Artykuł metodologiczny

Izolacja pierwotnych mysich komórek śródbłonka mikronaczyniowego mózgu

36K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52204

⸱

14 listopada 2014

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, University of Münster, 2Interdisciplinary Center for Clinical Research (IZKF) Münster, 3Institute of Physiology I — Neuropathophysiology I, University of Münster

W tym artykule

Podsumowanie

Komórki śródbłonka mikronaczyniowego mózgu (BMEC) są połączone specyficznymi białkami połączeniowymi, tworząc wysoce regulowaną barierę oddzielającą krew od ośrodkowego układu nerwowego (OUN), tak zwaną barierę krew-mózg (BBB). Izolacja pierwotnych mysich komórek śródbłonka mikronaczyniowego mózgu, jak omówiono w tym protokole, umożliwia szczegółowe badania in vitro bariery krew-mózg.

Streszczenie

Bariera krew-mózg jest ultrastrukturalnie złożona przez monowarstwę komórek śródbłonka mikronaczyniowego mózgu (BMEC) połączonych ze sobą kompleksem połączeń ścisłych i przylegających. Wraz z innymi typami komórek, takimi jak astrocyty lub perycyty, tworzą jednostkę nerwowo-naczyniową (NVU), która specyficznie reguluje wymianę płynów, cząsteczek i komórek między krwią obwodową a OUN. Dzięki temu złożonemu i dynamicznemu systemowi BMEC biorą udział w różnych procesach utrzymujących homeostazę OUN. Dysfunkcja bariery krew-mózg jest obserwowana jako niezbędny krok w patogenezie wielu ciężkich chorób OUN. Jednak terapie specyficzne i celowane są bardzo ograniczone, ponieważ mechanizmy leżące u ich podstaw są nadal dalekie od zrozumienia.

Modele zwierzęce i in vitro były szeroko wykorzystywane do dogłębnego zrozumienia złożonych procesów fizjologicznych i patofizjologicznych. Dzięki ograniczeniu i uproszczeniu możliwe jest skoncentrowanie dochodzenia na przedmiocie będącym przedmiotem zainteresowania i wykluczenie różnych czynników zakłócających. Porównywalność i możliwość przenoszenia są jednak również ograniczone w systemach modelowych, które muszą być brane pod uwagę przy ocenie. Najczęściej spotykane modele zwierzęce bazują na myszach między innymi ze względu na stale zwiększające się możliwości metodologii. Badania in vitro izolowanych mysich BMEC mogą umożliwić dogłębną analizę ich właściwości oraz bariery krew-mózg w warunkach fizjologicznych i patofizjologicznych. Dalsze badania nad złożonymi mechanizmami zachodzącymi w BBB mogą stanowić podstawę dla nowych strategii terapeutycznych.

Ten protokół opisuje metodę izolowania pierwotnych mysich komórek śródbłonka mikronaczyniowego za pomocą sekwencji fizycznych i chemicznych etapów oczyszczania. Omówiono specjalne względy dotyczące czystości i uprawy MBMEC, a także kontroli jakości, potencjalnych zastosowań i ograniczeń.

Wprowadzenie

Mikronaczyniowe komórki śródbłonka mózgu (BMEC) tworzą monowarstwy, które są integralną częścią wysoce wyspecjalizowanej bariery krew-mózg (BBB). BMEC są połączone białkami połączeniowymi przyłączonymi do błony podstawnej. Wraz z perycytami, komórkami mięśni gładkich, astrocytami stóp końcowych i krążącymi krwinkami budują tzw. jednostkę nerwowo-naczyniową (NVU)1. W przeciwieństwie do dotychczasowego wyobrażenia o nieprzepuszczalnej barierze między krwią a ośrodkowym układem nerwowym (OUN), NVU jest dynamicznym, wysoce specyficznym i regulowanym interfejsem, który kontroluje przejście płynów, cząsteczek i komórek między naczyniami krwionośnymi mózgu a OUN2. Dysfunkcja lub rozregulowanie NVU może inicjować i/lub przyczyniać się do różnych chorób nerwowo-naczyniowych, zakaźnych, zapalnych lub zwyrodnieniowych OUN, takich jak udar niedokrwienny, encefalopatia HIV, stwardnienie rozsiane, choroba Alzheimera lub Parkinsona3-6.

Monowarstwa BMEC jest szczelnie zamknięta przez kompleks złączy składający się z połączeń szczelnych (TJ) i adherenów (AJ)7. Wysoka oporność elektryczna i niska przepuszczalność parakomórkowa BBB opierają się głównie na białkach TJ8. TJ są kompleksami utworzonymi przez białka transbłonowe z rodziny klaudyny i okludyny, które są połączone z cytoszkieletem komórek śródbłonka za pomocą cząsteczek adapterowych, takich jak białka zonulaoccludens (ZO) ZO1-34. Połączenia adherenów są głównie składane przez integralne białko błonowe śródbłonka naczyniowego (VE)-kadherynę, która jest połączona z cytoszkieletem za pomocą kateniny8.

Szczelne uszczelnienie BBB zapobiega swobodnej wymianie substratów i komórek między krwią a płynem mózgowo-rdzeniowym. Wyjątkami od tej reguły są lipofilowe, małe cząsteczki o masie cząsteczkowej <400 Da, które są w stanie przekroczyć barierę krew-mózg poprzez dyfuzję za pośrednictwem lipidów9. Przejście większych i/lub hydrofilowych cząsteczek, takich jak glukoza, aminokwasy, peptydy, białka i wiele leków, jest ograniczone do wysoce kontrolowanych systemów transportu międzykomórkowego10, które można podzielić na pięć głównych kategorii: transport za pośrednictwem nośnika, transport jonów, transport aktywnego wypływu, transport za pośrednictwem receptora i transport za pośrednictwem kaweoli4. Te systemy transportowe pomagają w utrzymaniu homeostazy OUN, która jest niezbędna do dokładnego generowania sygnału, transdukcji i integracji. Co więcej, BMEC są w stanie aktywnie kontrolować przejście różnych cząsteczek poprzez ekspresję różnych ektoenzymów. Enzymy te są zlokalizowane na powierzchni komórki i modyfikują specyficzne endogenne i egzogenne substraty, utrudniając lub umożliwiając przejście BBB11.

Podczas gdy OUN przez długi czas był uważany za organ uprzywilejowany immunologicznie, ostatnie odkrycia sugerują raczej dynamiczny i ściśle regulowany system immunologicznego nadzoru nad OUN. BMEC są krytycznie zaangażowane w regulację transmigracji komórek odpornościowych. Poprzez ekspresję selektyn na ich powierzchni limfocyty są selektywnie indukowane do luźnego przyczepiania się do śródbłonka. Wydzielanie chemokin, które napotykają specyficzne receptory na leukocytach, prowadzi do ekspresji lub zmian konformacyjnych integryn leukocytów, takich jak LFA-1 (antygen związany z funkcją limfocytów-1) i VLA-4 (bardzo późny antygen-4). Integryny pośredniczą w mocnej adhezji poprzez wiązanie swoich śródbłonkowych przeciwreceptorów, np. VCAM-I (cząsteczka adhezyjna komórek naczyniowych), ICAM-I (cząsteczka adhezji międzykomórkowej) umożliwiająca transmigrację do miąższu mózgu między lub przez BMEC BBB12-14. Te i inne odkrycia podkreślają aktywną rolę samego śródbłonka w regulacji migracji komórek odpornościowych.

Ponadto, BMEC jako część NVU są zaangażowane w regulację przepływu krwi w mózgu związaną z lokalnymi neuronalnymi wymaganiami metabolicznymi. Po stymulacji astrocytarnej komórki śródbłonka wytwarzają substancje wazoaktywne, takie jak tlenek azotu, co prowadzi do rozluźnienia komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych15.

Angiogeneza i neurogeneza zarówno w rozwijającym się, jak i dorosłym mózgu wykazują równoległe wzorce i rozwój oraz mają wiele wspólnych właściwości regulacji 1,4. Komórki śródbłonka są krytycznie zaangażowane w te procesy 16,17.

Podsumowując, BMEC zapewniają podstawowe cechy gwarantujące prawidłowy rozwój i funkcjonowanie OUN. Dysfunkcja bariery krew-mózg jest związana z wieloma poważnymi zaburzeniami neurologicznymi. Jednak tylko bardzo niewiele celów zostało zidentyfikowanych na styku mózg-układ krwionośny dla specyficznego i skutecznego leczenia18. Uproszczone modele in vitro są od dawna wykorzystywane do zrozumienia mechanizmów związanych z funkcjonowaniem i regulacją złożonych systemów fizjologicznych. Izolacja opisana w tym manuskrypcie oraz badanie in vitro mysich BMEC, biorąc pod uwagę szeroką gamę specyficznych szczepów nokautujących myszy, mogą dostarczyć dalszego zrozumienia funkcji i regulacji BBB w warunkach fizjologicznych i patofizjologicznych, otwierając nowe możliwości terapeutyczne.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez lokalne władze ("LandesamtfürNatur, Umwelt und Verbraucherschutz NRW; Fachbereich 87, Tiergesundheit, Tierschutz; Recklinghausen, Niemcy") i prowadzone zgodnie z niemiecką ustawą o ochronie zwierząt.

1. Ogólne uwagi do eksperymentów na myszach

  1. Wszystkie eksperymenty na myszach należy wykonywać zgodnie z wytycznymi odpowiedniego Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Wykorzystania.
  2. Trzymaj myszy w warunkach wolnych od patogenów i zapewnij im dostęp do pożywienia i wody ad libitum.
  3. Używaj myszy dopasowanych pod względem wieku i płci w grupach eksperymentalnych, ponieważ właściwości biologiczne mogą się różnić w zależności od wieku i płci.
  4. Jeśli to możliwe, staraj się ograniczyć, udoskonalić lub zastąpić eksperymenty na zwierzętach.

2. Przygotowanie gradientu Percoll

  1. Zmieszać 19 ml 1x PBS z 1 ml 10x PBS, 1 ml FCS i 10 ml Percoll.
  2. Przeprowadzić sterylną filtrację w szklanej probówce (średnica porów filtra: 0,2 μm). Następnie przechowywać roztwór w temperaturze 4 °C.

3. Przygotowanie podłoża komórkowego śródbłonka i powlekanie płytek do hodowli komórkowych

  1. Pożywka komórkowa śródbłonka:
    1. Przygotowanie 500 ml pożywki: Zmieszać 400 ml pożywki DMEM (ok. 80%) ze 100 ml PDS (ok. 20%), 0,25 ml bFgF (20 μg/ml; ok. 0,05%), 0,5 ml heparyny (100 μl/ml; ok. 0,1%) i 0,5 ml pyrumycyny (4 mg/ml; ok. 0,1%). Dodać pyrumycynę tylko do pożywki do hodowli komórkowych stosowanych w ciągu pierwszych 2 dni hodowli.
    2. Przeprowadzić sterylną filtrację w szklanej probówce (średnica porów filtra: 0,2 μm). Następnie przechowywać roztwór w temperaturze 4 °C.
  2. Powlekanie płytek do hodowli komórkowych:
    1. Na 1 ml roztworu powlekającego przygotować roztwór 500 μl ddH2O, 400 μl kolagenu IV (0,4 mg/ml) i 100 μl fibronektyny (0,1 mg/ml).
    2. Pokryć całą powierzchnię każdej studzienki płytki do hodowli komórkowej roztworem powlekającym. Przechowywać płytkę w temperaturze 4 °C przez noc.

4. Izolacja komórek mikronaczyniowych śródbłonka mózgu myszy (MBMEC)

  1. Uśmierc 10 dorosłych myszy (w wieku 8-12 tygodni, C57BL/6) przez zwichnięcie szyjki macicy. Następnie wyizoluj móżdżki myszy i umieść je w 5 ml PBS (zastrzeżenie: praca sterylna!).
  2. Usuń pnie mózgu, móżdżek i wzgórze za pomocą kleszczy. Odłącz opony mózgowe, ostrożnie zwijając mózgi na sterylnej bibułce. Zbierz powstałe przodomózgowie wolne od opon mózgowych.
  3. Przenieś mózgi do 50 ml probówki Falcon wypełnionej 13,5 ml DMEM.
  4. Zmielić tkankę, najpierw pipetą o pojemności 25 ml, a następnie pipetą o pojemności 10 ml, aż podłoże stanie się mleczne.
  5. Następnie trawić tkankę mieszaniną 0,6 ml kolagenazy CLS2 (10 mg/ml w DMEM) i 0,2 ml DNAzy (1 mg/ml w PBS) w zmodyfikowanym podłożu Eagle (DMEM) firmy Dulbecco przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 180 obr./min.
  6. Dodać 10 ml DMEM dodanego do zawiesiny tkanek i odwirować komórki w temperaturze 1 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  7. Odrzuć supernatant (zastrzeżenie: PELLET ŁATWO STRACIĆ!)
  8. W celu usunięcia mieliny należy ponownie zawiesić osad za pomocą pipety o pojemności 25 ml w 25 ml BSA-DMEM (20% w/v) (ok. 25 razy) i odwirować przy 1 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
  9. Wyrzuć górną warstwę mieliny (mleczną) za pomocą potłuczonej szklanej pipety Pasteura o większej średnicy, a następnie wyrzuć warstwę BSA zwykłą pipetą Pasteura.
  10. Zawiesić osad w 9 ml DMEM i dodać 1 ml kolagenazy/dypazy (końcowe stężenie wynosi 1 mg/ml) i 0,1 ml DNAzy. Roztwór trawić przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 180 obr./min (zastrzeżenie: nie używać pipety do ponownego zawieszenia – może dojść do utraty komórek).
  11. Podczas mineralizacji odwirować roztwór Percoll w celu ustawienia gradientu gęstości za pomocą ultrawirówki o sile 3 000 x g przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C, z przyspieszeniem, bez hamulca.
  12. Dodać 10 ml DMEM do strawionej zawiesiny komórkowej. Odwirować zawiesinę o sile 1 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Następnie wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 2 ml DMEM.
  13. Ostrożnie dodać zawieszone komórki na wierzchu gradientu Percoll i odwirować przy 700 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C bez przyspieszania i hamowania. Uwaga: Komórki są widoczne jako chmura w interfazie.
  14. Weź ok. 12 ml interfazy z komórkami za pomocą długiej sterylnej igły i umieść ją w nowym 50 ml Falcon z 5 ml DMEM.
  15. Ponownie odwirować komórki w temperaturze 1 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Następnie ponownie zawiesić osad w pożywce komórek śródbłonka (użyć ok. 0,2 ml pożywki na 1cm2 powierzchni płytki do hodowli komórkowych).
  16. Usunąć roztwór powlekający z powlekanych płytek do hodowli komórkowych (patrz krok 3.2) i przepłukać każdą studzienkę sterylnym PBS w dwóch kolejnych etapach mycia.
  17. Hodowle komórkowe należy utrzymywać w pożywce z komórkami śródbłonka w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w sterylnym inkubatorze. Zmieniaj podłoże co dwa do trzech dni. Podziel komórki przy 90% zbiegu.

Wyniki

Bezpośrednio po izolacji, mysie BMEC oraz komórki zanieczyszczające tworzą konglomeraty pływające w pożywce hodowlanej (Ryc. 1A, dzień 0). Obróbka pyrumycyną prowadzi do selekcji mysich BMEC, ponieważ wykazują one wysoką ekspresję transporterów eflluksu, takich jak glikoproteina P, co skutkuje względną opornością na toksyny. Komórki zanieczyszczające są znacznie bardziej podatne na cytotoksyczność indukowaną pyrumycyną19. W procesie selekcji pyrumycyną komórki zanieczyszczające wchodzą na drogę apoptozy lub nekrozy, podczas gdy MBMEC zaczynają przylegać do płytek hodowlanych pokrytych kolagenem IV/fibronectiną (Ryc. 1A, dzień 1 i dzień 2). Do 5. dnia MBMEC proliferują do gęstości ok. 80 - 90%. Charakteryzują się typowym wrzecionowatym wyglądem. Po osiągnięciu konfluencji tworzą one monowarstwę ściśle upakowanych, ustawionych podłużnie i niezachodzących na siebie komórek z inhibicją kontaktową (Ryc. 1A, dzień 5). Dzięki selekcji pyrumycyną osiągana jest wysoka czystość MBMEC do 99%, co potwierdzono za pomocą markera komórek śródbłonka CD31 (PECAM1; Ryc. 1B). MBMEC tworzą szczelne monowarstwy połączone białkami złączy ścisłych. Po 7 - 8 dniach hodowli warstwy komórek śródbłonka osiągają stabilne wartości rezystancji elektrycznej (osiągając typowe wartości między 20 - 30 Ω x cm2) oraz pojemności (Ryc. 1C). W tym punkcie czasowym należy przeprowadzić testy funkcjonalne, takie jak eksperymenty z migracją komórek3,20,21 oraz testy przepuszczalności, np. z użyciem błękitu Evansa lub dekstranu.

Proces różnicowania komórek w ciągu 5 dni; barwienie fluorescencyjne CD31 i DAPI; wykres wzrostu impedancji.
Rysunek 1. Właściwości morfologiczne i funkcjonalne mysich BMEC. (A) Reprezentatywny przebieg czasowy hodowli BMEC obserwowanych za pomocą mikroskopii świetlnej transmisyjnej w ciągu 5 dni. Pasek skali dotyczy wszystkich obrazów. (B) Barwienie immunofluorescencyjne markera komórek śródbłonka CD31 w 5. dniu. CD31 (zielony) i DAPI (niebieski). (C) Komórki były wstępnie hodowane przez 5 dni, a następnie przeniesione do zautomatyzowanego systemu analizy właściwości biofizycznych (rezystancji i pojemności). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Dysfunkcja bariery krew-mózg jest cechą charakterystyczną różnych szkodliwych chorób OUN, np. rozpad bariery krew-mózg w stwardnieniu rozsianym znacznie ułatwia inwazję OUN przez autoreaktywne komórki odpornościowe oraz umożliwia spotkanie i zniszczenie oligodendrocytów. W udarze niedokrwiennym zaburzenia bariery krew-mózg i późniejsze powstanie obrzęku mózgu są krytycznymi czynnikami, które wpływają na wtórny wzrost zawału i całkowite przeżycie pacjentów6. Ponadto, poprzez zmiany w BBB w odległych obszarach, ogniskowe zmiany niedokrwienne są w stanie wywołać rozległe zmiany funkcjonalne mózgu. Jednak leżące u ich podstaw mechanizmy molekularne są w dużej mierze nieznane5. W przeciwieństwie do tego, duża gęstość i różnorodność transporterów wypływu w funkcjonalnych BMEC zmniejsza stężenie korzystnych leków, takich jak chemioterapeutyki w nowotworach mózgu lub antybiotyki w chorobach zakaźnych. Dlatego głębsze zrozumienie funkcji bariery krew-mózg w warunkach fizjologicznych i patofizjologicznych jest niezbędne do opracowania środków farmakologicznych, które są w stanie specyficznie regulować funkcję bariery w preferowanymkierunku. Wiarygodne modele in vitro bariery krew-mózg są niezbędnymi narzędziami do badania mechanizmów regulacyjnych w BBB.

Wiele unieśmiertelnionych linii komórkowych śródbłonka mózgu zostało stworzonych i wykorzystanych jako modele BBB in vitro 22. Te linie komórkowe mają pewne zalety w porównaniu z pierwotnymi BMEC, ponieważ rosną szybciej i zachowują pewne cechy BBB przez kilka pasaży. Jednak linie komórkowe śródbłonka nie mogą w pełni zastąpić komórek pierwotnych, ponieważ zmieniają się ważne właściwości, które przenikają się z możliwością przeniesienia wyników eksperymentalnych do sytuacji in vivo . Na przykład mysia linia komórkowa śródbłonka mózgu bEnd.5 wyraża tylko niskie poziomy niestale rozmieszczonych białek ścisłego połączenia, co prowadzi do wysokiej przepuszczalności parakomórkowej23. BEnd.3, inna często stosowana linia komórek śródbłonka mózgu myszy, wykazuje gęste i stale rozmieszczone połączenia ścisłe, wysoki opór transśródbłonka, kilka transporterów wypływu i niską przepuszczalność parakomórkową. Jednak warstwy komórkowe bEND.3 w porównaniu z pierwotnymi BMEC nie mają rzeczywistej dyskryminacji w odniesieniu do przenikania niektórych substratów transkomórkowych i parakomórkowych24.

W preparatach pierwotnych hodowli komórkowych zanieczyszczenie komórek może znacząco wpływać na wiarygodność wyników eksperymentalnych. W opisanym protokole pyrumicyna jest stosowana jako środek selektywny dla komórek śródbłonka w celu osiągnięcia wysokiej czystości. Niemniej jednak regularna kontrola jakości hodowli komórkowej jest nieuchronnie potrzebna, aby zagwarantować wiarygodne eksperymenty. Istnieje kilka metod kontroli jakości, oprócz typowych właściwości morfologicznych komórek śródbłonka (patrz rysunek 1A), można zmierzyć oporność transśródbłonka lub ocenić ekspresję markera komórek śródbłonka, takiego jak CD31 (patrz rysunek 1B) lub czynnik von Willebranda (vWF).

Liczba komórek śródbłonka mózgu wyizolowanych z jednego mózgu myszy jest stosunkowo niska i aby stworzyć odpowiednią hodowlę komórkową do wielu eksperymentów, mózgi kilku myszy muszą zostać połączone. Z naszego doświadczenia wynika, że do jednego eksperymentu należy użyć co najmniej 10 myszy, co może być czynnikiem ograniczającym w zależności od zasobów danego obiektu dla zwierząt. Aby uniknąć stronniczości lub czynników zakłócających, należy łączyć tylko myszy o identycznym tle genetycznym i środowiskowym. Natomiast preparaty z komórek śródbłonka mózgu bydlęcego i świńskiego dostarczają dużą liczbę komórek śródbłonka mózgu dostępnych w jednym mózgu. Jednak oprócz nieskomplikowanej hodowli i trzymania, szeroki i stale rosnący repertuar dostępnych myszy transgenicznych sprawia, że pierwotne mysie BMEC są idealnym modelem do badania funkcji bariery krew-mózg.

Kilka kluczowych ustaleń dotyczących funkcji bariery krew-mózg i leżących u jej podstaw mechanizmów molekularnych pochodzi z badań nad systemami hodowli tkankowych 2D. Ostatnio opracowano systemy hodowli3D 25, w których komórki śródbłonka są umieszczane w macierzy kolagenowej, co umożliwia im tworzenie sieci świetlnych i kanalikowych. Te nowe systemy hodowli komórkowych pozwalają na jeszcze dokładniejsze odtwarzanie procesów naczyniowych w nienaruszonym organizmie in vivo. Udział kolejnych komórek NVU w systemach hodowli komórkowych 3D, takich jak perycyty i astrocyty, może zrewolucjonizować badania in vitro funkcji bariery krew-mózg; Niedawno opracowano pierwsze modele26.

Istnieje kilka zaleceń dotyczących rozwiązywania problemów. Przede wszystkim sterylna praca ma zasadnicze znaczenie dla jakości hodowli komórek śródbłonka. Po drugie, pyrumycynę należy dodawać tylko do pożywki do hodowli komórkowych stosowanych w ciągu pierwszych 2 dni hodowli, dłuższe stosowanie może prowadzić do zwiększonej śmierci komórek MBMEC i niskiej jakości funkcji barierowej. Po trzecie, enzymy zastosowane w tym protokole powinny być używane i przechowywane zgodnie z instrukcjami producenta; w przeciwnym razie ich prawidłowe działanie może być zagrożone. Ponadto powłoka płytek do hodowli komórkowych może zostać zmieniona, jeśli komórki śródbłonka nie przyczepią się. Stężenia fibronektyny i kolagenu mogą ulec zmianie lub do roztworu powlekającego mogą zostać dodane inne białka macierzy. Wreszcie, wiek, płeć, pora roku i warunki środowiskowe w obiekcie dla zwierząt są ważnymi czynnikami, które mogą wpływać na jakość izolacji MBMEC i porównywalność eksperymentów. Należy zapewnić, aby warunki były porównywalne między niezależnymi doświadczeniami.

Opisany protokół należy traktować jako podstawową metodę neuroimmunologiczną izolacji mysich BMEC. Wyizolowane komórki mogą być wykorzystywane do wielu różnych zastosowań w celu uzyskania dalszego wglądu w funkcję BBB, takich jak testy migracji, badania ekspresji genów i białek, oceny elektrofizjologiczne lub eksperymenty z przepuszczalnością. Jak wspomniano powyżej, systemy hodowli komórkowych 3D BMEC mogą zapewnić nowe możliwości badania złożonych mechanizmów związanych z regulacją bariery krew-mózg w kontekście NVU. Dlatego izolacja pierwotnych komórek śródbłonka pozostanie w przyszłości nieocenioną techniką w dziedzinie badań nad barierą krew-mózg.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Interdyscyplinarne Centrum Badań Klinicznych (IZKF) Münster (SEED 03/12, SB), przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), Cells-in-Motion Cluster of Excellence (EXC 1003 – CiM), Uniwersytet w Muenster (do SB i SGM) oraz przez Else Kröner-Fresenius-Stiftung (2012_A88 do SB i SGM). Dziękujemy firmie Heike Blum za doskonałe ilustracje.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
bFGFPeprotech100-18BPodstawowy czynnik wzrostu fibroblastów
BSASigma AldrichA9418Albumina surowicy bydlęcej
Kolagenaza CLS2WorthingtonLS004176Wysoki względny poziom aktywności proteazy
Kolagenaza dyspazaRoche10269638001Kolagenaza z V. alginolyticus, Rozpad z B. polymyxa
Collagen IVSigma AldrichC0543Z błony podstawnej mięsaka myszy Engelbreth-Holm-Swarm
DMEMSigma AldrichD5030Ciepły w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem
DNAseSigma AldrichD4513Deoksyrybonukleaza I z trzustki bydlęcej
FCSSigma AldrichF6178Surowica cielęca płodu (zwana również płodową surowicą bydlęcą)
HeparynaSigma AldrichH3393Antykoagulant
PDSFirst Link UK Ltd.60-00-850Surowica osoczochowa
PercollSigma AldrichP1644Ogrzana do temperatury pokojowej przed użyciem
PyrumycynaSigma AldrichP8833Należy stosować tylko w pierwszych 2 dniach hodowli

Bibliografia

  1. Neuwelt, E. A., et al. Engaging neuroscience to advance translational research in brain barrier biology. Nature reviews. Neuroscience. 12, 169-182 (2011).
  2. Ohtsuki, S., Terasaki, T. Contribution of carrier-mediated transport systems to the blood-brain barrier as a supporting and protecting interface for the brain; importance for CNS drug discovery and development. Pharmaceutical Research. 24, 1745-1758 (2007).
  3. Bittner, S., et al. Endothelial TWIK-related potassium channel-1 (TREK1) regulates immune-cell trafficking into the CNS. Nature Medicine. 19, 1161-1165 (2013).
  4. Zlokovic, B. V. The blood-brain barrier in health and chronic neurodegenerative disorders.Neuron. 57, 178-201 (2008).
  5. Stoll, G., et al. Transient widespread blood-brain barrier alterations after cerebral photothrombosis as revealed by gadofluorine M-enhanced magnetic resonance imaging. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 29, 331-341 (2009).
  6. Kleinschnitz, C., et al. Glucocorticoid insensitivity at the hypoxic blood-brain barrier can be reversed by inhibition of the proteasome. Stroke. 42, 1081-1089 (2011).
  7. Hawkins, B. T., Davis, T. P. The blood-brain barrier/neurovascular unit in health and disease. Pharmacological reviews. 57, 173-185 (2005).
  8. Bazzoni, G., Dejana, E. Endothelial cell-to-cell junctions: molecular organization and role in vascular homeostasis. Physiological reviews. 84, 869-901 (2004).
  9. Pardridge, W. M. Blood-brain barrier delivery. Drug Discovery Today. 12, 54-61 (2007).
  10. Persidsky, Y., Ramirez, S. H., Haorah, J., Kanmogne, G. D. Blood-brain barrier: structural components and function under physiologic and pathologic conditions. Journal of neuroimmunepharmacology : the official journal of the Society on NeuroImmune Pharmacology. 1, 223-236 (2006).
  11. Pardridge, W. M. Molecular biology of the blood-brain barrier. Molecular Biotechnology. 30, 57-70 (2005).
  12. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature Reviews Immunology. 7, 678-689 (2007).
  13. Wilson, E. H., Weninger, W., Hunter, C. A. Trafficking of immune cells in the central nervous system. Journal of Clinical Investigation. 120, 1368-1379 (2010).
  14. Engelhardt, B., Capture Ransohoff, R. M. crawl, cross: the T cell code to breach the blood-brain barriers. Trends in Immunology. 33, 579-589 (2012).
  15. Zonta, M., et al. Neuron-to-astrocyte signaling is central to the dynamic control of brain microcirculation. Nature Neuroscience. 6, 43-50 (20003).
  16. Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468, 562-566 (2010).
  17. Gerhardt, H., et al. VEGF guides angiogenic sprouting utilizing endothelial tip cell filopodia. Journal of Cell Biology. 161, 1163-1177 (2003).
  18. Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Seminars in immunopathology. 31, 497-511 (2009).
  19. Perriere, N., et al. Puromycin-based purification of rat brain capillary endothelial cell cultures. Effect on the expression of blood-brain barrier-specific properties. J. Neurochem. 93, 279-289 (2005).
  20. Ruck, T., et al. CD4+NKG2D+ T cells exhibit enhanced migratory and encephalitogenic properties in neuroinflammation. PLoS One. 8, 81455(2013).
  21. Weidenfeller, C., Schrot, S., Zozulya, A., Galla, H. J. Murine brain capillary endothelial cells exhibit improved barrier properties under the influence of hydrocortisone. Brain Res. 1053, 162-174 (2005).
  22. Gumbleton, M., Audus, K. L. Progress and limitations in the use of in vitro cell cultures to serve as a permeability screen for the blood-brain barrier. J. Pharmaceutal Sci. 90, 1681-1698 (2001).
  23. Watanabe, T., et al. Paracellular barrier and tight junction protein expression in the immortalized brain endothelial cell lines bEND.3, bEND.5 and mouse brain endothelial cell 4. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 36, 492-495 (2013).
  24. Omidi, Y., et al. Evaluation of the immortalised mouse brain capillary endothelial cell line, b.End3, as an in vitro blood-brain barrier model for drug uptake and transport studies. Brain Research. 990, 95-112 (2003).
  25. Sacharidou, A., et al. Endothelial lumen signaling complexes control 3D matrix-specific tubulogenesis through interdependent Cdc42- and MT1-MMP-mediated events. Blood. 115, 5259-5269 (2010).
  26. Urich, E., et al. Multicellular self-assembled spheroidal model of the blood brain barrier. Scientific reports. 3, (2013).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

bariera krew-mózgizolacja komórek śródbłonkawirowanie w gradiencie gęstościtrawienie enzymatycznebiałka połączeń szczelnychbarwienie immunofluorescencyjnehodowla komórkowaekspresja CD31testy przepuszczalności
Izolacja pierwotnych mysich komórek śródbłonka mikronaczyniowego mózgu
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.