Artykuł metodologiczny

Metoda oceny wpływu zakresu długości fal i natężeń terapii światłem czerwonym/bliskiej podczerwieni na stres oksydacyjny in vitro

DOI:

10.3791/52221

⸱

21 marca 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Experimental and Regenerative Neurosciences, School of Animal Biology, The University of Western Australia, 2School of Animal Biology and The Oceans Institute, The University of Western Australia, 3Experimental and Regenerative Neurosciences, School of Anatomy, Physiology and Human Biology, The University of Western Australia

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niekoherentne światło ksenonowe było przepuszczane przez wąskopasmowe filtry interferencyjne i neutralne gęstości, aby dostarczyć światło o różnej długości fali i intensywności do hodowanych komórek. Protokół ten został wykorzystany do oceny wpływu terapii światłem czerwonym/bliskiej podczerwieni na produkcję form reaktywnych in vitro: nie zaobserwowano żadnych efektów przy użyciu badanych parametrów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Terapia światłem czerwonym/bliskiej podczerwieni (R/NIR-LT), dostarczana za pomocą lasera lub diody elektroluminescencyjnej (LED), poprawia funkcjonalne i morfologiczne wyniki w szeregu urazów ośrodkowego układu nerwowego in vivo, prawdopodobnie poprzez zmniejszenie stresu oksydacyjnego. Wykazano jednak, że wpływ R/NIR-LT na stres oksydacyjny różni się w zależności od długości fali lub intensywności napromieniowania. Brakuje badań porównujących parametry leczenia ze względu na brak dostępnych na rynku urządzeń, które dostarczają różne długości fal lub intensywności, odpowiednie do wysokoprzepustowych badań optymalizacyjnych in vitro. Protokół ten opisuje technikę dostarczania światła o różnych długościach fal i intensywnościach w celu optymalizacji dawek terapeutycznych wymaganych dla danego modelu urazu. Postawiliśmy hipotezę, że metoda dostarczania światła, w której parametry długości fali i natężenia mogą być łatwo zmieniane, może ułatwić określenie optymalnej dawki R/NIR-LT do redukcji reaktywnych form tlenu (ROS) in vitro.

Niespójne światło ksenonowe zostało przefiltrowane przez wąskopasmowe filtry interferencyjne, aby dostarczyć różne długości fal (centralne długości fal 440, 550, 670 i 810nm) i fluencje (8,5 x 10-3 do 3,8 x 10-1 J/cm2) światła do hodowanych komórek. Strumień świetlny z aparatu został skalibrowany tak, aby emitować terapeutycznie istotne, równe ilościowe dawki światła na każdej długości fali. Formy reaktywne wykryto w komórkach poddanych działaniu glutaminianu poddanych działaniu światła, przy użyciu barwników fluorescencyjnych wrażliwych na DCFH-DA iH2O2.

Udało nam się dostarczyć światło o różnych fizjologicznie i terapeutycznie istotnych długościach fal i intensywnościach, do hodowanych komórek wystawionych na działanie glutaminianu jako modelu uszkodzenia OUN. Podczas gdy fluencje R/NIR-LT zastosowane w niniejszym badaniu nie wywierały wpływu na ROS generowane przez hodowane komórki, metoda dostarczania światła ma zastosowanie do innych systemów, w tym izolowanych mitochondriów lub bardziej fizjologicznie istotnych organotypowych modeli hodowli warstwowych i może być wykorzystana do oceny wpływu na szereg pomiarów wyników metabolizmu oksydacyjnego.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reaktywne formy tlenu (ROS) są wymagane dla szeregu szlaków transdukcji sygnału i normalnych reakcji metabolizmu komórkowego, w tym neuroprotekcji 1. Jednakże, gdy endogenny mechanizm antyoksydacyjny nie jest w stanie kontrolować produkcji ROS, komórki mogą ulegać stresowi oksydacyjnemu 2,3. Uważa się, że po uszkodzeniu OUN związany z tym wzrost obecności ROS i stresu oksydacyjnego odgrywa istotną rolę w postępie uszkodzenia 4,5. Pomimo ogromnej liczby strategii tłumienia stresu oksydacyjnego, które zostały ocenione, obecnie nie ma w pełni skutecznych, klinicznie istotnych strategii przeciwutleniających do tłumienia produkcji ROS i związanego z nią stresu oksydacyjnego w zastosowaniach klinicznych po neurotraumie 6. Dlatego też tłumienie stresu oksydacyjnego pozostaje ważnym celem interwencji terapeutycznej 7.

Poprawa po R/NIR-LT została zgłoszona w szerokim zakresie urazów i chorób, w tym zmniejszenie rozmiaru zawału serca, powikłania nerkowe i wątrobowe podczas cukrzycy, zwyrodnienie siatkówki, uszkodzenie OUN i udar 8, być może poprzez zmniejszenie stresu oksydacyjnego. Ze szczególnym uwzględnieniem uszkodzenia OUN, badania przedkliniczne skuteczności światła 670 nm wykazały dobre efekty w modelach zwyrodnienia siatkówki 9-11, uszkodzenia rdzenia kręgowego 12, śmierci neuronów 13. Przeprowadzono badania kliniczne dotyczące zwyrodnienia plamki żółtej związanego z suchym wiekiem i są obecnie w toku dla udaru mózgu 14, jednak wyniki tych badań nie wydają się obiecujące, być może z powodu niezastosowania skutecznych parametrów leczenia 15. W związku z tym R/NIR-LT nie został powszechnie przyjęty jako część normalnej praktyki klinicznej w neurotraumatyce, mimo że jest łatwym do przeprowadzenia, nieinwazyjnym i stosunkowo niedrogim leczeniem. Do przeszkód w translacji klinicznej należy brak jasno zrozumiałego mechanizmu działania i brak ustandaryzowanego, skutecznego protokołu leczenia 16,17. Aktualna literatura dotycząca terapii światłem ujawnia liczne różnice w parametrach leczenia w odniesieniu do źródeł napromieniowania (LED lub laser), długości fali (np. 630, 670, 780, 810, 830, 880, 904 nm), dawki całkowitej (dżule napromieniowania / jednostka powierzchni), czasu trwania (czas ekspozycji), czasu (przed lub po zniewadze), częstotliwości leczenia i sposobu dostarczania (pulsacyjne lub ciągłe) 8. Zmienność parametrów leczenia między badaniami utrudnia porównanie i przyczyniła się do sceptycyzmu co do skuteczności 16.

Dlatego optymalizacja R/NIR-LT jest wyraźnie wymagana, z systemami hodowli komórkowych zdolnymi do zapewnienia wysokoprzepustowego mechanizmu przesiewowego niezbędnego do porównania wielu zmiennych. Istnieje jednak niewiele dostępnych na rynku systemów oświetleniowych, które mogą zapewnić wystarczającą elastyczność i kontrolę nad długością fali i intensywnością, aby przeprowadzić takie eksperymenty optymalizacyjne. Dostępne na rynku urządzenia LED na ogół nie są w stanie dostarczyć wielu długości fal lub intensywności, co powoduje, że badacze wykorzystują wiele urządzeń LED różnych producentów, które mogą różnić się nie tylko intensywnością, ale także widmem długości fali emitowanego światła. Rozwiązaliśmy ten problem, stosując szerokopasmowe ksenonowe źródło światła filtrowane przez wąskopasmowe filtry interferencyjne, generując w ten sposób szereg długości fal i fluencji światła, umożliwiając ścisłą, dokładną kontrolę parametrów R/NIR-LT.

Ważne jest, aby zauważyć, że terapeutyczna dawka leczenia jest definiowana przez liczbę fotonów oddziałujących z fotoakceptorem (chromoforem), który w przypadku R/NIR-LT jest postulowany jako oksydaza cytochromu c (COX) 18. Dostarczana energia fotonów zmienia się wraz z długością fali; Oznacza to, że równe dawki energii na różnych długościach fal będą składać się z różnej liczby fotonów. W związku z tym światło emitowane przez urządzenie zostało skalibrowane tak, aby emitować równą liczbę fotonów dla każdej z wybranych długości fal, które miały być badane. Opracowaliśmy system, który może być używany do dostarczania R/NIR-LT o różnych długościach fal i natężeniach do komórek in vitro i wykazaliśmy zdolność do pomiaru wpływu dostarczonego R/NIR-LT na produkcję ROS w komórkach poddanych stresowi glutaminianem.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Kalibracja optyczna: Pomiar strumienia świetlnego

  1. Aby przygotować aparat dostarczający światło, należy podłączyć szerokopasmowe źródło światła (np. lampę ksenonową lub wolframową) do odpowiedniego źródła zasilania. Umieść soczewkę kolimacyjną przed źródłem światła, aby wytworzyć skolimowaną wiązkę światła. Przepuść światło przez ciekły filtr ciepła, aby usunąć większość ciepła z wiązki światła. W zależności od zastosowania, skolimowaną wiązkę należy skoncentrować na otworze wejściowym płynnego światłowodu, co zapewnia bardziej elastyczne dostarczanie światła (np. do inkubatora).
  2. Na drugim końcu płynnego światłowodu umieść drugą soczewkę kolimacyjną, a następnie uchwyt na filtry interferencyjne i o neutralnej gęstości. Sprawdź, czy ten układ wytwarza równomiernie oświetloną plamę światła o pożądanym zakresie fal i intensywności.
    Uwaga: Odległość między końcem światłowodu a płaszczyzną próbki może wymagać zmian w zależności od obszaru, który ma być oświetlony, ale pamiętaj, że wraz ze wzrostem odległości od końca światłowodu natężenie światła będzie się zmniejszać. W niniejszym badaniu odległość ta wynosi 14 cm i tworzy przekrój poprzeczny wiązki, który równomiernie oświetla obszar dołka 3x3 na płytce 96-dołkowej.
  3. Upewnij się, że światło rozproszone z lampy i powiązanych elementów optycznych nie jest w stanie dotrzeć do próbki.
  4. Włącz chłodnicę wody dla filtra ciepła cieczy i upewnij się, że następuje wymiana wody przez płaszcz filtra. Włącz lampę źródło zasilania i odczekaj co najmniej 5 minut, aż szerokopasmowe źródło światła się ustabilizuje. Uwaga: Użycie chłodnicy wody jest wymagane, aby zapobiec przegrzaniu urządzenia.
  5. Wybierz wąskopasmowy filtr interferencyjny (zwykle opisany przez ich środkową długość fali, szczytową transmitancję i pełną szerokość przy połowie maksymalnej szerokości pasma (FWHM)), aby wygenerować żądany zakres fal oświetlenia. Uwaga: Wąskopasmowe filtry interferencyjne użyte w obecnym badaniu wynosiły 442 nm, 550 nm, 671 nm i 810 nm.
  6. Zmierzyć światło wytwarzane przez lampę na płaszczyźnie, na której próbka ma być umieszczona podczas zabiegu. Zmierz światło za pomocą skalibrowanej sondy natężenia promieniowania (kolektora cosinusowego) podłączonej do odpowiedniego spektroradiometru, używając odpowiedniego oprogramowania zgodnie z instrukcjami producenta.
  7. Użyj filtrów o neutralnej gęstości, aby dostosować intensywność światła, aż do uzyskania pożądanej mocy wyjściowej. Uwaga: W niniejszym badaniu natężenie światła przepuszczanego przez każdy filtr interferencyjny jest dostosowywane tak, aby uzyskać równą moc wyjściową w każdym z czterech zakresów fal obróbki. Ważne jest, aby regularnie sprawdzać kalibrację, ponieważ moc lampy może ulec zmianie.
    Uwaga: Po ustawieniu aparatu komórki są gotowe do oświetlenia. Rysunek 1 przedstawia aparat dostarczający światło używany w obecnym badaniu.

figure-protocol-1

Rysunek 1. Obraz aparatu dostarczającego światło. Na ilustracji przedstawiono źródło zasilania światła, lampę ksenonową z obudową, soczewkę kolimacyjną, filtr wody, otwór wejściowy, płynny światłowód, drugą soczewkę kolimacyjną, uchwyt filtra, ramkę zabiegową i matową czarną kartę. Należy pamiętać, że filtry długości fali i intensywności wąskopasmowej nie są pokazane.

2. Przygotowanie komórek

  1. Opisana metoda dostarczania R/NIR-LT może być zastosowana do dowolnego typu komórki lub systemu modelowego in vitro; w związku z tym poniższe opisy hodowli komórkowej są ogólne, przy użyciu dobrze znanych technik hodowli guza chromochłonnego (PC12), Müllera (rMC1) i pierwotnych mieszanych komórek siatkówki.
  2. Przed wysiewem komórek w celu lekkiego traktowania i testu stresu oksydacyjnego należy wyhodować unieśmiertelnione komórki w odpowiednich pożywkach wzrostowych zawierających odpowiednie suplementy (np. FBS, antybiotyki) w kolbach T75 do 70-80% zlewania się.
  3. Oderwać unieśmiertelnione komórki od kolb T75, stosując metodę właściwą dla typu ogniwa, które ma być badane, np. trypsyna. W razie potrzeby, przed przystąpieniem do wysiewu komórek na 96-dołkowych płytkach testowych, należy pokryć płytki testowe 10 μg/ml poli-L-lizyny przez 1 godzinę (np. dla komórek PC12) lub 10 μg/ml poli-L-lizyny przez 1 godzinę, a następnie inkubację O/N z 10 μg/ml lamininy (np. dla mieszanych komórek siatkówki).
  4. Odwirować komórki w celu zebrania, jeśli jest to właściwe (np. 3 minuty przy 405 x g dla komórek PC12 lub 10 minut przy 218 x g dla komórek rMC1), usunąć supernatant i ponownie zawiesić w 8 ml odpowiedniej pożywki do hodowli komórkowych.
  5. Jeżeli mają być użyte mieszane komórki siatkówki, należy przygotować z nowonarodzonych szczeniąt szczurów P0-5 przez trawienie enzymatyczne (papaina) zgodnie z ustalonymi procedurami 19
  6. Policz liczbę żywotnych komórek z wyłączeniem 0,4% (w/v) niebieskiego barwnika trypanowego, używając hemocytometru.
  7. Dostosuj gęstość komórek tak, aby komórki były zlewające się w około 70-80% po 24 lub 48 godzinach w hodowli. (dla komórek PC12 gęstość wysiewu wynosi 4,0 x 105 żywotnych komórek/ml, dla komórek rMC1 wynosi 2,5 x 105 żywotnych komórek/ml, a dla mieszanych komórek siatkówki 8 x 105 żywotnych komórek/ml). Po dodaniu komórek do przezroczystych lub czarnych 96-dołkowych płytek (używanych odpowiednio do testuH2O2lub DCFH-DA), w 100 μl odpowiedniej pożywki wzrostowej, pozostaw płytkę na płaskiej powierzchni w temperaturze 37°C, 5% CO2 (lub w innych warunkach odpowiednich dla określonego typu komórek) przez co najmniej 24 godziny, aby umożliwić przyleganie komórek.
  8. Hoduj komórki w pożywkach wzrostowych w odpowiednich tacach z 96 dołkami, aż osiągną 70-80% zlewu (24 godziny dla komórek PC12 i rMC1, 48 godzin dla mieszanych komórek siatkówki).

3. Dodawanie stresora glutaminianu do komórek

  1. Przygotować stężenie hydratu soli monosodowej kwasu L-glutaminowego o stężeniu 0-10 mM w odpowiednich pożywkach do hodowli o pełnym wzroście.
  2. Usuń pożywkę z komórek i delikatnie umyj komórki 3 razy PBS (PC12) lub HBSS (rMC1 i mieszane komórki siatkówki). Po umyciu dodać pożywkę zawierającą glutaminian do całkowitej objętości 100 μl/studzienkę.

4. Pierwsze dawki leczenia światłem

  1. Natychmiast po dodaniu glutaminianu lub wybranego stresora, wystawij komórki na działanie światła o pożądanych długościach fal i intensywności, umieszczając je pod przygotowanym aparatem dostarczającym światło. Należy pamiętać o zmianie ilościowej mocy wyjściowej wiązki światła przy użyciu ustalonych kombinacji filtrów o neutralnej gęstości w zależności od podawanej długości fali.
    Uwaga: W obecnych eksperymentach wystawiaj komórki na działanie światła przez 3 minuty, utrzymując temperaturę, opierając 96 dołków na poduszce grzewczej o temperaturze 37oC. Czas leczenia może być zmieniany w zależności od potrzeb.
    1. Umieść matową czarną kartę pod komórkami, aby zapobiec odbijaniu się światła do sąsiednich studzienek w 96-dołkowej tacy przeznaczonej dla innych parametrów uzdatniania.
  2. Jeśli leczenie jest pożądane przez dłuższy czas, dodaj 25 mM buforu Hepes, aby utrzymać pH pożywki do hodowli komórkowych lub najlepiej umieść aparat i płytki zabiegowe w inkubatorze ze stężeniem CO2 regulowanym do 5% CO2 lub warunkami optymalnymi dla określonego typu komórek.
  3. Po zakończeniu obróbki światłem umieść komórki na równej powierzchni i inkubuj w temperaturze 37°C i 5% CO2 (lub w innych warunkach optymalnych dla typu komórek) przez 24 godziny
    Uwaga: Dodatkowe dawki R/NIR-LT można podawać zgodnie z powyższym opisem, zgodnie z potrzebami.

5. Końcowe dawkowanie leczenia światłem i wykrywanie ROS

  1. Przed wykonaniem ostatniej rundy obróbki światłem należy przygotować odczynniki, które mają być użyte do wykrywania ROS. Przygotować 50 mM bufor cytrynianowy (pH 6,0), Triton X100 i roztwór roboczy odczynnika do wykrywania H22 (stosunek 1:2:97 roztworu podstawowego odczynnika do wykrywania 10 mMH 2O2; 10 U/ml peroksydazy chrzanowej; 50 mM cytrynian sodu (pH 6,0)). Przygotować DCFH-DA w końcowym stężeniu 100 μM w odpowiednich pożywkach.
    Uwaga: Odczynnik DCFH-DA do ogniw PC12 znajduje się w pożywce RPMI, odczynnik DCFH-DA do komórek rMC1 znajduje się w pożywce DMEM. Należy pamiętać, że dostępne na rynku odczynniki detekcyjne mają różną czułość na określone ROS i odczynniki powinny być starannie dobierane, aby dostarczyć informacji pożądanych dla indywidualnego zastosowania.
  2. Podać leczenie światłem do komórek, jak opisano w kroku 4.1-4.1.2. Upewnij się, że komórki są traktowane pożądanymi fluencjami / długościami fal światła.
  3. Bezpośrednio po poddaniu działaniu światła należy usunąć pożywkę zawierającą glutaminian i dwukrotnie przemyć ją odpowiednim roztworem buforowym (w przypadku komórek PC12 stosuje się PBS, a w przypadku komórek rMC1 HBSS). Wykonaj testy ROS na komórkach w następujący sposób:
    1. OznaczenieH2O2: dodać 45 μl 50 mM buforu cytrynianowego (pH 6,0) i 5 μl Triton X100 do każdej z studzienek. Delikatnie potrząsaj komórkami na wytrząsarce orbitalnej przez 30 sekund i inkubuj w temperaturze 37°C i 5% CO2 przez 15 minut. Dodać 50 μl roztworu roboczego do wykrywaniaH2O2i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Zmierzyć fluorescencję za pomocą czytnika płytek o długości fali wzbudzenia 530 nm i długości fali emisji 480 nm.
    2. Test DCF: dodać 100 μl 100 μM roztworu DCFH-DA do każdej z studzienek i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37°C i 5% CO2 . Wyjąć pożywkę zawierającą 100 μM DCFH-DA i dwukrotnie przemyć odpowiednim roztworem buforowym (jak opisano powyżej). Dodać 90 μl roztworu buforowego i 10 μl Triton X100 do każdego z dołków i delikatnie wstrząsnąć na wytrząsarce orbitalnej przez 30 sekund przed 15 minutową inkubacją w temperaturze 37°C. Zmierzyć fluorescencję pochodzącą z DCF za pomocą czytnika płytek o długości fali wzbudzenia 480 nm i długości fali emisji 530 nm.
    3. Wyrazić wartości ROS w odniesieniu do stężenia białka w komórkach pozostających w studzienkach, używając zestawu kolorymetrycznego do ilościowego określenia stężenia białka zgodnie z instrukcjami producenta, z odniesieniem do krzywej standardowej w celu obliczenia mg białka.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Strumień światła dostarczany na długości fali 670nm został skalibrowany za pomocą filtrów o neutralnej gęstości w celu naświetlania komórek o zakresie fluencji obejmującym dawkę światła 670nm, co wcześniej okazało się korzystne in vivo (0,3 J/cm2) 20. Wraz ze wzrostem liczby filtrów o neutralnej gęstości przed źródłem światła, intensywność (W/m2) zmniejszała się, co pozwalało na przepuszczanie mniejszej ilości światła do obszaru docelowego. W tabeli 1 przedstawiono dane kalibracy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Udało nam się zaadaptować precyzyjny i skalibrowany system dostarczania światła, aby zapewnić mechanizm do badania optymalizacji R/NIR-LT in vitro. Za pomocą tego systemu można dokładnie i efektywnie manipulować parametrami długości fali i intensywności R/NIR-LT. Ustaliliśmy, że leczenie komórkami światłem nie prowadziło do śmierci komórek, chociaż ROS nie były zmniejszone przy dostarczanych długościach fal i dawkach w testowanych typach komórek. Maksymalne natężenia osiągane przez obecny system przy 670 nm (20,...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Program Badań nad Neurotraumą (Australia Zachodnia). Projekt ten jest finansowany za pośrednictwem Road Trauma Trust Account, ale nie odzwierciedla poglądów ani zaleceń Rady Bezpieczeństwa Ruchu Drogowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Wewnątrzkomórkowy zestaw testowy ROS OxiSelect (zielona fluorescencja)Cell BiolabsSTA-342
Sondy molekularneodczynnika Amplex UltraRedA36006
300-watowa ksenonowa lampa łukowaNewport Corporation6258Bardzo intensywne źródło światła, nie patrz bezpośrednio w lampę. Upewnij się, że lampa jest wystarczająco chłodzona, gdy jest włączona
USB4000-FL Spektrometr fluorescencyjnyOcean Optics
CC-3-UV Korektor cosinusowy do zbierania emisjiOcean Optics
200μ Średnica m Światłowód kwarcowyOptics
Platforma spektroskopowa SpectraSuiteOcean Optics
2300 Wielomodowy czytnik płytek EnSpirePerkin Elmer
Pierce Zestaw do oznaczania białek BCAThermo Scientific23225
Triton X-100Sigma-Aldrich9002-93-1Ostra toksyczność, podczas obsługi należy nosić rękawice.
Hydrat soli monosodowej kwasu L-glutaminowegoSigma-Aldrich142-47-2 (bezwodny)
Komórki rdzenia nadnerczy szczura (PC12)Kolekcja kultur typu amerykańskiegoCRL-2522
Roswell Park Memorial Institute (RPMI1640) Głoska bezdźwięcznaGibco11875-119
Surowica bydlęca płodu, certyfikowana, inaktywowana termicznie, pochodzenie z USAGibco10082-147Ciepły do 37 stopni; C w kąpieli wodnej przed użyciem
Serum dla koni, pochodzenie z Nowej ZelandiiGibco16050-122Ciepłe do 37 & stopni; C w kąpieli wodnej przed użyciem
GlutaMAX SuplementGibco35050-061Ciepły do 37 stopni C w łaźni wodnej przed użyciem
100 mM Pirogronian soduGibco11360-070Ciepły do 37 & stopni; C w łaźni wodnej przed użyciem
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/mL)Gibco15140-122Ciepły do 37 & stopni; C w łaźni wodnej przed użyciem
100X MEM Roztwór aminokwasów endogennychGibco11140-050Ciepły do 37 stopni C w kąpieli wodnej przed użyciem
Komórki Retinal Muller (rMC1)Uniwersytet Kalifornijski, San Diego
Zmodyfikowane podłoże Eagle Medium firmy Dulbecco (DMEM)Gibco11965-118Ciepłe do 37 & stopni; C w kąpieli wodnej przed użyciem
75 cm2 KolbyBD BiosciencesB4-BE-353136
Bromowodorek poli-L-lizynySigma-Aldrich25988-63-0Aliquot i przechowywać w temperaturze -20 °; C
Zrównoważony roztwór soli Hanka (HBSS)Gibco14025-134Rozgrzany do 37 & stopni; C w łaźni wodnej przed użyciem
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Gibco10010-049Ogrzany do 37 & stopni; C w kąpieli wodnej przed użyciem
Laminin Mouse Protein, NaturalGibco23017-015Aliquot i przechowywać w temperaturze -20 & deg; C
1X Neurobaseal MediumGibco21103-049Ciepły do 37 & deg; C w łaźni wodnej przed użyciem
Trypan Blue Solution, 0,4%Gibco15250-061
165U PapainWorthington
L-CysteineSigma-AldrichW326305
płytki, przezroczyste dno, czarneCorningCLS3603-48EA
Costar Clear Polistyren 96-dołkowe płytki nieobrobione; Dobry kształt: Okrągły; Sterylny.Costar07-200-103
Huśtawka RockerStandardowe urządzenie
WirówkaStandardowy zestaw
Bibuła filtracyjna o neutralnej gęstości (0,3)Filtr pasmowo-przepustowy THORLABS
FL441.6-10
550 nm Filtr pasmowo-przepustowyTHORLABSFB550-10
Filtr pasmowo-przepustowy 670 nmTHORLABSFB670-10
Filtr pasmowo-przepustowy 810 nmTHORLABSFB810-10e
Niezamontowany i Oslash; Filtry absorpcyjne o neutralnej gęstości 25 mm (0,1)THORLABSNE01B
niezamontowane i Oslash; Filtry absorpcyjne o neutralnej gęstości 25 mm (0,2)THORLABSNE02B
niezamontowane i Oslash; Filtry absorpcyjne o neutralnej gęstości 25 mm (0,3)THORLABSNE03B
niezamontowane i Oslash; Filtry absorpcyjne o neutralnej gęstości 25 mm (0,5)THORLABSNE05B
Niezamontowane i Oslash; 25 mm Filtry absorpcyjne o neutralnej gęstości (0,6)THORLABSNE06B
Niezamontowane & Oslash; 25 mm Filtry absorpcyjne o neutralnej gęstości (1.0)THORLABSNE10B
Ocean Corning 96-dołkowe laboratoryjnelaboratoryjny 442 nm THORLABS

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gutterman, D. D. Mitochondria and reactive oxygen species an evolution in function. Circulation research. 97, 302-304 (2005).
  2. Camello-Almaraz, C., Gomez-Pinilla, P. J., Pozo, M. J., Camello, P. J. Mitochondrial reactive oxygen species and Ca2+ signaling. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 291, C1082-C1088 (2006).
  3. Kowaltowski, A. J., de Souza-Pinto, N. C., Castilho, R. F., Vercesi, A. E. Mitochondria and reactive oxygen species. Free Radical Biology and Medicine. 47, 333-343 (2009).
  4. Coyle, J. T., Puttfarcken, P. Oxidative stress, glutamate, and neurodegenerative disorders. Science. 262, 689-695 (1993).
  5. Doble, A. The role of excitotoxicity in neurodegenerative disease: implications for therapy. Pharmacology & therapeutics. 81, 163-221 (1999).
  6. Hall, E. D. Antioxidant therapies for acute spinal cord injury. Neurotherapeutics. 8, 152-167 (2011).
  7. Jia, Z., et al. Oxidative stress in spinal cord injury and antioxidant-based intervention. Spinal Cord. 50, 264-274 (2012).
  8. Fitzgerald, M., et al. Red/near-infrared irradiation therapy for treatment of central nervous system injuries and disorders. Reviews in the Neurosciences. 24, 205-226 (2013).
  9. Rutar, M., Natoli, R., Albarracin, R., Valter, K., Provis, J. 670-nm light treatment reduces complement propagation following retinal degeneration. J Neuroinflammation. 9, 257(2012).
  10. Eells, J. T., et al. Therapeutic photobiomodulation for methanol-induced retinal toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 3439-3444 (2003).
  11. Begum, R., Powner, M. B., Hudson, N., Hogg, C., Jeffery, G. Treatment with 670 nm light up regulates cytochrome C oxidase expression and reduces inflammation in an age-related macular degeneration model. PloS one. 8, e57828(2013).
  12. Byrnes, K. R., et al. Light promotes regeneration and functional recovery and alters the immune response after spinal cord injury. Lasers in surgery and medicine. 36, 171-185 (2005).
  13. Liang, H. L., et al. Photobiomodulation partially rescues visual cortical neurons from cyanide-induced apoptosis. Neuroscience. 139, 639-649 (2006).
  14. Zivin, J. A., et al. Effectiveness and safety of transcranial laser therapy for acute ischemic stroke. Stroke. 40, 1359-1364 (2009).
  15. Lapchak, P. A. Transcranial near-infrared laser therapy applied to promote clinical recovery in acute and chronic neurodegenerative diseases. Expert review of medical devices. 9, 71-83 (2012).
  16. Chung, H., et al. The nuts and bolts of low-level laser (light) therapy. Annals of biomedical engineering. 40, 516-533 (2012).
  17. Wu, Q., et al. Low-Level Laser Therapy for Closed-Head Traumatic Brain Injury in Mice: Effect of Different Wavelengths. Lasers in surgery and medicine. 44, 218-226 (2012).
  18. Hashmi, J. T., et al. Role of low-level laser therapy in neurorehabilitation. PM&R. 2, S292-S305 (2010).
  19. Fitzgerald, M., et al. Metallothionein-IIA promotes neurite growth via the megalin receptor. Experimental Brain Research. 183, 171-180 (2007).
  20. Fitzgerald, M., et al. Near infrared light reduces oxidative stress and preserves function in CNS tissue vulnerable to secondary degeneration following partial transection of the optic nerve. Journal of neurotrauma. 27, 2107-2119 (2010).
  21. Ando, T., et al. Low-level laser therapy for spinal cord injury in rats: effects of polarization. Journal of biomedical. 18, 098002(2013).
  22. Lanzafame, R. J., et al. Reciprocity of exposure time and irradiance on energy density during photoradiation on wound healing in a murine pressure ulcer model. Lasers in surgery and medicine. 39, 534-542 (2007).
  23. Castano, A. P., et al. Low-level laser therapy for zymosan induced arthritis in rats: Importance of illumination time. Lasers in surgery and medicine. 39, 543-550 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ocena stresu oksydacyjnegoManipulacja intensywno ci d ugo ci faliSystem dostarczania wiat a ksenonowegoW skopasmowe filtry interferencyjneFiltry neutralneDetekcja reaktywnych form tlenuBarwnik fluorescencyjny DCFH DATest czu y na H2O2Kom rki poddane stresowi glutaminianowemu

Powiązane artykuły