Efektywne pozyskiwanie komórek nabłonka barwnikowego siatkówki z komórek macierzystych

Podsumowanie

Komórki nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) pochodzące z komórek macierzystych mogą być wykorzystywane do wielu zastosowań, w tym do terapii komórkowych w celu zwyrodnienia siatkówki, modelowania chorób i badań nad lekami. Poniżej przedstawiamy prosty protokół umożliwiający powtarzalne pozyskiwanie RPE z komórek macierzystych.

Streszczenie

Nie znaleziono lekarstwa na zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem (AMD), główną przyczynę utraty wzroku u osób powyżej 55 roku życia. AMD jest złożoną, wieloczynnikową chorobą o nieznanej etiologii, chociaż w dużej mierze uważa się, że występuje z powodu śmierci lub dysfunkcji nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE), monowarstwy komórek, która leży u podstaw siatkówki i zapewnia krytyczne wsparcie dla fotoreceptorów. Strategie wymiany komórek RPE mogą być bardzo obiecujące, jeśli chodzi o zapewnienie ulgi terapeutycznej dla dużej podgrupy pacjentów z AMD, a komórki RPE, które bardzo przypominają pierwotne komórki ludzkie (hRPE), zostały wygenerowane w wielu niezależnych laboratoriach, w tym w naszym. Ponadto zastosowania iPS-RPE nie ograniczają się do terapii opartych na komórkach, ale są również wykorzystywane do modelowania chorób RPE. Tego typu badania mogą nie tylko wyjaśnić molekularne podstawy chorób, ale także służyć jako nieocenione narzędzia do opracowywania i testowania nowych leków. Przedstawiamy tutaj zoptymalizowany protokół ukierunkowanego różnicowania RPE od komórek macierzystych. Dodanie nikotynamidu i aktywiny A lub IDE-1, małej cząsteczki, która naśladuje jej działanie, w określonych punktach czasowych, znacznie zwiększa wydajność komórek RPE. Korzystając z tej techniki, możemy uzyskać dużą liczbę RPE o niskim pasażu już po trzech miesiącach.

Wprowadzenie

Różne typy komórek, które zajmują siatkówkę, są zorganizowane w funkcjonalną architekturę. Fotoreceptory w tylnej części siatkówki są odpowiedzialne za przekształcanie światła w impulsy elektryczne poprzez fototransdukcję. Jednak fototransdukcja nie może zachodzić bez skoordynowanych wysiłków innych sąsiednich typów komórek, w tym komórek glejowych Muellera i komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE). Monowarstwa komórek RPE oddziela siatkówkę czuciową od naczyniówki włosowatej, głównego źródła krwi dla fotoreceptorów, i jest idealnie usytuowana do kontrolowania wielu funkcji ważnych dla homeostazy fotoreceptorów. W rzeczywistości RPE i fotoreceptory są tak współzależne, że powszechnie uważa się je za jedną jednostkę funkcjonalną. (Przegląd wszystkich różnorodnych funkcji RPE można znaleźć w Strauss, 2005,^{s. 1}.) Śmierć lub dysfunkcja komórek nabłonka barwnikowego siatkówki może wywołać zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem (AMD), główną przyczynę trwałej utraty wzroku w krajach uprzemysłowionych^2-4.

AMD jest wieloczynnikową chorobą RPE, fotoreceptorów i naczyniówki; czynniki ryzyka są zróżnicowane i obejmują kombinacje wpływów środowiskowych i genetycznych^5,6. Metody leczenia AMD są bardzo ograniczone, ale jedną z obiecujących potencjalnych terapii jest wymiana komórek RPE^7,8. Chociaż wyniki były mieszane, przeszczepienie komórek RPE u pacjentów z AMD (i u innych pacjentów ze zwyrodnieniem siatkówki), a także w modelach zwyrodnienia siatkówki u gryzoni, może przejściowo zapobiec znacznemu zanikowi fotoreceptorów^9-23. (Modelem zwierzęcym powszechnie używanym w tych badaniach są szczury Royal College of Surgeons (RCS), które są nosicielami mutacji w genie MerTK. Ta mutacja sprawia, że komórki RPE nie są zdolne do fagocytozy zewnętrznych segmentów fotoreceptorów i sprzyjają zwyrodnieniu siatkówki²⁴.) Chociaż zgłaszane wskaźniki przeżycia wszczepionego RPE w przestrzeni podsiatkówkowej szczurów i myszy RCS różnią się znacznie, istnieje potencjał, aby przeżyły one kilka miesięcy lub lat^9,10,12,20.

Komórki RPE można uzyskać w wystarczającej liczbie do przeszczepu, pozyskując je z pluripotencjalnych komórek macierzystych^9-14,25-28. Kilka niezależnych grup wykazało, że komórki te funkcjonują w podobny sposób jak ich somatyczne odpowiedniki, a długoterminowe badania sugerują, że są one bezpieczne po implantacji w modelach chorób szczurów i myszy^{9,10,12,14,19,20,25,29-32}. Stosowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych zamiast embrionalnych komórek macierzystych może być korzystne, ponieważ można uniknąć problemów etycznych i immunologicznych związanych z allogenicznym RPE^33,34. Innym ekscytującym zastosowaniem technologii iPS jest modelowanie chorób³⁵. Możliwość badania dużej liczby komórek RPE pochodzących od pacjentów z chorobami RPE może być nieoceniona dla zrozumienia ich podstaw molekularnych. Tego typu badanie zostało niedawno przeprowadzone z udziałem najlepszego pacjenta z chorobą RPE i może utorować drogę do podobnych badań nad dziedzicznymi makulopatiami³⁶.

Uzyskanie RPE z komórek macierzystych jest stosunkowo prostym procesem i może być przeprowadzone całkowicie w warunkach wolnych od kseno. Najprostszą strategią jest spontaniczne wyprowadzanie monowarstw komórek RPE, jednak wydajność można znacznie poprawić, stosując techniki ukierunkowanego różnicowania. Techniki te wiążą się jednak z wykorzystaniem egzogennych czynników białkowych, które mogą być kosztowne i często generowane przez bakterie lub inne źródła inne niż ludzkie^10,12,37. W naszych badaniach postępowaliśmy zgodnie z ustalonym protokołem¹⁰, który wykorzystuje nikotynamid i aktywinę A, czynnik sygnalizacyjny, który, jak wykazano, jest wystarczający dla specyfikacji RPE³⁸. Tutaj pokażemy, że mała cząsteczka IDE-1 może odpowiednio zastąpić aktywinę A, zmniejszając w ten sposób koszty i łagodząc obawy związane ze stosowaniem rekombinowanych białek³⁹. Dodatkowo stosujemy zamiennik surowicy wolnej od ksenotypów i hodujemy różnicujące się komórki RPE na syntetycznym podłożu wolnym od kseno. Wcześniej wykazano, że komórki RPE bardzo skutecznie różnicują się przy użyciu tego podejścia⁴⁰.

Gdy różnicujemy się jako monowarstwa, wizualizujemy pigmentowane kolonie zawierające komórki RPE już po pięciu tygodniach¹². Gdy osiągną odpowiedni rozmiar, można je ręcznie wyciąć i przenieść do innego naczynia w celu rozprężenia. Komórki RPE są znane z dedyferencjacji przy każdym pasażu i należy unikać używania czegokolwiek starszego niż pięć pasaży (stwierdzamy, że wystarczająca liczba komórek do charakterystyki i przeszczepu w modelach zwierzęcych może być łatwo wygenerowana po dwóch lub trzech pasażach). Po pełnym zróżnicowaniu stosujemy wiele technik, aby scharakteryzować komórki anatomicznie i funkcjonalnie, aby zapewnić, że będą one służyć jako odpowiednie zamienniki chorego RPE. Opis tych technik i protokół wszczepiania iPS-RPE w przestrzeń podsiatkówkową gryzoni wykraczają poza zakres tej pracy metodologicznej i zostały wcześniej opublikowane^12,32,41.

Podczas gdy opracowanie standardowych protokołów do skutecznego wyprowadzania iPS-RPE jest wyraźnie ważne dla klinik, jest jeszcze wiele do zrobienia w zakresie badań przedklinicznych na modelach zwierzęcych. Istnieją obawy dotyczące immunogenności komórek pochodzących z iPS i bada się wiele różnych technik implantacji, w tym wszczepianie komórek na sztuczne podłoża^42,43. Z tych powodów uważamy, że publikacja ustandaryzowanych protokołów jest korzystna dla ułatwienia zarówno badań klinicznych, jak i przedklinicznych. Zwłaszcza, jeśli zostaną przeprowadzone bezpośrednie porównania komórek iPS-RPE pochodzących z różnych laboratoriów przez różne grupy badawcze.

Protokół

1. Ukierunkowane różnicowanie RPE pochodzącego z komórek macierzystych

UWAGA: Wszystkie etapy inkubacji przeprowadzane są w temperaturze 37 °C przy 5% CO₂

1. Utrzymuj linie hES lub hiPS (podawanie codziennie) w pożywkach konserwacyjnych (MM; Tabela 1). Gdy linie osiągną wystarczające standardy kontroli jakości, utrzymuj je na warstwie mysich embrionalnych komórek żywiących (MEF) wysianych w gęstości 250 000 / dołek na płytce sześciodołkowej. Kultury wolne od ksenotypów mogą być również generowane zgodnie z protokołem ustalonym przez Tuckera i wsp.^{Lokal mieszkalny 40}.
2. Pozwól koloniom komórek macierzystych osiągnąć zbieg.
3. Przełącz się na pożywki różnicujące z nikotynamidem (DM/NIC; Tabela 1); karmić codziennie.
4. Po trzech tygodniach w hodowli zmień na pożywki różnicujące z nikotynamidem i Activin-A lub IDE-1 (DM/NIC/AA lub DM/NIC/IDE1; Tabela 1) w celu zwiększenia zróżnicowania RPE.
5. Po pięciu tygodniach w hodowli przełącz się z powrotem na DM/NIC. Codzienne karmienie nie jest już konieczne, gdy wskaźniki pH w pożywce przestają żółknąć następnego dnia po karmieniu.
6. Poczekaj, aż pojawią się wysepki komórek barwnikowych, które są wystarczająco duże, aby można je było przeciąć i usunąć (patrz rysunki 2D-F i 3A).

2. Izolowanie pigmentowanych wysepek

1. Pokryj studzienki 24-dołkowej płytki matrycą, która naśladuje naturalne środowisko komórkowe (preferowane jest wolne od kseno).
   UWAGA: Ostrza rogówki i ostre kleszcze z cienką końcówką są bardzo przydatne do zbierania. Cały arkusz zróżnicowanych komórek może się odczepić podczas pobierania. Unikaj tego, pracując ostrożnie i początkowo zbierając kolonie na środku naczynia.
2. Napełnij tyle studzienek płytki 24-dołkowej pożywką różnicującą (DM; Tabela 1) w zależności od potrzeb. Decyzja ta będzie zależeć od liczby zebranych pigmentowanych kolonii.
3. W kapturze do hodowli komórkowej z lunetą sekcyjną ręcznie wytnij pigmentowane wysepki. Pokrój każdą wysepkę na dnie oryginalnej płytki za pomocą skalpela na około 2-6 kawałków i chwyć pigmentowane części ostrymi kleszkami.
4. Przenieś 1-2 pigmentowane kawałki do każdej 24-dołkowej.
5. Nie zmieniaj pożywki przez 3-5 dni, aż komórki się przykleją, a następnie zacznij zmieniać pożywkę trzy razy w tygodniu. (Jeśli nie zastosują się do nich po tym czasie, istnieje duże prawdopodobieństwo, że nigdy tego nie zrobią).
6. Rozwijaj komórki przez 3-4 tygodnie w pożywkach różnicujących (DM; Tabela 1) -- Obraz typowej kultury jest pokazany na rysunku 3B. Komórki mogą nadal nie wypełniać całej studni, ale dłuższe czekanie nie wydaje się pomagać. Karm komórki trzy razy w tygodniu.
7. Po około 3 tygodniach ręcznie usuń skupiska białych krwinek w grudkach, jeśli to konieczne, za pomocą ostrych kleszczy. Nie wykonuj tego kroku, chyba że jest to konieczne – łatwo o wprowadzenie zanieczyszczeń. Idealnym rozwiązaniem jest próba uzyskania najczystszych populacji RPE z oryginalnych pigmentowanych kolonii w kroku 1.6.

3. Passaging Stem Cell RPE

1. Odłączyć komórki o stężeniu 200 μl roztworem do dysocjacji komórek (najlepiej nie trypsyny – preferowany jest odczynnik, który można inaktywować przez rozcieńczenie) na 5-8 minut w temperaturze 37 °C i dezaktywować go przez rozcieńczenie s.m. Za pomocą pipety o pojemności 200 μl zmyć wszystkie komórki i ponownie je zawiesić (jeśli wybrana studzienka zawiera tylko kilka komórek, rozważ połączenie komórek z dwóch 24-dołków).
2. Odwirować (800 x g przez 5 min), odrzucić supernatant i ponownie zawiesić w 3 ml pożywki DM.
3. Ponownie płytkować komórki z jednego (lub dwóch) 24-dołków w jednym 6-dołku pokrytym matrycą w 3 ml DM na dołek (ekspansja 1:5).
4. Rozszerzaj się przez 1-2 tygodnie, aż komórki zlewają się w ~90%; obraz w pełni zróżnicowanej czystej kultury pokazano na rysunku 3C.
5. Odłączyć komórki z 1 ml roztworu dysocjacyjnego na około 5-8 minut w temperaturze 37 °C, dezaktywować je przez rozcieńczenie DM, użyć pipety 1 000 μl do zmycia wszystkich komórek i ponownie je zawiesić.
6. Odwirować (800 x g przez 5 min), odrzucić supernatant i ponownie zawiesić w 18 ml pożywki DM.
7. Ponownie płytki komórek z jednego 6-dołkowego każdego do sześciu 6-dołkowych pokrytych matrycą w 3 ml s.m. na studzienkę (ekspansja 1:6) lub jednokrotnie powlekanej kolby o długości 75 cm² (ekspansja 1:7,5).
8. W razie potrzeby powtarzaj kroki 3.4–3.8, aż do uzyskania wystarczającej liczby komórek.
   UWAGA: Staraj się zebrać jak najwięcej kolonii w celu ekspansji, zamiast planować amplifikację kultur poprzez pasażowanie, ponieważ każde przejście wywołuje dedyferencjację RPE.

Wyniki

Kroki opisane w tym manuskrypcie, jak pokazano na rysunku 1, mogą być wykorzystane do łatwego generowania RPE z komórek macierzystych, jak wcześniej opisano^10,12. Po utrzymaniu linii iPS przez kilka tygodni, pigmentowane kolonie zaczynają pojawiać się w koloniach po 5-7 tygodniach (7-tygodniowe kultury pokazano na rycinie 2A-C). Kolonie te mogą rosnąć przez tygodnie, ponieważ kultury są utrzymywane. Po osiągnięciu wystarczających rozmiarów, jak pokazano na rysunku 2D-F...

Dyskusja

W tym manuskrypcie przedstawiamy kroki, które należy podjąć, aby efektywnie wygenerować dużą liczbę czystych kultur iPS-RPE. Wykazaliśmy wcześniej, używając tego protokołu ukierunkowanego różnicowania z aktywiną A, że możemy generować iPS-RPE, które bardzo przypominają hRPE w oparciu o transkryptomikę, proteomikę, metabolomikę i funkcjonalność, oraz że opóźniają one zwyrodnienie siatkówki po wszczepieniu szczurom RCS^12,31,32. Proces generowania iPS-RPE jest czasochłonny, ale nie pracochłonny (rys. 1

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Nóż do rogówki	Nóż Surgipro	SPOI-070	x 1
DMEM/F-12, HEPES	Life Technologies	11330-032	500 ml x 4
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami firmy Dulbecco, 1X bez Ca lub Mg	VWR	45000-434	500 ml x 6
Surowica bydlęca płodu, regularna (inaktywowana termicznie)	VWR	45000-736	500 ml x 1
FGF-Basic (AA 10-155) Rekombinowane technologie życia białek ludzkich		PHG0021	100 i mikro; g x 1
IDE-1	Stemgent	04-0026	2 mg x 1
Knockout DMEM	Life Technologies	10829-018	500 ml x 1
KnockOut Serum Replacement	Life Technologies	10828-028	500 ml x 1
L-Glutamina 200 mM	Life Technologies	25030-081	100 ml x 1
MEM Roztwór aminokwasów endogennych 100X	Life Technologies	11140-050	100 ml x 1
Nikotynamid	Sigma-Aldrich	N0636-100G	100 g x 1
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)	Life Technologies	15140-148	20 ml x 1
Rekombinowana aktywina ludzka/mysia/szczurza A	PeproTech	120-14E	10 &mikro; g x 2
Synthemax-T Powierzchnia 6-dołkowa Płytki	Corning	3877	Case(12) x 1
Enzym TrypLE-Express (1X), bez czerwieni fenolowej	Life Technologies	12604-021	500 ml x 1
System filtrów próżniowych/butelek do przechowywania, 0,1 i mikro; m porów, 500ml	Etui na 431475 Corning		(12) x 1