Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Regulacja składników odżywczych poprzez ciągłe karmienie w celu ekspansji komórek ssaków w sferoidach na dużą skalę

7.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52224

⸱

25 września 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Radiology, University of Minnesota, 2Medicine, University of Minnesota, 3School of Public Health, University of Minnesota, 4Surgery, University of Arizona

W tym artykule

Podsumowanie

Regulacja składników odżywczych za pomocą ciągłego karmienia dostosowanego do wzrostu poprawia tempo wzrostu sferoid komórek ssaków w porównaniu do przerywanego karmienia partiami dla kultur w bioreaktorach z mieszaną zawiesiną. Niniejsze badanie demonstruje metody wymagane do ustalenia prostych kultur karmionych o skorygowanej dawce.

Streszczenie

W tej demonstracji, sferoidy utworzone z linii komórkowej insulinoma β-TC6 zostały wyhodowane jako model wytwarzania produktu komórkowego wysp trzustkowych ssaków, aby zademonstrować, jak regulacja poziomu składników odżywczych może poprawić wydajność komórek. W poprzednich badaniach bioreaktory ułatwiały zwiększenie objętości hodowli w porównaniu z kulturami statycznymi, ale nie zaobserwowano wzrostu wydajności komórek. Ograniczenia w kluczowych składnikach odżywczych, takich jak glukoza, które były spożywane między karmieniami grupowymi, mogą prowadzić do ograniczeń w ekspansji komórek. Zaobserwowano duże wahania poziomu glukozy, pomimo wzrostu stężenia glukozy w pożywce. Zastosowanie systemów ciągłego karmienia wyeliminowało wahania poziomu glukozy i poprawiło tempo wzrostu komórek w porównaniu z metodami hodowli statycznej karmionej wsadowo i SSB. Dodatkowy wzrost tempa wzrostu zaobserwowano poprzez dostosowanie dawki paszy na podstawie obliczonego zużycia składników odżywczych, co pozwoliło na utrzymanie fizjologicznego poziomu glukozy przez trzy tygodnie w hodowli. Tę metodę można również dostosować do innych typów komórek.

Wprowadzenie

Aby wygenerować dużą liczbę zdolnych do życia i funkcjonalnych komórek ludzkich do przeszczepu, konieczna jest regulacja warunków hodowli. Wyczerpanie składników odżywczych wraz z nagromadzeniem odpadów metabolicznych jest głównym czynnikiem przyczyniającym się do starzenia się i zmian metabolicznych, które obniżają jakość produktu komórkowego 1-3. Procedura ta demonstruje metodę hodowli komórek ssaków w sferoidach przy użyciu bioreaktora z mieszadłem w połączeniu z systemem podawania perfuzyjnego o regulowanej szybkości w celu regulacji glukozy w zakresie fizjologicznym4 przez cały czas trwania hodowli. Na potrzeby tych badań zakres fizjologiczny określono jako od 100 do 200 mg/dl. Te same metody można zastosować do regulacji innych składników odżywczych i produktów przemiany materii, takich jak mleczan.

Statyczne kultury w małych objętościach (1 - 30 ml) są zazwyczaj używane w warunkach laboratoryjnych do utrzymania i różnicowania linii komórkowych do celów eksperymentalnych. Pasażowanie komórek odbywa się z całkowitą wymianą pożywki w razie potrzeby w regularnych odstępach czasu. Większość "konwencjonalnych" pożywek hodowlanych ma wysokie stężenie glukozy (450 mg/dl dla DMEM stosowanego w tych badaniach), aby umożliwić rzadsze zmiany pożywki bez ryzyka ograniczeń składników odżywczych. Jednak ta metoda karmienia partiami nadal wymaga częstych manipulacji, wprowadza zmienność w środowisku komórek i zwiększa ryzyko zanieczyszczenia5–9. Bioreaktory zawiesinowe z mieszaniem (SSB) zapewniają lepsze mieszanie i mniejszą obsługę3,10–20, ale podobnie jak kultury statyczne, wymagają ręcznej zmiany podłoża, co przyczynia się do potencjalnie szkodliwych wahań poziomu składników odżywczych i produktów odpadowych. Karmienie perfuzyjne kultur SSB zmniejsza te problemy poprzez ciągłą infuzję i usuwanie pożywki, ale duże zmiany w poziomach składników odżywczych spowodowane wzrostem komórek pozostają problemem. Zastosowanie skorygowanej dawki karmienia na podstawie obliczeń zużycia składników odżywczych w oparciu o szacowane zapotrzebowanie komórek może zapewnić stabilne środowisko komórkowe wymagane do optymalizacji żywotności i funkcji komórek21–24.

Istnieje obszerna literatura opisująca metody skalowalnych hodowli SSB komórek ssaków specjalnie do hodowli i ekspansji komórek pluripotencjalnych25–32, inne koncentrują się na komórkach wysp trzustkowych (beta)17,33,34 lub produkcji produktów biologicznych24,35–38. Wiele z tych badanych typów komórek może być hodowanych w hodowlach sferoidalnych, a określone procedury dla używanego typu komórek powinny być zoptymalizowane przed wdrożeniem systemu ciągłego karmienia. W tej demonstracji zastosowano metodę karmienia perfuzyjnego w celu rozprężenia linii komórek beta hodowanych jako sferoidy w bioreaktorze z mieszadłem39-43. Opisana w niniejszym dokumencie metoda zapewnia prostą implementację regulacji dawki karmienia w oparciu o pomiary glikemii off-line w celu uzyskania docelowych warunków hodowli. Wykazano, że dostosowanie szybkości karmienia tą metodą w celu utrzymania fizjologicznego poziomu glukozy zwiększa wydajność komórek. Komórki ssaków są zależne od kluczowego składnika odżywczego, glukozy, do produkcji energii, więc wykorzystanie tej linii komórkowej stanowi model dla wielu hodowanych komórek ssaków44. Ponadto linia ta ilustruje dalszą złożoność komórek beta, które są wrażliwe na przewlekły wysoki poziom glukozy45. W tym badaniu komórkom β-TC6 pozwolono tworzyć sferoidy w hodowli, aby zbliżyć się do średniej wielkości wysepek Langerhansa in vivo. System bioreaktora perfuzyjnego17–19,21,46 z szybkością podawania dostosowaną do zużycia glukozy, skutkował utrzymaniem warunków fizjologicznych i wyższą wydajnością komórek bez zmian w żywotności.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Linia komórkowa i konserwacja

  1. Uzyskaj komórki β-TC6 (lub inną pożądaną przylegającą linię komórkową ssaków). W ramach przygotowań do badania, hodowla, pasaż i kriokonserwacja komórek zgodnie z instrukcjami dostawcy.

2. Montaż systemu ciągłego podawania

UWAGA: Projekt systemu ciągłego karmienia w poniższej metodzie był oparty na podobnych systemach opisanych w literaturze17–19,21,47–49. Montaż zastosowanego tu systemu został szczegółowo opisany w poprzedniej publikacji3.

  1. Zbierz składniki potrzebne do systemu karmienia, który składa się z pięciu podstawowych elementów: zbiornika pożywki, pompy perystaltycznej, bioreaktora z mieszadłem, zbiornika na odpady i specjalnie zaprojektowanego przewodu/zestawu do pobierania próbek.
    1. Zbiornik pożywki należy przygotować za pomocą szklanej butelki o pojemności 1 l, zbiornik na odpady za pomocą szklanej butelki o pojemności 2 l, a bioreaktor z mieszadłem za pomocą szklanego reaktora o pojemności 250 ml (wersja dostępna z półki).
    2. Użyj cyfrowej pompy perystaltycznej lub podobnej pompy z 8-kanałową głowicą pompy, aby sterować wymianą medium.
    3. Zbiornik i zmodyfikowane pokrywy bioreaktora należy wykonać z twardego i nadającego się do sterylizacji w autoklawie tworzywa sztucznego z portami przelotowymi ze stali nierdzewnej, aby zapewnić wentylację przez sterylne filtry i umożliwić transfer medium między zbiornikami a bioreaktorami. Alternatywnie można zakupić specjalistyczne pokrywy z portami przepływu od różnych dostawców.
      UWAGA: Pokrywa bioreaktora może zawierać dodatkowe porty przelotowe dla opcjonalnego oprzyrządowania i sond monitorujących (np. monitora tlenu).
    4. Do zmodyfikowanej pokrywy SSB należy przymocować rurkę odpływową (OT) wykonaną z porowatych szklanych rurek napowietrzających o średnim zakresie wielkości porów od 40 μm do 60 μm i gęstości porów 40%. Alternatywnie wybierz inną rurkę odpływową w oparciu o specyficzne wymagania kultury.
      UWAGA: Wybierz rozmiar porów OT, aby usunąć tylko pożywkę i resztki komórek, pozostawiając agregaty komórkowe w kulturze (zgodnie z opisem w sekcji 6 i publikacji3, aby uzyskać więcej informacji).
  2. Zmontuj zestawy przewodów perfuzyjnych do autoklawu z łączników rurek z polifluorku winylidenu (PVDF) i trwałych przewodów pompy perystaltycznej. Długość odcinka zależy od odległości między różnymi komponentami.
    UWAGA: Zachowaj szczególną ostrożność przy wyborze odmiany rurek, aby zapewnić trwałość i niezawodność podczas długotrwałych eksperymentów.
  3. Zmontuj zestaw przewodów z trzech części: przewodu zasilającego, przewodu odpływowego i przewodu do pobierania próbek.
    1. Zamontuj przewód zasilający za pomocą dwóch średnic przewodów (L/S 14 i L/S 13). Użyj L/S 14 dla rurki pierwotnej, która będzie rozciągać się na odległość od bioreaktora do zbiornika medium, i włóż krótki odcinek L/S 13 w środku długości rurki dla sekcji pompy za pomocą odpowiednich adapterów PVDF.
    2. Użyj standardowych adapterów węży kolczastych PVDF, aby połączyć dwa kawałki rurki L/S 14 po obu stronach krótszej sekcji pompy (L/S 13).
      UWAGA: Alternatywnie, cała długość rurki może być rurką L/S 13 o mniejszej średnicy, a cała długość rurki może zostać wymieniona, gdy integralność sekcji pompy jest kwestionowana.
  4. Zamontuj drugą sekcję rurki do usuwania odpadów za pomocą rurki o większej średnicy (L/S 16) i włóż krótki odcinek rurki L/S 14 pośrodku do sekcji pompującej. Odbywa się to w taki sam sposób, jak montaż przewodu zasilającego za pomocą adapterów z zadziorami węża PVDF lub alternatywnie za pomocą ciągłej długości rurki pompy o żądanym rozmiarze i wymiany w razie potrzeby.
    UWAGA: Jeśli ta sama pompa i głowica pompy są używane do obwodu zasilającego i obwodu kanalizacyjnego, sekcja pompy przewodów rurowych do usuwania odpadów musi mieć większą średnicę niż sekcja pompy przewodu zasilającego. Gwarantuje to, że szybkość pompy usuwającej jest większa niż prędkość podawania i pozwoli uniknąć potencjalnych dużych zmian objętości kultury oraz zmniejszy ryzyko przepełnienia.
  5. Zmontuj ostatni element zestawu przewodów: zestaw do pobierania próbek.
    1. W tej procedurze opisano niestandardowy system portów do pobierania próbek; alternatywnie sterylny port do pobierania próbek można zakupić od różnych dostawców.
    2. Zestaw należy skonstruować z trzech krótkich (~ 6 cm) węży L/S o długości 14 połączonych ze sobą łącznikiem PVDF typu T oraz dwóch małych zacisków węża na dwóch długościach przewodów.
    3. Podłącz sterylny filtr gazu do odpowietrzania gazu do jednej z zaciśniętych długości, a drugi służy do podłączenia do sterylnej strzykawki do pobierania próbek (po sterylizacji może być konieczne dodanie sterylnych filtrów gazowych w komorze bezpieczeństwa biologicznego, ponieważ wiele sterylnych filtrów nie nadaje się do sterylizacji w autoklawie).
    4. Podłącz trzeci koniec do złącza próbki ze stali nierdzewnej umieszczonego na pokrywie bioreaktora.
    5. Przed rozpoczęciem eksperymentu należy autoklawować zespół do pobierania próbek, gdy jest on podłączony do bioreaktora (patrz krok 3 poniżej).
    6. Użyj tego zestawu do pobierania sterylnych próbek z bioreaktora w razie potrzeby bez zakłócania procesu ciągłego podawania.

3. Autoklaw Wszystkie materiały

  1. Przygotuj wszystkie elementy bioreaktora do sterylizacji w autoklawie.
  2. Zbierz poszczególne składniki do sterylizacji. Zbiorniki pożywki i odpływu (zmontowane z kroku 2.1.1), kolba obrotowa o pojemności 250 ml (zmontowana z ppkt 2.1.1), niezbędne zmodyfikowane pokrywy (zmontowane z ppkt 2.1.3), rurka odpływowa (opisana w ppkt 2.1.4), trzy zestawy przewodów (zmontowane w sekcjach 2.2-2.5), rurka odpływowa (w zależności od potrzeb do ciągłego karmienia).
    1. Zmontować kolbę obrotową ze wszystkimi elementami i upewnić się, że rurka odpływowa jest dobrze zamocowana wewnątrz kolby obrotowej (opisanej w sekcji 2.1.4), a następnie przymocować niestandardowo zmontowany port do pobierania próbek (sekcja 2.5) lub inny port do pobierania próbek do górnej części pokrywy.
    2. Owiń cały zespół kolby obrotowej materiałem do owijania autoklawu i taśmą wskazującą autoklawu. Upewnij się, że folia jest szczelna. UWAGA: Folia aluminiowa lub podobny materiał może być użyty do zakrycia poszczególnych końców każdego portu dostępowego w pokrywie bioreaktora, aby zachować sterylność złącza/końcówek podczas rozpakowywania i gdy nie są podłączone do zestawów przewodów wewnątrz inkubatora.
    3. Zamontuj zmodyfikowane pokrywy pożywki i zbiorników na odpady, a następnie przymocuj je do odpowiednich szklanych butelek. Przykryj je folią aluminiową i taśmą wskazującą autoklawu.
    4. Indywidualnie owiń zestawy przewodów (sekcja 2.2 - 2.5) folią autoklawu i taśmą, aby pomóc w końcowym montażu. Folia aluminiowa lub podobny materiał może być użyty do owinięcia poszczególnych końców każdego zestawu rurek, aby zachować sterylność złącza/końcówek podczas rozpakowywania.
    5. Autoklaw wszystkie owinięte przedmioty przy użyciu standardowego cyklu autoklawu na sucho (np. ustawienie "Grawitacja" przy ~ 15 psi przy 121 °C przez 30 minut lub dłużej).
      UWAGA: Nie zakładaj sterylnych filtrów przed autoklawowaniem, chyba że potwierdzisz, że są one bezpieczne w autoklawie.

4. Formacja sferoidalna

UWAGA: Ta technika jest podobna do tych opisanych w literaturze17–19,21,50–52 dla innych hodowli komórek ssaków. Wszystkie procedury po sterylizacji powinny być wykonywane w kapturze z przepływem laminarnym i przy użyciu sterylnych rękawiczek w celu utrzymania sterylnych warunków hodowli komórek.

  1. W każdych warunkach hodować i ekspandować komórki β-TC6 w standardowych kulturach przylegających (opisanych przez dostawcę), aż do uzyskania wystarczającej ilości komórek, aby zasiać żądaną liczbę bioreaktorów.
    1. Zmontować bioreaktor zasilany ciągłym z rurką odpływową, jak pokazano na rysunku 1 i opisano w rozdziale 2, a następnie podłączyć port pobierania próbek do pokrywy do pobierania próbek. UWAGA: Rurkę odpływową i zespół portu do pobierania próbek należy dodać do bioreaktora w celu ciągłego zasilania przed utworzeniem sferoidy i wyciągnąć z pożywki hodowlanej do momentu rozpoczęcia ciągłego karmienia.
    2. Wysterylizuj zmodyfikowany zespół SSB w autoklawie (opisany w sekcji 3).
    3. Sterylne otwory wentylacyjne (sterylne filtry 0,22 μm lub mniejsze) należy przymocować w odpowiednich miejscach na pokrywach kolby obrotowej oraz na pożywkach i pojemnikach na odpady.
      UWAGA: Jest to ważne, aby zapobiec korkowi parowemu i umożliwić wymianę gazową między środowiskiem inkubatora (5%CO2) a bioreaktorem. Wymiana gazowa jest niezbędna do utrzymania prawidłowego pH w przypadku stosowania pożywek buforowanych wodorowęglanami.
  2. Zebrać komórki przez delikatną trypsynizację przy użyciu 0,25% (w/v) roztworu trypsyny-0,53 mM EDTA, w temperaturze pokojowej wspomaganej mechanicznym mieszaniem przez 2 - 3 minuty i zasiać nasiona do bioreaktorów o gęstości około 1,3 x 106 komórek/ml w 200 ml pożywki hodowlanej.
    1. Przenieść wyznaczone kolby z inkubatora do szafy bezpieczeństwa biologicznego.
      UWAGA: Wszystkie hodowle komórkowe i manipulacje powinny być wykonywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego przy użyciu odpowiedniej sterylnej techniki.
    2. Usunąć pożywkę hodowlaną z kolb przez zasysanie.
    3. Przemyć komórki, pipetując 5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (bez Ca++ lub Mg++) do kolby i przepłukać komórki na powierzchni, a następnie odessać PBS.
    4. Dodać 3 ml roztworu trypsyny-EDTA do każdej kolby, która zostanie zebrana (zwykle około 10 x 175 cm2 T-kolby).
    5. Pozostawić pobrane komórki do inkubacji w temperaturze pokojowej przez 2-3 minuty w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
    6. Delikatnie mieszać ręcznie, aby rozluźnić komórki z powierzchni kolby, a następnie zebrać komórki, dodając 6 ml pożywki (z surowicą) do kolby i przenieść komórki do probówki o pojemności 50 ml. Gdy jedna probówka o pojemności 50 ml jest pełna, należy użyć kolejnej probówki o pojemności 50 ml, aż wszystkie potrzebne komórki zostaną zebrane (około jedna probówka o pojemności 50 ml będzie potrzebna na każde 5 zebranych kolb T-175).
    7. Delikatnie odwirować (około 50 x grawitacja) zebrane zawiesiny komórek, aby osadzać komórki.
    8. Zassać pozostałą pożywkę, pozostawiając osad w stanie nienaruszonym.
    9. Zebrać wszystkie komórki w jednej probówce, ponownie zawieszając osadki w pożywce hodowlanej (zawierającej surowicę) za pomocą pipety i przenosząc wszystkie osadki do tej samej probówki.
    10. Policz gęstość komórek za pomocą standardowego hemocytometru z barwieniem błękitem trypanowym, jak opisano w literaturze53.
    11. Dodaj żądaną liczbę komórek do sterylnego SSB dla każdego warunku (1,3 x 106 komórek/ml było docelową początkową gęstością komórek dla tej demonstracji).
    12. Dodaj pożywkę (o pożądanym stężeniu glukozy, w tym przypadku użyliśmy średniego poziomu glukozy w zakresie fizjologicznym) do SSB za pomocą pipety, aby osiągnąć pożądaną całkowitą objętość kultury (w tych badaniach użyto 200 ml objętości kultury).
      UWAGA: W tych badaniach z ciągłym karmieniem SSB kultury wysiewano przy użyciu zmodyfikowanej wersji pożywki hodowlanej o "niskiej zawartości glukozy" (100 mg / dl). Pozwoliło to hodowlom rozpocząć od pożądanego docelowego stężenia glukozy, zamiast zaczynać od pożywki o "wysokiej zawartości glukozy" i czekać, aż zużycie glukozy obniży poziom glukozy do fizjologicznego zakresu, aby rozpocząć karmienie. We wszystkich innych pożywkach do karmienia w tych badaniach stosowano standardowe podłoże o wysokiej zawartości glukozy (500 mg/dl).
    13. Przenieść SSB z komórkami na płytkę mieszającą wewnątrz inkubatora do hodowli komórkowych.
  3. Hodowla komórek w bioreaktorach bez karmienia przez 3 dni w temperaturze 37 °C, przy 5% CO2 , 100% wilgotności względnej i szybkości mieszania 70 obr./min, aby umożliwić tworzenie się sferoid.
    UWAGA: Nie należy obserwować znaczącej proliferacji w ciągu trzydniowego okresu tworzenia się sferoidów.
  4. Po utworzeniu sferoid podziel sferoidy między bioreaktory o pożądanych warunkach hodowli.

5. Hodowla ciągłego karmienia i dostosowana szybkość karmienia

  1. W autoklawie lub gazie wysterylizuj wszystkie elementy i zmontuj w komorze bezpieczeństwa biologicznego przy użyciu sterylnych technik (kroki 2 - 4).
  2. Po utworzeniu sferoidy należy wyjąć SSB z inkubatora i zmontować elementy systemu ciągłego karmienia w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
    1. Najpierw napełnij zbiornik świeżej pożywki żądaną pożywką hodowlaną, a następnie podłącz z jednej strony linii zasilającej. Upewnij się również, że zbiornik świeżej pożywki jest odpowiednio odpowietrzony sterylnym filtrem.
    2. Podłącz jedną stronę przewodu zasilającego do portu wlotowego zasilania w bioreaktorze w sterylny sposób. Między przewodem zasilającym a portem wlotowym bioreaktora należy zainstalować sterylny filtr, aby przefiltrować pożywkę przed jej wejściem do bioreaktora.
    3. Podłącz przewód odpływowy do rurki odpływowej bioreaktora i zbiornika na odpady medium i upewnij się, że zbiornik na odpady jest prawidłowo odpowietrzony za pomocą sterylnego filtra.
  3. Przenieś zespół z szafy bezpieczeństwa biologicznego (prawdopodobnie będzie to wymagało dwóch osób do przenoszenia wszystkich naczyń i rurek) i wyjmij wszystkie elementy do długotrwałej hodowli.
    1. Umieścić SSB na płytce mieszającej wewnątrz inkubatora, stosując te same parametry hodowli do tworzenia sferoidów (37 °C, 5% CO2, 100% wilgotności i 70 obr./min). UWAGA: Może być konieczne tymczasowe odłączenie segmentów przewodów od bioreaktora, jeśli przewody muszą przebiegać przez otwory z boku inkubatora, a nie na zewnątrz przez uszczelkę w drzwiach. Można to zrobić w sposób aseptyczny, owijając końce zestawów przewodów folią aluminiową przed autoklawowaniem (krok 3) i czekając na przymocowanie strony bioreaktora do sekcji rurki zasilającej i odpływowej, aż bioreaktor znajdzie się w inkubatorze. Przewody rurowe można umieścić na miejscu, a folię aluminiową można wyjąć z wnętrza inkubatora i szybko przymocować do bioreaktora.
    2. Wyprowadź pozostałe końce zestawów przewodów (te, które nie są połączone z pokrywą bioreaktora) przez port dostępowy inkubatora (przelotowy) lub przez wcięcie w uszczelce drzwi inkubatora.
    3. Na zewnątrz inkubatora (jeśli to możliwe, w pobliskiej szafie bezpieczeństwa biologicznego) szybko podłącz przewód zasilający do zbiornika świeżej pożywki, a przewód odpływowy do zbiornika pożywki i upewnij się, że zbiornik na odpady jest odpowiednio odpowietrzony za pomocą sterylnego filtra. UWAGA: Aby zrobić to w sposób aseptyczny, usuń folię aluminiową z przewodów i złączy naczyń i podłącz do odpowiednich naczyń tak szybko, jak to możliwe (zwłaszcza jeśli to połączenie musi być wykonane poza szafą bezpieczeństwa biologicznego).
    4. Umieść zbiornik świeżej pożywki (wypełniony żądaną pożywką) w pobliskiej mini-lodówce. Sprawdź, czy przewody zasilające i odpływowe są w stanie opuścić inkubator i wejść do lodówki bez uniemożliwiania zamknięcia drzwi na każdym z nich. Bardzo ważne jest również, aby przewody zasilające nie były przyciśnięte do drzwi ani lodówki, ani inkubatora.
      UWAGA: Pożywką użytą w tych badaniach była standardowa pożywka hodowlana o wysokiej zawartości glukozy (500 mg/dl) zalecana przez dostawcę dla tego typu komórek. Można użyć dowolnej pożywki o wysokim poziomie glukozy w oparciu o specyficzne potrzeby hodowanego typu komórek. Stężenie glukozy w pożywce paszowej powinno być rozsądnie wyższe (2 razy lub więcej) niż pożądane stężenie w kulturze, ponieważ system żywienia opiera się na zwiększaniu dawki podawania pożywki o wysokiej zawartości glukozy w celu utrzymania odpowiedniego poziomu glukozy w kulturach przy jednoczesnym utrzymaniu rozsądnych dawek podawania.
    5. Następnie zbiornik na odpady można umieścić na blacie na zewnątrz inkubatora w dogodnym miejscu.
    6. Następnie umieść "sekcję pompy" przewodów zasilających i odpływowych w głowicy pompy, zapewniając odpowiednią orientację, tak aby przewody zasilające pompowały medium ze zbiornika świeżego medium do SSB, a przewody odpływowe pompowały medium z SSB do zbiornika na odpady.
  4. Włącz pompę na żądaną prędkość posuwu.
    1. Obliczyć prędkość posuwu, korzystając z równania skorygowanej prędkości posuwu opisanego w literaturze3 oraz w poniższej sekcji dotyczącej reprezentatywnych wyników.
    2. Należy wykorzystać najnowsze informacje o liczbie komórek (procedura opisana w kroku 5) wraz z prognozą wzrostu i pomiarami stężenia glukozy w pożywce, aby oszacować szybkość podawania potrzebną do utrzymania pożądanego stężenia glukozy w hodowli.
      UWAGA: Przed wykonaniem tych procedur należy uzyskać tempo wzrostu komórek i wskaźniki zużycia glukozy.
    3. Ustawić prędkość pompy na podstawie obliczonej prędkości posuwu.
  5. Powtórzyć obliczanie prędkości podawania i dostosować prędkość pompy dla każdego punktu pobierania próbek (co trzy dni dla opisanej metody).

6. Pomiary liczby komórek, żywotności i stężenia glukozy

  1. Próbki należy pobierać z każdego bioreaktora co trzy dni lub w zależności od potrzeb.
  2. Pobrać próbki kultur z ciągle karmionych kultur SSB przy użyciu wyspecjalizowanego portu pobierania próbek opisanego powyżej.
    1. Pozostawiając stale podawany SSB wewnątrz bioreaktora, podłącz sterylną strzykawkę (do tych badań użyto strzykawki o objętości 5 ml) do niefiltrowanego połączenia portu pobierania próbek.
    2. Przesunąć probówkę do pobierania próbek w dół do pożywki hodowlanej.
    3. Odkręcić odcinek rurki prowadzący do strzykawki i pobrać żądaną całkowitą objętość próbki.
    4. Przesunąć probówkę do pobierania próbek do góry, tak aby nie była już zanurzona w kulturze, i kontynuować wyjmowanie strzykawki, aż powietrze zostanie usunięte.
    5. Zacisnąć rurkę podającą strzykawkę, odłączyć strzykawkę zawierającą próbkę i odłożyć na bok.
    6. Wstępnie napełnić powietrze drugą świeżą sterylną strzykawką i przymocować do sterylnej strony filtra w porcie pobierania próbek.
    7. Odkręcić rurkę prowadzącą do portu pobierania próbek po stronie filtra strzykawkowego, a następnie oczyścić port pobierania próbek, delikatnie wypychając powietrze ze strzykawki przez sterylny filtr. Gwarantuje to, że port do pobierania próbek będzie wolny od wszelkich pozostałości pożywki.
    8. Ponownie zacisnąć rurkę prowadzącą do filtra, odłączyć sterylną strzykawkę i wyrzucić ją.
  3. Pobrać strzykawkę zawierającą próbkę komórek z hodowli i wyrzucić ją do probówki o pojemności 10 ml. Podpróbki o znanych objętościach mogą być pobierane bezpośrednio z tej probówki.
  4. W celu zliczenia komórek należy usunąć znaną objętość komórek i przenieść do probówki mikrowirówkowej, a następnie delikatnie wirować przez 1 - 2 minuty (około 50 x grawitacja).
  5. Przenieść supernatant do oddzielnej probówki w celu pomiaru stężenia glukozy i ponownie zawiesić osad z tą samą objętością roztworu trypsyny-EDTA (0,25% (w/v) trypsyny, 0,53 mM EDTA) i policzyć trzykrotnie przy użyciu standardowego hemocytometru z barwieniem błękitem trypanowym, jak opisano w literaturze53.
    1. Dodać pożywkę (z surowicą) do próbki w celu rozcieńczenia, jeśli to konieczne.
    2. Policz komórki i oblicz żywotność komórek, rejestrując żywe (niebarwione) komórki i martwe (barwione) komórki niezależnie (żywotność % = żywe komórki / całkowita liczba komórek).
  6. Zmierz średni poziom glukozy w trzech egzemplarzach za pomocą glukometru i jednorazowych pasków testowych.
    1. Wykonaj pomiary stężenia glukozy zgodnie z opisem w instrukcji glukometru, zastępując krew pożywką hodowlaną.
    2. Zanurzyć pasek testowy w pożywce, która ma być badana (pobrana z powyższej liczby próbek) i powtórzyć dla żądanej liczby powtórzeń (zalecane są trzy powtórzenia).
    3. Zbadaj zarówno świeżą pożywkę, jak i pożywkę odpadową pod kątem stężenia glukozy.
      UWAGA: W przypadku niektórych mierników pomiary niższe niż 20 mg/dl (wykrywalny próg miernika) mogą być obserwowane jako błąd w wyjściu miernika.

7. Pomiary szybkości osiadania sferoid

  1. Aby upewnić się, że skupiska komórek nie są usuwane przez system ciągłego podawania, należy zmierzyć szybkość osiadania sferoid β-TC6, obserwując ich sedymentację w plastikowej pipecie o dużej średnicy.
  2. Hodowla komórek β-TC6 w bioreaktorach SSB w celu utworzenia sferoid, jak opisano powyżej.
  3. Po 3 dniach hodowli pobrać 30 ml próbek zawiesiny sferoidalnej i umieścić w probówce o pojemności 50 ml.
  4. Delikatnie pipetować w górę i w dół za pomocą pipety o dużej średnicy 25 ml w celu równomiernego rozprowadzenia w zawiesinie, następnie przerwać pipetowanie z zawiesiną na znanym poziomie w pipecie (np. oznaczenie 20 ml), a następnie zapisać czas, w którym wszystkie sferoidy osiągną 5 cm.
  5. Powtórz tę procedurę wystarczająco dużo razy, aby uzyskać pewność statystyczną (zwykle n > 3).
    UWAGA: W przypadku badań biologicznych wartość p mniejsza niż 0,05 jest uważana za statystycznie istotną przy porównywaniu pomiarów. Do raportowania błędów wykorzystano błąd standardowy średniej, a do porównania warunków dla prezentowanych danych wykorzystano dwustronny niesparowany test studenta-t.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Średnie poziomy glukozy i jej wahania ograniczają ekspansję komórek w standardowych hodowlach SSB

Poziomy glukozy ulegają wahaniom w kulturach statycznych i kulturach SSB przez cały okres hodowli3. Wahania te nasilają się wraz ze wzrostem liczby komórek podczas 21-dniowego okresu hodowli i były niemal identyczne zarówno w kulturach statycznych, jak i SSB. Obserwacje te zostały przedstawione w naszej poprzedniej publikacji3. Poziomy glukozy mogą być nadfiz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Wytwarzanie produktów z komórek ssaków do produkcji czynników biologicznych i terapii komórkowych wymaga hodowli i monitorowania komórek ssaków na dużą skalę55–58. Co więcej, aplikacje te wymagają zdefiniowanych i zweryfikowanych warunków hodowli. Samo zwiększenie objętości ogniw za pomocą technologii badawczych nie spełni wszystkich tych wymagań. Ręczne zmiany pożywki powodujące wahania składników odżywczych i gromadzenie się produktów przemiany materii obniżają jakość, żywotność i wydaj...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują Michaelowi Garwoodowi i Samowi Steinowi za pomocne komentarze, a Kristen M. Maynard za pomoc w przygotowaniu manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
β Komórki TC-6ATCC, Manassas, VACRL-11506Linia komórkowa mysiego insulinoma (typ komórki adherentnej)
DPBS No Ca, No MgInvitrogen, Carlsbad, CA14190-144https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/14190144? ICID=search-14190144
Dulbecco's Modified Eagles MediumInvitrogen, Carlsbad, CAPoniżej znajdują się numery produktów 
DMEM Wysoki poziom glukozy (500 mM)Invitrogen, Carlsbad, CA11965-092http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11965092
DMEM Niski poziom glukozy (100 mM)Invitrogen, Carlsbad, CA11885-084http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11885084 (zauważ, że to podłoże zawiera już pirogronian)
L-glutaminaInvitrogen, Carlsbad, CA25030081http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081? ICID=search-product
Sodium PyrpreciousInvitrogen, Carlsbad, CA11360070https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11360070? ICID=search-product
Heat Inactivated Porcane SerumGibco - Life Technologies10082147http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/10082147
Trypsin-EDTAInvitrogen, Carlsbad, CA25200056https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25200056? ICID=search-product
T-150 Kolby poddane hodowli tkankowejCorning, Corning, NY430825http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=430825(nauki przyrodnicze)
& categoryname=
Inkubator kultur komórkowych NuAirePrinceton, MNUS Autoflow. Można użyć dowolnego inkubatora z płaszczem wodnym regulującym hodowle komórkowe CO2
WirówkaSorvall RT 7 (można użyć dowolnej podobnej wirówki stołowej)
LodówkaMożna użyć dowolnej lodówki laboratoryjnej (do tych badań użyto małej wersji stołowej)
1 L Szklana butelkaCorning, Corning, NY1395-1LMożna użyć dowolnego dostawcy. http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=1395-1L(nauki przyrodnicze)
& categoryname=
2 L Szklana butelkaCorning, Corning, NY1395-2LKażdy sprzedawca może być używany
250 ml mieszanych bioreaktorów Corning, Corning, Nowy Jork4500-250http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=4500-250 (nauki przyrodnicze)
& categoryname=
Płytka mieszającaFisher Scientific11-496-104AMożna użyć dowolnej płytki mieszającej bezpiecznej dla inkubatora, dowolnego dostawcy
Naczynia do kultur tkankowych o średnicy 100 mmNunc, Rochester, NY (Fisher Scientific)1256598 Można użyć dowolnego sprzedawcy (zamówionego przez Fisher Sci)
Probówki stożkowe FALCON 50 mlFalcon, San Jose, CA1256598Można użyć dowolnego dostawcy
Delran Plastic używany do niestandardowych częściMcMaster CarrRóżneMożna użyć dowolnego materiału, ale Deran jest wybierany, ponieważ jest bezpieczny w autoklawie, niereaktywny i łatwy w obróbce. http://www.mcmaster.com/#acetal-homopolymer-sheets/=rjrcac
Rura ze stali nierdzewnej do niestandardowych pokrywMcMaster CarrRóżneMożna użyć dowolnego dostawcy. http://www.mcmaster.com/#standard-stainless-steel-tubing/=rjrd91
Niestandardowe zmodyfikowane pokrywki bioreaktora Delran do ciągłego karmieniaWykonaneNie wiem o żadnych dostawcach produkujących podobny produkt
Niestandardowe zmodyfikowane szklane pokrywki do butelek do ciągłego karmieniaWykonaneNiektórzy dostawcy (np. , Fischer Sci, Corning) wytwarzają podobne produkty w poniższych linkach.
Cyfrowa pompa perystaltyczna Masterflex ColeParmer, Vernon Hills, ILEW-77919-25Można użyć dowolnej precyzyjnej pompy perystaltycznej. http://www.coleparmer.com/Product/L_S_Eight_Channel_Four_Roller_
Cartridge_Pump_System_115_230
_VAC/EW-77919-25
Łączniki rurowe PVDF (różne)Cole Parmer, Vernon Hills, ILZobacz linkMożna użyć dowolnego dostawcy. http://www.coleparmer.com/Category/Cole_Parmer_PVDF_Premium
_Luer_Fittings/55889
Rurka Pharmed BPT L/S 16Cole Parmer, Vernon Hills, ILWU-06508-16Można użyć dowolnego dostawcy. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing
_L_S_13_25/WU-06508-16
Rurki Pharmed BPT L/S 14Cole Parmer, Vernon Hills, ILWU-06508-14Można użyć dowolnego dostawcy. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing
_L_S_13_25/WU-06508-14
Rurka Pharmed BPT L/S 13Cole Parmer, Vernon Hills, ILWU-06508-13Można użyć dowolnego dostawcy. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing
_L_S_13_25/ WU-06508-13
Membrana Millipore Millex GP PES 0,22 µ l sterylny filtr strzykawkowy (używany do wentylacji i filtracji średniej)Fisher ScientificSLGP033RSMożna użyć dowolnego dostawcy
25 ml Pipeta z podziałkąFisher Scientific13-678-11Można użyć dowolnego dostawcy i można użyć różnych rozmiarów
PikultarkaFisher Scientific13-681-15EMożna użyć dowolnego dostawcy lub podobnego produktu
HemocytometrFisher Scientific02-671-6Można użyć dowolnego dostawcy lub podobnego produktu
Trypan BlueGibco - Life Technologies15250-061Można użyć dowolnego dostawcy lub podobnego produktu. https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15250061
Mikroskop światła odwróconegoLeicaMożna użyć dowolnego dostawcy lub podobnego produktu
Ultra glukometr One TouchFisher Scientific22-029-293Można użyć dowolnego dostawcy lub podobnego produktu (. , Bayer)
One Touch Ultra-StripsFisher Scientific22-029-292 Można użyć dowolnego dostawcy lub podobnego produktu (np. , Bayer)
. na zamówienie na zamówienie

Bibliografia

  1. Reuveny, S., Velez, D., Macmillan, J. D., Miller, L. Factors affecting cell growth and monoclonal antibody production in stirred reactors. J. Immunol. Methods. 86 (1), 53-59 (1986).
  2. Tarleton, R. L., Beyer, A. M. Medium-scale production and purification of monoclonal antibodies in protein-free medium. Biotechniques. 11 (5), 590-593 (1991).
  3. Weegman, B. P., et al. Nutrient regulation by continuous feeding removes limitations on cell yield in the large-scale expansion of Mammalian cell spheroids. PLoS One. 8 (10), e76611(2013).
  4. Klueh, U., et al. Continuous glucose monitoring in normal mice and mice with prediabetes and diabetes. Diabetes Technol. Ther. 8 (3), 402-412 (2006).
  5. Hay, R. J. Operator-induced contamination in cell culture systems. Dev. Biol. Stand. 75, 193-204 (1991).
  6. Dazey, B., Duchez, P., Letellier, C., Vezon, G., Ivanovic, Z. Cord blood processing by using a standard manual technique and automated closed system "Sepax" (Kit CS-530). Stem Cells Dev. 14 (1), 6-10 (2005).
  7. Gastens, M. H., et al. Good manufacturing practice-compliant expansion of marrow-derived stem and progenitor cells for cell therapy. Cell Transplant. 16 (7), 685-696 (2007).
  8. Naing, M. W., Williams, D. J. Three-dimensional culture and bioreactors for cellular therapies. Cytotherapy. 13 (4), 391-399 (2011).
  9. Stacey, G. N. Cell culture contamination. Cancer Cell Culture. , Methods Mol Biol; 731. Humana Press. Totowa, NJ. 79-91 (2011).
  10. Zur Nieden, I. N., Cormier, J. T., Rancourt, D. E., Kallos, M. S. Embryonic stem cells remain highly pluripotent following long term expansion as aggregates in suspension bioreactors. J. Biotechnol. 129 (3), 421-432 (2007).
  11. Kehoe, D. E., Jing, D., Lock, L. T., Tzanakakis, E. S. Scalable stirred-suspension bioreactor culture of human pluripotent stem cells. Tissue Eng. Part A. 16 (2), 405-421 (2010).
  12. Krawetz, R., et al. Large-scale expansion of pluripotent human embryonic stem cells in stirred-suspension bioreactors. Tissue Eng. Part C. Methods. 16 (4), 573-582 (2010).
  13. Shafa, M., et al. Expansion and long-term maintenance of induced pluripotent stem cells in stirred suspension bioreactors. J. Tissue Eng. Regen. Med. 6 (6), 462-472 (2012).
  14. Oh, S. K. W., et al. Long-term microcarrier suspension cultures of human embryonic stem cells. Stem Cell Res. 2 (3), 219-230 (2009).
  15. Olmer, R., et al. Suspension culture of human pluripotent stem cells in controlled, stirred bioreactors. Tissue Eng. Part C. Methods. 18 (10), 772-784 (2012).
  16. Baptista, R. P., Da Fluri,, Zandstra, P. W. High density continuous production of murine pluripotent cells in an acoustic perfused bioreactor at different oxygen concentrations. Biotechnol. Bioeng. 110 (2), 648-655 (2013).
  17. Papas, K. K. Characterization of the metabolic and secretory behavior of suspended free and entrapped ART-20 spheroids in fed-batch and perfusion cultures [dissertation]. , Georgia Institute of Technology. Atlanta, GA. (1992).
  18. Papas, K. K., Constantinidis, I., Sambanis, A. Cultivation of recombinant, insulin-secreting AtT-20 cells as free and entrapped spheroids. Cytotechnology. 13 (1), 1-12 (1993).
  19. Sambanis, A., Papas, K. K., Flanders, P. C., Long, R. C., Kang, H., Constantinidis, I. Towards the development of a bioartificial pancreas: immunoisolation and NMR monitoring of mouse insulinomas. Cytotechnology. 15 (1-3), 351-363 (1994).
  20. Sharma, S., Raju, R., Sui, S., Hu, W. -S. Stem cell culture engineering - process scale up and beyond. Biotechnol. J. 6 (11), 1317-1329 (2011).
  21. Papas, K. K., Long, R. C., Constantinidis, I., Sambanis, A. Role of ATP and Pi in the mechanism of insulin secretion in the mouse insulinoma betaTC3 cell line. Biochem. J. 326 (Pt 3), 807-814 (1997).
  22. Papas, K. K., Long, R. C., Sambanis, A., Constantinidis, I. Development of a bioartificial pancreas: I. long-term propagation and basal and induced secretion from entrapped betaTC3 cell cultures. Biotechnol. Bioeng. 66 (4), 219-230 (1999).
  23. Papas, K. K., Long, R. C., Sambanis, A., Constantinidis, I. Development of a bioartificial pancreas: II. Effects of oxygen on long-term entrapped betaTC3 cell cultures. Biotechnol. Bioeng. 66 (4), 231-237 (1999).
  24. Hu, W. S. Cell culture process monitoring and control-a key to process optimization. Cytotechnology. 14 (3), 155-156 (1994).
  25. Alfred, R., et al. Efficient suspension bioreactor expansion of murine embryonic stem cells on microcarriers in serum-free medium. Biotechnol. Prog. 27 (3), 811-823 (2011).
  26. Cormier, J. T., zur Nieden, N. I., Rancourt, D. E., Kallos, M. S. Expansion of undifferentiated murine embryonic stem cells as aggregates in suspension culture bioreactors. Tissue Eng. 12 (11), 3233-3245 (2006).
  27. Dang, S. M., Zandstra, P. W. Scalable production of embryonic stem cell-derived cells. Methods Mol. Biol. 290 (1), 353-364 (2005).
  28. Elseberg, C. L., et al. Microcarrier-based expansion process for hMSCs with high vitality and undifferentiated characteristics. Int. J. Artif. Organs. 35 (2), 93-107 (2012).
  29. Kallos, M. S., Behie, L. A. Inoculation and growth conditions for high-cell-density expansion of mammalian neural stem cells in suspension bioreactors. Biotechnol. Bioeng. 63 (4), 473-483 (1999).
  30. Kehoe, D. E., Lock, L. T., Parikh, A., Tzanakakis, E. S. Propagation of embryonic stem cells in stirred suspension without serum. Biotechnol. Prog. 24 (6), 1342-1352 (2008).
  31. Kirouac, D. C., Zandstra, P. W. The systematic production of cells for cell therapies. Cell Stem Cell. 3 (4), 369-381 (2008).
  32. Serra, M., et al. Stirred bioreactors for the expansion of adult pancreatic stem cells. Ann. Anat. 191 (1), 104-115 (2009).
  33. Chawla, M., Bodnar, C. A., Sen, A., Kallos, M. S., Behie, L. A. Production of islet-like structures from neonatal porcine pancreatic tissue in suspension bioreactors. Biotechnol. Prog. 22 (2), 561-567 (2006).
  34. Weegman, B. P., et al. Temperature profiles of different cooling methods in porcine pancreas procurement. Xenotransplantation. , (2014).
  35. Cruz, H. J., Moreira, J. L., Carrondo, M. J. Metabolic shifts by nutrient manipulation in continuous cultures of BHK cells. Biotechnol. Bioeng. 66 (2), 104-113 (1999).
  36. Dowd, J. E., Jubb, A., Kwok, K. E., Piret, J. M. Optimization and control of perfusion cultures using a viable cell probe and cell specific perfusion rates. Cytotechnology. 42 (1), 35-45 (2003).
  37. Goudar, C., Biener, R., Zhang, C., Michaels, J., Piret, J., Konstantinov, K. Towards industrial application of quasi real-time metabolic flux analysis for mammalian cell culture. Cell Culture Engineering. 101, Adv. Biochem. Eng. Biotechnol; 101. Springer Berlin Heidelberg. Berlin, Heidelberg. 99-118 (2006).
  38. Hu, W. S., Piret, J. M. Mammalian cell culture processes. Curr. Opin. Biotechnol. 3 (2), 110-114 (1992).
  39. Knaack, D., et al. Clonal insulinoma cell line that stably maintains correct glucose responsiveness. Diabetes. 43 (12), 1413-1417 (1994).
  40. Poitout, V., Stout, L. E., Armstrong, M. B., Walseth, T. F., Sorenson, R. L., Robertson, R. P. Morphological and functional characterization of beta TC-6 cells--an insulin-secreting cell line derived from transgenic mice. Diabetes. 44 (3), 306-313 (1995).
  41. Poitout, V., Olson, L. K., Robertson, R. P. Insulin-secreting cell lines: classification, characteristics and potential applications. Diabetes Metab. 22 (1), 7-14 (1996).
  42. Suzuki, R., et al. Cyotomedical therapy for insulinopenic diabetes using microencapsulated pancreatic beta cell lines. Life Sci. 71 (15), 1717-1729 (2002).
  43. Skelin, M., Rupnik, M., Cencic, A. Pancreatic beta cell lines and their applications in diabetes mellitus research. ALTEX. 27 (2), 105-113 (2010).
  44. Masters, J. R., Stacey, G. N. Changing medium and passaging cell lines. Nat. Protoc. 2 (9), 2276-2284 (2007).
  45. Murdoch, T. B., McGhee-Wilson, D., Shapiro, A. M. J., Lakey, J. R. T. Methods of human islet culture for transplantation. Cell Transplant. 13 (6), 605-617 (2004).
  46. Woodside, S. M., Bowen, B. D., Piret, J. M. Mammalian cell retention devices for stirred perfusion bioreactors. Cytotechnology. 28 (1-3), 163-175 (1998).
  47. Serra, M., et al. Improving expansion of pluripotent human embryonic stem cells in perfused bioreactors through oxygen control. J. Biotechnol. 148 (4), 208-215 (2010).
  48. Gálvez, J., Lecina, M., Solà, C., Cairó, J., Gòdia, F. Optimization of HEK-293S cell cultures for the production of adenoviral vectors in bioreactors using on-line OUR measurements. J. Biotechnol. 157 (1), 214-222 (2012).
  49. Trabelsi, K., Majoul, S., Rourou, S., Kallel, H. Development of a measles vaccine production process in MRC-5 cells grown on Cytodex1 microcarriers and in a stirred bioreactor. Appl. Microbiol. Biotechnol. 93 (3), 1031-1040 (2012).
  50. Liu, H., et al. A high-yield and scaleable adenovirus vector production process based on high density perfusion culture of HEK 293 cells as suspended aggregates. J. Biosci. Bioeng. 107 (5), 524-529 (2009).
  51. Zhi, Z., Liu, B., Jones, P. M., Pickup, J. C. Polysaccharide multilayer nanoencapsulation of insulin-producing beta-cells grown as pseudoislets for potential cellular delivery of insulin. Biomacromolecules. 11 (3), 610-616 (2010).
  52. Lock, L. T., Laychock, S. G., Tzanakakis, E. S. Pseudoislets in stirred-suspension culture exhibit enhanced cell survival, propagation and insulin secretion. J. Biotechnol. 151 (3), 278-286 (2011).
  53. Marchenko, S., Flanagan, L. Counting human neural stem cells. J. Vis. Exp. (7), e262(2007).
  54. Campos, C. Chronic hyperglycemia and glucose toxicity: pathology and clinical sequelae. Postgrad. Med. 124 (6), 90-97 (2012).
  55. Eve, D. J., Fillmore, R., Borlongan, C. V., Sanberg, P. R. Stem cells have the potential to rejuvenate regenerative medicine research. Med. Sci. Monit. 16 (10), RA197-RA217 (2010).
  56. Hsiao, L. -C., Carr, C., Chang, K. -C., Lin, S. -Z., Clarke, K. Review Article: Stem Cell-based Therapy for Ischemic Heart Disease. Cell Transplant. , (2012).
  57. Oldershaw, R. A. Cell sources for the regeneration of articular cartilage: the past, the horizon and the future. Int. J. Exp. Pathol. 93 (6), 389-400 (2012).
  58. De Coppi, P. Regenerative medicine for congenital malformations. J. Pediatr. Surg. 48 (2), 273-280 (2013).
  59. Tziampazis, E., Sambanis, A. Modeling of cell culture processes. Cytotechnology. 14 (3), 191-204 (1994).
  60. Sidoli, F. R., Mantalaris, A., Asprey, S. P. Modelling of Mammalian cells and cell culture processes. Cytotechnology. 44 (1-2), 27-46 (2004).
  61. Yim, R. Administrative and research policies required to bring cellular therapies from the research laboratory to the patient’s bedside. Transfusion. 45, Suppl 4. 144S-158S (2005).
  62. Fink, D. W. FDA regulation of stem cell-based products. Science. 324 (5935), 1662-1663 (2009).
  63. Moos, M. Stem-cell-derived products: an FDA update. Trends Pharmacol. Sci. 29 (12), 591-593 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ekspansja kom rek ssak whodowla sferoid wpompa perystaltycznabioreaktor z mieszad emmonitorowanie poziomu glukozyregulacja szybko ci dozowania po ywkizwi kszenie wydajno ci kom reksterylne pobieranie pr bek
Regulacja składników odżywczych poprzez ciągłe karmienie w celu ekspansji komórek ssaków w sferoidach na dużą skalę
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.