Barwienie Schiffa kwasem okresowym to technika, która wizualizuje zawartość polisacharydów w tkankach. W artykule przedstawiono protokół barwienia Schiffa kwasem okresowym przystosowany do stosowania na komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej oczyszczonych z ludzkiej krwi żylnej. Takie próbki są wzbogacone o limfocyty i inne białe krwinki układu odpornościowego.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wykrywanie glikogenu w komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej za pomocą barwienia Schiffa kwasem okresowym
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Barwienie kwasem okresowym Schiffa (PAS) jest techniką immunohistochemiczną stosowaną w biopsjach mięśni i jako narzędzie diagnostyczne dla próbek krwi. Polisacharydy, takie jak glikogen, glikoproteiny i glikolipidy, barwią jasną magentę, co ułatwia wyliczenie pozytywnych i ujemnych komórek w tkance. W komórkach mięśniowych barwienie PAS służy do określania zawartości glikogenu w różnych typach komórek mięśniowych, podczas gdy w próbkach komórek krwi barwienie PAS zostało zbadane jako narzędzie diagnostyczne dla różnych schorzeń. Krew zawiera pewną ilość białych krwinek, które należą do układu odpornościowego. Pogląd, że komórki układu odpornościowego posiadają glikogen i wykorzystują go jako źródło energii, nie został szeroko zbadany. W tym miejscu opisujemy zaadaptowaną wersję protokołu barwienia PAS, który można zastosować do jednojądrzastych komórek odpornościowych krwi obwodowej z ludzkiej krwi żylnej. Zaobserwowano małe komórki z ziarnistościami PAS-dodatnimi i większe komórki z rozlanym barwieniem PAS. Traktowanie próbek amylazą znosi te wzorce, potwierdzając specyficzność plamy. Alternatywna technika oparta na trawieniu enzymatycznym potwierdziła obecność i ilość glikogenu w próbkach. Protokół ten jest przydatny dla hematologów lub immunologów badających zawartość polisacharydów w limfocytach pochodzących z krwi.
Wprowadzenie
Barwienie kwasem okresowym i Schiffem (PAS) jest techniką immunohistochemiczną szeroko stosowaną w badaniach i diagnostyce mięśni. Wykorzystywana jest również jako narzędzie diagnostyczne w badaniach próbek krwi. Technika ta polega na naniesieniu na próbkę roztworu kwasu okresowego, który utlenia jednostki w polisacharydach, tworząc grupy aldehydowe reagujące z bezbarwnym odczynnikiem Schiffa, co prowadzi do powstania produktu o głębokim purpurowym kolorze. Etapy tej procedury przedstawiono na Rysunku 1. Barwnik zabarwia na purpurowo wszystkie struktury zawierające polisacharydy, w tym glikogen, glikoproteiny, glikolipidy, mucyny oraz inne cząsteczki ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Badania z próbkami ludzkiej krwi zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Uniwersytetu Concordia, numer certyfikatu 10000618. Praca nad mięśniami myszy została zatwierdzona przez Concordia University Ethics Review Board, numer certyfikatu 2010BERG.
1. Izolacja PBMC z krwi pełnej
UWAGA: Przeprowadź tę procedurę w komorze bezpieczeństwa biologicznego, używając sterylnej techniki i sprzętu wysterylizowanego przez producenta.
- Ostrożnie wlej 10-15 ml krwi pełnej z probówek do pobierania krwi heparynizowanej (antykoagulantowej) do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. W przypadku drobnych rozlany....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W celu walidacji odczynników i podstawowej techniki wykonano barwienie PAS zgodnie z instrukcją producenta na przekrojach mięśnia soleus myszy. Barwienie przeprowadzono w tym samym dniu co uśmiercenie zwierząt, a w ostatnim kroku procedury preparaty utrwalono w ksylenoli. Mięsień soleus znany jest z zawartości ~35% komórek wykazujących dodatnią reakcję na glikogen9. W zabarwionych komórkach mięśniowych zaobserwowano dwie odrębne cechy PAS-dodatnie: punktowe granulki wewnątrz komórki oraz ciągłą linię wyznaczaj.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Kluczowymi etapami tego artykułu wideo były mycie i leczenie komórek amylazą. Podczas mycia szkiełek kluczowym krokiem było użycie plastikowej, wyciskanej butelki do mycia i pozostawienie, aby woda delikatnie przepływała przez próbkę na szkiełku, a nie kierowała się bezpośrednio na próbki. Nawet najmniejsze bezpośrednie ciśnienie wody spowodowałoby, że ogniwa odpadłyby ze zjeżdżalni. Kolejnym kluczowym krokiem było użycie tego samego szkiełka do ± warunkach amylazy. Po przyklejeniu PBMC do szkiełka, szkiełko ostrożnie um.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
To badanie zostało wsparte grantem z programu NSERC Discovery o numerze grantu RGPIN 418522-2013. Dziękujemy R. Kilgourowi za pomocne dyskusje oraz Katelin Gresty i dr A. Berghdalowi za dostarczenie sekcji mięśni myszy.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Zestaw Periodic Acid Schiff |  Sigma-Aldrich | 395B | Przed użyciem doprowadzić do temperatury pokojowej. Materiały w tym zestawie są toksyczne i szkodliwe. Należy zachować ostrożność. |
| α-Amylaza z trzustki świńskiej | Sigma-Aldrich | A3176 | |
| Mikroskop binokularny | Carl Zeiss Microscopy | Axio Lab A0 | |
| Zestaw do oznaczania glikogenu | Sigma-Aldrich | MAK016 | |
| Ficoll-Paque PLUS | VWR, GE Healthcare | 17-1440-02 | Niejonowy syntetyczny polimer sacharozy. |
| Wirówka | Do izolacji PBMC zastosowano wirówkę z koszem wahadłowym. |
Bibliografia
- Rich, P. R. The molecular machinery of keilin's respiratory chain. Biochem. Soc. Trans. 31 (Pt 6), 1095-1105 (2003).
- Peter, J. B., Barnard, R. J., Edgerton, V. R., Gillespie, C. A., Stempel, K. E. Metabolic profiles of three fiber types of skeletal muscle in guinea p....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
