Jednoczesna kwantyfikacja kręgów wycinania receptora komórek T (TREC) i kręgów wycinania rekombinacji z delecją K (KREC) za pomocą PCR w czasie rzeczywistym

Summary

Tutaj opisujemy metodę jednoczesnej kwantyfikacji okręgów wycinania receptora limfocytów T (TREC) i kręgów wycinania rekombinacji deklacyjnej K (KRECs). Test TREC/KREC może być stosowany jako marker wydalania grasicy i szpiku kostnego.

Abstract

Kręgi wycinania receptora limfocytów T (TREC) i kręgi wycinania rekombinacji delokacji K (KREC) są kolistymi elementami DNA powstającymi podczas procesu rekombinacji, które tworzą receptory komórek T i B. Ponieważ TREC i KREC nie są w stanie się replikować, są rozcieńczane po każdym podziale komórki, a zatem utrzymują się w komórce. Ich ilość we krwi obwodowej można traktować jako oszacowanie wydalania grasicy i szpiku kostnego. Łącząc dobrze ugruntowany i powszechnie stosowany test TREC ze zmodyfikowaną wersją testu KREC, opracowaliśmy dupleksowy ilościowy PCR w czasie rzeczywistym, który umożliwia ilościowe oznaczanie zarówno nowo wytworzonych limfocytów T, jak i B w jednym teście. Liczbę TREC i KREC uzyskuje się za pomocą krzywej standardowej przygotowanej przez seryjne rozcieńczanie stawów sygnałowych TREC i KREC sklonowanych w plazmidzie bakteryjnym, wraz z fragmentem genu stałej receptora komórek T, który służy jako gen odniesienia. Wyniki są podawane jako liczba TREC i KREC/10⁶ komórek lub na ml krwi. Okazało się, że kwantyfikacja tych fragmentów DNA jest przydatna do monitorowania rekonstytucji immunologicznej po przeszczepie szpiku kostnego zarówno u dzieci, jak i dorosłych, w celu lepszej charakterystyki niedoborów immunologicznych lub lepszego zrozumienia niektórych działań leków immunomodulujących.

Introduction

Kręgi wycinania receptora limfocytów T (TREC) i kręgi wycinania rekombinacji delokacji K (KREC) to małe okrągłe elementy DNA, które są wycinane odpowiednio w proporcji limfocytów T i B podczas procesu rekombinacji genomowego DNA, co prowadzi do powstania wysoce zróżnicowanego repertuaru receptorów komórek T i B. Nie pełnią żadnej funkcji, ale ponieważ są stabilne i nie mogą być replikowane, są rozcieńczane po każdym podziale komórki, dzięki czemu utrzymują się tylko w jednej z dwóch komórek potomnych. W związku z tym ich poziomy we krwi obwodowej można przyjąć jako oszacowanie ilości grasicy i szpiku kostnego.

Podczas gdy test TREC był głównie używany w ciągu ostatnich 15 lat do oceny zasięgu produkcji grasicy,1 test KREC, który początkowo został opracowany do pomiaru proliferacji komórek B i ich wkładu w homeostazę komórek B w zdrowiu i ^chorobie,2 został dopiero niedawno zaproponowany jako marker produkcji szpiku kostnego. ^3,4 W tym miejscu opisujemy opracowaną przez nas metodę jednoczesnej kwantyfikacji zarówno TREC, jak i KREC. ⁴

Dzięki tej połączonej metodzie, zmienność związana z kwantyfikacją DNA za pomocą PCR w czasie rzeczywistym jest eliminowana dzięki zastosowaniu unikalnej krzywej standardowej uzyskanej przez rozcieńczenie plazmidu z potrójną insercją zawierającego fragmenty TREC, KREC i genu TCRAC (T-cell receptor alpha constant) w stosunku 1:1:1. Pozwala to na dokładniejszą ocenę numeru kopii TREC i KREC. Co więcej, jednoczesna kwantyfikacja dwóch celów w tej samej reakcji pozwala na obniżenie kosztów odczynników.

Proponowany test TREC/KREC może być przydatny do pomiaru zakresu produkcji komórek T i B u dzieci i dorosłych z ciężkim złożonym niedoborem odporności (SCID)^,4 Powszechnym zmiennym niedoborem ^{odporności,5} chorobami autoimmunologicznymi,6-8 i zakażeniem HIV. ⁹ Ponadto może być stosowany do monitorowania odzyskiwania odporności po przeszczepieniu krwiotwórczych komórek macierzystych10, wymianie enzymów11 oraz terapiach przeciwwirusowych⁹ lub immunomodulujących. ^6-8 Wreszcie, ponieważ pacjenci z SCID są rozpoznawani za pomocą testu TREC pomimo podstawowych wad genetycznych, a pacjenci z agammaglobulinemią mogą być identyfikowani za pomocą kwantyfikacji KREC, test TREC / KREC może być również stosowany do wykrywania niedoborów odporności w programach badań przesiewowych noworodków. ¹² W takim przypadku badanie musi być przeprowadzone na DNA wyekstrahowanym z małych plamek krwi osuszonych i wysuszonych na bibule filtracyjnej, musi być bardzo czułe i specyficzne dla chorób docelowych, a także wysoce powtarzalne i opłacalne.

Wprowadzenie kwantyfikacji KREC do testu powinno poprawić wyniki badań przesiewowych noworodków pod kątem niedoborów odporności, które są rutynowo przeprowadzane w niektórych częściach USA (WI, MA, CA) od 2008 roku, kiedy Wisconsin jako pierwszy wprowadził analizę TREC do swojego programu badań przesiewowych po porodzie. ¹³

Protocol

UWAGA: Oświadczenie etyczne: Ten protokół jest zgodny z wytycznymi naszej instytucji, Spedali Civili di Brescia

1. Przygotowanie plazmidu "potrójnej inkubacji"

1. Dobór i przygotowanie odpowiedniego materiału wyjściowego:
   1. Uzyskać próbkę zawierającą komórki, w których istnieje duże prawdopodobieństwo, że mają TREC i KREC wykrywalne metodą PCR, takie jak krew obwodowa młodego, zdrowego osobnika zebrana do probówek EDTA.
      UWAGA: Pierwotnie opracowaliśmy metodę wykorzystującą tymocyty do TREC i komórki jednojądrzaste z fragmentów migdałków do KREC, ale zdrowi ludzie zwykle mają wystarczającą ilość TREC i KREC, aby umożliwić ich wykrycie za pomocą PCR. Dlatego krew obwodowa powinna być ważną alternatywą, łatwiejszą do uzyskania i pracy. Biorąc pod uwagę, że TREC, w szczególności, zmniejsza się wraz z wiekiem u zdrowych osób dorosłych, zaleca się krew obwodową od młodego dorosłego, jeśli nie od dzieci.
   2. Oddzielić komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) metodą separacji w standardowym gradiencie gęstości.
2. Ekstrakcja DNA:
   1. Wyodrębnij DNA z PBMC za pomocą komercyjnego zestawu DNA Blood Mini Kit. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta z kilkoma modyfikacjami opisanymi poniżej.
      1. Próbki inkubować w temperaturze 70 °C (zamiast 56 °C) przez 10 minut przy użyciu wytrząsarki-inkubatora z prędkością 1 400 obr./min.
      2. Dodać bufor elucyjny podgrzany w temperaturze 70 °C do kolumny, inkubować przez 5 minut w temperaturze 70 °C i eluować DNA przez odwirowanie zgodnie z instrukcjami producenta. Oznaczyć stężenie wyekstrahowanego DNA metodą oceny spektrofotometrycznej przy długości fali 260/280 nm.
3. Przygotowanie plazmidu zawierającego insercje stawów sygnałowych TREC i KREC (SJ) oraz gen referencyjny TCRAC:
   1. Amplifikować DNA wyekstrahowane z PBMC (w celu uzyskania fragmentów TREC-SJ, KREC-SJ i TCRAC) starterami specyficznymi dla TREC, KREC i TCRAC (patrz Tabela 1).
      UWAGA: Na końcu 5' startery specyficzne dla KREC i TCRAC zawierają miejsca restrykcyjne HindIII i SpeI (małymi literami w sekwencjach pokazanych w tabeli 1) z odpowiednią liczbą flankujących dodatkowych nukleotydów (oznaczonych kursywą); obie cechy nie występują w kanonicznych sekwencjach KREC i TCRAC.

TRECs	naprzód	5'-AAA GAG GGC AGC CCT CTC CAA GGC-3'
	rewers	5'-GGC TGA TCT TGT KTG ACA TTT GC-3'
KRECs	naprzód	5'-CCC aag ctt TCA GCG CCC ATT ACG TTT CT-3'
	rewers	5'-CCC aag ctt GTG AGG GAC ACG CAG CC-3'
TCRAC	naprzód	5'-Gac tag tAT GAG ACC GTG ACT TGC CAG-3'
	rewers	5'-Gac tag tGC TGT TGA TGA AGG CGT TTG C-3'

Tabela 1. Podkłady używane do procedur klonowania. Na końcu 5', małymi literami pokazane są nukleotydy odpowiadające miejscom enzymu restrykcyjnego, podczas gdy kursywą pokazane są dodane nukleotydy flankujące.

3. 2. Przeprowadzić reakcje PCR w końcowej objętości 25 μl, składającej się z 1x buforu II, 1,5 mM MgCl₂, mieszanki dNTP (po 200 μM każdy), starterów o końcowym stężeniu 900 nM, polimerazy DNA AmpliTaq (2,5 U/25 μl) i 100 ng DNA.
   3. Stosować następujące parametry PCR: pierwszy etap w temperaturze 95 °C przez 10 minut, następnie 40 cykli w temperaturze 95 °C przez 30 sekund; 60 °C przez 30 sekund; 72 °C przez 30 sekund, a na koniec 1 cykl w temperaturze 72 °C przez 10 minut. Długość produktu PCR powinna wynosić: 380 pz dla TREC, 166 punktów bazowych dla KREC, 381 punktów bazowych dla TCRAC.
   4. Umieścić produkt PCR TREC-SJ w miejscu akceptora T-A wektora pCR2.1-TOPO. Przekształć plazmidowe DNA w chemicznie kompetentne komórki XL1-blue poprzez szok termiczny zgodnie z protokołem dostarczonym z komórkami. Wśród kolonii, które rosną z powodu oporności na ampicylinę, zidentyfikuj te, które będą nosicielami wkładki, która będzie wyglądać na białą z powodu utraconej komplementacji β-galaktozydazy, i zaszczepij je w naczyniu głównym. Na koniec zidentyfikuj kolonie zawierające fragment TREC za pomocą PCR.
   5. Rozwiń jedną ze zidentyfikowanych kolonii i oczyść plazmidowe DNA za pomocą zestawu do miniprzygotowania plazmidu i postępuj zgodnie z instrukcjami producenta. Trawić plazmidowe DNA i produkt amplifikowany TCRAC enzymem restrykcyjnym SpeI i ligować fragment TCRAC do miejsca restrykcji SpeI.
   6. Przekształć plazmidowe DNA w niebieskie komórki XL1 i zidentyfikuj kolonie zawierające fragment TCRAC za pomocą PCR. Rozwiń jedną ze zidentyfikowanych kolonii i oczyść plazmidowe DNA za pomocą zestawu miniprep plazmidu.
   7. Strawić plazmidowe DNA i produkt amplifikowany KREC za pomocą HindIII i sklonować fragment KREC-SJ do miejsca restrykcji HindIII. Przekształć plazmidowe DNA w niebieskie komórki XL1 i zidentyfikuj kolonie zawierające trzeci fragment za pomocą PCR.
   8. Sprawdzić, poprzez bezpośrednie sekwencjonowanie, obecność trzech insercji i brak mutacji. Mapa końcowego plazmidu z potrójną insercją jest przedstawiona na rysunku 1.

Rysunek 1. Mapa plazmidu z potrójną wkładką. Mapa plazmidu z potrójną insercją pokazująca położenie sekwencji TREC, KREC, TCRAC i miejsc enzymów restrykcyjnych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. 9. Rozwiń jedną ze zidentyfikowanych kolonii, oczyść plazmidowe DNA za pomocą zestawu do plazmidu midiprep. Określić stężenie plazmidowego DNA przez spektrofotometryczne oszacowanie przy 260/280 nm, a jakość DNA przez elektroforezę żelową. Przechowywać odpowiednie porcje plazmidu w temperaturze -80 °C (np. 50 μl każdy).

2. Przygotowanie krzywej standardowej

UWAGA: Przygotuj wszystkie rozcieńczenia w buforze 0.1x TE w miejscu specjalnie zaprojektowanym do przechowywania przeniesionego DNA.

1. Obliczyć masę liczby kopii plazmidu będących przedmiotem zainteresowania (patrz tabela 2), biorąc pod uwagę, że rozmiar plazmidu wynosi 4,846 pz i że średnia masa na pz wynosi 1,096 x ^10-21 g/pz, a zatem: m_p = (4,846 pz) x (1,096 x ^10-21 g/bp) = 5,311,216 x ^10-21 g = 5,311 x ^10-18 g.

szt.

Kopiuj #	x 5.311 x 10-18 g	Masa plazmidowego DNA (g)
1 x 106		5.311 x 10-12
1 x 105		5.311 x 10-13
1 x 104		5.311 x 10-14
1 x 103		5.311 x 10-15
1 x 102		5.311 x 10-16

Tabela 2. Masa plazmidu potrzebna dla każdego punktu rozcieńczenia krzywej wzorcowej.

2. Obliczyć stężenia plazmidowego DNA, dzieląc potrzebne masy plazmidu przez objętość (5 μl), która ma być pipetowana do każdej reakcji (patrz Tabela 3).

szt. szt.

Masa plazmidowego DNA (g)	÷ 5 μl	Końcowe stężenie plazmidowego DNA (g/μl)
5.311 x 10-12		1.062 x 10-12
5.311 x 10-13		Wymiary: 1.062 x 10-13
5.311 x 10-14		Wymiary: 1.062 x 10-14
5.311 x 10-15		1.062 x 10-15
5.311 x 10-16		1.062 x 10-16

Tabela 3. Obliczanie stężeń plazmidu potrzebnych dla każdego punktu rozcieńczenia.

3. Rozmrozić podwielokrotność plazmidu. Linearyzować 2 μg plazmidowego DNA za pomocą XhoI i oznaczyć jego stężenie przez oszacowanie spektrofotometryczne przy 260/280 nm.
4. Przygotować odpowiednie rozcieńczenie zlinearyzowanego plazmidowego DNA, aby uzyskać wygodny roboczy roztwór podstawowy na początek (np. 100 ng / μl = 0,1 μg / μl = 1 x ^10-7 g / μl). Pozostałą część zlinearyzowanego plazmidowego DNA przechowywać w temperaturze -80 °C.
5. Wykonaj dogodną liczbę rozcieńczeń 1:10 lub 1:100, aby doprowadzić plazmid do bardziej użytecznego stężenia 1 x ^10-10 g/μl.
6. Użyć wzoru C₁V₁ = C₂V₂ w celu obliczenia objętości rozcieńczenia (V₂ – V₁) potrzebnej do przygotowania pierwszego wzorcowego punktu krzywej serii (1 x 10⁶ kopii, co odpowiada 1,062 x 10-12 g/5 μl; patrz tabela 4).

szt. szt. szt. szt. szt. szt. szt.

Stężenie początkowe (g/μl)	Plazmidowe DNA objętości (μl)	Obj. rozcieńczalnika (μl)	Objętość końcowa (μl)	Stężenie końcowe (g/μl)	Ostateczny numer kopii plazmidowego DNA/5μl
Kategoria1	Wersja1	V2-V 1	Wersja2	C2
1 x 10-7	5 μl	45 μl	50 μl	1 x 10-8	N/a
1 x 10-8	5 μl	495 μl	500 μl	1 x 10-10	N/a
1 x 10-10	5 μl	465 μl	470 μl	1.062 x 10-12	1 x 106
1.062 x 10-12	50 μl	450 μl	500 μl	Wymiary: 1.062 x 10-13	1 x 105
Wymiary: 1.062 x 10-13	50 μl	450 μl	500 μl	Wymiary: 1.062 x 10-14	1 x 104
Wymiary: 1.062 x 10-14	50 μl	450 μl	500 μl	1.062 x 10-15	1 x 103
1.062 x 10-15	50 μl	450 μl	500 μl	1.062 x 10-16	1 x 102

Tabela 4. Obliczenia rozcieńczenia.

7. Postępuj z regularną serią rozcieńczeń w stosunku 1:10, aby uzyskać pozostałe standardowe punkty krzywej.
   UWAGA: Nie zapomnij na krótko zawirować każdego rozcieńczenia plazmidu przed wykonaniem następnego.
   UWAGA: Najwyższe rozcieńczenie krzywej wzorcowej (10 kopii/5 μl) musi być przygotowane tuż przed wykonaniem testu, ponieważ tak mała ilość plazmidowego DNA nie jest wystarczająco stabilna, aby można ją było przechowywać do wykorzystania w przyszłości.
8. Punkty rozcieńczenia potrójnego plazmidu przechowywać w temperaturze -80 °C w oddzielnych probówkach do czasu użycia. Rozcieńczony potrójny plazmidowy DNA jest wysoce stabilny przez co najmniej 6 miesięcy.

3. Ekstrakcja DNA z próbek docelowych

1. Oddzielić PBMC od krwi obwodowej pobranej do probówek EDTA przy użyciu metody separacji gradientu gęstości.
   UWAGA: Alternatywnie należy użyć innego odpowiedniego materiału wyjściowego (np. posortowanych subpopulacji limfocytów, krwi pełnej) jako próbki docelowej.
2. Ekstrahować DNA z PBMC z próbek docelowych, jak podano w kroku 1.2.

4. PCR w czasie rzeczywistym do kwantyfikacji TREC i KREC

1. Przygotowanie i załadunek płyty:
   1. Ułożyć płytkę PCR zawierającą co najmniej dwie kontrpróby dla każdej próbki, która ma być poddana analizie: krzywa wzorcowa (A→F 1→4), kontrola dodatnia (CTRL⁺; G1→4) i sterowanie bez szablonu (NTC; H 1→4).
      UWAGA: Obserwuj typowy schemat w Tabeli 5, ale można utworzyć różne formaty. Pamiętaj, że TREC i KREC będą wzmacniane razem w tych samych studzienkach, różniących się od tych z TCRAC.

T T T T

	TRECs+KRECsa		TCRACb		TRECs+KRECs		TCRAC		TRECs+KRECs		TCRAC
	1	cyfra arabska	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
A	106 kopii	106 kopii	106 kopii	106 kopii	1	1	1	1	9	9	9	9
B	105 kopii	105 kopii	105 kopii	105 kopii	cyfra arabska	cyfra arabska	cyfra arabska	cyfra arabska	10	10	10	10
C	104 kopie	104 kopie	104 kopie	104 kopie	3	3	3	3	11	11	11	11
D	103 kopie	103 kopie	103 kopie	103 kopie	4	4	4	4	12	12	12	12
E	102 kopie	102 kopie	102 kopie	102 kopie	5	5	5	5	13	13	13	13
F	10 kopii	10 kopii	10 kopii	10 kopii	6	6	6	6	14	14	14	14
G	CTRL+	CTRL+	CTRL+	CTRL+	7	7	7	7	15	15	15	15
H	NTC (Międzynarodowa Sieć	NTC (Międzynarodowa Sieć	NTC (Międzynarodowa Sieć	NTC (Międzynarodowa Sieć	8	8	8	8	16	16	16	16

Tabela 5. Próbka płytki PCR w czasie rzeczywistym.

1. 2. Obliczyć całkowitą liczbę potrzebnych studzienek (uwzględnić 1-2 dodatkowe studzienki w celu uwzględnienia ewentualnych błędów pipetowania) i przygotować mieszankę wzorcową dla TREC/KREC i TCRAC w oddzielnych probówkach (patrz Tabela 6).
      UWAGA: Startery i sondy specyficzne dla TREC, KREC i TCRAC są wymienione w Tabeli 7. Stężenia końcowe startera i sondy wynoszą odpowiednio 900 nM i 200 nM.

TRECs/KRECs		TCRAC
H2O	2 μl	H2O	4,75 μl
KREC dla 20 pmol/μl	1,125 μl	TCRAC dla 20 pmol/μl	1,125 μl
KREC rev 20 pmol/μl	1,125 μl	TCRAC rev 20 pmol/μl	1,125 μl
Sonda KREC 10 pmol/μl	0,5 μl	Sonda TCRAC 10 pmol/μl	0,5 μl
TREC dla 20 pmol/μl	1,125 μl	2x TaqMan Uniwersalny Mistrz PCR Mix	12,5 μl
TREC rev 20 pmol/μl	1,125 μl
Sonda TREC 10 pmol/μl	0,5 μl
2x TaqMan Uniwersalny Mistrz PCR Mix	12,5 μl

Tabela 6. Objętość odczynników potrzebnych do wskazanych studzienek.

TRECs	naprzód	5'-CAC ATC CCT TTC AAC CAT GCT-3'
	rewers	5'-TGC AGG TGC CTA TGC ATC A-3'
	Sondy	5'-FAM-ACA CCT CTG GTT TTT GTA AAG GTG CCC ACT-TAMRA-3'
KRECs	naprzód	5'-TCC CTT AGT GGC ATT ATT TGT ATC ACT-3
	rewers	5'-AGG AGC CAG CTC TTA CCC ZNACZNIK AGT-3'
	Sondy	5'-HEX-TCT GCA CGG GCA GCA GGT TGG-TAMRA-3
TCRAC	naprzód	5'-TGG CCT AAC CCT GAT CCT CTT-3'
	rewers	5'-GGA TTT AGA GTC TCT CAG CTG GTA CAC-3
	Sondy	5'-FAM-TCC CAC AGA TAT CCA GAA CCC TGA CCC-TAMRA-3'

Tabela 7. Sekwencja startera i sond do testu PCR w czasie rzeczywistym.

1. 3. Dodać 20 μl każdej mieszanki (TRECs/KREC i TCRAC). Przed opuszczeniem pomieszczenia przygotowania odczynników należy uszczelnić płytkę reakcyjną optyczną osłoną samoprzylepną.
   4. W pomieszczeniu do ekstrakcji kwasów nukleinowych podnieś osłonę adhezyjną i dodaj 5 μl próbki genomowego DNA (400 - 500 ng) do studzienek. Dodać 5 μl genomowego DNA (tj. przygotowanego z PBMC uzyskanego z krwi pępowinowej) do studzienek CTRL⁺.
      UWAGA: Jako alternatywę dla krwi pępowinowej, należy użyć DNA z tej samej znanej, dodatniej próbki krwi obwodowej lub puli próbek, lub przygotować "sztuczny" dodatni wzorzec poprzez zmieszanie określonej ilości plazmidu z potrójną insercją z genomowym DNA z linii komórkowych TREC i KREC-ujemnych.
   5. Dodaj 5 μl wody do studzienek NTC. Ponownie uszczelnij płytkę reakcyjną za pomocą optycznej osłony samoprzylepnej.
   6. Przenieść do miejsca zapewniającego przetrzymanie plazmidowego DNA; rozmrozić każdy punkt rozcieńczenia krzywej wzorcowej plazmidowego DNA tylko przed użyciem i przygotować najwyższe rozcieńczenie (10 kopii/5 μl). Podnieś osłonę adhezyjną tylko z dołków A→H 1→4 i dodaj 5 μl każdego punktu rozcieńczenia krzywej wzorcowej plazmidowego DNA. Ponownie uszczelnij samoprzylepną osłonę.
   7. Sprawdź, czy na dnie studzienek nie ma pęcherzyków, upewniając się w ten sposób, że odczynniki są umieszczone na dnie.
   8. Uruchom test w systemie PCR w czasie rzeczywistym. Standardowy protokół składa się z pierwszego etapu w temperaturze 50 °C przez 2 minuty, wstępnego ogrzewania w temperaturze 95 °C przez 10 minut, a następnie 45 cykli denaturacji w temperaturze 95 °C przez 15 sekund oraz połączonego wyżarzania i wydłużania w temperaturze 60 °C przez 1 minutę.
   9. Zapisz dane na końcu programu PCR.
      UWAGA: Aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego DNA, pamiętaj: aby postępować zgodnie ze zwykłymi zaleceniami dobrej praktyki laboratoryjnej dla ilościowego PCR podczas ustawiania testu PCR w czasie rzeczywistym: użyj oddzielnych obszarów/pomieszczeń do ekstrakcji kwasów nukleinowych, przygotowania odczynników, manipulacji plazmidem, reakcji amplifikacji; używać oddzielnych zestawów pipet; W razie potrzeby zmień rękawice/płaszcze.
2. Wyniki i obliczenia:
   UWAGA: Poniższe kroki są oparte na naszym doświadczeniu w korzystaniu z oprogramowania dostarczonego z urządzeniem do PCR w czasie rzeczywistym, o którym mowa w Tabeli materiałów, ale ogólnie rzecz biorąc, powinny one mieć zastosowanie do innych platform i oprogramowania do analizy PCR w czasie rzeczywistym. Należy pamiętać, że nawet w przypadku korzystania z tego samego oprogramowania zwykle istnieje więcej niż jeden sposób wykonania wymaganych poleceń (np. ikon, skrótów).
   1. Otwórz zapisany plik wyników w oprogramowaniu i kliknij zakładkę "Wyniki". W górnej części okna kliknij menu "Analiza" i wybierz "Ustawienia analizy". Pozwól oprogramowaniu automatycznie określić próg, wybierając detektory "Wszystkie" i "Auto Ct" (Ct = cykl progowy. Pozwól oprogramowaniu ustawić "Automatyczną linię bazową" w celu domyślnego usuwania tła.
   2. Kliknij zakładkę o nazwie "Wykres amplifikacji" i w skrajnej prawej części okna wybierz jeden z trzech "detektorów" z odpowiedniego menu rozwijanego (np. zacznij od TREC). Tuż poniżej wybierz "Manual Ct", aby ręcznie ustawić próg; Przejdź do dolnej części okna i wybierz studzienki odpowiadające punktom rozcieńczenia krzywej standardowej wybranego detektora, aby wyświetlić wykresy amplifikacji. Aby to zrobić, po prostu kliknij i przeciągnij myszą po odpowiednich komórkach tabeli.
      1. Aby ręcznie dostosować próg, przeciągnij czerwoną linię progu w górę iw dół, a następnie kliknij "Analizuj", aby ponownie przeanalizować wyniki. Aby sprawdzić, jak ustawienie progu wpływa na wyniki, wybierz zakładkę "Raport" i zobacz wynikowe Ct odpowiednich punktów rozcieńczenia krzywej standardowej. Przesuwając próg, staraj się postępować zgodnie z poniższymi zaleceniami, aby uzyskać optymalne rozmieszczenie.
      2. Wróć do zakładki "Wykres wzmocnienia" i sprawdź, czy próg znajduje się w obszarze wykładniczego wzmocnienia wystarczająco powyżej szumu tła, ale poniżej fazy plateau. Jeśli wykres wzmocnienia nie jest pokazany w skali logarytmicznej, kliknij wykres prawym przyciskiem myszy, aby przywołać "Ustawienia wykresu" i ustaw ustawienie osi Y po uruchomieniu jako "log", ustaw próg w połowie długości w liniowej części wykresu i obserwuj krzywe wzmocnienia w przybliżeniu równoległe do siebie.
      3. Kliknij zakładkę "Raport", aby zobaczyć wyniki Ct. Upewnij się, że rozmieszczenie progów dało wyniki, które maksymalizują precyzję dwóch powtórzeń każdej krzywej wzorcowej punktów rozcieńczenia.
      4. Sprawdzić, czy próg jest umieszczony w punkcie, który najlepiej odzwierciedla skrajne rzędy wielkości punktów rozcieńczenia krzywej wzorcowej (optymalna czułość). Powtórzyć krok 4.2.2 i pozostałe podetapy dla pozostałych dwóch detektorów (KREC i TCRAC).
      5. Przejdź do zakładki Raport, ponownie przeciągnij myszką w tabeli w dolnej części okna, aby wybrać komórki odpowiadające studzienkom krzywej standardowej dla wszystkich detektorów (TRECs, KRECs, TCRAC). Sprawdzić, czy wynikowe Ct trzech tarcz jest bardzo podobne w tych samych punktach rozcieńczenia (np. różnica nie większa niż 0,5 Ct). W razie potrzeby dostosuj progi i sprawdź ponownie.
         UWAGA: Ponieważ plazmid z potrójną wkładką zawiera pojedynczą kopię każdego celu, a zatem współczynnik amplifikacji powinien być teoretycznie bliski 1:1:1. W niektórych przypadkach może być konieczne ręczne dostosowanie linii bazowej dla jednego lub więcej detektorów, aby uzyskać lepsze wyniki. Wystarczy przywołać okno "Ustawienia analizy", wybrać detektor, dla którego potrzebna jest regulacja, a następnie ustawić "Ręczną linię bazową" i wstawić niestandardowe wartości dla cykli początkowych i końcowych (zwykle od 3 do 15). Następnie kliknij "OK & Reanalyze" i ponownie sprawdź poprzednie punkty.
   3. Zaakceptuj sesję eksperymentalną dopiero po zweryfikowaniu następujących elementów:
      1. Kliknij zakładkę "Raport", przejdź do dolnej części okna, wybierz studnie NTC i sprawdź, czy odpowiadający im Ct to "Undet" (tj. w studniach NTC nie występuje wzmocnienie).
      2. Wybierz zakładkę "Krzywa standardowa" i spójrz na prawo od okna wykresu; wybierz detektory z menu rozwijanego i sprawdź, czy zgłoszone nachylenie krzywej standardowej mieści się w zakresie od -3,55 do -3,32 (co odpowiada sprawności PCR 91 - 100%)
      3. Upewnij się, że współczynnik determinacji (R²) jest wyższy niż 0,998 (Rysunek 2), odczytując jego wartość tuż pod nachyleniem i przecięciem (w tej samej zakładce "Krzywa standardowa", po wybraniu każdego detektora).
         UWAGA: Zwróć uwagę na skrajne punkty rozcieńczenia, ponieważ ich niewspółosiowość może łatwiej wpływać na nachylenie (mają one duży efekt "dźwigni" na linii regresji). W szczególności należy pamiętać, że najwyższe rozcieńczenie plazmidu może ulec degradacji szybciej niż oczekiwano. Jednakże, gdy tylko jest to możliwe, warto ich nie odrzucać, ponieważ racjonalnym podejściem może być uznanie 100 za granicę wykrywania ilościowego: innymi słowy, dla próbek między 10 a 100 wynik może być podany jako <100 lub "dodatni, ale niekwantyfikowalny", podczas gdy jeśli znajduje się poza zakresem krzywej (<10), może być zgłoszony jako 0 lub "niewykrywalny".
         UWAGA: Przydatne może być prowadzenie archiwum wartości Ct poprzednich rozcieńczeń krzywej wzorcowej, w celu obliczenia średniej wartości dla każdego punktu rozcieńczenia, która ma być przechowywana jako rodzaj optymalnego zakresu "referencyjnego" lub wewnętrznej kontroli jakości dla przyszłych eksperymentów (np. Obliczenie średniej i SD w celu zbudowania kart kontrolnych Shewhart). Analogicznie, pomocne może być prowadzenie archiwum przeszłych Ct kontroli pozytywnej.

Rysunek 2. Standardowe krzywe dla TREC, KREC i TCRAC. Wykresy standardowych punktów krzywej i oszacowania linii logarytmicznej regresji dla TREC (A), KREC (B) i TCRAC (C) są budowane w celu sprawdzenia zgodności z idealną szybkością wykładniczego wzmocnienia (nachylenie = 3,32), która odpowiadałaby wydajności 100%. Ct: cykl progowy; R²: współczynnik determinacji regresji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. 3. 4. Kliknij zakładkę "Raport" i sprawdź, czy Ct kontroli dodatniej (znajdujący się w odpowiednich komórkach tabeli pod wykresem) jest zgodny z wynikami poprzednich testów na tej samej znanej kontroli dodatniej.
         UWAGA: Zakładka "Raport" pokazuje ilość TREC, KREC i TCRAC badanych próbek, które oprogramowanie obliczyło przez interpolację z odpowiedniej krzywej wzorcowej, przy użyciu wartości Ct uzyskanych po prawidłowym ustawieniu progu i linii bazowej (nowa analiza z nowym progiem/linią bazową zmieniłaby te wyniki). Aby zobaczyć, gdzie odbywa się interpolacja na krzywej standardowej, wybierz zakładkę "Krzywa standardowa", a następnie wybierz żądane dołki i poszukaj czarnego "X" pojawiającego się na linii regresji. Ich wartość na osi y jest wielkością interpolowaną. W przypadku stosowania zawsze tej samej kontroli dodatniej można zbudować odpowiednie zakresy referencyjne lub wykresy kontroli jakości, na podstawie wcześniejszych wartości określonych w kontroli dodatniej.
   4. Kliknij menu "Plik", "Zapisz", a następnie "Eksportuj" do pliku .csv, aby wyeksportować ilości wszystkich studzienek w pliku tekstowym zawierającym wartości oddzielone przecinkami.
   5. Zaimportuj plik the.csv w arkuszu kalkulacyjnym i oblicz liczbę TREC lub KREC na 10⁶ PBMC, odpowiednio ustawiając następujący wzór: [(średnia ilość TREC lub KREC) / (średnia ilość TCRAC/2)] x 10⁶
      UWAGA: Średnia ilość TCRAC jest dzielona przez 2, ponieważ w każdej komórce znajdują się dwie kopie genu TCRAC, np. po jednej dla każdego chromosomu.
      UWAGA: Można wziąć pod uwagę spójność ostatecznej liczby TREC i KREC kontroli dodatniej, ale należy pamiętać, że wartości nie będą idealnie zgodne ze względu na dodatkową zmienność punktów rozcieńczenia krzywej wzorcowej. W przypadku dużej rozbieżności może być konieczne powtórzenie eksperymentu. Również w tym przypadku wykresy kontrolne mogą być zbudowane w celu ustawienia odpowiedniego zakresu odniesienia.
   6. (opcjonalnie, ale zalecane) Jeśli dostępne są wyniki pełnej morfologii krwi, należy obliczyć TREC lub KREC na ml krwi, korzystając z następującego wzoru:
      TREC lub KREC na 1 x 10⁶) x (liczba limfocytów + monocytów w 1 ml krwi) / 10⁶ = kopie/ml.

Results

Test został przeprowadzony na reprezentatywnej próbie 87 zdrowych osób z grupy kontrolnej: 42 dzieci w wieku 0 - 17 lat (mężczyźni/kobiety: 25/17) i 45 dorosłych w wieku 24 - 60 lat (mężczyźni/kobiety: 29/16). Wyniki uzyskano jako TREC i KREC na 10⁶ PBMC, a następnie obliczono TREC i KREC na ml krwi.

Liczba TREC zmniejsza się wraz z wiekiem z powodu inwolucji grasicy,4 w szczególności w bardzo ostry sposób od 0 do 3 - 4 lat. U dorosłych liczba TREC zależy również od płci,...

Discussion

Kwantyfikacja TREC i KREC może być uważana za dobre oszacowanie niedawnej produkcji grasicy i szpiku kostnego, pod warunkiem uwzględnienia pewnych zastrzeżeń. Mimo że bezwzględna metoda kwantyfikacji wykorzystująca krzywą standardową wymaga większej liczby odczynników i więcej miejsca na płytce reakcyjnej PCR w czasie rzeczywistym, zapewnia bardzo dokładne wyniki ilościowe, ponieważ nieznane ilości próbek są interpolowane z krzywych standardowych zbudowanych na znanych ilościach materiału wyjściowego. Co więcej, metoda t...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Histopaque-1077	Sigma Aldrich SRL	10771-500 ML	metoda separacji gradientu gęstości
QIAamp DNA Blood Mini Kit (250)	QIAGEN	51106	Ekstrakcja DNA
Niezmodyfikowane oligonukleotydy DNA HPSF 0,01 mmol	Odczynniki Eurofins MWG Operon/Carlo Erba S.r.l		Zawiesić liofilizowany produkt do 100 pmol/&mikro; l
Polimeraza DNA AmpliTaq: w tym 10x bufor II i 25 mM MgCl2	Applied Biosystems/Life-Technologies	N8080156
GeneAmp dNTP Blend (100 mM)	Applied Biosystems/Life-Technologies	N8080261
Zestaw do klonowania TOPO TA do subklonowania	Invitrogen/Life-Technologies	K4500-01
XL1-Blue Kompetentne komórki do subklonowania	Stratagene	200130
PureYield Plasmid Miniprep System	Promega	A1223
SpeI 500U	New England Biolabs	R0133S
HindIII-HF 10,000 U	New England Biolabs	R3104S
PureYield Plasmid Midiprep System	Promega	A2492
XhoI 5,000 U	New England Biolabs	R0146S
TRIS Utrapure	Sigma Aldrich SRL	T1503
EDTA	Sigma Aldrich SRL	E5134
TE bufor (1 mM TRIS i 0,1 mM EDTA)
TaqMan Universal PCR Master	Mix Applied Biosystems/Life-Technologies	4364338
Podwójnie znakowane sondy HPLC 0,01 mmol	Eurofins MWG Operon/Carlo Erba Reagenty S.r.l		Zawiesić liofilizowany produkt do 100 pmol/&mikro; l
Spektrofotometr NanoDrop 2000c	ThermoFisher
Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler	Applied Biosystems/Life-Technologies	4359659
Fast 7500 Real-Time PCR System Applied	Biosystems/Life-Technologies
Oprogramowanie do wykrywania sekwencji SDS 1.4	Biosystemy stosowane/Technologie