Artykuł metodologiczny

Szybkie frakcjonowanie i izolacja składników krwi pełnej w próbkach uzyskanych w warunkach środowiskowych

16.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52227

⸱

30 listopada 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Carl R. Woese Institute for Genomic Biology, University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Department of Molecular and Integrative Physiology, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Department of Epidemiology, Gillings School of Global Public Health, University of North Carolina, 4Department of Psychology, University of Illinois at Urbana-Champaign, 5Department of Epidemiology, Mailman School of Public Health, Columbia University, 6Department of Epidemiology, University of Michigan School of Public Health, 7Center for Molecular Medicine and Genetics, Wayne State University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiamy metodologię przetwarzania krwi pełnej w celu uzyskania różnych składników do dalszej analizy. Zoptymalizowaliśmy uproszczony protokół, który umożliwia szybkie, wysokoprzepustowe jednoczesne przetwarzanie próbek krwi pełnej w warunkach nieklinicznych.

Streszczenie

Pobieranie i przetwarzanie próbek krwi pełnej w warunkach nieklinicznych oferuje unikalną okazję do oceny osób mieszkających w społecznościach zarówno z wcześniej istniejącymi schorzeniami, jak i bez nich. Szybkie przetwarzanie tych próbek jest niezbędne, aby uniknąć degradacji kluczowych składników komórkowych. Uwzględniono tutaj metody jednoczesnej izolacji komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC), DNA, RNA i surowicy z pojedynczego pobrania krwi przeprowadzonego w domach uczestników, którzy wyrazili na to zgodę, na obszarze metropolitalnym, z przetwarzaniem rozpoczętym w ciągu 2 godzin od pobrania. Wykorzystaliśmy te techniki do przetworzenia ponad 1600 próbek krwi, uzyskując spójny, wysokiej jakości materiał, który następnie został wykorzystany w udanych analizach metylacji DNA, genotypowania, ekspresji genów i cytometrii przepływowej. Niektóre z zastosowanych metod są standardowe; Jednak po połączeniu w opisany sposób umożliwiają one efektywne przetwarzanie próbek pochodzących od uczestników badań populacyjnych i/lub środowiskowych, którzy normalnie nie byliby oceniani w warunkach klinicznych. W związku z tym protokół ten ma potencjał do uzyskania próbek (a następnie danych), które są bardziej reprezentatywne dla populacji ogólnej.

Wprowadzenie

Liczne badania scharakteryzowały różnice w ekspresji genów, metylacji DNA i podzbiorach komórek we krwi u osób z chorobami psychicznymi (lub innymi) oraz u osób zdrowych1-4. Wyniki tych badań uzyskano jednak w warunkach klinicznych, w których różnice związane z chorobą mogą być wyolbrzymione ze względu na zazwyczaj cięższy przebieg schorzeń, z powodu których pacjenci szukają leczenia. Dzięki postępowi w podejściach „omicznych”, w ostatniej dekadzie odnotowano gwałtowny wzrost zainteresowania pobieraniem próbek biologicznych w środowiskach społecznych i/lub epidemiologicznych5-7, aby dostarczyć opartych na populacji szacunków rozpowszechnienia chorób oraz szerszego obrazu determinant środowiskowych tych schorzeń psychicznych i/lub somatycznych.

Kluczowym wyzwaniem w tym zakresie jest wymóg szybkiego przetworzenia pobranych próbek. Degradacja komórek mononuklearnych, kluczowych elementów układu odpornościowego często wykorzystywanych do oceny stanu zdrowia jednostki, rozpoczyna się natychmiast po pobraniu krwi, a po 2 hr od pobrania następuje znaczący spadek wydajności ich odzyskiwania8-10. Aby sprostać temu wyzwaniu, przedstawiamy zoptymalizowany protokół, w którym wiele składników pełnej krwi ludzkiej jest izolowanych jednocześnie z próbek pobranych w domach osób mieszkających w dużym obszarze metropolitalnym. Protokół opiera się na naszym opracowaniu i modyfikacji aktualnych technik, w tym na przechowywaniu wszystkich „nadmiarowych” frakcji na wypadek, gdyby przyszłe techniki umożliwiły dalszą izolację/analizy. Choć zamiast opisanych tutaj poszczególnych metod można zastosować alternatywne sposoby lub zestawy, przedstawione procedury okazały się niezawodnym i wydajnym sposobem przetwarzania próbek w trybie wysokoprzepustowym. Wysokiej jakości frakcje (PBMCs, DNA, surowica i RNA) ze świeżej krwi mogą zostać otrzymane w ciągu 2 hr od pobrania, a wszystkie próbki gotowe do analizy mogą być dostępne w ciągu 2 dni (Rysunek 1).

Niniejszy protokół opracowano w celu umożliwienia efektywnego przetwarzania próbek pobranych od dorosłych mieszkańców miasta Detroit w ramach Detroit Neighborhood Health Study (DNHS; DA022720, RC1MH088283, DA022720-05-S1) – populacyjnego badania społecznych i biologicznych uwarunkowań zespołu stresu pourazowego (PTSD) oraz innych chorób psychicznych. Częstość występowania PTSD w Detroit jest ponad dwukrotnie wyższa od średniej krajowej11,12. Identyfikacja biologicznych uwarunkowań PTSD w tej populacji może pomóc w opracowaniu odpowiednich interwencji farmakologicznych i/lub poznawczo-behawioralnych, aby wspomóc osoby cierpiące na to zaburzenie, zarówno w tej populacji miejskiej, jak i w innych populacjach wysokiego ryzyka (np. powracających weteranach wojennych). Nasze laboratorium, wcześniej zlokalizowane na Wayne State University w Detroit w stanie Michigan, zostało wybrane do przetwarzania próbek ze względu na nasze doświadczenie w pracy ze świeżymi próbkami tkanek pochodzącymi z różnych źródeł, konieczność rozpoczęcia obróbki próbek w ciągu 2 hr od momentu pobrania oraz bliskość miejsc pobrań. Korzystając z tej wyjątkowej okazji, naszym celem była optymalizacja procesu w celu uzyskania maksymalnej wydajności DNA, RNA, surowicy oraz mononuklearnych komórek krwi obwodowej (PBMCs) z każdego materiału (łącznie N=1639 próbek pobranych w 5 seriach). Przedstawione tutaj procedury mogą być wykonywane jednocześnie w warunkach pozaklinicznych, dostarczając tym samym materiału wyjściowego (średnie wydajności podano w tabeli 1) do wielu analiz następczych, w tym mikromacierzy, analiz epigenetycznych, RT-PCR w czasie rzeczywistym oraz cytometrii przepływowej.

Schemat procesu pobierania i przetwarzania krwi; od flebotomii do izolacji DNA/RNA; kroki osi czasu.
Rycina 1. Ogólny schemat postępowania. Przedstawiony tutaj ogólny proces obejmuje logistykę pozyskiwania próbek krwi, od zidentyfikowania uczestników wyrażających zgodę, po samo pobranie krwi. Wysokiej jakości frakcje świeżej krwi pełnej (mononuklearne komórki krwi obwodowej; PBMCs, DNA, surowica i RNA) mogą zostać otrzymane w ciągu 2 hr od pobrania, a wszystkie próbki gotowe do analizy mogą być dostępne w ciągu 2 dni. Co więcej, frakcje przygotowane tą metodą nadają się do długoterminowego przechowywania, jeśli próbki nie mają być badane natychmiast. Cały opisany tutaj harmonogram mógłby zostać zrealizowany w ciągu jednego dnia (łącznie ok. 5 hr). Jednak taki dzień byłby niezwykle pracochłonny, szczególnie dla jednego technika, nawet z dużym doświadczeniem w tych technikach. Dlatego zalecamy podział procedur z Dnia 1 pomiędzy co najmniej dwóch techników i zakończenie przetwarzania RNA w Dniu 2. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Badanie Zdrowia Sąsiedztwa w Detroit zostało sprawdzone i zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną Uniwersytetu Michigan. Wszyscy uczestnicy wyrazili świadomą zgodę przed udziałem w badaniu.

1. Przegląd

  1. Odpowiednio dokumentuj wszystkie etapy, począwszy od rekrutacji, poprzez analizę danych końcowych. Wykonuj protokoły w dniu 1 jednocześnie, zmieniając etapy i nakładając się na siebie, jeśli pozwala na to czas. Sekwencja etapów jest napisana w celu optymalizacji wydajności wydajności. Rysunek 1 przedstawia przegląd całego procesu.
    Uwaga: Termin "uczestnik" jest używany w całym tekście do oznaczenia pozbawionej elementów pozwalającej na identyfikację próbki krwi pobranej od osoby, która wyraziła na to zgodę. Czasy w nawiasach poniżej wskazują czas praktyczny. Przykłady arkusza śledzenia i dziennika próbek można znaleźć odpowiednio w tabelach uzupełniających S1 i S2. Próbki są pobierane przez flebotomistów w domach osób zidentyfikowanych przez koordynatora badania jako uczestnicy wyrażający zgodę i transportowane do laboratorium przez kuriera (więcej szczegółów na temat wstępnego przetwarzania znajduje się w Informacjach Uzupełniających (SI) 1).

2. Dzień 1 Konfiguracja

  1. Przygotować 1x sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).
  2. Rozgrzej blok grzewczy do 56 ºC.
  3. Przygotować proteazę (patrz SI 2), dzieląc 20 μl do odpowiedniej liczby probówek wirówkowych na dostawy dzienne (2 na uczestnika).
  4. Upewnij się, że AW1 i AW2 (płuczące znajdujące się w zestawie do izolacji DNA, które zwiększają czystość DNA) są gotowe do użycia, dodając 100% etanolu, jak wskazano na etykiecie, jeśli to konieczne.
  5. Schłodzić wirówkę z chłodzeniem do temperatury 4 °C.
  6. Załóż nakrętkę na butelce 1x PBS na dostarczoną gumową nasadkę przegrody i przebij gumową przegrodę kolcem transferowym, przytrzymując nakrętkę na górze kolca do przenoszenia, aby zapobiec parowaniu. Powtórzyć z butelką roztworu stabilizującego RNA.
  7. Po przygotowaniu, wirówki i bloku grzewczego należy udokumentować czas dostarczenia urządzenia próżniowego na arkuszu śledzenia próbki (patrz tabela SI).

3. Dzień 1: Przetwarzanie próbki krwi pełnej pod kątem DNA, PBMC i RNA leukocytów (2 godziny)

  1. przegląd
    1. Przeznacz odpowiednią ilość czasu, aby zminimalizować opóźnienie między pobraniem krwi a czasem rozpoczęcia przetwarzania. Przetwarzanie Ficollu zawierającego wakutainery należy rozpocząć w ciągu 2 godzin od pobrania krwi, aby uniknąć wzrostu zanieczyszczenia krwinek czerwonych i zmniejszenia odzysku komórek jednojądrzastych.
    2. Załóżmy, że zbieramy 2 wakutainery zawierające gradient żelu Ficoll, 2 K2 wakutainery kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) i 1 wakutainer surowicy na dorosłego uczestnika. Po dostarczeniu wakutainerów do laboratorium poproś technika o podpisanie arkusza śledzenia oznaczającego przyjęcie próbek. Przetwarzanie należy rozpocząć natychmiast po upływie czasu rozpoczęcia udokumentowanego w dzienniku pobierania próbek w odniesieniu do każdego urządzenia próżniowego.
  2. Izolacja surowicy Etap 1 (1 min)
    1. Udokumentować czas rozpoczęcia w dzienniku próbek (zob. tabela SI 2). Odwirować (z wyłączonym hamulcem i przyspieszeniem) 7,0 ml próżniowego środka do suszenia surowicy (czerwony) (1 na uczestnika) za pomocą wahliwego wirnika kubełkowego z nasadkami aerozolowymi (poziom bezpieczeństwa biologicznego 2; Certyfikat BSL2) przez 20 min, 1 300 x g, 4 ºC.
  3. Izolacja DNA Etap 1 (15 min)
    Uwaga: Więcej informacji na temat tej procedury izolacji można znaleźć w protokole producenta13.
    1. Udokumentuj godzinę rozpoczęcia. W kapturze do hodowli komórkowej BSL2 odwróć wakutainery zawierające żel Ficoll 5 razy, a następnie dodaj 200 μl krwi pełnej z górnej części jednego z wakutainerów do każdego z dwóch 20 μl podwielokrotności proteazy (łącznie 400 μl na uczestnika). Pozostawiając probówki do mikrowirówek proteazy + krwi w kapturze, kontynuuj wirowanie Ficollu zawierającego wakutainery w kroku 3.4.1.
      Uwaga: Należy użyć urządzenia do podgrzewania o największej objętości pobierania, mając na uwadze konieczność zrównoważenia wirówki (tj. może być konieczne usunięcie 200 μl z każdego z dwóch urządzeń do podgrzewania) podczas obracania urządzeń zatrzymujących w kroku 3.4.1. Dodatkowo, aby zapewnić prawidłową separację podczas przetwarzania niebieskich odkurzaczy, poziom krwi pozostałej w vacutainerze nie powinien być mniejszy niż 2,5 cala powyżej warstwy Ficoll.
  4. Izolacja PBMC Etap 1 (1 min)
    1. Udokumentuj czas rozpoczęcia (musi przypadać w ciągu 2 godzin od pobrania krwi, aby uniknąć wzrostu zanieczyszczenia krwinek czerwonych i spadku regeneracji komórek jednojądrzastych). Odwróć Ficoll zawierający vacutainery 8-10 razy. Odwirować (z wyłączonym hamulcem i przyspieszeniem) urządzenia próżniowe (2 na uczestnika) za pomocą wahliwego wirnika kubełkowego z nasadkami aerozolowymi (certyfikat BSL2) przez 30 minut, 1 600 x g, 22 °C.
  5. Izolacja DNA Etap 2 (20 min)
    1. Wrócić do okapu i dodać 200 μl buforu AL do każdej z probówek do mikrowirówek proteazy + krwi (krok 3.3.1). Nakryj, zdejmij z maski, wiruj 15 sekund i wiruj błyskawicznie.
    2. Inkubować w temperaturze 56 ºC w bloku grzewczym, 10 min.
    3. Wyjmij rurki z bloku grzewczego. Błyskawiczny wirowanie. Wróć do maski BSL2. Dodaj 200 μl 100% etanolu. Nakryj, zdejmij z maski, wiruj 15 sekund i wiruj błyskawicznie. Pozostałe kroki można wykonać na zewnątrz okapu.
    4. Nanieść lizat (w ciągu 30 minut od kroku 3.5.3) na oznakowaną kolumnę wirową (w probówce zbiorczej o pojemności 2 ml). Zamknij nakrętkę, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego przez aerozole. Wirówka 6.000 x g, 1 min.
    5. Wyrzucić probówkę zbiorczą zawierającą filtrat i umieścić kolumnę wirową w nowej probówce zbiorczej o pojemności 2 ml.
    6. Dodać 500 μl buforu AW1 do kolumny bez zwilżania brzegu, zamknąć nakrętkę i odwirować 6 000 x g, 1 min.
    7. Wyrzucić probówkę zbiorczą zawierającą filtrat i umieścić kolumnę wirową w nowej probówce zbiorczej o pojemności 2 ml.
    8. Dodać 500 μl buforu AW2 do kolumny bez zwilżania brzegu, zamknąć nakrętkę i odwirować 20 000 x g, 3 min.
    9. Wyrzuć probówkę zbiorczą zawierającą filtrat i umieść kolumnę wirową w nowej probówce zbiorczej o pojemności 1,5 ml (brak w zestawie) i odwiruj 20 000 x g, 1 min.
    10. Wyrzucić probówkę zbiorczą zawierającą filtrat i umieścić kolumnę wirową w nowej probówce zbiorczej o pojemności 1,5 ml (brak w zestawie).
    11. Dodać 200 μl buforu AE lub wody do każdej kolumny i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Odwirować 6 000 x g, 1 min.
    12. Powtórzyć krok 3.5.11 elucji do tej samej probówki zbiorczej.
    13. Połącz wymyte DNA z 2 kolumn na uczestnika. Całkowita wydajność ~800 μl na uczestnika.
    14. Określić ilościowo próbki za pomocą spektrofotometru, gdy pozwala na to czas.
    15. Podwielokrotność DNA według uznania umieścić w kriowialach o pojemności 2 ml, dokumentując stężenie każdego z nich w dzienniku próbki. Przenieść kriowiale do krioboxa i umieścić w temperaturze -80 °C w celu długotrwałego przechowywania. Udokumentuj godzinę uruchomienia zamrażarki.
  6. Izolacja RNA leukocytów Etap 1 (30 min)
    Uwaga: Wykonaj w kapturze do hodowli komórkowych z certyfikatem bezpieczeństwa biologicznego 2. Więcej informacji na temat tej izolacji można znaleźć w instrukcji producenta15.
    1. Przekłuć gumową przegrodę odkurzacza K2 EDTA za pomocą kolca transferowego. Zachowaj osłonę i nakrętkę do użycia w kroku 3.6.11. Postępując zgodnie ze standardowymi praktykami BSL2, należy uważać, aby uniknąć narażenia na patogeny przenoszone przez krew.
    2. Przymocuj białe złącze poślizgowe do górnej części kolca transferowego.
    3. Oznacz filtr odpowiednim identyfikatorem uczestnika, a następnie podłącz wlot (rozszerzony koniec) filtra do białego złącza poślizgowego.
    4. Przymocuj igłę 255/8 G w osłonie do wylotu (stożkowego końca) filtra. Przygotowanie zespołu filtra przed dostawą znacznie przyspiesza proces, dlatego zaleca się przymocowanie białego łącznika poślizgowego do kolca transferowego, dodanie filtra, a następnie igły w osłonie i ustawienie zespołu w stojaku na probówki hodowlane do czasu użycia.
    5. Po zmontowaniu systemu rurek K2 EDTA należy bezpiecznie odsunąć igłę (użyć końcówki metalowej szpatułki). Wbić igłę do pustej 10 ml opróżnionej probówki do pobierania krwi (probówka do odbioru surowicy) i odwrócić zespół rurki próżniowej/filtra/odbiornika K2 EDTA. Postępując zgodnie ze standardowymi praktykami BSL2, należy uważać, aby uniknąć narażenia na patogeny przenoszone przez krew.
    6. Pozwól krwi przefiltrować się, aż klinowate części filtra oczyszczą się z krwi. Filtracja trwa około 2 minut i na czas filtracji można ją umieścić w stojaku na probówki.
    7. Wyjmij filtr z zespołu. Pozostawić igłę w probówce zawierającej filtrat i wyrzucić cały zestaw do pojemnika na ostre przedmioty.
    8. Podłączyć strzykawkę o pojemności 5 ml do kolca do przenoszenia na butelce 1x PBS, odwrócić butelkę i pobrać 3 ml.
    9. Podłączyć strzykawkę z PBS do wlotu filtra i przepłukać filtr (3-5 kropli na sekundę). Zebrać przepływ do pojemnika na odpady biologiczne. Odłączyć strzykawkę od filtra, nie wsuwając tłoka.
    10. Po przefiltrowaniu i przepłukaniu PBS pobrać 3 ml środka stabilizującego RNA za pomocą nowej strzykawki o pojemności 5 ml i metody opisanej w kroku 3.6.8. Przepłukać filtr jak w kroku 3.6.9. Środek stabilizujący RNA powinien pozostać na filtrze. Odłączyć strzykawkę od filtra, nie wsuwając tłoka.
    11. Uszczelnij wlot i wylot filtra osłoną i nakrętką zabezpieczonymi przed kolcem transferowym, pozostawiając filtr nasycony środkiem stabilizującym RNA. W tym momencie filtr można zapisać. Przechowuj filtr w temperaturze -80 ºC, aż czas pozwoli (~2 godziny) na wykonanie kroków od 5.3 do 5.4.7.
      Uwaga: Filtry przechowywane w temperaturze -80 ºC przez okres do roku po pobraniu zostały przetworzone bez pogorszenia jakości RNA.
  7. Izolacja PBMC Etap 2 (30 min)
    1. Wyjąć z wirówki Ficoll zawierający vacutainery (krok 3.4.1) i kontynuować w okapie BSL2. Urządzenia do utrzymywania powinny wyświetlać separację, jak na rysunku 2. Jeśli nie, patrz tabela 2.
    2. Po umieszczeniu urządzenia próżniowego z powrotem w okapie BSL2 należy usunąć korek i pobrać 1,5 ml wierzchniej, żółtawej warstwy osocza (ryc. 2) za pomocą pipety serologicznej, nie zbliżając się do warstwy jednojądrzastej (przezroczystej/białej). Przenieś osocze do kriowialnego o pojemności 5 ml — (pula z 2 urządzeń próżniowych — 1 uczestnik). Rejestruj zebrany wolumin. Zobacz krok 3.7.6, aby uzyskać instrukcje przechowywania.
      Uwaga: Najlepsza separacja i największe plony PBMC pochodzą od uczestników, którzy pościli co najmniej 12 godzin przed pobraniem krwi.
    3. Przenieść pozostałą plazmę i białawą, jednojądrzastą warstwę (wszystko powyżej warstwy żelu - Ryc. 2) za pomocą pipety serologicznej do stożkowej probówki o pojemności 15 ml, łącząc warstwę jednojądrzastą z każdego z dwóch Ficoll zawierających wakutainery na uczestnika w jednej stożkowej probówce.
    4. Dodaj 1x PBS, aby całkowita objętość w stożkowej probówce wynosiła 15 ml. Zakręć probówkę i odwróć 5 razy. Wirówka (z wyłączonym hamulcem i przyspieszeniem) 15 min, 300 x g, 22 °C.
    5. Wróć do Ficoll zawierającego vacutainery w kapturze i zbierz czerwone krwinki (RBC) za pomocą pipety Pasteura 53/4", aby zawirować i poluzować zewnętrzną warstwę żelu Ficoll i usunąć ją, jeśli to możliwe. Użyj pipety serologicznej, aby zebrać i przenieść erytrocyty (~4,5 ml) do kriowialu o pojemności 5 ml. Rejestruj zebrany wolumin.
    6. Przenieść oba 5 ml kriowiali (osocze w kroku 3.7.2 i erytrocyty w kroku 3.7.5) do pojemnika do zamrażania z kontrolowaną szybkością i umieścić w temperaturze -80 °C na co najmniej 24 godziny, po czym można je przenieść do krioboxa i przywrócić do temperatury -80 °C w celu długotrwałego przechowywania.
    7. Włożyć stożkową rurkę z powrotem do okapu, gdy wirowanie w kroku 3.7.4 zostanie zakończone, i zassać całość oprócz ~500 μl PBS bez naruszania osadu. Wydajność PBMC jest większa, jeśli na tym etapie nad osadem pozostanie ~200 μl PBS.
    8. Dodaj świeży 1x PBS, aby zwiększyć objętość do 10 ml. Delikatnie zawiesić granulkę. Zakręć rurkę i odwróć 5 razy. Wirówka (z wyłączonym hamulcem i przyspieszeniem) 10 min, 300 x g, 22 °C.
  8. Izolacja surowicy Etap 2 (10 min)
    Uwaga: Występuj w okapie BSL2.
    1. Podwielokrotność wierzchniej warstwy surowicy z urządzenia do uwalniania surowicy, po odwirowaniu (etap 3.2.1), podzielić na 2 ml kriowialiów zgodnie z życzeniem. Typowa wydajność to 2,5 ml (tabela 1). Rejestruj wolumin. Na przykład użyj 4 kriowialiów o proporcji 200 μl do kriowialnego 1, 1,000 μl do kriowialnego 2, a następnie podziel resztę na kriowialne 3 i 4.
    2. Przenieść kriowiale do krioboxa i umieścić w temperaturze -80 ºC w celu długotrwałego przechowywania. Udokumentuj godzinę uruchomienia zamrażarki.
  9. Izolacja PBMC Etap 3 (15 min)
    1. Po odwirowaniu (krok 3.7.8) powrócić do okapu i odessać jak najwięcej supernatantu/PBS bez naruszania osadu. Zawiesić osad przez pipetowanie w 2,5 ml pożywki do zamrażania PBMC 1 (patrz SI 2).
    2. Dodać 2,5 ml pożywki do zamrażania PBMC 2 (patrz SI 2) do roztworu komórki/pożywki w kroku 3.9.1. Wiruj delikatnie.
    3. Podwielokrotność 10 μl roztworu komórkowego rozlać do probówki mikrowirówkowej o pojemności 0,65 ml (może być konieczne dalsze rozcieńczenie). Dodać 10 μl 0,4% barwie błękitu trypanowego do probówki mikrowirówki o pojemności 0,65 ml i kilkakrotnie wymieszać pipetując. Więcej informacji można znaleźć w instrukcji producenta16.
    4. Odpipetować 10 μl mieszaniny do szkiełka z komory liczenia komórek i umieścić szkiełko w liczniku komórek w ciągu 3 minut od wymieszania. Powiększ i ustaw ostrość komórek. Naciśnij przycisk "Policz komórki", aby uzyskać liczbę PBMC.
    5. Podwielokrotność, jeśli żywotna liczba PBMC przekracza 3 miliony komórek na mililitr (mc/ml), zgodnie z życzeniem do kriowiali i kontynuować krok 3.9.9. Przechowywać PBMC w maksymalnie 5 kriowialiach o stężeniu co najmniej 3 mc/ml każdy.
    6. Jeśli liczba żywotnych PBMC jest mniejsza niż 3 mc/ml, oblicz całkowitą liczbę komórek, mnożąc żywy mc/ml przez 5 ml. Podziel tę liczbę przez 4, 3, 2 lub 1 ml, tak aby pozostała co najmniej jedna probówka o stężeniu 3 mc/ml.
    7. Odwirować stożkową probówkę zawierającą roztwór komórek/pożywki zamrażającej przez 5 minut przy 300 x g (hamowanie i przyspieszanie wyłączone). Po odwirowaniu odessać odpowiednią objętość pożywki zamrażającej (supernatantu), pozostawiając objętość obliczoną powyżej (4, 3, 2 lub 1 ml).
    8. Zawiesić osad w pozostałym supernatancie i podwielokrotność co najmniej 3 mc/ml do odpowiedniej liczby kriowiali (1-4) w stężeniu 1 ml/kriowial. Końcowa pożywka do zamrażania to 10% dimetylosulfotlenek (DMSO) / 20% płodowa surowica bydlęca (FBS) / 70% Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640.
    9. Udokumentuj liczbę komórek na kriowial. Przenieść kriowiale do pojemnika do zamrażania z kontrolowaną szybkością i umieścić w temperaturze -80 °C na co najmniej 24 godziny, po czym kriofiale można przenieść do krioboxa i umieścić w zbiorniku ciekłego azotu (faza parowa) w celu długotrwałego przechowywania. Czas uruchomienia zamrażarki dokumentów.

4. Dzień 2 Konfiguracja

  1. Podgrzać podwielokrotność (220 μl na filtr) 0,1 mM EDTA wolnego od nukleaz w probówce bez nukleazy do temperatury 80 °C w bloku grzewczym.
  2. Przygotować roztwory płuczące 1 i 2 (patrz SI 2).

5. Dzień 2: Długoterminowe przechowywanie próbek i przetwarzanie filtrów leukocytów (3 godz.)

  1. przegląd.
    1. Tę procedurę należy wykonać w ciągu 6 miesięcy od nałożenia leukocytów na filtr.
      Uwaga: Ogólnie rzecz biorąc, przetwarzanie w dniu 2 trwa około 3 godzin i chociaż jest oznaczone jako "dzień 2", kluczowym wymaganiem jest to, aby część przetwarzania filtra została wykonana w dniu, w którym w laboratorium nie ma przetwarzania dnia 1.
  2. Długotrwałe przechowywanie próbki (15 min)
    1. Wykonuj tę procedurę codziennie, przed dostarczeniem nowych odkurzaczy do laboratorium w celu przetworzenia w dniu 1. Przenieś kriowialisty, które były przechowywane O/N w pojemnikach do zamrażania z kontrolowaną szybkością w dniu 1, do odpowiednio oznakowanych krioboxów i zwróć je do temperatury -80 ºC lub ciekłego azotu (faza parowa) w celu długotrwałego przechowywania. Uporządkuj kriowiale w oparciu o typ próbki (np. DNA, PBMC, RBC itp.), aby przyspieszyć śledzenie lokalizacji próbki do testów końcowych.
  3. Przetwarzanie filtrów RNA leukocytów (45 min).
    Uwaga: Więcej informacji na temat tej procedury można znaleźć w instrukcji producenta17.
    1. Doprowadź filtr do temperatury rynkowej (rozmrażanie około 5 min).
    2. Zdejmij osłonę i nakrętkę z filtra. Wycofać tłok strzykawki o pojemności 5 ml i podłączyć go do wlotu (rozszerzanego końca) filtra, wcisnąć tłok, aby usunąć środek stabilizujący RNA z otworów filtra do pojemnika na odpady biologiczne.
    3. Załadować nową strzykawkę o pojemności 5 ml 4 ml roztworu izotiocyjanianu fenolu i guanidyny do izolacji RNA i podłączyć ją do wlotu filtra, nacisnąć tłok, aby przepłukać roztwór przez filtr, zbierając lizat do oznakowanej stożkowej probówki o pojemności 15 ml (2 na uczestnika).
    4. Odłączyć strzykawkę od filtra, wycofać tłok, ponownie przymocować go do filtra i wcisnąć tłok, aby usunąć resztki próbki uwięzione w krążku filtra do tej samej stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Wyrzuć filtr i strzykawkę.
    5. Dodać 800 μl BCP do stożkowej probówki, szczelnie zamknąć probówkę i energicznie wstrząsać preparatem przez 30 sekund.
    6. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Wirować przez 10 minut przy 2 000 x g.
    7. Przenieś fazę wodną (górną) do świeżo oznakowanej stożkowej probówki o pojemności 15 ml (~2,5 ml).
    8. Dodaj 0,5-krotność objętości fazy wodnej wody wolnej od nukleaz i dobrze wymieszaj. Następnie dodaj 1,25 razy więcej niż objętość wody 100% etanolu i ponownie wymieszaj.
      Uwaga: Aby uzyskać objętość wodną 2,5 ml, dodaj 1,25 ml wody wolnej od nukleaz, wymieszaj, a następnie dodaj 4,7 ml 100% etanolu (2,5 ml x 0,5 = 1,25 ml wody wolnej od nukleazy, NASTĘPNIE 2,5 ml + 1,25 ml = 3,75 ml nowej objętości wodnej, NASTĘPNIE 3,75 ml x 1,25 = 4,7 ml 100% etanolu). Ten etap pozwala na wyizolowanie całkowitego RNA, który zawiera małą frakcję RNA. Metodę pomijania małych RNA w izolacji można znaleźć w instrukcji17.
    9. Wyjąć tłok ze strzykawki o pojemności 5 ml i w jego miejsce włożyć wkład wirowy. Podłączyć zespół wkładu/strzykawki do kolektora próżniowego. Aby zapewnić bezpieczniejsze połączenie z kolektorem próżniowym, umieść zestaw wkładu/strzykawki w probówce mikrowirówki o pojemności 1.5 ml z odciętym dnem.
    10. Powoli nakładaj próbkę z kroku 5.3.8 na wkład wirowy z włączonym podciśnieniem, ostrożnie dodając więcej próbki podczas przeciągania przez wkład.
      Uwaga: Jeśli nie ma próżni, patrz metoda wirowania na http://www.ambion.com/techlib/misc/leuko_iso.pdf.
    11. Przenieść wkład wirowy do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i dodać 750 μl roztworu Wash 1. Odwirować zespół wkładu wirowego/probówki przez 5 – 10 sekund przy 12 000 x g.
    12. Wyrzuć filtrat z probówki i włóż wkład wirowy z powrotem do tej samej probówki do mikrowirówki.
    13. Dodać 750 μl roztworu Wash 2 i odwirowywać wkład wirowy/probówkę przez 5 – 10 sekund przy 12 000 x g. Odrzucić filtrat jak w kroku 5.3.12. Włóż wkład wirowy z powrotem do tej samej probówki mikrowirówkowej.
    14. Powtórzyć z kolejnymi 750 μl roztworu Wash 2 i odwirować, jak w kroku 5.3.13. Odrzucić filtrat. Włóż wkład wirowy z powrotem do tej samej probówki mikrowirówkowej. Odwiruj wkład wirowy/rurkę z maksymalną prędkością przez 1 minutę, aby wysuszyć filtr.
    15. Przenieś wkład wirowy do świeżej, oznakowanej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 μl.
    16. Dodaj 200 μl wolnego od nukleaz 0,1 mM EDTA (podgrzanego do 80 °C) do środka filtra z wkładem wirowym (2 na uczestnika). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 minutę.
    17. Wirować przez 1 minutę przy 12 000 x g w celu elucji RNA. Zachować filtrat. Wyrzuć nabój wirowy.
    18. Podzielić każde 200 μl filtratu na dwie porcje po 100 μl do świeżych probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml, oznaczyć etykietą i przechowywać na lodzie. W tym momencie, zaczynając od 2 filtrów na uczestnika, otrzymasz cztery 100 μl porcji RNA na uczestnika.
  4. Leczenie DNazą (1 godz.)
    Uwaga: Więcej informacji na temat tego leczenia można znaleźć w protokole producenta18.
    1. Utwórz mieszaninę wzorcową, łącząc 10 μl buforu DNazy I i 2 μl rDNazy I na podwielokrotność + 1 (w celu uwzględnienia błędu pipetowania).
      Uwaga: Dla czterech próbek, 100 μl podwielokrotności używa 50 μl bufora DNazy I + 10 μl rDNazy I.
    2. Podwielokrotność 12 μl roztworu wzorcowego zmieszać w kroku 5.4.1 z każdą z podwielokrotności RNA z kroku 5.3.18 i delikatnie wymieszać. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut w bloku grzewczym.
    3. Odczynnik do inaktywacji DNazy należy przemieszać i dodać 11,2 μl do każdej podwielokrotności, dobrze wymieszać. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 minuty, wirując 2-3 razy podczas inkubacji.
    4. Wirować przy 10 000 x g przez 1,5 min.
    5. Przenieść supernatant (RNA) do świeżej probówki o pojemności 1,5 ml. W tym miejscu można łączyć podwielokrotności od tego samego uczestnika.
    6. Uruchom każdą próbkę na spektrofotometrze, aby uzyskać stężenie. Zaleca się analizę jakości RNA przy użyciu bioanalizatora (patrz krok 5.5).
    7. Podziel RNA na kriowiale zgodnie z potrzebami. Jeśli analiza bioanalizatora nie zostanie przeprowadzona natychmiast, należy przenieść 1,5 μl próbki do probówki mikrowirówkowej w celu późniejszej analizy. Udokumentuj stężenia i czas uruchomienia zamrażarki. Próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C.
  5. Analiza bioanalizatorem (1 godz.)
    1. Postępuj zgodnie z protokołem producenta19. Po zakończeniu przebiegu dane są automatycznie przechowywane, ale zapisz je ponownie pod mniejszą, bardziej rozpoznawalną nazwą pliku. Oczekiwane wyniki (ryc. 3): drabinka powinna mieć 6 pików, próbki powinny mieć 3 piki (2 piki rybosomalne odpowiednio po 44 sekundach i 50 sekundach oraz 1 pik wczesnego znacznika po 25 sekundach).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Kluczowe jest, aby cała procedura pozwalała na uzyskanie materiału wysokiej jakości do analiz w wielu zastosowaniach następczych, w tym do badania ekspresji genów za pomocą mikromacierzy i analizy RT-PCR, wykrywania modyfikacji epigenetycznych oraz zmienności podzbiorów komórek. Tabela 1 przedstawia średnią wydajność i jakość materiałów uzyskanych z każdego z procesów. Rysunek 3 prezentuje przykład jakości materiału uzyskanego metodami izolacji RNA z leukocytów oraz przetwarzania filtr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisaliśmy uproszczony protokół, który został z powodzeniem zastosowany do przetwarzania ponad 1600 próbek krwi pełnej w Detroit Neighborhood Health Study. Chociaż wiele z tych technik jest dostępnych w istniejącej literaturze, nasza kompilacja krok po kroku, obejmująca precyzyjnie określone w czasie zmiany między każdym krokiem, odzwierciedla zoptymalizowany, wydajny protokół, który z powodzeniem wytwarza różnorodne próbki biologiczne o szerokim zakresie dalszych zastosowań, w tym metylacji DNA, ekspresji mRNA i analizi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają sprzecznych interesów.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Henriette Mair-Meijers za nieocenioną dbałość o szczegóły i godziny poświęcone na przetwarzanie pobrań krwi. Jesteśmy wdzięczni za doświadczenie w projektowaniu graficznym Natalie Jameson Kiesling. Doceniamy również zgodę producentów (Qiagen (Walencja, Kalifornia), BD Biosciences (San Jose, Kalifornia), Life Technologies (Grand Island, NY)) wymienionych w niniejszym dokumencie na publikowanie zastosowań ich produktów zgodnie z opisem. Fundusze na tę pracę zostały hojnie zapewnione przez National Institutes of Health o numerach nagród DA022720, RC1MH088283 i DA022720-05-S1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
QIAamp DNA Blood Mini KitQiagen51104Dzień 1: Izolacja DNA
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)SigmaP5493-1LDzień 1: Izolacja PBMC
5 i frac34; ” Pipety PasteuraFisher13-678-6ADzień 1: Izolacja PBMC
Płodowa surowica bydlęca (FBS), inaktywowana termicznieLife Technologies10082147Dzień 1: Izolacja PBMC
Dimetylosulfotlenek (DMSO)SigmaD8418-500mlDzień 1: Izolacja PBMC
RPMI Medium 1640, płynInvitrogen11875119Dzień 1: Izolacja PBMC
0,4% plama błękitu trypanowego InvitrogenT10282Dzień 1: Izolacja PBMC
Komora do liczenia komórek hrabinyInvitrogenC10283Dzień 1: Izolacja PBMC
Hrabina Automatyczny licznik komórek lub urządzenie do liczenia komórek, takie jak mikroskop i hemocytometrInvitrogenC10281Dzień 1: Izolacja PBMC
Frakcjonowanie i LeukoLOCK Zestaw stabilizacyjny Ambion1933Dzień 1: Izolacja RNA leukocytów
25  G x 5/8 cala igłyBecton Dickinson305122do izolacji RNA leukocytów
(5  ml)Becton Dickinson309646Dzień 1 i 2: Roztwór do lizy denaturacyjnej izolacji RNA leukocytów
 Ambion8540GDzień 2: Izolacja RNA leukocytów
5  M NaClLife Technologies24740011Dzień 2: Izolacja RNA leukocytów
Odczynnik TRIAmbion9738Dzień 2: Izolacja RNA leukocytów
Bromo-3-chloro-propan (BCP)SigmaB-9673do izolacji RNA leukocytów
 Ambion10051GDzień 2: Izolacja RNA leukocytów
0,1  mM EDTAAmbion9912Dzień 2: Zestaw do izolacji RNA leukocytów
bez DNAAmbionAM1960Dzień 2: Drabina RNA 6000 do pomiaru DNazy
 Agilent5067-1529Dzień 2: Zestaw do analizy bioanalizatora
RNA 6000 Nano Series II Agilent5067-1511Dzień 2: Analiza bioanalizatorem
RNaseZAPAmbionAM8782Dzień 2: Analiza bioanalizatorem
Etanol >99%SigmaE7023-500ml
Izopropanol >99% SigmaI9516-500ml
Ultra czysta woda bez nukleaz Invitrogen9938
Końcówki do pipet (bez nukleazy)Eppendorf22491253
Pipeter (serologiczny)Eppendorf2223020-4
Pipety (do objętości poniżej 1  ml)Eppendorf3120000-054
Pipety (serologiczne)Fisher13-678-27E
Pojemniki do zamrażania z kontrolowaną szybkościąNalgene5100-0001
Cryoboxy (do 2  ml oraz 5  ml kriowialiów i 1,5  ml probówki do mikrowirówek)Fisher03-395-464
Stojak na probówkiThermo Scientific14-804-134
15  ml rurki polipropylenoweFisher14-959-49D
1,5  ml i 0,65 probówki do mikrowirówekFisher07-200-534 i 07-200-185
2  ml oraz 5  ml kriowialeFisher10-500-26 i 10-269-88F 
8  ml CPT vacutainerBD Biosciences3627612 probówki
6  ml K2 Vacutainer EDTABD Biosciences3678632 probówki
8,5  ml SST vacutainerBD Biosciences3679881 probówka
VortexerFisher2215365
Inkubator do suchej kąpieli z blokiem grzewczym do probówek do mikrowirówekFisher11-715-1250
System filtracji/próżni do stosowania w okapie do hodowli komórkowychFisher01-257-87
Wirnik o stałym kącie nachylenia do probówek do mikrowirówek z pokrywąszczelną na aerozolEppendorf22637002
Wirówka z chłodzeniem z obracanym wirnikiem kubełkowym i nasadkami aerozolowymi do 16 x 125  mm vacutainery i 15  ml probówki polipropylenoweEppendorf226281572, nie trzeba przechowywać w lodówce
Nanodrop 2000 (zalecane do dokładności małych objętości) lub innego urządzenia spektrofotometrycznegoFisher13-400-411
Bioanalizator AgilentAgilent TechnologiesG2940CA
Zbiornik ciekłego azotuThermo Scientific11-676-56
Pojemnik na ostre przedmiotyFisher22-037-970
Pojemnik na odpady biologiczneThermo Scientific1223P52
Poziom bezpieczeństwa biologicznego 2  certyfikowany kaptur do hodowli komórkowychThermo Scientific13-261-315
Dzień 1: Strzykawki Dzień 2: Wkłady wirowe

Bibliografia

  1. Hernandez, M. E., Martinez-Fong, D., Perez-Tapia, M., Estrada-Garcia, I., Estrada-Parra, S., Pavon, L. Evaluation of the effect of selective serotonin-reuptake inhibitors on lymphocyte subsets in patients with a major depressive disorder. Eur Neuropsychopharmacol. 20, 88-95 (2010).
  2. Weigelt, K., et al. TREM-1 and DAP12 expression in monocytes of patients with severe psychiatric disorders EGR3, ATF3 and PU.1 as important transcription factors. Brain Behav Immun. 25, 1162-1169 (2011).
  3. Robertson, M. J., et al. Lymphocyte subset differences in patients with chronic fatigue syndrome, multiple sclerosis and major depression. Clin Exp Immunol. 141, 326-332 (2005).
  4. Rotter, A., Asemann, R., Decker, A., Kornhuber, J., Biermann, T. Orexin expression and promoter-methylation in peripheral blood of patients suffering from major depressive disorder. J Affect Disord. 131, 186-192 (2011).
  5. Klengel, T., et al. Allele-specific FKBP5 DNA demethylation mediates gene-childhood trauma interactions. Nat Neurosci. 16, 33-41 (2013).
  6. Segman, R. H., Shefi, N., Goltser-Dubner, T., Friedman, N., Kaminski, N., Shalev, A. Y. Peripheral blood mononuclear cell gene expression profiles identify emergent post-traumatic stress disorder among trauma survivors. Mol Psychiatry. 10, 500-513 (2005).
  7. Smith, B. H., et al. Cohort Profile: Generation Scotland: Scottish Family Health Study (GS:SFHS). The study, its participants and their potential for genetic research on health and illness. Int J Epidemiol. 42, 689-700 (2013).
  8. Mallone, R., et al. Isolation and preservation of peripheral blood mononuclear cells for analysis of islet antigen-reactive T cell responses: position statement of the T-Cell Workshop Committee of the Immunology of Diabetes Society. Clin Exp Immunol. 163, 33-49 (2011).
  9. Duvigneau, J. C., Hartl, R. T., Teinfalt, M., Gemeiner, M. Delay in processing porcine whole blood affects cytokine expression. J Immunol Methods. 272, 11-21 (2003).
  10. Debey, S., et al. Comparison of different isolation techniques prior gene expression profiling of blood derived cells: impact on physiological responses, on overall expression and the role of different cell types. Pharmacogenomics J. 4, 193-207 (2004).
  11. Uddin, M., et al. Epigenetic and immune function profiles associated with posttraumatic stress disorder. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 9470-9475 (2010).
  12. Kessler, R. C., Wang, P. S. The descriptive epidemiology of commonly occurring mental disorders in the United States. Annu Rev Public Health. 29, 115-129 (2008).
  13. Qiagen. QIAamp® DNA Mini and Blood Mini Handbook. , Valencia, California, USA. Available from: https://www.qiagen.com/us/resources/resourcedetail?id=67893a91-946f-49b5-8033-394fa5d752ea (2010).
  14. Thermo Scientific. NanoDrop 1000 Spectrophotometer. , Waltham, Massachusetts, USA. Available from: http://www.nanodrop.com/Library/nd-1000-v3.8-users-manual-8 (2010).
  15. Life Technologies. LeukoLOCK™ Total RNA Isolation System. , Grand Island, New York, USA. Available from: http://www.ambion.com/techlib/misc/leuko_iso.pdf (2011).
  16. Life Technologies. Countess™ Automated Cell Counter. , Grand Island, New York, USA. Available from: http://www.lifetechnologies.com/content/dam/LifeTech/migration/files/cell-analysis/pdfs.par.5257.file.dat/mp10227-countess (2009).
  17. Life Technologies. Alternative Protocol for Extraction of RNA from Cells Captured on LeukoLOCK™ Filters Using TRI Reagent®. , Grand Island, New York, USA. Available from: http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/protocols/nucleic-acid-purification-and-analysis/rna-protocol/alternative-protocol-extraction-of-rna-from-cells-captured-on-leukolock-filters-using-tri-reagent.html (2011).
  18. Life Technologies. DNA-free™ Kit. , Grand Island, New York, USA. Available from: http://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/cms_055739.pdf (2012).
  19. Agilent Technologies. Agilent RNA 6000 Nano Kit Guide. , Santa Clara, California, USA. Available from: http://www.genomics.agilent.com/files/Manual/G2938-90034_KitRNA6000Nano_ebook.pdf (2006).
  20. Koenen, K. C., et al. SLC6A4 methylation modifies the effect of the number of traumatic events on risk for posttraumatic stress disorder. Depress Anxiety. 28, 639-647 (2011).
  21. Walsh, K., Uddin, M., Soliven, R., Wildman, D. E., Bradley, B. Associations between the SS variant of 5-HTTLPR and PTSD among adults with histories of childhood emotional abuse: Results from two African American independent samples. J Affect Disord. 161, 91-96 (2014).
  22. Bustamante, A. C., et al. Childhood maltreatment is associated with epigenetic differences in hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis genes in the Detroit Neighborhood Health Study. American Association of Physical Anthropologists 82nd Annual Meeting, Knoxville, TN, , Comprehensive Psychiatry. (2013).
  23. Sipahi, L., et al. Longitudinal epigenetic variation of DNA methyltransferase genes is associated with vulnerability to post-traumatic stress disorder. Psychol Med. 44, 3165-3179 (2014).
  24. Uddin, M., Koenen, K. C., Aiello, A. E., Wildman, D., de los Santos, R., Galea, S. Epigenetic and inflammatory marker profiles associated with depression in a community-based epidemiologic sample. Psychol Med. 41, 997-1007 (2011).
  25. Uddin, M., et al. Post-traumatic stress disorder is associated with immunosenescent T cell phenotypes in the Detroit Neighborhood Health Study. 3rd North American Congress of Epidemiology, Montreal, QC, , (2011).
  26. Uddin, M., et al. Post-traumatic stress disorder is associated with immunosenescent T cell phenotypes in the Detroit Neighborhood Health Study. 101st Annual Conference of the American Psychopathological Association, New York, NY, , (2011).
  27. Uddin, M. Biological signatures of post-traumatic stress disorder in the Detroit Neighborhood Health Study. 9th International Conference on Urban Health, New York Academy of Medicine, , (2010).
  28. Aiello, A. E. Cytomegalovirus antibodies as a marker of immunosenescence in the Detroit Neighborhood Health Study. 9th International Conference on Urban Health, New York Academy of Medicine, , (2010).
  29. Bustamante, A. C., et al. Distinct gene expression profiles characterize lifetime PTSD and childhood maltreatment in the Detroit Neighborhood Health Study. , International Society for Traumatic Stress Studies. Philadelphia, PA. (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Obr bka krwi pe nejmononuklearne kom rki krwi obwodowejizolacja DNAizolacja RNAizolacja surowicyseparacja osoczapobieranie erytrocyt wanaliza cytometrycznarodowisko pozaklinicznepobieranie pr bek w spo eczno ciach lokalnych

Powiązane artykuły