Makrofagi są kluczowymi komórkami zaangażowanymi w patogeniczność gospodarza. Makrofagi wykazują różnorodność fenotypową i funkcjonalną, którą można analizować i wykrywać za pomocą analizy proteomicznej. W artykule opisano, jak przeprowadzić elektroforezę 2D pierwotnych kultur ludzkich makrofagów zróżnicowanych do fenotypu M1 lub M2.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Profilowanie proteomiczne makrofagów za pomocą elektroforezy 2D
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Celem opisanego tutaj dwuwymiarowego (2D) protokołu elektroforezy jest pokazanie, jak analizować fenotyp makrofagów hodowanych przez człowieka. Wykazano kluczową rolę makrofagów w różnych zaburzeniach patologicznych, takich jak choroby zapalne, immunologiczne i zakaźne. W tym protokole używamy pierwotnych kultur ludzkich makrofagów pochodzących z monocytów, które można różnicować w fenotyp M1 (prozapalny) lub M2 (przeciwzapalny). Ten model in vitro jest wiarygodny w badaniu aktywności biologicznej makrofagów M1 i M2, a także w podejściu proteomicznym. Techniki proteomiczne są przydatne do porównywania fenotypu i zachowania makrofagów M1 i M2 podczas patogenności gospodarza. Elektroforeza żelowa 2D jest potężną techniką proteomiczną do jednoczesnego mapowania dużej liczby białek lub polipeptydów. Opisujemy protokół elektroforezy 2D z użyciem barwników fluorescencyjnych, zwany 2D Różnicową Elektroforezą Żelową (DIGE). Białka makrofagów M1 i M2 są znakowane barwnikami cyjaninowymi przed rozdzieleniem przez ogniskowanie izoelektryczne, zgodnie z ich punktem izoelektrycznym w pierwszym wymiarze i masą cząsteczkową w drugim wymiarze. Oddzielone plamki białkowe lub polipeptydowe są następnie wykorzystywane do wykrywania różnic w poziomach ekspresji białek lub polipeptydów. Opisane tutaj podejścia proteomiczne pozwalają na badanie zmian białek makrofagów związanych z różnymi zaburzeniami, takimi jak patogenność gospodarza lub toksyny mikrobiologiczne.
Wprowadzenie
Makrofagi to heterogeniczne i plastyczne komórki, które są w stanie uzyskać odrębne funkcjonalne fenotypy. In vivo komórki te reagują na wiele różnych sygnałów mikrośrodowiskowych, takich jak produkty mikrobiologiczne, cytokiny itp. 1. In vitro fenotyp prozapalny (M1) makrofagów może być indukowany przez lipopolisacharyd (LPS), a fenotyp przeciwzapalny (M2) przez niektóre cytokiny, takie jak interleukina-4 (IL-4). Co więcej, makrofagi mogą przełączać się z aktywowanego fenotypu M1 na M2 i odwrotnie, na określone sygnały2.
W zależności od fenotypu, makrofagi będą miały różne funkcje. Makrofagi M1 to komórki, które wytwarzają cytokiny prozapalne, takie jak czynnik martwicy nowotworu α (TNF-α), w celu zabijania mikroorganizmów lub komórek nowotworowych3. Natomiast makrofagi M2 zapobiegają tej reakcji zapalnej, takiej jak gojenie się ran i zwłóknienie, wytwarzając czynniki przeciwzapalne, takie jak TGF-β3,4.
Ludzkie komórki jednojądrzaste krwi obwodowej od zdrowych dawców zostały wyizolowane przez wirowanie w gradiacji gęstości Ficoll, jak wcześniej opisano5, przy użyciu techniki zaadaptowanej z Boyum6. Makrofagi w hodowli mogą być zróżnicowane do fenotypu M1 lub M2 po 6 dniach hodowli pierwotnej7.
Analiza ekspresji białek lub zmian białek między dwoma podtypami makrofagów pod wpływem różnych kontrolowanych bodźców, takich jak patogenność gospodarza czy toksyny mikrobiologiczne, będzie pomocna w rozszyfrowaniu funkcjonalności makrofagów pro- i przeciwzapalnych.
Proteomika to unikalne narzędzia do bezpośredniego monitorowania białek, które są specyficznie regulowane w górę lub w dół w ludzkich makrofagach pod wpływem różnych bodźców. Barwniki fluorescencyjne rozwiązały niektóre ograniczenia elektroforezy żelowej 2D, takie jak niska czułość i analiza obrazu8. Barwniki reagujące z resztą cysteiny mają zwiększoną czułość wykrywania w porównaniu z tymi reagującymi z resztą lizyny9. W poprzednim badaniu wykazaliśmy przydatność znakowania nasyceniem DIGE do analizy rzadkich próbek10 w porównaniu z klasyczną elektroforezą 2D barwioną srebrem11. Technologia ta jest pomocna w szybkiej analizie modyfikacji białek między dwoma podtypami makrofagów lub między makrofagami nieleczonymi i poddanymi działaniu substancji z tego samego podtypu.
Zaletą tej techniki proteomicznej jest dostęp do informacji o wielkości białka i modyfikacjach potranslacyjnych poprzez analizę żelu 2D12. Należy wziąć pod uwagę, że nie jest to technika o wysokiej przepustowości, ograniczająca liczbę próbek, które można poddać analizie. Opracowanie wysokoprzepustowych testów opartych na spektrometrii mas, które zostały poddane niedawnemu przeglądowi13, może poprawić ten stan rzeczy.
Tutaj prezentujemy, jak przeprowadzić analizę DIGE 2D od ekstrakcji białek hodowanych makrofagów poprzez procesy elektroforezy, izoelektrofokusa i SDS-PAGE, a także informacje na temat przydatności odpowiedniego oprogramowania 2D.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Protokół jest zgodny z wytycznymi komisji etycznej ds. badań na ludziach w naszych instytucjach. Sierść buffy od zdrowych dawców została pozyskana z Regionalnego Centrum Transfuzji Krwi (Lille, Francja). Próbki uzyskane z kożuchów są deklarowane jako kolekcja Inserm (nr DC2010-1209).
1. Przygotowanie materiałów i pożywek kulturowych
- Rozcieńczyć 10x sól fizjologiczną buforu fosforanowego (PBS) w sterylnej wodzie destylowanej, aby uzyskać 1x PBS.
- Przygotuj pożywkę RPMI 1640 uzupełnioną gentamycyną (40 μg/ml) i L-glutaminą (2 mM), z 10% pulą surowicy ludzkiej i bez niej.
2. Pierwotne kultury makrofagów pochodzących z monocytów (MDM)
- Rozcieńczyć buffycoat (25 ml) z 1x PBS. Ostrożnie załadować do probówki Ficoll/leucosep i odwirować przy 1 600 x g przez 20 minut, w temperaturze pokojowej.
- Zbierz monocyty na granicy faz do nowej probówki. Przemyć 3x 10 ml 1x PBS zawierający 0,1% kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) przez kolejne wirowanie po 1.000 x g, 370 x g i 160 x g przez 10 min każde, a następnie raz w 1x PBS sam przy 160 x g przez 10 min.
- Zawiesić osad komórkowy w 5 ml pożywki RPMI-1640 bez surowicy i zasiać komórki w szalkach o średnicy 35 mm o gęstości 1 x 106 komórek na szalkę.
- Po sedymentacji przez 90 minut w inkubatorze należy odrzucić supernatant zawierający nieprzylegające komórki. Przemyć przylegające komórki, składające się z monocytów, 3x 1 ml PBS; Następnie dodać 1 ml świeżej pożywki zawierającej 10% (v/v) ludzkiej surowicy do wcześniej wolnych komórek surowicy.
- Po 6 dniach hodowli, aby uzyskać alternatywne zróżnicowane makrofagi (M2), dodaj rekombinowaną ludzką IL-4 (15 ng / ml) i utrzymuj przez 6 dni. Następnie należy potraktować zróżnicowane makrofagi lipopolisacharydem (100 ng / ml) w dniu 12 przez 4 godziny, aby uzyskać makrofagi M1.
3. Ekstrakcja białek makrofagów M1 i M2 do elektroforezy 2D
- Przemyć makrofagi trzykrotnie 25 mM Tris, pH 7,4 i złom w buforze zawierającym 30 mM Tris pH 8, 4% 3-[(3-cholamidopropylo)dimetyloamonio]-1-propanosulfonianu (CHAPS), 2 M tiomocznika i 7 M mocznika.
- Lizować komórki za pomocą mieszalnika odpowiedniego do probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml przez 5 minut w lodzie i przechowywać w temperaturze -20 °C.
- Określ stężenie białka za pomocą komercyjnego odczynnika Bradforda. Przechowywać 100 μl porcji białek w temperaturze -20 °C do momentu użycia.
4. Izoelektrofokus
UWAGA: Wszystkie procedury etykietowania wykonuj w ciemności.
- Zredukować 5 μg każdej próbki (makrofagi M1 i M2) dostosowane do 9 μl za pomocą buforu do lizy z 2 mM tris(2-karboksyetylo)fosfiną (TCEP) przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
- Dodać cyjaninę 3 (Cy3) do ekstraktu M1 i ekstraktu barwnika sulfhydryl-reaktywnego M2 w stężeniu 0,8 nM/μg białka. Dodać cyjaninę 5 (Cy5) do ekstraktów M1 i M2 o stężeniu 0,8 nM/μg białka i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
- Zatrzymać reakcję przez dodanie równej objętości buforu próbki zawierającego 7 M mocznika, 2 M tiomocznik, 4% CHAPS, 130 mM ditiotreitol (DTT) i 2% pharmalitów.
- Mieszaj próbki M1 znakowane Cy3 z próbkami M2 znakowanymi Cy5 w jednej ręce i próbkami M2 znakowanymi Cy3 z próbkami M1 znakowanymi Cy5 w drugiej ręce.
- Ponownie uwodnić pasek z immobilizowanym gradientem pH (IPG) (240 mm, gradient liniowy pH 3-10) z 450 μl znakowanych próbek mieszanych w buforze zawierającym 7 M mocznika, 2 M tiomocznika i 4% CHAPS na izoelektrycznym systemie ogniskowania (IEF) przez 24 godziny bez stosowania prądu.
- Wykonuj ostrość przy napięciu 300 V (V) przez 3 godziny, a następnie przy nachyleniu do 1,000 V przez 6 godzin, przy nachyleniu do 8,000 V przez 3 godziny i wreszcie przy 8,000 V przez 3 godziny.
5. Drugi wymiar
UWAGA: Wszystkie procedury elektroforezy wykonuj w ciemności.
- Inkubować paski IPG w buforze równowagowym zawierającym 0,1 mM Tris-HCl (pH 8), 6 M mocznika, 2% (w/v) dodecylosiarczanu sodu (SDS) i 30% (v/v) glicerolu przez 10 minut.
- Przenieść zrównoważone paski IPG dla drugiego wymiaru (elektroforeza w żelu poliakrylamidowym SDS (PAGE)) na 12,5% żele PAGE i uszczelnić niskotopliwą agarozą.
- Przeprowadzić elektroforezę w temperaturze 20 °C przy użyciu systemu Ettan-Daltsix przy stałym napięciu 70 V przez noc, a następnie 300 V, aż czoło błękitu bromofenolowego dotrze do dna żelu.
6. Akwizycja obrazu i analiza bioinformatyczna
- Żele skanujące odlane między dwiema szklanymi płytkami o niskiej fluorescencji za pomocą skanera DIGE Imager o długościach fal wzbudzenia/emisji 532/580 nm dla Cy3 i 633/670 nm dla Cy5 w celu uzyskania obrazów o rozmiarze piksela 100 μm.
- Wykonaj analizę obrazu za pomocą komercyjnego oprogramowania, jak opisano wcześniejw punkcie 12.
- Obliczanie i normalizowanie objętości punktów na każdym obrazie. Przypisz znormalizowaną objętość plamki jako proporcję całkowitej wartości każdej plamki wykrytej w żelu.
- Przeanalizuj różnice w objętości plamki białkowej dla każdego typu makrofagów, porównując znormalizowaną wartość objętości plamki między dwiema grupami (M1 i M2). Uznaj, że różnica między wolumenami spot jest znacząca, jeśli zmiana jest 1,5-krotna (p <0,05, jednoczynnikowa analiza ANOVA).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Aby przeprowadzić odpowiednią analizę proteomiczną różnicową, należy zweryfikować proces przygotowania próbek przeznaczonych do analizy.
W przedstawionym przykładzie, jakość hodowli komórkowej makrofagów pod kątem aspektów morfologicznych i molekularnych była wymagana zgodnie z wcześniejszymi publikacjami5. Dyferencjację monocytów w makrofagi oraz homogenność hodowli monitorowano za pomocą mikroskopii fazowej. Rycina 1 przedstawia przykład pierwotnych hodowli makrof...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisany w niniejszym dokumencie protokół szczegółowo opisuje metodę analizy wpływu różnych bodźców dwóch podtypów makrofagów, M1 (prozapalne) i M2 (przeciwzapalne). Pierwotne kultury makrofagów M1 i M2 uzyskano z różnicowania monocytów, jak wcześniej opublikowano7.
Procedura elektroforezy żelowej 2D DIGE wymaga specjalistycznych materiałów i sprzętu, takich jak komórka IEF do izoelektrofokusowania, płytki o niskiej fluorescencji do SDS-PAGE w celu dwukrotnego zeskanowania żelu na dł...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie ma zadeklarowanego konfliktu interesów.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Inserm. Marion Bouvet jest stypendystką francuskiego Ministerstwa Badań Naukowych i Technologii. Annie Turkieh jest stypendystką programu Unii Europejskiej HOMAGE 7PR (305507).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| RPMI 1640 | Invitrogen | 31870-074 | |
| PBX 10 X | Invitrogen | 14200-083 | |
| L-glutamina-200 mM-100X | Invitrogen | 25030-024 | |
| gentamycyna 10 mg/ml | Invitrogen | 15710-049 | |
| surowica ludzka | Invitrogen | 34005100 | |
| Ficoll d = 1,077 | ATGC | L6115 | |
| Leucosep | Dutscher | 16760 | |
| Płytka 6-dołkowa PRIMARIA | Becton Dickinson | 353846 | |
| IL-4 | Promocell | B-61410 | |
| lipopolisacharyd | Sigma-Aldrich | L-2654 | |
| Giemsa | Fluka | 48900 | |
| EDTA MM372,2 | Research Organics | 3.00E+01 | |
| Filtr 0,22 i mikro; m | Millipore | SCGPTORE | |
| 100 ml cylinder | Corning | 430182 | |
| TCEP | Interchim | UP242214 | |
| Bradford odczynnik | Bio-Rad | 5000006 | |
| Cy3+Cy5-reaktywny barwnik | GE Healthcare | 25-8009-83 | |
| IPG 3-10 24cm | GE Healthcare | 17-6002-44 | |
| Protean Komórka IEF | Bio-Rad | 165-4000 | |
| Niskotopliwa agaroza | Invitrogen | 15517-014 | |
| System Ettan-Daltsix | GE Healthcare | 80-6485-08 | |
| Ettan DIGE Skaner do obrazowania | GE Healthcare | ||
| Progeneza Samespot | Dynamika nieliniowa | ||
| 50 ml probówki | dowolny dostawca | nie dotyczy | |
| Probówki 15 ml | dowolny dostawca | nie dotyczy | |
| CHAPS | Sigma-Aldrich | C5070 | |
| uré e | Merk | 108484-500 | |
| Thiouré e | Sigma-Aldrich | T7875 | |
| DTT | Bio-Rad | 1610611 | |
| APS | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Tris HCl | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Pharmalytes 3-10 | GE Healthcare | 17-0456-01 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L3773 | |
| Błękit bromofenolowy | Sigma-Aldrich | 114391 | |
| Glicerol | Sigma-Aldrich | G6279 | |
| Akrylamid 40% | Bio-Rad | 161-0148 | |
| Czyszczenie 2D GE | Healthcare | 80-6454-51 | |
| Glicyna | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| Ciemny i ostry; elektrodowe tyloformamid | Sigma-Aldrich | 22705-6 | |
| Bio-Rad | 165-4071 |
Bibliografia
- van Ginderachter, J. A., et al. Classical and alternative activation of mononuclear phagocytes: picking the best of both worlds for tumor promotion. Immunobiology. 211, (2006).
- Porcheray, F., et al. Macrophage activation switching: an asset for the resolution of inflammation. Clin. Exp. Immunol. 142, 481-489 (2005).
- Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).
- Mantovani, A., Locati, M., Vecchi, A., Sozzani, S., Allavena, P. Decoy receptors: a strategy to regulate inflammatory cytokines and chemokines. Trends Immunol. 22, 328-336 (2001).
- Pinet, F., et al. Morphology, homogeneity and functionality of human monocytes-derived macrophages. Cell. Mol. Biol. 49, 899-905 (2003).
- Boyum, A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Isolation of monuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1. 97, 77-89 (1968).
- Chinetti-Gbaguidi, G., et al. Human atherosclerotic plaque alternative macrophages display low cholesterol handling but high phagocytosis because of distinct activities of the PPARγ and LXRα pathways. Circ. Res. 108, 985-995 (2011).
- Tonge, R., et al. Validation and development of fluorescence two-dimensional differential gel electrophoresis proteomics technology. Proteomics. 1, 377-396 (2001).
- Shaw, J., et al. Evaluation of saturation labelling two-dimensional difference gel electrophoresis fluorescent dyes. Proteomics. 3, 1181-1195 (2003).
- Dupont, A., et al. Application of saturation dye 2D DIGE proteomics to characterize proteins modulated by oxidized low density lipoprotein treatment of human macrophages. J. Proteome Res. 7, 3572-3582 (2008).
- Dupont, A., et al. Two-dimensional maps and databases of the human macrophage proteome and secretome. Proteomics. 4, 1761-1778 (2004).
- Acosta-Martin, A. E., et al. Impact of incomplete DNase I treatment on human macrophage analysis. Proteomics Clin. Appl. 3, 1236-1246 (2009).
- Acosta-Martin, A. E., Lane, L. Combining bioinformatics and MS-based proteomics: clinical implications. Expert Rev Proteomics. , (2014).
- Boytard, L., et al. Role of proinflammatory CD68+MR- macrophages in peroxiredoxin-1 expression and in abdominal aortic aneurysms in humans. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 33, 431-438 (2013).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
