Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Jednoczesna kwantyfikacja kręgów wycinania receptora komórek T (TREC) i kręgów wycinania rekombinacji z delecją K (KREC) za pomocą PCR w czasie rzeczywistym

16.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52184

⸱

6 grudnia 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1CREA, Diagnostics Department, Spedali Civili di Brescia

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy metodę jednoczesnej kwantyfikacji okręgów wycinania receptora limfocytów T (TREC) i kręgów wycinania rekombinacji deklacyjnej K (KRECs). Test TREC/KREC może być stosowany jako marker wydalania grasicy i szpiku kostnego.

Streszczenie

Kręgi wycinania receptora limfocytów T (TREC) i kręgi wycinania rekombinacji delokacji K (KREC) są kolistymi elementami DNA powstającymi podczas procesu rekombinacji, które tworzą receptory komórek T i B. Ponieważ TREC i KREC nie są w stanie się replikować, są rozcieńczane po każdym podziale komórki, a zatem utrzymują się w komórce. Ich ilość we krwi obwodowej można traktować jako oszacowanie wydalania grasicy i szpiku kostnego. Łącząc dobrze ugruntowany i powszechnie stosowany test TREC ze zmodyfikowaną wersją testu KREC, opracowaliśmy dupleksowy ilościowy PCR w czasie rzeczywistym, który umożliwia ilościowe oznaczanie zarówno nowo wytworzonych limfocytów T, jak i B w jednym teście. Liczbę TREC i KREC uzyskuje się za pomocą krzywej standardowej przygotowanej przez seryjne rozcieńczanie stawów sygnałowych TREC i KREC sklonowanych w plazmidzie bakteryjnym, wraz z fragmentem genu stałej receptora komórek T, który służy jako gen odniesienia. Wyniki są podawane jako liczba TREC i KREC/106 komórek lub na ml krwi. Okazało się, że kwantyfikacja tych fragmentów DNA jest przydatna do monitorowania rekonstytucji immunologicznej po przeszczepie szpiku kostnego zarówno u dzieci, jak i dorosłych, w celu lepszej charakterystyki niedoborów immunologicznych lub lepszego zrozumienia niektórych działań leków immunomodulujących.

Wprowadzenie

Kręgi wycinania receptora limfocytów T (TREC) i kręgi wycinania rekombinacji delokacji K (KREC) to małe okrągłe elementy DNA, które są wycinane odpowiednio w proporcji limfocytów T i B podczas procesu rekombinacji genomowego DNA, co prowadzi do powstania wysoce zróżnicowanego repertuaru receptorów komórek T i B. Nie pełnią żadnej funkcji, ale ponieważ są stabilne i nie mogą być replikowane, są rozcieńczane po każdym podziale komórki, dzięki czemu utrzymują się tylko w jednej z dwóch komórek potomnych. W związku z tym ich poziomy we krwi obwodowej można przyjąć jako oszacowanie ilości grasicy i szpiku kostnego.

Podczas gdy test TREC był głównie używany w ciągu ostatnich 15 lat do oceny zasięgu produkcji grasicy,1 test KREC, który początkowo został opracowany do pomiaru proliferacji komórek B i ich wkładu w homeostazę komórek B w zdrowiu i chorobie,2 został dopiero niedawno zaproponowany jako marker produkcji szpiku kostnego. 3,4 W tym miejscu opisujemy opracowaną przez nas metodę jednoczesnej kwantyfikacji zarówno TREC, jak i KREC. 4

Dzięki tej połączonej metodzie, zmienność związana z kwantyfikacją DNA za pomocą PCR w czasie rzeczywistym jest eliminowana dzięki zastosowaniu unikalnej krzywej standardowej uzyskanej przez rozcieńczenie plazmidu z potrójną insercją zawierającego fragmenty TREC, KREC i genu TCRAC (T-cell receptor alpha constant) w stosunku 1:1:1. Pozwala to na dokładniejszą ocenę numeru kopii TREC i KREC. Co więcej, jednoczesna kwantyfikacja dwóch celów w tej samej reakcji pozwala na obniżenie kosztów odczynników.

Proponowany test TREC/KREC może być przydatny do pomiaru zakresu produkcji komórek T i B u dzieci i dorosłych z ciężkim złożonym niedoborem odporności (SCID),4 Powszechnym zmiennym niedoborem odporności,5 chorobami autoimmunologicznymi,6-8 i zakażeniem HIV. 9 Ponadto może być stosowany do monitorowania odzyskiwania odporności po przeszczepieniu krwiotwórczych komórek macierzystych10, wymianie enzymów11 oraz terapiach przeciwwirusowych9 lub immunomodulujących. 6-8 Wreszcie, ponieważ pacjenci z SCID są rozpoznawani za pomocą testu TREC pomimo podstawowych wad genetycznych, a pacjenci z agammaglobulinemią mogą być identyfikowani za pomocą kwantyfikacji KREC, test TREC / KREC może być również stosowany do wykrywania niedoborów odporności w programach badań przesiewowych noworodków. 12 W takim przypadku badanie musi być przeprowadzone na DNA wyekstrahowanym z małych plamek krwi osuszonych i wysuszonych na bibule filtracyjnej, musi być bardzo czułe i specyficzne dla chorób docelowych, a także wysoce powtarzalne i opłacalne.

Wprowadzenie kwantyfikacji KREC do testu powinno poprawić wyniki badań przesiewowych noworodków pod kątem niedoborów odporności, które są rutynowo przeprowadzane w niektórych częściach USA (WI, MA, CA) od 2008 roku, kiedy Wisconsin jako pierwszy wprowadził analizę TREC do swojego programu badań przesiewowych po porodzie. 13

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Oświadczenie etyczne: Niniejszy protokół jest zgodny z wytycznymi naszej instytucji, Spedali Civili di Brescia

1. Przygotowanie plazmidu z „potrójną wstawką”

  1. Wybór i przygotowanie odpowiedniego materiału wyjściowego:
    1. Pozyskać próbkę zawierającą komórki z dużym prawdopodobieństwem obecności TRECs i KRECs wykrywalnych metodą PCR, np. krew obwodową od młodej, zdrowej osoby, pobraną do probówek z EDTA.
      UWAGA: Pierwotnie opracowaliśmy tę metodę, wykorzystując tymocyty dla TRECs oraz komórki mononuklearne z fragmentów migdałków dla KRECs, jednak u zdrowych osób ilość TRECs i KRECs jest zazwyczaj wystarczająca, aby umożliwić ich wykrycie za pomocą PCR. Dlatego krew obwodowa powinna być trafną alternatywą, łatwiejszą do pobrania i obróbki. Biorąc pod uwagę, że liczba TRECs w szczególności spada z wiekiem u zdrowych dorosłych, zaleca się pobranie krwi obwodowej od młodej osoby dorosłej lub dziecka.
    2. Wyizolować mononuklearne komórki krwi obwodowej (PBMC) za pomocą standardowej metody rozdziału w gradiencie gęstości.
  2. Ekstrakcja DNA:
    1. Wyekstrahować DNA z PBMC, używając komercyjnego zestawu DNA Blood Mini Kit. Postępować zgodnie z instrukcjami producenta, z wprowadzeniem kilku modyfikacji opisanych poniżej.
      1. Inkubować próbki w temperaturze 70 °C (zamiast 56 °C) przez 10 min, korzystając z inkubatora z wytrząsarką przy 1 400 rpm.
      2. Dodać do kolumny bufor elucyjny podgrzany do 70 °C, inkubować przez 5 min w temperaturze 70 °C i eluować DNA poprzez wirowanie zgodnie z instrukcjami producenta. Określić stężenie wyekstrahowanego DNA za pomocą pomiaru spektrofotometrycznego przy 260/280 nm.
  3. Przygotowanie plazmidu zawierającego wstawki połączeń sygnałowych (SJ) TREC i KREC oraz genu referencyjnego TCRAC:
    1. Amplifikować DNA wyekstrahowane z PBMC (aby uzyskać fragmenty TREC-SJ, KREC-SJ i TCRAC) za pomocą starterów specyficznych dla TRECs, KRECs i TCRAC (patrz Tabela 1).
      UWAGA: Na końcu 5’, startery specyficzne dla KREC i TCRAC zawierają miejsca restrykcyjne HindIII i SpeI (zapisane małymi literami w sekwencjach przedstawionych w Tabeli 1) z odpowiednią liczbą flankujących dodatkowych nukleotydów (oznaczonych kursywą); obie cechy te nie występują w kanonicznych sekwencjach KREC i TCRAC.
TRECsw przód5’-AAA GAG GGC AGC CCT CTC CAA GGC-3’
odwrócić5’-GGC TGA TCT TGT CTG ACA TTT GC-3’
KREC-ydo przodu5’-CCC aag ctt TCA GCG CCC ATT ACG TTT CT-3’
odwrócić5’-CCC aag ctt GTG AGG GAC ACG CAG CC-3’
TCRACdo przodu5’-G5’-TAG TAT GAG ACC GTG ACT TGC CAG-3’
odwrócenie5’-Gac tag tGC TGT TGT TGA AGG CGT TTG C-3’

Tabela 1. Primery użyte w procedurach klonowania. Na końcu 5' małymi literami oznaczono nukleotydy odpowiadające miejscom cięcia enzymów restrykcyjnych, natomiast kursywą oznaczono dodane nukleotydy flankujące.

    1. Przeprowadzić reakcje PCR w końcowej objętości 25 μl, składającej się z 1x Buforu II, 1,5 mM MgCl2, mieszanki dNTP (po 200 µM każdego), starterów w końcowym stężeniu 900 nM, polimerazy DNA AmpliTaq (2,5 U/25 μl) oraz 100 ng DNA.
    2. Zastosować następujące parametry PCR: pierwszy etap w 95 °C przez 10 min, następnie 40 cykli: 95 °C przez 30 s; 60 °C przez 30 s; 72 °C przez 30 s, a na koniec 1 cykl w 72 °C przez 10 min. Długości produktów PCR powinny wynosić: 380 bp dla TRECs, 166 bp dla KRECs, 381 bp dla TCRAC.
    3. Wprowadzić produkt PCR TREC-SJ w miejsce akceptora T-A wektora pCR2.1-TOPO. Przetransformować plazmidowy DNA do chemicznie kompetentnych komórek XL1-blue metodą szoku termicznego zgodnie z protokołem dostarczonym wraz z komórkami. spośród kolonii, które wyrosły dzięki oporności na ampicylinę, zidentyfikować te zawierające insert, które będą białe z powodu utraty komplementacji β-galaktozydazy, i zaszczepić je na płytkę główną. Na koniec zidentyfikować kolonie zawierające fragment TREC za pomocą PCR.
    4. Namnożyć jedną z zidentyfikowanych kolonii i oczyścić plazmidowy DNA przy użyciu zestawu do miniprep plazmidów zgodnie z instrukcją producenta. Strawić plazmidowy DNA oraz produkt amplifikacji TCRAC enzymem restrykcyjnym SpeI i ligować fragment TCRAC w miejsce restrykcyjne SpeI.
    5. Przetransformować plazmidowy DNA do komórek XL1-blue i zidentyfikować kolonie zawierające fragment TCRAC za pomocą PCR. Namnożyć jedną z zidentyfikowanych kolonii i oczyścić plazmidowy DNA przy użyciu zestawu do miniprep plazmidów.
    6. Strawić plazmidowy DNA oraz produkt amplifikacji KREC enzymem HindIII i sklonować fragment KREC-SJ w miejsce restrykcyjne HindIII. Przetransformować plazmidowy DNA do komórek XL1-blue i zidentyfikować kolonie zawierające trzeci fragment za pomocą PCR.
    7. Zweryfikować za pomocą sekwencjonowania bezpośredniego obecność trzech insertów oraz brak mutacji. Mapa końcowego plazmidu z potrójnym insertem przedstawiona jest na Rysunku 1.

Analiza sekwencji genomowego DNA; schemat mapy plazmidu z KREC, TCRAC i TREC do rekombinacji.
Rysunek 1. Mapa plazmidu z potrójną wstawką. Mapa plazmidu z potrójną wstawką przedstawiająca położenie sekwencji TREC, KREC, TCRAC oraz miejsc cięcia enzymów restrykcyjnych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

    1. Namnóż jedną z zidentyfikowanych kolonii, a następnie oczyść plazmidowe DNA przy użyciu zestawu do midiprepu plazmidów. Określ stężenie plazmidowego DNA poprzez pomiar spektrofotometryczny przy 260/280 nm, a jakość DNA za pomocą elektroforezy żelowej. Przechowuj odpowiednie alikwoty plazmidu w temperaturze -80 °C (np. po 50 μl każda).

2. Przygotowanie krzywej wzorcowej

UWAGA: Wszystkie rozcieńczenia należy przygotować w buforze TE 0,1x w miejscu specjalnie przeznaczonym do zapobiegania przenoszeniu DNA.

  1. Oblicz masę interesujących liczb kopii plazmidu (patrz Tabela 2), biorąc pod uwagę, że rozmiar plazmidu wynosi 4,846 bp, a średnia masa na bp wynosi 1.096 x 10-21 g/bp, zatem: mp = (4,846 bp) x (1.096 x 10-21 g/bp) = 5,311.216 x 10-21 g = 5.311 x 10-18 g.
Kopia #x 5,311 x 10-18 gMasa plazmidowego DNA (g)
1 x 1065,311 x 10-12
1 x 1055,311 x 10-13
1 x 1045,311 x 10-14
1 x 1035,311 x 10-15
1 x 1025,311 x 10-16

Tabela 2. Masa plazmidu potrzebna dla każdego punktu rozcieńczenia krzywej wzorcowej.

  1. Oblicz stężenia plazmidowego DNA, dzieląc wymaganą masę plazmidu przez objętość (5 μl), która zostanie pipetowana do każdej reakcji (patrz Tabela 3).
Masa plazmidowego DNA (g)÷ 5 μlKońcowe stężenie plazmidowego DNA (g/μl)
5,311 x 10-121,062 x 10-12
5,311 x 10-131,062 x 10-13
5,311 x 10-141,062 x 10-14
5,311 x 10-151,062 x 10-15
5,311 x 10-161,062 x 10-16

Tabela 3. Obliczanie stężeń plazmidów potrzebnych dla każdego punktu rozcieńczenia.

  1. Rozmrozić alikwot plazmidu. Zlinearyzować 2 μg DNA plazmidowego za pomocą XhoI i oznaczyć jego stężenie metodą spektrofotometryczną przy 260/280 nm.
  2. Przygotować odpowiednie rozcieńczenie zlinearyzowanego DNA plazmidowego, aby uzyskać wygodny roztwór zapasu roboczego (np. 100 ng/μl = 0.1 μg/μl = 1 x 10-7 g/μl). Pozostałą część zlinearyzowanego DNA plazmidowego przechowywać w temperaturze -80 °C.
  3. Wykonać odpowiednią liczbę rozcieńczeń 1:10 lub 1:100, aby doprowadzić plazmid do bardziej praktycznego stężenia 1 x 10-10 g/μl.
  4. Użyć wzoru C1V1 = C2V2 , aby obliczyć objętość rozcieńczenia (V2 – V1) potrzebną do przygotowania pierwszego punktu serii krzywej standardowej (1 x 106 kopii, co odpowiada 1.062 x 10-12 g/5 μl; patrz Tabela 4).
Konc. początkowa (g/μl) Obj. plazmidowego DNA (μl) Obj. rozcieńczalnika (μl) Obj. końcowa (μl) Konc. końcowa (g/μl) Końcowa liczba kopii plazmidowego DNA/5μl 
C1V1V2-V1V2C2
1 x 10-7 5 μl45 μl50 μl1 x 10-8N/D
1 x 10-85 μl495 μl500 μl1 x 10-10N/D
1 x 10-105 μl465 μl470 μl1.062 x 10-121 x 106
1.062  x 10-1250 μl450 μl500 μl1.062 x 10-131 x 105
1.062  x 10-1350 μl450 μl500 μl1.062 x 10-141 x 104
1.062  x 10-1450 μl450 μl500 μl1.062 x 10-151 x 103
1.062 x 10-1550 μl450 μl500 μl1.062 x 10-161 x 102

Tabela 4. Obliczenia rozcieńczeń.

  1. Wykonaj regularną serię rozcieńczeń 1:10, aby uzyskać pozostałe punkty krzywej standardowej.
    UWAGA: Należy pamiętać o krótkim wymieszaniu każdego rozcieńczenia plazmidu wirówką przed przygotowaniem kolejnego.
    UWAGA: Najwyższe rozcieńczenie krzywej standardowej (10 kopii/5 μl) musi być przygotowane bezpośrednio przed wykonaniem analizy, ponieważ tak niewielka ilość plazmidowego DNA nie jest wystarczająco stabilna, aby przechowywać ją do późniejszego użycia.
  2. Przechowuj punkty rozcieńczeń potrójnego plazmidu w temperaturze -80 °C w osobnych probówkach do momentu użycia. Rozcieńczone potrójne plazmidowe DNA jest wysoce stabilne przez co najmniej 6 miesięcy.

3. Ekstrakcja DNA z próbek docelowych

  1. Wyizoluj PBMC z krwi obwodowej pobranej do probówek z EDTA, stosując metodę separacji gradientem gęstości.
    UWAGA: Alternatywnie, jako próbkę docelową można wykorzystać inny odpowiedni materiał wyjściowy (np. posortowane subpopulacje limfocytów, krew pełną).
  2. Wyekstrahuj DNA z PBMC próbek docelowych zgodnie z opisem w kroku 1.2.

4. Real-time PCR do ilościowego oznaczania TRECs i KRECs

  1. Przygotowanie i załadowanie płytki:
    1. Przygotuj płytkę PCR, uwzględniając co najmniej dwie powtórki dla każdej analizowanej próbki: krzywą standardową (A→F 1→4), kontrolę pozytywną (CTRL+; G1→4) oraz kontrolę bez matrycy (NTC; H 1→4).
      UWAGA: Należy stosować schemat przedstawiony w Tabeli 5, jednak możliwe jest zastosowanie innych formatów. Należy pamiętać, że TRECs i KRECs będą amplifikowane wspólnie w tych samych studzienkach, oddzielnie od studzienek dla TCRAC.
TRECs+KRECsaTCRACbTRECs+KRECsTCRACTRECs+KRECsTCRAC
123456789101112
A106 kopie106 kopie106 kopie106 kopie11119999
B105 kopie105 kopie105 kopie105 kopie222210101010
C104 kopie104 kopie104 kopie104 kopie333311111111
D103 kopie103 kopie103 kopie103 kopie444412121212
E102 kopie102 kopie102 kopie102 kopie555513131313
F10 kopii10 kopii10 kopii10 kopii666614141414
GKONTROLA+KONTROLA+KONTROLA+KONTROLA+777715151515
HNTC (kontrola nieprzeniesiona/negatywna)NTC (kontrola nietranskrypcyjna)NTC (kontrola bez matrycy)NTC (kontrola nietranskrypcyjna)888816161616

Tabela 5. Przykładowa płyta do PCR w czasie rzeczywistym.

    1. Oblicz całkowitą liczbę potrzebnych dołków (dołącz 1 - 2 dodatkowe dołki, aby uwzględnić możliwe błędy pipetowania) i przygotuj master mix dla TRECs/KRECs oraz TCRAC w osobnych probówkach (patrz Tabela 6).
      UWAGA: Primery i sondy specyficzne dla TRECs, KRECs i TCRAC wymieniono w Tabeli 7. Końcowe stężenia primerów i sond wynoszą odpowiednio 900 nM i 200 nM.
TRECs/KRECsTCRAC
H2O2 μlH2O4,75 μl
KRECs dla 20 pmol/μl1,125 μlTCRAC dla 20 pmol/μl1,125 μl
KRECs rev 20 pmol/μl1,125 μlTCRAC rev 20 pmol/μl1,125 μl
Sonda KRECs 10 pmol/μl0,5 μlSonda TCRAC 10 pmol/μl0,5 μl
TRECs dla 20 pmol/μl1,125 μl2x TaqMan Universal PCR Master Mix12,5 μl
TRECs rev 20 pmol/μl1,125 μl
Sonda TRECs 10 pmol/μl0,5 μl
2x TaqMan Universal PCR Master Mix 12,5 μl

Tabela 6. Objętość odczynników potrzebna dla wskazanych studzienek.

TRECsforward5’-CAC ATC CCT TTC AAC CAT GCT-3’
reverse5’-TGC AGG TGC CTA TGC ATC A-3’
sonda5’-FAM-ACA CCT CTG GTT TTT GTA AAG GTG CCC ACT-TAMRA-3’
KRECsforward5’-TCC CTT AGT GGC ATT ATT TGT ATC ACT-3
reverse5’-AGG AGC CAG CTC TTA CCC TAG AGT-3’
sonda5’-HEX-TCT GCA CGG GCA GCA GGT TGG-TAMRA-3
TCRACforward5’-TGG CCT AAC CCT GAT CCT CTT-3’
reverse5’-GGA TTT AGA GTC TCT CAG CTG GTA CAC-3
sonda5’-FAM-TCC CAC AGA TAT CCA GAA CCC TGA CCC-TAMRA-3’

Tabela 7. Sekwencje starterów i sond dla badania real-time PCR.

    1. Dodaj 20 µl każdego miksu (TRECs/KRECs i TCRAC). Przed opuszczeniem pomieszczenia do przygotowywania odczynników szczelnie zamknij płytkę reakcyjną optyczną pokrywą adhezyjną.
    2. W pomieszczeniu do ekstrakcji kwasów nukleinowych odchyl pokrywę adhezyjną i dodaj do dołków 5 µl próbki genomicznego DNA (400 - 500 ng). Do dołków CTRL+ dodaj 5 µl genomicznego DNA (tj. przygotowanego z PBMC uzyskanych z krwi pępowinowej).
      UWAGA: Jako alternatywę dla krwi pępowinowej można zastosować DNA z tej samej znanej, pozytywnej próbki krwi obwodowej lub puli próbek, albo przygotować „sztuczny” standard pozytywny poprzez zmieszanie określonej ilości plazmidu z potrójną wstawką z genomicznym DNA z linii komórkowych negatywnych pod kątem TREC i KREC.
    3. Do dołków NTC dodaj 5 µl wody. Ponownie zamknij płytkę reakcyjną optyczną pokrywą adhezyjną.
    4. Przenieś się w miejsce zapewniające zapobieganie przenoszeniu plazmidowego DNA; rozmrażaj każdy punkt rozcieńczenia krzywej standardowej plazmidowego DNA dopiero przed użyciem i przygotuj najwyższe rozcieńczenie (10 kopii/5 µl). Odchyl pokrywę adhezyjną tylko nad dołkami A→H 1→4 i dodaj 5 µl każdego punktu rozcieńczenia krzywej standardowej plazmidowego DNA. Ponownie zamknij pokrywę adhezyjną.
    5. Upewnij się, że na dnie dołków nie ma pęcherzyków powietrza, aby mieć pewność, że odczynniki znajdują się na dnie.
    6. Przeprowadź analizę w systemie Real-time PCR. Standardowy protokół składa się z pierwszego kroku w 50 °C przez 2 min, wstępnego nagrzania do 95 °C przez 10 min, a następnie 45 cykli denaturacji w 95 °C przez 15 s oraz połączonego etapu przyłączania starterów/sond i elongacji w 60 °C przez 1 min.
    7. Zapisz dane po zakończeniu programu PCR.
      UWAGA: Aby uniknąć krzyżowej kontaminacji DNA, pamiętaj o stosowaniu standardowych zaleceń dobrej praktyki laboratoryjnej dla ilościowego PCR podczas przygotowywania analizy Real-time PCR: używaj oddzielnych obszarów/pomieszczeń do ekstrakcji kwasów nukleinowych, przygotowywania odczynników, manipulacji plazmidami oraz reakcji amplifikacji; używaj oddzielnych zestawów pipet; zmieniaj rękawiczki/fartuchy w razie potrzeby.
  2. Wyniki i obliczenia:
    UWAGA: Poniższe kroki opierają się na naszym doświadczeniu w korzystaniu z oprogramowania dostarczonego z instrumentem do real-time PCR wymienionym w Tabeli Materiałów, ale ogólnie powinny one mieć zastosowanie do innych platform i oprogramowań do analizy real-time PCR. Należy pamiętać, że nawet przy korzystaniu z tego samego oprogramowania zazwyczaj istnieje więcej niż jeden sposób wykonania wymaganych poleceń (np. ikony, skróty).
    1. Otwórz zapisany plik z wynikami w oprogramowaniu i kliknij zakładkę „Results”. Na górze okna kliknij menu „Analysis” i wybierz „Analysis settings”. Pozwól oprogramowaniu automatycznie wyznaczyć próg (threshold), wybierając wszystkie detektory („All”) i opcję „Auto Ct” (Ct = próg cyklu). Pozostaw domyślne ustawienie „Automatic Baseline” dla eliminacji tła.
    2. Kliknij zakładkę „Amplification Plot” i w prawej części okna wybierz jeden z trzech „detektorów” z odpowiedniego menu rozwijanego (np. zacznij od TRECs). Poniżej wybierz „Manual Ct”, aby ręcznie ustawić próg; przejdź do dolnej części okna i wybierz dołki odpowiadające punktom rozcieńczenia krzywej standardowej wybranego detektora, aby wyświetlić wykresy amplifikacji. Aby to zrobić, kliknij i przeciągnij myszą po odpowiednich komórkach tabeli.
      1. Aby ręcznie dostosować próg, przeciągnij czerwoną linię progu w górę lub w dół, a następnie kliknij „Analyze”, aby ponownie przeanalizować wyniki. Aby sprawdzić, jak ustawienie progu wpływa na wyniki, wybierz zakładkę „Report” i sprawdź wynikowe wartości Ct dla poszczególnych punktów rozcieńczenia krzywej standardowej. Przesuwając próg, staraj się stosować następujące zalecenia, aby uzyskać optymalne rozmieszczenie.
      2. Wróć do zakładki „Amplification Plot” i upewnij się, że próg znajduje się w regionie amplifikacji wykładniczej, wystarczająco powyżej szumu tła, ale poniżej fazy plateau. Jeśli wykres amplifikacji nie jest wyświetlany w skali logarytmicznej, kliknij prawym przyciskiem myszy na wykresie, aby wywołać „Graph Settings” i ustaw oś Y po zakończeniu przebiegu (post-run) jako „log”, ustaw próg w połowie liniowej części wykresu i zaobserwuj krzywe amplifikacji przebiegające w przybliżeniu równolegle do siebie.
      3. Kliknij zakładkę „Report”, aby zobaczyć wyniki Ct. Upewnij się, że rozmieszczenie progu pozwoliło uzyskać wyniki maksymalizujące precyzję dwóch powtórzeń dla każdego punktu rozcieńczenia krzywej standardowej.
      4. Sprawdź, czy próg jest ustawiony w punkcie, który najlepiej odzwierciedla skrajne rzędy wielkości punktów rozcieńczenia krzywej standardowej (optymalna czułość). Powtórz krok 4.2.2 oraz pozostałe podkroki dla dwóch pozostałych detektorów (KRECs i TCRAC).
      5. Przejdź do zakładki Report, ponownie przeciągnij myszą w tabeli w dolnej części okna, aby wybrać komórki odpowiadające dołkom krzywej standardowej dla wszystkich detektorów (TRECs, KRECs, TCRAC). Upewnij się, że wynikowe Ct dla trzech celów są bardzo podobne w tych samych punktach rozcieńczenia (np. różnica nie większa niż 0,5 Ct). W razie potrzeby ponownie dostosuj progi i sprawdź wyniki.
        UWAGA: Ponieważ plazmid z potrójną wstawką zawiera pojedynczą kopię każdego celu, stosunek amplifikacji teoretycznie powinien wynosić blisko 1:1:1. W niektórych przypadkach konieczne może być ręczne dostosowanie linii bazowej (baseline) dla jednego lub większej liczby detektorów, aby uzyskać lepsze wyniki. Wystarczy wywołać okno „Analysis settings”, wybrać detektor wymagający korekty, ustawić „Manual Baseline” i wprowadzić własne wartości dla cykli początkowego (Start) i końcowego (End) (zazwyczaj od 3 do 15). Następnie kliknij „OK & Reanalyze” i ponownie sprawdź poprzednie punkty.
    3. Zatwierdź sesję eksperymentalną dopiero po zweryfikowaniu następujących punktów:
      1. Kliknij zakładkę „Report”, przejdź do dolnej części okna, wybierz dołki NTC i sprawdź, czy odpowiadające im Ct to „Undet” (tj. w dołkach NTC nie występuje amplifikacja).
      2. Wybierz zakładkę „Standard Curve” i spójrz na prawą stronę okna wykresu; wybierz detektory z menu rozwijanego i sprawdź, czy raportowane nachylenie krzywej standardowej mieści się w zakresie od -3,55 do -3,32 (co odpowiada wydajności PCR od 91% do 100%).
      3. Upewnij się, że współczynnik determinacji (R2) jest wyższy niż 0,998 (Rysunek 2), odczytując jego wartość bezpośrednio pod nachyleniem (slope) i punktem przecięcia (intercept) (w tej samej zakładce „Standard Curve”, po wybraniu każdego detektora).
        UWAGA: Zwróć uwagę na skrajne punkty rozcieńczenia, ponieważ ich rozbieżność może łatwiej wpłynąć na nachylenie (mają duży wpływ „dźwigni” na linię regresji). W szczególności pamiętaj, że najwyższe rozcieńczenie plazmidu może ulec degradacji szybciej niż oczekiwano. Jednakże, o ile to możliwe, warto ich nie odrzucać, ponieważ racjonalnym podejściem może być uznanie wartości 100 za granicę detekcji ilościowej: innymi słowy, dla próbek między 10 a 100 wynik może być raportowany jako <100 lub „pozytywny, ale nieilościowy”, natomiast w przypadku wartości poza zakresem krzywej (<10) może być raportowany jako 0 lub „niewykrywalny”.
        UWAGA: Przydatne może być prowadzenie archiwum wartości Ct poprzednich rozcieńczeń krzywej standardowej w celu obliczenia średniej wartości dla każdego punktu rozcieńczenia, która będzie służyć jako optymalny zakres „referencyjny” lub wewnętrzna kontrola jakości dla przyszłych eksperymentów (np. obliczenie średniej i SD w celu zbudowania kart kontrolnych Shewharta). Analogicznie pomocne może być prowadzenie archiwum poprzednich wartości Ct kontroli pozytywnej.

Wykresy logarytmicznych stężeń TREC, KREC i TCRAC z równaniami regresji liniowej i wartościami R-kwadrat.
Rysunek 2. Krzywe standardowe dla TRECs, KRECs i TCRAC. Wykresy punktów krzywej standardowej i szacunków linii regresji logarytmicznej dla TRECs (A), KRECs (B) i TCRAC (C) zostały opracowane w celu weryfikacji zgodności z idealną wykładniczą stopą amplifikacji (nachylenie = 3,32), która odpowiadałaby wydajności 100%. Ct: cykl progowy; R2: współczynnik determinacji regresji. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

      1. Kliknij zakładkę „Report” i zweryfikuj, czy wartość Ct kontroli dodatniej (znajdująca się w odpowiednich komórkach tabeli pod wykresem) jest zgodna z wynikami poprzednich analiz przeprowadzonych na tej samej znanej kontroli dodatniej.
        UWAGA: Zakładka „Report” pokazuje ilość TRECs, KRECs i TCRAC w badanych próbkach, którą oprogramowanie obliczyło poprzez interpolację z odpowiedniej krzywej wzorcowej, wykorzystując wartości Ct uzyskane po prawidłowym ustawieniu progu (threshold) i linii bazowej (baseline) (nowa analiza z nowym progiem/linią bazową zmieni te wyniki). Aby zobaczyć, gdzie odbywa się interpolacja na krzywej wzorcowej, wybierz zakładkę „Standard Curve”, a następnie zaznacz odpowiednie studzienki i odszukaj czarne „X” pojawiające się na linii regresji. Wartość na osi y dla tych punktów to interpolowana ilość. W przypadku stałego używania tej samej kontroli dodatniej można stworzyć odpowiednie zakresy referencyjne i/lub wykresy kontroli jakości w oparciu o poprzednie wartości wyznaczone dla kontroli dodatniej.
    2. Kliknij menu „File”, „Save”, a następnie „Export” do pliku .csv, aby wyeksportować ilości ze wszystkich studzienek do pliku tekstowego zawierającego wartości rozdzielone przecinkami.
    3. Zaimportuj plik .csv do programu arkusza kalkulacyjnego i oblicz liczbę TRECs lub KRECs na 106 PBMC, stosując odpowiednio następujący wzór: [(średnia ilość TRECs lub KRECs) / (średnia ilość TCRAC/2)] x 106
      UWAGA: Średnia ilość TCRAC jest dzielona przez 2, ponieważ w każdej komórce znajdują się dwie kopie genu TCRAC, np. jedna dla każdego chromosomu.
      UWAGA: Można wziąć pod uwagę spójność końcowej liczby TRECs i KRECs kontroli dodatniej, ale należy pamiętać, że wartości nie będą idealnie zgodne ze względu na dodatkową zmienność punktów rozcieńczenia krzywej wzorcowej. W przypadku rażących rozbieżności eksperyment może wymagać powtórzenia. Ponownie, można stworzyć wykresy kontrolne w celu ustalenia odpowiedniego zakresu referencyjnego.
    4. (opcjonalnie, ale zalecane) Jeśli dostępne są wyniki morfologii krwi obwodowej, oblicz liczbę TRECs lub KRECs na ml krwi, stosując następujący wzór:
      (TRECs lub KRECs na 1 x 106) x (liczba limfocytów + monocytów w 1 ml krwi) / 106 = kopie/ml.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Analizę przeprowadzono na reprezentatywnej próbie 87 zdrowych osób z grupy kontrolnej: 42 dzieci w wieku 0 – 17 lat (mężczyzn/kobiet: 25/17) oraz 45 dorosłych w wieku 24 – 60 lat (mężczyzn/kobiet: 29/16). Wyniki określono jako liczbę TRECs i KRECs na 106 PBMC, a następnie obliczono liczbę TRECs i KRECs na ml krwi.

Liczba TRECs spada wraz z wiekiem ze względu na regresję grasicy,4 w szczególności w sposób bardzo gwałtowny od 0 do 3–4 roku życia. U dorosłych liczba TREC zal...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Kwantyfikacja TREC i KREC może być uważana za dobre oszacowanie niedawnej produkcji grasicy i szpiku kostnego, pod warunkiem uwzględnienia pewnych zastrzeżeń. Mimo że bezwzględna metoda kwantyfikacji wykorzystująca krzywą standardową wymaga większej liczby odczynników i więcej miejsca na płytce reakcyjnej PCR w czasie rzeczywistym, zapewnia bardzo dokładne wyniki ilościowe, ponieważ nieznane ilości próbek są interpolowane z krzywych standardowych zbudowanych na znanych ilościach materiału wyjściowego. Co więcej, metoda t...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy nie mają żadnych podziękowań.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Histopaque-1077Sigma Aldrich SRL10771-500 MLmetoda separacji gradientu gęstości
QIAamp DNA Blood Mini Kit (250)QIAGEN51106Ekstrakcja DNA
Niezmodyfikowane oligonukleotydy DNA HPSF 0,01 mmolOdczynniki Eurofins MWG Operon/Carlo Erba S.r.l Zawiesić liofilizowany produkt do 100 pmol/&mikro; l
Polimeraza DNA AmpliTaq: w tym 10x bufor II i 25 mM MgCl2Applied Biosystems/Life-TechnologiesN8080156
GeneAmp dNTP Blend (100 mM)Applied Biosystems/Life-TechnologiesN8080261
Zestaw do klonowania TOPO TA do subklonowaniaInvitrogen/Life-TechnologiesK4500-01
XL1-Blue Kompetentne komórki do subklonowaniaStratagene200130
PureYield Plasmid Miniprep SystemPromegaA1223
SpeI 500UNew England BiolabsR0133S
HindIII-HF 10,000 UNew England BiolabsR3104S
PureYield Plasmid Midiprep SystemPromegaA2492
XhoI 5,000 UNew England BiolabsR0146S
TRIS UtrapureSigma Aldrich SRLT1503
EDTASigma Aldrich SRLE5134
TE bufor (1 mM TRIS i 0,1 mM EDTA)
TaqMan Universal PCR MasterMix Applied Biosystems/Life-Technologies4364338
Podwójnie znakowane sondy HPLC 0,01 mmolEurofins MWG Operon/Carlo Erba Reagenty S.r.l Zawiesić liofilizowany produkt do 100 pmol/&mikro; l
Spektrofotometr NanoDrop 2000cThermoFisher
Applied Biosystems 2720 Thermal CyclerApplied Biosystems/Life-Technologies4359659
Fast 7500 Real-Time PCR System AppliedBiosystems/Life-Technologies
Oprogramowanie do wykrywania sekwencji SDS 1.4Biosystemy stosowane/Technologie
życia

Bibliografia

  1. Douek, D. C., et al. Changes in thymic function with age and during the treatment of HIV infection. Nature. 396 (6712), 690-695 (1998).
  2. Zelm, M. C., Szczepanski, T., van der Burg, M., van Dongen, J. J. M. Replication history of B lymphocytes reveals homeostatic proliferation and extensive antigen-induced B cell expansion. J. Exp. Med. 204 (3), 645-655 (2007).
  3. Fronkova, E., et al. B-cell reconstitution after allogeneic SCT impairs minimal residual disease monitoring in children with ALL. Bone Marrow Transplant. 42 (3), 187-196 (2008).
  4. Sottini, A., et al. Simultaneous quantification of recent thymic T-cell and bone marrow B-cell emigrants in patients with primary immunodeficiency undergone to stem cell transplantation. Clin. Immunol. 136 (2), 217-227 (2010).
  5. Serana, F., et al. Thymic and bone marrow output in patients with common variable immunodeficiency. J. Clin. Immunol. 31 (4), 540-549 (2011).
  6. Zanotti, C., et al. Opposite effects of interferon-β on new B and T cell release from production sites in sclerosis. J. Neuroimmunol. 240-241, 147-150 (2011).
  7. Zanotti, C., et al. Peripheral accumulation of newly produced T and B lymphocytes in natalizumab-treated multiple sclerosis patients. Clin. Immunol. 145 (1), 19-26 (2012).
  8. Sottini, A., et al. Pre-existing T- and B-cell defects in one progressive multifocal leukoencephalopathy patient. PLoS One. 7, e34493(2012).
  9. Quiros-Roldan, E., et al. Effects of combined antiretroviral therapy on B- and T-cell release from production sites in long-term treated HIV-1+ patients. J. Transl. Med. 10, 94(2012).
  10. Mensen, A., et al. Utilization of TREC and KREC quantification for the monitoring of early T- and B-cell neogenesis in adult patients after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. J. Transl. Med. 11, 188(2013).
  11. Serana, F., et al. The different extent of B and T cell immune reconstitution after hematopoietic stem cell transplantation and enzyme replacement therapies in SCID patients with adenosine deaminase deficiency. J. Immunol. 185 (12), 7713-7722 (2010).
  12. Borte, S., et al. Neonatal screening for severe primary immunodeficiency diseases using high-throughput triplex real-time PCR. Blood. 119 (11), 2552-2555 (2012).
  13. Baker, M. W., et al. Implementing routine testing for severe combined immunodeficiency within Wisconsin's newborn screening program. Public Health Rep. 125 (2), 88-95 (2010).
  14. Lorenzi, A. R., et al. Determination of thymic function directly from peripheral blood: a validated modification to an established method. J. Immunol. Meth. 339 (2), 185-194 (2008).
  15. De Boer, R. J., Perelson, A. S. Quantifying T lymphocyte turnover. J. Theor. Biol. 327, 45-87 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ilościowe oznaczanie TREC i KRECtest Real-time PCRwydajność szpiku kostnego w produkcji tyreocytówdupleksowa ilościowa PCRprzygotowanie krzywej standardowejmononuklearne komórki krwi obwodowejgen stały łańcucha alfa TCRmonitorowanie rekonstytucji odporności
Jednoczesna kwantyfikacja kręgów wycinania receptora komórek T (TREC) i kręgów wycinania rekombinacji z delecją K (KREC) za pomocą PCR w czasie rzeczywistym
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.