Warunkowanie niedokrwienne kończyn na odległość: technika neuroprotekcyjna u gryzoni

Summary

Zdalne warunkowanie niedokrwienne (RIP) to metoda kondycjonowania tkanek przed szkodliwym stresem. Ustaliliśmy metodę zdalnego niedokrwienia kończyny tylnej, poprzez napompowanie mankietu ciśnieniomierza na 5-10 minut. Zdolności neuroprotekcyjne RIP wykazano w modelu zwyrodnienia siatkówki u gryzoni.

Abstract

Niedokrwienie subletalne chroni tkanki przed kolejnym, cięższym niedokrwieniem poprzez regulację w górę mechanizmów endogennych w dotkniętej tkance. Wykazano również, że niedokrwienie subletalne zwiększa mechanizmy ochronne w odległych tkankach. Krótki okres niedokrwienia (5-10 min) kończyny tylnej ssaków wywołuje reakcje samoobronne w mózgu, płucach, sercu i siatkówce. Efekt ten jest znany jako zdalne kondycjonowanie wstępne niedokrwienne (RIP). Jest to obiecujący terapeutycznie sposób ochrony ważnych narządów i jest już w trakcie badań klinicznych dotyczących urazów serca i mózgu. Niniejsza publikacja przedstawia kontrolowaną, małoinwazyjną metodę doprowadzenia kończyny – a konkretnie tylnej kończyny szczura – do niedokrwienia. Mankiet do pomiaru ciśnienia krwi opracowany do stosowania u noworodków jest połączony z ręcznym ciśnieniomierzem i służy do wywierania ciśnienia 160 mmHg wokół górnej części kończyny tylnej. Sonda przeznaczona do wykrywania temperatury skóry służy do weryfikacji niedokrwienia, rejestrując spadek temperatury skóry spowodowany niedrożnością tętnic nóg wywołaną ciśnieniem oraz wzrost temperatury, który następuje po zwolnieniu mankietu. Ta metoda RIP zapewnia ochronę siatkówki szczura przed uszkodzeniami i zwyrodnieniami wywołanymi jasnym światłem.

Introduction

Przeżywalność większości, być może wszystkich, tkanek w obliczu stresu metabolicznego może być poprawiona przez wcześniejsze kondycjonowanie z okresem subletalnego niedokrwienia^1,2. Wstępne kondycjonowanie niedokrwienne (IP) w praktyce to narażenie tkanki na niedokrwienie subletalne, zanim tkanka doświadczy poważniejszych czynników stresogennych, takich jak późniejsze uszkodzenie niedokrwienne. W modelach zwierzęcych IP zapewnia uderzającą ochronę mózgu, siatkówki, serca i płuc^3-6. Analogicznie, obserwacje u pacjentów po udarze wykazały związek między wcześniejszymi przemijającymi atakami niedokrwiennymi a lepszymi wynikami klinicznymi^7,8. IP chroni również fotoreceptory siatkówki przed urazami nieniedokrwiennymi⁹.

Skuteczność IP w różnych tkankach i urazach sugeruje, że aktywuje ona wrodzony mechanizm przetrwania komórek, obecny we wszystkich tkankach. Sugeruje się, że wstępne kondycjonowanie niedokrwienne mięśnia sercowego ma działanie ochronne poprzez regulację w górę czynnika indukowanego hipoksją (HIF), o którym wiadomo, że reguluje wiele szlaków metabolicznych poprzez uwalnianie adenozyny lub otwarcie mitochondrialnych kanałów potasowych ATP^10,11. Uwalnianie adenozyny i kanały potasowe ATP są zaangażowane w niedokrwienie mózgu, ale dotychczasowe badania nad neuroprotekcyjnemi mechanizmami warunkowania niedokrwiennego koncentrowały się na modyfikacjach szlaków antyekscytotoksycznych, antyapoptotycznych i przeciwzapalnych^12,13. Ogólnie rzecz biorąc, wiedza na temat molekularnego procesu warunkowania niedokrwiennego w celu ochrony neuronów jest ograniczona.

Zdalne warunkowanie niedokrwienne próbuje warunkować odległe, krytycznie ważne organy (serce, mózg, płuca) poprzez generowanie niedokrwienia w mniej krytycznych tkankach. Wykazano, że zdalne kondycjonowanie niedokrwienne (RIP) przy użyciu kończyny tylnej ma działanie neuroprotekcyjne w modelach udaru^14-17 u gryzoni. Opisana przez nas metoda zapewnia prosty, niezawodny i nieinwazyjny protokół indukcji RIP.

Zdecydowana większość protokołów RIP dotyczy kończyny tylnej, przypuszczalnie dlatego, że tętnica udowa znajdująca się w górnej kończynie tylnej może być łatwo zidentyfikowana i dostępna w celu chirurgicznego zaciśnięcia i założenia opaski uciskowej. W inwazyjnych badaniach niedokrwiennych kończyn w celu zbadania ochrony mózgu i skóry, niedokrwienie jest wywoływane przez oddzielenie tętnicy udowej od więzadeł pachwinowych i zaciśnięcie tętnicy udowej^2,15,18.

Niedokrwienie wynikające z zaciśnięcia kończyny lub zaciśnięcia tętnicy udowej zostało potwierdzone przez zmiany w kończynie, w tym utratę pulsu, spadek natlenienia i spadek temperatury skóry. Zdalne niedokrwienie można potwierdzić utratą tętna za pomocą laserowego Dopplera lub ultrasonograficznego Dopplera^17-19. Temperatura skóry może być stosowana jako alternatywa dla Dopplera, chociaż zależność jest nieliniowa^20,21. Dokładne zapisy temperatury są powszechne w laboratoriach i można je łatwo włączyć do zdalnych badań niedokrwiennych.

Alternatywą dla operacji zaciskania kości udowej jest indukcja niedokrwienia za pomocą opaski uciskowej. Założenie opaski uciskowej powoduje niedokrwienie porównywalne do tego, które osiąga się przy zaciskaniu naczynia; Kutchner i wsp. Porównano inwazyjne zaciskanie tętnicy udowej z nieinwazyjną opaską uciskową i stwierdzono, że obie metody zatrzymały przepływ krwi do kończyny i zmniejszyły uszkodzenia skóry w modelu chirurgii plastycznej niedokrwienia płata skórnego¹⁸. Stwierdzono, że skucie nogi lub ramienia i podniesienie ciśnienia w mankiecie do poziomu powyżej skurczowego ciśnienia krwi chroni przed uszkodzeniem niedokrwiennym u świń i ludzi^17,19,22.

Różne podejścia do wywoływania zdalnego niedokrwienia za pomocą opaski uciskowej obejmują użycie mankietu do pomiaru ciśnienia krwi lub elastycznej opaski^17,22,23. Jednak stosowanie elastycznej opaski w celu wywołania niedokrwienia jest niebezpieczną metodą, potencjalnie powodującą nieuregulowany nacisk w kończynie, przy czym u ludzi odnotowuje się wzrost ciśnienia powyżej 500 mmHg²⁴. Co więcej, niedokrwienie kończyn za pomocą elastycznej opaski prowadzi do uszkodzenia mięśni u szczurów po usunięciu opaski²³, jak oceniono za pomocą Evans Blue Dye, markera przepuszczalności włókien mięśniowych in vivo ²⁵. W przeciwieństwie do tego, dostarczenie kontrolowanego ciśnienia do opaski uciskowej można osiągnąć za pomocą mankietu do pomiaru ciśnienia krwi połączonego z ciśnieniomierzem^17,19,22,26.

W tym badaniu, model lekkiego uszkodzenia degeneracji fotoreceptorów został wykorzystany do zademonstrowania neuroprotekcyjnej skuteczności zdalnego warunkowania niedokrwiennego. Zdalne niedokrwienie zostało wywołane bezpośrednio przed lekkim uszkodzeniem i zapobiegło późniejszemu zwyrodnieniu fotoreceptorów, co potwierdzono badaniami funkcji siatkówki. Załączony film zademonstruje zastosowanie nieinwazyjnego zdalnego niedokrwienia.

Protocol

Oświadczenie etyczne: Protokół jest zgodny z wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami Uniwersytetu w Sydney, AEC #5657. Znieczulenie zostało zatwierdzone przez komisję etyczną ds. zwierząt (University of Sydney, AEC #5657).

1. Przygotowanie sprzętu

1. Korzystaj ze śledzenia temperatury skóry w czasie rzeczywistym. Włącz komputer i sprzęt do akwizycji danych.
2. Otwórz oprogramowanie do rejestracji temperatury i ustaw temperaturę w zakresie 30-35 °C, a częstotliwość próbkowania co 100 ms.
3. Opcjonalnie: Włóż termometr doodbytniczy, aby upewnić się, że temperatura rdzenia pozostaje stabilna na poziomie 37,5 °C.

2. Kalibracja ręcznego ciśnieniomierza

1. Podłącz mankiet noworodka do ciśnieniomierza. Użyj mankietu w rozmiarze 2 dla szczura o wadze 250-550 g. Do podłączenia rurki mankietu do ciśnieniomierza może być konieczny adapter
.
2. Opróżnij mankiet, poluzowując zawór spustowy powietrza lub odłączając rurkę mankietu od adaptera. Upewnij się, że w rurce nie ma ciśnienia, a igła manometru spoczywa na zerze wewnątrz owalu/prostokąta.
3. Sprawdź ciśnienie między rurką, manometrem i mankietem. Napompuj mankiet delikatnymi pompkami żarówki do pompowania, aż na manometrze pojawi się 100 mmHg. Upewnij się, że ciśnienie pozostaje stałe. Opróżnij mankiet, powoli otwierając wartość uwalniania powietrza.

3. Przygotowanie zwierząt

Uwaga: Zwierzęta, które mają zostać zranione światłem, wymagają adaptacji do ciemności w noc poprzedzającą zdalne niedokrwienie. Zwierzęta poddawane lekkim uszkodzeniom wymagają ciemnego chowu (12 godzin cyklu światło: ciemność (5 luksów))

1. Wykonaj zdalne niedokrwienie u obudzonych lub znieczulonych gryzoni. Upewnij się, że zwierzęta mają zdrowe napięcie mięśniowe. Upewnij się tego, ściskając górną tylną kończynę, aby upewnić się, że obecne są odpowiednie mięśnie. Ochrona przed lekkimi urazami wywołana przez RIP została przetestowana na szczurach prowadzących siedzący tryb życia do 6 miesiąca życia.
2. Znieczulony preparat do RIP
   1. Szczurom należy wstrzyknąć dootrzewnowe 60 mg/kg ketaminy i 5 mg/kg ksylazyny. Sprawdź głębokość znieczulenia, prostując nogę i szczypiąc skórę na spodniej stronie stopy. Zwierzę nie ma odruchu, jeśli jest głęboko znieczulone. Stosuj sztuczne łzy, aby uniknąć wysuszenia rogówki podczas znieczulenia.
   2. Umieść szczury na poduszce grzewczej lub rurki podgrzewacza wody obiegowej, aby utrzymać stałą temperaturę ciała 37.5 °C. Ustaw szczura w pozycji leżącej z poduszkami stóp kończyn dolnych skierowanymi do góry. Zarówno prawa, jak i lewa kończyna może ulec odległemu niedokrwieniu.
3. Przygotowanie Awake do RIP
   Uwaga: Eksperymenty na zwierzętach Awake wymagają dwóch osób. Jedna osoba krępuje zwierzę, a druga osoba obsługuje ręczny ciśnieniomierz. Eksperymentatorzy muszą być pewni, że wykonają procedurę, ponieważ unieruchomienie zwiększa ryzyko obrażeń osób obsługujących. Szczury poddawane zdalnej niedokrwieniu muszą być przyzwyczajone do ręcznego unieruchamiania. W zależności od intuicyjnych wytycznych, ręczne unieruchomienie powinno być postępowane od 30 sEC do maksymalnie 5 minut w ciągu kilku tygodni. Płochliwe zwierzęta, które nie przyzwyczajają się do ręcznego krępowania, powinny być wyłączone z eksperymentów na jawie. Wreszcie, ręczne unieruchomienie może powodować stres (i potencjalnie wprowadzać zakłócenia do badania) u zwierząt, a w celu dokładnej interpretacji wyników badania RIP należy zastosować pozorowaną kohortę (założenie mankietu bez stanu zapalnego).
   1. Pokrój ręcznik na kawałek o wymiarach 15 cm x 30-50 cm i ułóż krótszą krawędź prostopadle do kręgosłupa szczura, zakrywając głowę do górnej części kończyn tylnych.
   2. Wsuń ciasno krótszą krawędź pod tułów szczura i zacznij owijać szczura pozostałą długą krawędzią ręcznika. Zabezpiecz owinięte zwierzę pod pachą w pozycji leżącej. Jeśli szczur jest trzymany pod lewym ramieniem, uwolnij prawą kończynę szczura z ręcznika.

4. Zastosowanie sondy temperatury skóry

1. Wyprostuj nogę szczura, który ma ulec niedokrwieniu i umieść sondę skórną na opuszku stopy. Ustaw sondę skóry tak, aby zmaksymalizować kontakt między sondą temperatury a skórą. Mocno wepchnij sondę w podnóżek i przymocuj sondę taśmą papierową.
2. Sprawdź położenie sondy skórnej, śledząc temperaturę w oprogramowaniu do rejestrowania temperatury. Upewnij się, że temperatura skóry wynosi od 30 do 34 °C i pozostaje stabilna. Śledź temperaturę skóry przez 1-2 minuty. Wyreguluj sondę skóry, jeśli temperatura jest niestabilna lub niższa niż 30 °C.

5. Zdalne niedokrwienie

1. Opróżnij mankiet i upewnij się, że zawór ciśnienia powietrza jest zamknięty. Wyprostuj nogę i luźno owiń mankiet na górnej kończynie tylnej. Użyj palca wskazującego i kciuka, aby wyprostować nogę i dolne palce, aby utrzymać poluzowany mankiet na miejscu.
2. Zwiększ ciśnienie w mankiecie znieczulonego zwierzęcia do 160 mmHg, a u zwierząt obudzonych zwiększ ciśnienie w mankiecie do 180 mmHg.
   Uwaga: Znieczulone ciśnienie krwi szczurów waha się od 120-140 mmHg i wzrasta do 160 mmHg, gdy są przytomne. Rozpocznij rejestrację temperatury timera i stopy po osiągnięciu prawidłowego ciśnienia.
   Uwaga: Temperatura stopy powinna spaść o 2 °C po 5 minutach stałego nacisku.
3. Utrzymuj pozycję mankietu nad "kolanem" zwierzęcia przez cały czas niedokrwienia. Ciśnienie w mankietu zacznie spadać po kilku minutach lub jeśli kończyna szczura się porusza.
4. Wielokrotnie pompuj bańkę do pompowania w krótkich seriach, aby utrzymać pożądane ciśnienie w mankiecie, powtarzalna krótka seria pompowania
5. Zdalne niedokrwienie może być dostarczane w sposób ciągły od 5 do 15 minut. Protokół reperfuzji niedokrwiennej obejmuje 2 okresy 5-minutowego niedokrwienia z 5-minutową reperfuzją.
6. Zmniejsz ciśnienie w mankiecie, poluzowując zawór ciśnienia powietrza. Sprawdź zmianę temperatury w trakcie protokołu niedokrwienia. Zwolnij mankiet.
7. Kontynuuj eksperymentowanie z kontuzjami. Zwierzęta pod wpływem znieczulenia będą musiały zostać umieszczone na poduszce grzewczej. Kontynuuj monitorowanie zwierząt do czasu rozpoczęcia chodzenia. Zwierzęta nie mogą być zwrócone do pomieszczeń przed chodzeniem.

6. Lekki uraz - model zwyrodnienia siatkówki

1. Ciemne zwierzęta przystosowują się przez noc (12-15 godzin). Bezpośrednio po kondycjonowaniu na zdalne niedokrwienie lub pozorowane zdalne niedokrwienie (unieruchomienie zwierząt) należy umieścić zwierzęta w pomieszczeniach z pleksiglasu z jedzeniem i wodą.
2. Włącz oświetlenie fluorescencyjne (1 000 luksów) znajdujące się nad obudową z pleksiglasu o godzinie 9 rano na 24 godziny. Po ekspozycji na światło przywróć zwierzęta do przyciemnionego oświetlenia cyklicznego na 7 dni.

7. Zabiegi po zdalnym niedokrwieniu

1. Ocena wzroku za pomocą elektroretinogramu (ERG):
   Uwaga: Konfiguracja ERG i protokół flash były zgodne z Brandli i Stone²⁶.
   1. Ciemne zwierzęta przystosowują się przez noc (12-15 godzin). W słabym czerwonym świetle znieczulić zwierzęta poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie ketaminy i ksylazyny (odpowiednio 60 mg/kg i 5 mg/kg). Rozszerzenie źrenic (siarczan atropiny 1,0%), znieczulenie rogówki (proksymetakaina 0,5%).
   2. Krople do oczu nawilżające rogówkę (polimer karbomerowy) należy natychmiast nałożyć na rogówkę. Nakładaj żel pod oczy w odstępach 20 minut, aby utrzymać nawilżenie rogówki.
   3. Narysuj luźno zawiązaną nić wokół gałki ocznej, aby pomóc w stabilnym zapisie ERG. Monitoruj temperaturę za pomocą sondy doodbytniczej i utrzymuj temperaturę ciała zwierzęcia na poziomie 37-37,5 °C.
   4. Umieść głowicę w kuli całkującej Ganzfelda.
      Uwaga: Ganzfeld to w pełni programowalny bodziec świetlny, który dostarcza równomierne błyski z diod LED do oka.
   5. Zapisz elektroretinogram za pomocą wykonanej na zamówienie platynowej elektrody dodatniej o średnicy 4 mm, lekko dotykającej rogówki, oraz elektrody osadkowej Ag/AgCl o średnicy 2 mm wprowadzonej do jamy ustnej. Odwołaj obie elektrody do igły ze stali nierdzewnej wprowadzonej podskórnie do zadu.
   6. Nagrywaj sygnały z ustawieniem pasma przepustowego 0,3-1,000 Hz (-3 dB), z szybkością akwizycji 2 kHz (AD Instruments). Po ustaleniu stabilnego zapisu ERG, przed rozpoczęciem zapisów zwierzę należy poddać je 10-minutowej adaptacji do ciemności.
   7. Postępuj zgodnie z protokołem flash, jak opisano wcześniej przez Brandli i Stone²⁶.
      1. Zaprogramuj czas trwania błysku (użyliśmy błysków o czasie trwania 1-2 ms) i ustaw jego intensywność na -4,4 do 2,0 log scot cd.s.m-2. Użyj jasnych błysków (2.0 log scot cd.s.m-2, 1 ms), aby zmierzyć funkcję siatkówki. W tym badaniu jest to porównanie między kontrolą, lekkim urazem i lekkim urazem z RIP.

8. Test TUNEL

1. Eutanazja zwierząt przez dootrzewnowe wstrzyknięcie przedawkowania fenobarbitalu (100 mg/kg). Wyłuszczyć oczy i utrwalić w 4% paraformaldehydu.
2. Przemyj oczy w PBS przed cyroochroną oczu przez noc w sacharozie 30% (w/v). Osadź oczy w związku OCT i pokrój na odcinki strzałkowe 20 μm za pomocą kriostatu.
3. Wykonaj test TUNEL na skrawkach siatkówki z barwieniem DAPI zgodnie z protokołem Maslima i wsp.^{27 Rozdział 27}
4. Użyj mikroskopii fluorescencyjnej do zliczania TUNEL siatkówki. Komórki TUNEL zarejestrowano z zewnętrznej warstwy jądrowej (ONL); Najbardziej zewnętrzna warstwa siatkówki, która zawiera jądra fotoreceptorów. W tym badaniu liczbę TUNEL wykonano w trzech egzemplarzach dla każdego oka, po 5 oczu dla każdej grupy leczonej.
5. Użyj jednokierunkowej ANOVA do statystycznego porównania grupowych średnich kontroli, lekkich obrażeń i lekkich obrażeń + szczurów RIP.

Results

Mankiet do pomiaru ciśnienia krwi podniesiony do powyżej 160 mmHg zatrzymuje przepływ krwi do kończyny tylnej, co wyraźnie widać na rysunku 1B. Brak dotlenienia tkanek spowodował obniżenie temperatury stopy zwierzęcia w przypadku protokołu niedokrwienno-reperfuzyjnego (ryc. 2). Temperatura stopy (33 °C) była niższa niż temperatura wewnętrzna i niezawodnie zmniejszała się podczas podnoszenia ciśnienia w mankiecie (31 °C) wzrastającego po opróżnieniu mankietu (32 °C). Pojedynczy uraz świet...

Discussion

Niedokrwienie kończyn tylnych gryzoni udało się wywołać za pomocą ręcznego ciśnieniomierza i mankietu, zapewniając neuroprotekcję fotoreceptorom siatkówki. Odkrycie zgodne z kondycją niedokrwienną indukowało ochronę fotoreceptorów przed uszkodzeniem światłem^9,28.

Zasadniczo, zdalne niedokrwienie powoduje krótkotrwały niedobór tlenu w tkankach. W związku z tym zdalne warunkowanie niedokrwienne ma wiele podobieństw do warunkowania niedokrwiennego lub alternatywnie nazywanego tolerancj...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ciśnieniomierz ręczny DuraShock z serii Gold	Welch Allyn	DS56	Ręczny ciśnieniomierz
Neonate [rozmiar 2] 1 tubka, 10 sztuk	Welch Allyn	5082-102-1	Mankiet do pomiaru ciśnienia krwi kończyn
Adapter Luer lock	Welch Allyn	5082-178	Adapter do mankietu noworodkowego
Termistor pod	AD Instruments	ML 309	jednostka temperatury skóry
Sonda temperatury skóry	AD Instruments	MLT 422/A
sprzęt do akwizycji	AD Instruments	PL 35044
System homeotermicznych z elastyczną sondą	Harvard Appartus	507222F
Ręcznik			opcjonalnie: obudź zdalne niedokrwienie
Isoflo - 100% Isofluran (250 ml)	Abbot Animal Health	05260-05	opcjonalnie: znieczulenie wziewne zdalne niedokrwienie
Ketamil - ketamina 100 mg / ml (50 ml)	Troy Laboratories Pty Ltd		opcjonalnie: znieczulenie do wstrzykiwań
Ksylium - Ksylazyna 100 mg / ml (50 ml)	Troy Laboratories Pty Ltd		opcjonalnie: znieczulenie do wstrzykiwań zdalne niedokrwienie