Wykrywanie glikogenu w komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej za pomocą barwienia Schiffa kwasem okresowym

Podsumowanie

Barwienie Schiffa kwasem okresowym to technika, która wizualizuje zawartość polisacharydów w tkankach. W artykule przedstawiono protokół barwienia Schiffa kwasem okresowym przystosowany do stosowania na komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej oczyszczonych z ludzkiej krwi żylnej. Takie próbki są wzbogacone o limfocyty i inne białe krwinki układu odpornościowego.

Streszczenie

Barwienie kwasem okresowym Schiffa (PAS) jest techniką immunohistochemiczną stosowaną w biopsjach mięśni i jako narzędzie diagnostyczne dla próbek krwi. Polisacharydy, takie jak glikogen, glikoproteiny i glikolipidy, barwią jasną magentę, co ułatwia wyliczenie pozytywnych i ujemnych komórek w tkance. W komórkach mięśniowych barwienie PAS służy do określania zawartości glikogenu w różnych typach komórek mięśniowych, podczas gdy w próbkach komórek krwi barwienie PAS zostało zbadane jako narzędzie diagnostyczne dla różnych schorzeń. Krew zawiera pewną ilość białych krwinek, które należą do układu odpornościowego. Pogląd, że komórki układu odpornościowego posiadają glikogen i wykorzystują go jako źródło energii, nie został szeroko zbadany. W tym miejscu opisujemy zaadaptowaną wersję protokołu barwienia PAS, który można zastosować do jednojądrzastych komórek odpornościowych krwi obwodowej z ludzkiej krwi żylnej. Zaobserwowano małe komórki z ziarnistościami PAS-dodatnimi i większe komórki z rozlanym barwieniem PAS. Traktowanie próbek amylazą znosi te wzorce, potwierdzając specyficzność plamy. Alternatywna technika oparta na trawieniu enzymatycznym potwierdziła obecność i ilość glikogenu w próbkach. Protokół ten jest przydatny dla hematologów lub immunologów badających zawartość polisacharydów w limfocytach pochodzących z krwi.

Wprowadzenie

Barwienie kwasem okresowym i Schiffem (PAS) jest techniką immunohistochemiczną szeroko stosowaną w badaniach i diagnostyce mięśni. Wykorzystywana jest również jako narzędzie diagnostyczne w badaniach próbek krwi. Technika ta polega na naniesieniu na próbkę roztworu kwasu okresowego, który utlenia jednostki w polisacharydach, tworząc grupy aldehydowe reagujące z bezbarwnym odczynnikiem Schiffa, co prowadzi do powstania produktu o głębokim purpurowym kolorze. Etapy tej procedury przedstawiono na Rysunku 1. Barwnik zabarwia na purpurowo wszystkie struktury zawierające polisacharydy, w tym glikogen, glikoproteiny, glikolipidy, mucyny oraz inne cząsteczki z frakcjami polisacharydowymi.

Barwienie PAS jest często stosowane do pomiaru poziomu glikogenu w włóknach mięśniowych. Przekroje tkanki mięśniowej są idealne do tej techniki, ponieważ mocno przylegają do szkiełka i wytrzymują wielokrotne etapy płukania i barwienia. Glikogen występuje najintensywniej w szybkokurczliwych włóknach mięśniowych typu II, które charakteryzują się wysokim zapotrzebowaniem na szybką produkcję ATP, wymagającą glikogenu dla osiągnięcia maksymalnej wydajności^1,2. Glikogen jest rozgałęzionym polimerem glukozy, który może zostać rozkładany do wolnej glukozy poprzez działanie enzymów glikogenofosforylaz. W okresach spoczynku i wystarczającej podaży składników odżywczych glikogen jest uzupełniany w procesie glikogenezy, natomiast w stanach niedoboru składników odżywczych lub wysokiego zapotrzebowania energetycznego glikogen jest rozkładany do glukozy w procesie glikogenolizy. Już od lat 50. XX wieku naukowcy-klinicyści badali barwienie PAS w próbkach krwi w celu analizy zawartości glikogenu w różnych chorobach^3-7. Na przykład w chorobie Pompego – klasycznej chorobie składowania glikogenu – leukocyty kumulują duże ilości glikogenu, co znacząco różni się od wyników w grupach kontrolnych osób zdrowych⁸.

Niniejszy artykuł wideo demonstruje dostosowaną wersję barwienia PAS do zastosowania w próbkach mononuklearnych komórek krwi obwodowej (PBMC) pobranych z krwi żylnej zdrowych ochotników. PBMC składają się głównie z limfocytów z grup limfocytów T i limfocytów B, a także innych komórek odpornościowych, takich jak komórki NK (natural killer) i monocyty. Pierwszy etap oczyszczania pozwala na usunięcie erytrocytów, neutrofili i innych granulocytów. Technika ta dostarcza danych dotyczących skoncentrowanej frakcji limfocytów, co umożliwia dokładniejsze zliczanie komórek PAS-dodatnich w porównaniu do analizy rozmazów z krwi pełnej.

Rysunek 1: Metodologia barwienia PAS w PBMC krok po kroku. (A) W pierwszej kolejności izolację PBMC przeprowadza się za pomocą gradientu Ficoll; lewy panel przedstawia preparat przed wirowaniem, a prawy panel przedstawia go po wirowaniu, gdzie w centrum probówki widoczna jest warstwa leukocytowa (buffy coat) zawierająca PBMC. (B) Izolowane PBMC są utrwalane na szkiełku za pomocą roztworu utrwalającego formalinowo-etanolowego. Szkiełko jest delikatnie płukane wodą destylowaną z plastikowej butelki płuczki. (C) Następnie szkiełko umieszcza się w zlewce o pojemności 100 ml wypełnionej do połowy roztworem amylazy, która rozpuści glikogen. Szkiełko jest delikatnie płukane. (D) Szkiełko poddaje się działaniu roztworu kwasu okresowego, w którym zachodzi utlenianie sacharydów. Szkiełka są delikatnie płukane, co usuwa nadmiar kwasu okresowego i zatrzymuje etap utleniania. (E) Po dodaniu do szkiełek odczynnika Schiffa, zareaguje on z aldehydami powstałymi podczas etapu utleniania. Ten bezbarwny odczynnik doprowadzi do powstania produktu o głębokim czerwono-magenta kolorze. Szkiełka są delikatnie płukane w celu usunięcia nadmiaru odczynnika Schiffa.

Protokół

Badania z próbkami ludzkiej krwi zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Uniwersytetu Concordia, numer certyfikatu 10000618. Praca nad mięśniami myszy została zatwierdzona przez Concordia University Ethics Review Board, numer certyfikatu 2010BERG.

1. Izolacja PBMC z krwi pełnej

UWAGA: Przeprowadź tę procedurę w komorze bezpieczeństwa biologicznego, używając sterylnej techniki i sprzętu wysterylizowanego przez producenta.

1. Ostrożnie wlej 10-15 ml krwi pełnej z probówek do pobierania krwi heparynizowanej (antykoagulantowej) do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. W przypadku drobnych rozlanych wycieków krwi przetrzyj ddH₂O i 70% EtOH za pomocą chusteczki czyszczącej.
2. Rozcieńczyć krew w stożkowej probówce w stosunku 1:1 roztworem soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS 1x) o pH 7,4. Upewnij się, że maksymalna całkowita objętość nie przekracza 30 ml.
3. Delikatnie wymieszać za pomocą serologicznego pistoletu do pipet, unikając pęcherzyków powietrza.
   UWAGA: NIE mieszaj przez odwrócenie probówki, aby uniknąć gromadzenia się krwi w nasadce i późniejszego przesiąkania podczas wirowania.
4. Dodać 13 ml Ficoll-paque (patrz tabela materiałów i wyposażenia) do nowej probówki stożkowej o pojemności 50 ml. Trzymaj rurkę pionowo w stojaku.
5. Za pomocą pipety transferowej pobrać rozcieńczoną krew, dotknąć końcówki pipety transferowej do wewnętrznej ścianki rurki w pobliżu góry. Z powolnym i stałym ciśnieniem przenieś krew wzdłuż wewnętrznej ścianki rurki, tworząc warstwę krwi na wierzchu warstwy sacharozy. Wykonaj ten krok kilka razy, aż cała krew zostanie przeniesiona.
6. Szczelnie zamknij probówkę i odwiruj probówkę w temperaturze pokojowej przez 30 minut przy 700 x g w wirniku obrotowym ze średnim przyspieszeniem ustawionym na 5 i opóźnieniem ustawionym na ZERO.
7. Powoli wyjmij probówkę i nie naruszając warstw, zanieś ją z powrotem do szafki bezpieczeństwa biologicznego.
8. Ostrożnie zebrać kożuchową powłokę (cienką, mętną białą warstwę), w której znajdują się PBMC, umieszczoną między warstwami PBS/plazmy i fikolu za pomocą pipety transferowej. Unikaj zbierania warstwy sacharozy i nie naruszaj warstwy czerwonych krwinek.
9. Przenieś kożuchową powłokę do nowej sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Może minąć kilka razy powtórzenie kroku 1.8 w celu zebrania wszystkich PBMC.
10. Dodać PBS pH 7,4 do probówki z PBMC i napełnić do oznaczenia 45 ml. Dokładnie wstrząśnij tubką. Nie wirować.
11. Mycie 1: Wirować przez 15 minut przy 480 x g z maksymalnym przyspieszeniem i opóźnieniem ustawionym na 9. Obserwuj tworzenie się osadu PBMC na dnie stożkowej rurki.
12. Wylać PBS (supernatant) do plastikowej zlewki z 10 ml wybielacza.
13. Poluzuj granulat komórkowy, delikatnie "uderzając" o pofałdowaną powierzchnię (tj. Pusty stojak). Nie wirować.
14. Do probówki dodać 25 ml świeżego PBS o pH 7,4. Jeśli przetwarzana jest więcej niż jedna probówka, na tym etapie połącz pelety.
15. Mycie 2: Wirować probówkę przez 12 minut przy 480 x g z maksymalnym przyspieszeniem i opóźnieniem ustawionym na 9.
16. Wylać PBS (supernatant) do plastikowej zlewki z odrobiną wybielacza.
17. Delikatnie "stojak" na pofałdowanej powierzchni (tj. pustym stojaku). Nie wirować.
18. Dodać 25 ml świeżego PBS do probówki.
    1. Wyjmij 50 μl komórek i przenieś do probówki mikrowirówkowej w celu zliczenia żywotności.
    2. Dodać równą ilość (50 μl) błękitu trypanowego (barwnik o żywotności) i delikatnie wymieszać, pipetować w górę i w dół.
19. Pobrać 10 μl i przenieść je do hemocytometru, aby sprawdzić żywotność komórek na ml. Zapisać liczbę komórek/ml.
20. Wyjmij żądaną ilość komórek i odwiruj probówkę przez 12 minut przy 480 x g z maksymalnym przyspieszeniem i opóźnieniem ustawionym na 9.
21. Wylać PBS (supernatant) do zlewki z wybielaczem.
22. Delikatnie "stojak" na pofałdowanej powierzchni (tj. pustym stojaku). Dodać 80 μl PBS do probówki.

2. Tworzenie ślizgu PBMC

1. Umieścić 80 μl komórek na szkiełku mikroskopowym. Rozsmaruj kroplę za pomocą innego szkiełka lub umieść 2 krople po 40 μl każda na obu końcach szkiełka.
2. Pozostaw szkiełko w komorze bezpieczeństwa biologicznego do wyschnięcia. Oznacz szkiełko ołówkiem po matowej stronie.

3. Ustalanie próbek na szkiełkach

1. Przygotować roztwór utrwalający, mieszając 0,5 ml 37% formaldehydu z 4,5 ml 99% etanolu.
2. Po wysuszeniu szkiełek należy wyjąć 2 ml świeżo przygotowanego roztworu utrwalającego i wylać go na szkiełko tak, aby pokryć całą powierzchnię szkiełka.
3. Pozostaw roztwór na szkiełku na 1 minutę. Płucz szkiełko przez 1 minutę wodą z kranu i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu.

4. Przygotowanie roztworu amylazy do kontroli negatywnej

1. Weź 0,25 g proszku amylazy i rozpuść w 50 ml wody destylowanej. Wlej roztwór do czystej zlewki o pojemności 100 ml.
2. Zanurzyć szkiełko w zlewce w taki sposób, aby połowa szkiełka została poddana działaniu środka, a druga połowa pozostała niepoddana działaniu środka, a następnie inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej (rysunek 1C).
3. Zanotuj, po której stronie szkiełka podawana jest amylaza. Narysuj linię na odwrocie szkiełka wskazującą granicę między leczeniem a kontrolą.
4. Umyj szkiełka preparatem ddH₂O, aby usunąć roztwór amylazy i pozostawić szkiełko do wyschnięcia na powietrzu.

5. Wykonaj barwienie i obrazowanie metodą Periodic Acid Schiff (PAS)

UWAGA: Odczynniki PAS są toksyczne przez wdychanie i są, więc kroki muszą być wykonane w dygestoriach chemicznych, a produkty przemiany materii muszą być odpowiednio zutylizowane zgodnie z wytycznymi instytucji.

1. Umieść szkiełko na płaskiej powierzchni i wlej 1,50-2,00 ml roztworu kwasu okresowego na próbkę. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
2. Opłucz szkiełka w kilku wsadach wody destylowanej.
3. Wlać 1,50-2,00 ml odczynnika Schiffa na szkiełko i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 min.
4. Umyj szkiełko wodą destylowaną przez 5 minut i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu.
5. Nałożyć 10 μl podłoża montażowego na szkiełko podstawowe i przykryć dwoma małymi szkiełkami nakrywkowymi lub nałożyć 50 μl i użyć jednego dużego szkiełka nakrywkowego.
6. Nałóż bezbarwny lakier do paznokci na krawędzie szkiełka nakrywkowego, pozostaw do wyschnięcia na noc.

6. Uzyskiwanie obrazów za pomocą mikroskopu dwuokularowego przy użyciu obiektywu 100X

Wyniki

W celu walidacji odczynników i podstawowej techniki wykonano barwienie PAS zgodnie z instrukcją producenta na przekrojach mięśnia soleus myszy. Barwienie przeprowadzono w tym samym dniu co uśmiercenie zwierząt, a w ostatnim kroku procedury preparaty utrwalono w ksylenoli. Mięsień soleus znany jest z zawartości ~35% komórek wykazujących dodatnią reakcję na glikogen⁹. W zabarwionych komórkach mięśniowych zaobserwowano dwie odrębne cechy PAS-dodatnie: punktowe granulki wewnątrz komórki oraz ciągłą linię wyznaczaj...

Dyskusja

Kluczowymi etapami tego artykułu wideo były mycie i leczenie komórek amylazą. Podczas mycia szkiełek kluczowym krokiem było użycie plastikowej, wyciskanej butelki do mycia i pozostawienie, aby woda delikatnie przepływała przez próbkę na szkiełku, a nie kierowała się bezpośrednio na próbki. Nawet najmniejsze bezpośrednie ciśnienie wody spowodowałoby, że ogniwa odpadłyby ze zjeżdżalni. Kolejnym kluczowym krokiem było użycie tego samego szkiełka do ± warunkach amylazy. Po przyklejeniu PBMC do szkiełka, szkiełko ostrożnie um...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zestaw Periodic Acid Schiff	Sigma-Aldrich	395B	Przed użyciem doprowadzić do temperatury pokojowej. Materiały w tym zestawie są toksyczne i szkodliwe. Należy zachować ostrożność.
α-Amylaza z trzustki świńskiej	Sigma-Aldrich	A3176
Mikroskop binokularny	Carl Zeiss Microscopy	Axio Lab A0
Zestaw do oznaczania glikogenu	Sigma-Aldrich	MAK016
Ficoll-Paque PLUS	VWR, GE Healthcare	17-1440-02	Niejonowy syntetyczny polimer sacharozy.
Wirówka			Do izolacji PBMC zastosowano wirówkę z koszem wahadłowym.