, D. M. I., Elworthy, S., Ingham, P. W., Whyte, M. K. B. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
  40. Kanther, M., Sun, X., et al. Microbial Colonization Induces Dynamic Temporal and Spatial Patterns of NF-κB Activation in the Zebrafish Digestive Tract. Gastroenterology. 141 (1), 197-207 (2011).
  41. Trinh, L. A., Hochgreb, T., et al. A versatile gene trap to visualize and interrogate the function of the vertebrate proteome. Genes Dev. 25 (21), 2306-2320 (2011).
  42. Trinh, L. A., Fraser, S. E., Moens, C. B. Zebrafish Neural Tube Morphogenesis Requires Scribble-Dependent Oriented Cell Divisions. Curr Biol. 21 (1), 79-86 (2011).
  43. Oehlers, S. H. B., Flores, M. V., et al. Expression of zebrafish cxcl8 (interleukin-8) and its receptors during development and in response to immune stimulation. Dev Comp Immunol. 34 (3), 352-359 (2010).
  44. Bast, D. J., Yue, M., et al. Novel murine model of pneumococcal pneumonia: use of temperature as a measure of disease severity to compare the efficacies of moxifloxacin and levofloxacin. Antimicrob Agents Chemother. 48 (9), 3343-3348 (2004).
  45. Davis, J., Clay, H., Lewis, J., Ghori, N., Herbomel, P., Ramakrishnan, L. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).
  46. Pack, M., Solnica-Krezel, L., et al. Mutations affecting development of zebrafish digestive organs. Development. 123, 321-328 (1996).
  47. Le Guyader, D., Redd, M. J., et al. Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish. Blood. 111 (1), 132-141 (2008).
  48. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
  49. Parichy, D. M., Elizondo, M. R., Mills, M. G., Gordon, T. N., Engeszer, R. E. Normal table of postembryonic zebrafish development: staging by externally visible anatomy of the living fish. Dev Dyn. 238 (12), 2975-3015 (2009).
  50. Noverr, M. C., Huffnagle, G. B. Does the microbiota regulate immune responses outside the gut. Trends in Microbiology. 12 (12), 562-568 (2004).
  51. Huffnagle, G. B. The microbiota and allergies/asthma. PLoS Pathog. 6 (5), 1000549(2010).
  52. Kim, Y. -G., Udayanga, K. G. S., Totsuka, N., Weinberg, J. B., Núñez, G., Shibuya, A. Gut dysbiosis promotes M2 macrophage polarization and allergic airway inflammation via fungi-induced PGE2. Cell Host Microbe. 15 (1), 95-102 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mucosal CandidiasisZebrafish ModelSwimbladder InjectionCandida AlbicansConfocal MicroscopyNeutrophil RecruitmentHost Pathogen InteractionFluorescent ProteinSwimbladder DissectionJuvenile Zebrafish

Related Articles