Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Postępowanie ze szczurem bawełnianym w badaniach nad oceną przedkliniczną wirusów onkolitycznych

9.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52232

⸱

24 listopada 2014

 ,  , 
1Department of Pathology and Molecular Medicine, McMaster Immunology Research Centre, Institute for Infectious Disease Research, McMaster University

W tym artykule

Podsumowanie

Szczury bawełniane są niezwykle pobudliwe i mają silną reakcję ucieczki lub walki. Opisano metodę postępowania zoptymalizowaną w celu zmniejszenia stresu u zwierząt, która sprawi, że szczury bawełniane będą bardziej dostępne jako model przedkliniczny.

Streszczenie

Wirusy onkolityczne to nowatorska terapia przeciwnowotworowa z możliwością celowania w komórki nowotworowe, pozostawiając zdrowe komórki nietknięte. Aby ta strategia była skuteczna, ostatnie badania wykazały, że niezbędne jest zaangażowanie układu odpornościowego gospodarza. Dlatego wirusoterapia onkoliczna powinna być oceniana w kontekście modelu immunokompetentnego. Co więcej, badanie terapii przeciwnowotworowych w tolerowanych modelach zwierzęcych może lepiej podsumować wyniki obserwowane w badaniach klinicznych. Szczury bawełniane, powszechnie używane do badania wirusów układu oddechowego, są atrakcyjnym modelem do badania wirusoterapii onkolitycznej, ponieważ syngeniczne modele raka sutka i kostniakomięsaka są dobrze znane. Brakuje jednak opublikowanych informacji na temat właściwej procedury postępowania z tymi wysoce pobudliwymi gryzoniami. Przedstawione podejście do obchodzenia się i chwytania minimalizuje stres zwierząt, aby ułatwić eksperymenty. Technika ta opiera się na zdolności badacza do zachowania spokoju podczas obchodzenia się z nią i wykonywania procedur w odpowiednim czasie. Na koniec opisujemy, jak przygotować komórki guza sutka szczura bawełnianego do konsekwentnego tworzenia guza podskórnego oraz jak wykonywać zastrzyki donowotworowe i dootrzewnowe. Metody te mogą być stosowane w szerokim zakresie badań przyczyniających się do rozwoju szczura bawełnianego jako odpowiedniego modelu przedklinicznego do badania terapii przeciwnowotworowej.

Wprowadzenie

Wirusy onkolityczne (OV) selektywnie replikują się w komórkach nowotworowych, wykorzystując różnice biochemiczne między komórkami normalnymi a nowotworowymi 1,2. Istnieją dwa rodzaje OV: te, które nie wymagają mutacji w celu osiągnięcia selektywnej onkolizy, określane jako naturalnie występujące wirusy typu dzikiego oraz te, które muszą zostać zmodyfikowane, aby osiągnąć selektywną onkolizę. Zbiór mutacji w obrębie danego typu nowotworu określa charakter selektywnej przewagi wzrostu nad normalnymi komórkami dla OV 2. Bezpieczeństwo i korzyści płynące ze stosowania OV wykazano w badaniach klinicznych 3-7. Pomimo postępów w dziedzinie wirusoterapii onkolitycznej istnieją luki między wynikami przedklinicznymi i klinicznymi, co sugeruje, że potrzebne są lepsze modele do oceny skuteczności przeciwnowotworowej OV.

Herpeswirus bydlęcy typu 1 (BHV-1) należy do rodziny Herpesviridae i podrodziny Alphaherpesviridae. BHV-1 inicjuje kompleks chorób układu oddechowego bydła u bydła, objawiający się szeroką gamą objawów przypominających silne przeziębienie 8,9. BHV-1 wiąże receptory przyłączeniowe i wnikowe używane przez HSV-1, takie jak siarczan heparanu i nektyna-1 10. Jednak wiąże CD155 w miejsce nektyny-2 10. BHV-1 ma bardzo wąski zakres gospodarzy, tak że nie jest w stanie skutecznie wejść i zainicjować replikacji w normalnych i przekształconych komórkach myszy 3,4,10. To sprawia, że korzystanie z konwencjonalnych modeli mysich jest problematyczne. Zdolność onkolityczną BHV-1 wykazano in vitro11,12. Wykazano, że BHV-1 inicjuje replikację i zabija ludzkie komórki nowotworowe o różnym pochodzeniu histologicznym, w tym komórki raka piersi i komórki inicjujące raka piersi 11,12. Jednak zdolność przeciwnowotworowa BHV-1 musi być oceniana in vivo w kontekście immunokompetentnego gospodarza.

Układ odpornościowy gospodarza został zidentyfikowany jako najbardziej wpływowy mechanizm, za pomocą którego OV wywołują śmierć komórek nowotworowych 19. Odpowiedzi przeciwnowotworowe między tolerowanymi i nietolerowanymi modelami antygenu związanego z nowotworem (TAA) różnią się i mogą mieć duży wpływ na powodzenie terapii OV. HSV-1 OV KM100 (ICP0n212VP16w181420)20,21 wywołał regresję guza u 80% myszy z guzem w mysim modelu raka sutka z antygenem Polyoma Middle T 22. Jednak w modelach HER-2 / neu skuteczność przeciwnowotworowa KM100 wahała się między 20% całkowitą regresją u myszy syngenicznych a zastojem guza u transgenicznych myszy tolerowanych przez HER2. Łącznie dane te podkreślają znaczenie pełnej oceny OV przy użyciu modeli zwierzęcych, które najlepiej oddają ludzki krajobraz immunologiczny, aby w pełni zrozumieć, jakie cechy decydują o sukcesie terapeutycznym.

Szczur bawełniany (Sigmodon hispidus), pochodzący z Ameryki Północnej i Południowej, jest najczęściej używany jako model infekcji wirusem syncytialnym układu oddechowego (jak omówiono w punkcie 5). Szczury bawełniane są również wykorzystywane w badaniach nad szczepionkami anty-BHV-1, ponieważ podsumowują patologię związaną z zespołem chorób układu oddechowego bydła 6,23. Ponadto zakażenie BHV-1 szczurów bawełnianych ma charakter immunogenny, wywołując utrzymującą się odpowiedź immunologiczną śluzówki i układu pokarmowego 6,23-25. Linie komórkowe wyprowadzono z samoistnego włókniakomięsaka i kostniakomięsaka gruczołu sutkowego (LCRT) i kości (CCRT i VCRT) odpowiednio 26. Szczury bawełniane wykorzystano do oceny skuteczności in vivo onkolitycznych wektorów Az, ponieważ są one podatne na zakażenie Ad i wykazują podobną patologię jak ludzie 27-29. Wykorzystanie modeli z obniżoną odpornością do przedklinicznej oceny OV nie tylko mniej wskazuje na odpowiedź kliniczną na terapię, ale także nie uwzględnia roli układu odpornościowego w wirusoterapii onkolitycznej 30,31. W związku z tym syngeniczne i tolerowane przez nowotwory szczurze modele raka sutka i kostniakomięsaka są odpowiednimi modelami do oceny przedklinicznej skuteczności OV, takich jak BHV-1 i AD, których nie można badać przy użyciu konwencjonalnych modeli mysich.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Użyte protokoły zostały zatwierdzone przez naszą instytucjonalną Radę Etyki Badań nad Zwierzętami na Uniwersytecie McMaster zgodnie z wytycznymi Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami. Eksperymenty przeprowadzono w McMaster University Central Animal Facility.

1. Hodowla komórek LCRT

  1. Hodowla komórek LCRT w zmodyfikowanym pożywce Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełniona 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 2 mM L-glutaminy, 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny. Utrzymać komórki w kolbach do hodowli tkankowych T-150 w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Komórki pasażowe, gdy tworzą 90% zlewającą się monowarstwę (co 2-3 dni, ryc. 1).
  2. Podgrzej 1x sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), 1x trypsynę i pożywkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 10 minut przed podziałem komórek.
  3. Odessać pożywkę z kolby i przepłukać komórki 5 ml 1x PBS.
  4. Po wypłukaniu odessać PBS i inkubować komórki z 2 ml 1x trypsyny, aż komórki oddzielą się od kolby (~2 min).
  5. Zawiesić komórki w pożywce o objętości 8 ml (w sumie 10 ml zawiesiny komórek) i delikatnie pipetować w górę i w dół, aby rozbić zlepki komórek.
  6. Utrzymać komórki w kolbie T-150, wysiewając 1 ml zawiesiny komórek do 24 ml pożywki (w sumie 25 ml na T-150) i delikatnie rozdrabniając kolbę z boku na bok. Utrzymuj komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 do następnego podziału.

2. Ocena replikacji wirusa i cytotoksyczności w komórkach LCRT

  1. Replikacja wirusa
    UWAGA: Konstrukty wirusa wykazujące ekspresję znacznika fluorescencyjnego, takiego jak białko zielonej fluorescencji (GFP), pod kontrolą endogennych promotorów wirusowych ułatwiają wizualizację infekcji wirusowej i rozprzestrzenianie się za pomocą czytników płytek fluorescencyjnych.
    1. Umieść komórki LCRT na płytkach hodowlanych, pozostawiając studzienkę do liczenia. Komórki nasienne tak, że dzień później będą zlewać się w 80-90%. Użyj stężenia 10-5 komórek/ml (100 μl na studzienkę), aby uzyskać pożądane zbieganie dzień później w 96-dołkowych płytkach o płaskim dnie.
    2. Następnego dnia przed rozpoczęciem eksperymentu podgrzej 1x PBS, 1x trypsynę, kompletną i bezsurowicę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 10 minut.
    3. Odessać pożywkę ze studzienki liczącej i przepłukać komórki 5 ml 1x PBS, kołysząc ją po powierzchni studzienki.
    4. Po wypłukaniu odessać PBS i inkubować komórki z 2 ml 1x trypsyny, aż komórki oddzielą się od kolby (~2 min).
    5. Ponownie zawiesić komórki w odpowiedniej objętości kompletnego podłoża, aby uzyskać gęstość komórek w policzalnym zakresie za pomocą hemocytometru. Aby zapewnić dokładną liczbę komórek, dokładnie wymieszaj zawiesinę komórek przed zaszczepieniem hemocytometru, pipetując w górę iw dół.
    6. Określić objętość zapasu wirusa wymaganą do zakażenia przy pożądanej wielokrotności infekcji (MOI).
      Wymagane jednostki formowania paque (pfu) = liczba posianych komórek * MOI (pfu/komórka)
      Wymagana ilość wirusa = wymagane miano pfu / wirusa (pfu/ml)
    7. Przygotować inokulum wirusa w pożywce wolnej od surowicy w probówkach. Dokładnie wymieszać przez wirowanie lub pipetowanie przed dodaniem inokulum do komórek.
    8. Infekować komórki przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, po czym nałożyć nakładkę konserwacyjną DMEM + 1% FBS.
    9. Skanuj płytki jeden i dwa dni po infekcji (pi), aby uwidocznić fluorescencję GFP.
  2. Cytotoksyczność wirusa
    UWAGA: Przeprowadzić test cytotoksyczności resazuryny w warunkach słabego oświetlenia, ponieważ związek jest światłoczuły. W celu skorygowania fluorescencji tła należy dołączyć tylko dobrze zawierającą pożywkę.
    1. Przygotować 5% (v/v) roztwór rezazuryny w 1x PBS. Wymieszać roztwór, pipetując.
    2. Odessać pożywkę z komórek i zastosować 5% roztwór rezazuryny. Dołącz studzienkę zawierającą pożywkę tylko w celu skorygowania fluorescencji tła.
    3. Inkubować komórki przez 30 minut w temperaturze 37 °C, po czym odczytać fluorescencję za pomocą czytnika płytek fluorescencyjnych (wzbudzenie 530 nm, emisja 595 nm).
    4. Analizuj dane względem niezainfekowanych kontroli, korygując fluorescencję tła.

3. Zakwaterowanie i obsługa

  1. Zakwaterowanie i dieta
    1. Szczury bawełniane trzymają się w domu indywidualnie, aby zmniejszyć walkę wewnętrzną w klatkach dla szczurów z poliwęglanu zawierających ściółkę dla gryzoni (ściółka z kolb kukurydzy 1/8 cala), odcinek rurki PVC nie dłuższy niż 8 cali i gniazda jako wzbogacenie (ryc. 2).
    2. Użyj zabezpieczonego stalowego kosza, aby usiąść nad klatką i przechowywać karmę dla gryzoni oraz butelkę z wodą.
      UWAGA: Ta konfiguracja klatki pozwoli na bezpieczne i łatwe chwytanie zwierząt, przy czym umieszczenie rurki wzbogacającej na końcu klatki ma ogromne znaczenie.
  2. przeładunek
    1. Z bawełnianymi szczurami należy obchodzić się rano, przed obchodami przez techników z obiektu dla zwierząt, aby uniknąć ich podniecenia przed zabiegiem.
    2. Podczas wszystkich zabiegów noś grube skórzane rękawice dla ochrony.
    3. Ponieważ zwierzęta pozostają głównie w probówkach wzbogacających, należy ich użyć do przeniesienia szczurów do nowej klatki podczas rutynowego czyszczenia. Alternatywnie, lekko otwórz klatkę, aby przewodnik mógł sięgnąć ręką do środka, zwierzę można następnie przytrzymać, ściskając skórę tuż nad ramionami i naciskając w dół. Zachowaj ostrożność, aby nie używać nadmiernej siły, ponieważ zwierzę może ugryźć się w język.
    4. Bądź cierpliwy i używaj pewnej ręki, ponieważ zwierzęta mają silną reakcję ucieczki lub walki i będą starały się uniknąć schwytania, biegnąc i wyskakując z klatki. Co ważne, nie należy dotykać zwierząt za ogon, ponieważ spowoduje to odłupanie.
    5. Uwięzić zwierzęta w probówkach urozmaicających, a nie podczas bezpośredniego przenoszenia. To drastycznie zmniejsza obrażenia i ucieczki.

4. Wychwyt i znieczulenie

  1. schwytać
    1. Noś grube skórzane rękawice dla ochrony podczas wszystkich zabiegów.
    2. Użyj dużego przezroczystego pojemnika z tworzywa sztucznego z otworami na powietrze i pokrywką, komory indukcyjnej do znieczulenia wystarczająco dużej, aby zmieścić się w pojemniku, oraz stożka nosowego zamontowanego na wężu doprowadzającym gaz (rysunek 3).
    3. Pracuj w parach, aby zabieg był bardziej efektywny i aby skrócić czas ekspozycji zwierząt na izofluran, wziewny środek znieczulający. Upewnij się, że jeden badacz jest odpowiedzialny za otwarcie i wymianę stalowej pokrywy klatki i pokrywy komory indukcyjnej (przewodnik #1), a jego współpracownik jest odpowiedzialny za złapanie zwierzęcia w rurze i transport do komory indukcyjnej (przewodnik #2).
    4. Umieść klatkę na płaskiej powierzchni i zdejmij zewnętrzną pokrywę. Lekko podnieś stalową tacę podającą i powoli manewruj rurką wzbogacającą tak, aby była równoległa do boków klatki i do tyłu. Jeśli to konieczne, użyj przedmiotu do manewrowania rurką wzbogacającą bez otwierania klatki, aby uniknąć podrażnienia zwierzęcia (przewodnik #1).
    5. Jeśli zwierzę stanie się pobudzone i opuści rurkę, należy odczekać odpowiedni czas, aby zwierzę się zrelaksowało i ponownie usadowiło się w rurze (przewodnik #1).
    6. Powoli i celowo podnieś krawędź stalowej pokrywy jak najdalej od rurki wzbogacającej, utrzymując drugi koniec w kontakcie z klatką. Zrób wystarczająco dużą przestrzeń na plastikowy pojemnik (handler #2).
    7. Jednym płynnym, szybkim ruchem wypchnij plastikowy pojemnik na rurkę wzbogacającą. Utrzymuj kontakt pojemnika z bokiem klatki, zatrzymując zwierzę w tubie. Wykonaj kroki 4.1.6 i 4.1.7 tak szybko, jak to możliwe (procedura obsługi #2).
    8. Wyjmij stalową tacę podającą i oddaj plastikową pokrywę pojemnika do obsługi #2 (obsługi #1). Wsuń plastikową pokrywę między bok klatki a pojemnik, zwracając uwagę na przydatki uwięzionego zwierzęcia. Nie zamykaj pojemnika, ponieważ utrudni to następny krok (handler #2).
  2. znieczulenie
    1. Upewnij się, że pojemnik pozostaje zamknięty i przetransportuj zwierzę do komory indukcyjnej. Szybko umieść zwierzę w komorze i zdejmij pokrywę pojemnika jednym płynnym ruchem (przewodnik #2). Otwórz i natychmiast załóż pokrywę komory indukcyjnej (uchwyt #1).
    2. Włączyć dopływ izofluranu do komory indukcyjnej (5 l/min) i monitorować zwierzę pod kątem oznak letargu, w którym to momencie szybko wysuń zwierzę z rurki i pojemnika, wyjmując je z komory indukcyjnej, aby ułatwić cyrkulację gazu.
    3. Gdy szczur jest w pełni znieczulony, przenieś go na powierzchnię roboczą i umieść nos i usta w stożku nosa (ryc. 3). Szczur jest w pełni znieczulony, gdy nie reaguje na silne szczypanie palca u nogi.
    4. Umieść maść okulistyczną vet petrolatum na oczach zwierzęcia, aby zapobiec wysuszeniu i otarciom. Jest to niezbędny krok, ponieważ szczury bawełniane mają duże oczy, które mogą być podatne na infekcje w przypadku urazu.
    5. Uważnie monitoruj i utrzymuj stałą częstość oddechów oraz upewnij się, że nos zwierzęcia pozostaje w stożku nosowym przez cały czas trwania zabiegu. Odpowiednio dostosować szybkość przepływu izofluranu. Ilość izofluranu potrzebna do znieczulenia każdego zwierzęcia będzie się różnić.
    6. Po zabiegu należy umieścić zwierzę z powrotem w klatce i upewnić się, że odzyska pełną ruchomość i leżący mostek.

5. Przygotowanie komórek LCRT do podskórnego tworzenia guza

UWAGA: Jedna kolba T-150 LCRT (90% konfluencji) daje około 2 x 107 komórek. Oprzyj wymaganą liczbę kolb T-150 na całkowitej liczbie potrzebnych komórek. Wysiewać dodatkowe kolby, aby zapewnić uzyskanie całkowitej wymaganej liczby komórek i pomieścić komórki utracone podczas przygotowywania oraz te, które są potrzebne do dodatkowych wstrzyknięć. Utrzymuj komórki na lodzie, gdy tylko jest to możliwe, aby przedłużyć ich żywotność.

  1. W celu pobrania komórek należy odessać pożywkę z kolby i przepłukać komórki 5 ml 1x PBS.
  2. Odessać PBS i inkubować komórki z 2 ml 1x trypsyny, aż komórki oddzielą się od kolby (~2 min).
  3. Zawiesić komórki w pożywce o objętości 8 ml (w sumie 10 ml zawiesiny komórek) i delikatnie pipetować w górę i w dół, aby rozbić zlepki komórek. Kontynuuj pobieranie komórek z dodatkowych kolb.
  4. Zebrać wszystkie zawiesiny komórek w jednej stożkowej probówce, około 4 T-150 na 50 ml stożkowej probówki.
  5. Odwirować probówkę o sile 160 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  6. Odessać pożywkę i ponownie zawiesić osad komórkowy w odpowiedniej objętości PBS (10 ml PBS na T-150), aby uzyskać gęstość komórek w policzalnym zakresie za pomocą hemocytometru. Aby zapewnić dokładną liczbę komórek, dokładnie wymieszaj zawiesinę komórek przed załadowaniem hemocytometru, pipetując w górę iw dół.
  7. Oblicz całkowitą liczbę komórek:
    Całkowita liczba pobranych komórek = liczba komórek (komórki/ml) x objętość reprodukcji (ml)
  8. Należy określić objętość zawiesiny komórek wymaganą do wszystkich wstrzyknięć. Zrób 2-3 dodatkowe dawki na eksperyment. W sumie 5 x 105 komórek LCRT wstrzykniętych podskórnie utworzy wyczuwalne guzy w ciągu 3-4 dni.
    Całkowita wymagana liczba komórek = 5 x 105 komórek x całkowita liczba dawek
    Wymagana zawiesina komórek objętościowych (ml) = (całkowita wymagana liczba komórek * suma objętości wstrzyknięć) / (całkowita liczba pobranych komórek)
  9. Odpipetować wymaganą objętość zawiesiny komórkowej do stożkowej probówki zawierającej PBS i dokładnie wymieszać. Porcje pojedynczych wstrzyknięć (100 μl) do probówek Eppendorfa. Utrzymuj rurki na lodzie podczas procedury wstrzykiwania.

6. Zastrzyki

UWAGA: Wykonuj procedury z dwoma badaczami, jeden do wykonywania zastrzyków, podczas gdy drugi monitoruje tempo oddychania zwierzęcia i ogólny stan podczas znieczulenia. Do wszystkich wstrzyknięć należy używać strzykawek insulinowych (29 G x 1/2', 0,3 ml) oraz nowej igły dla każdego zwierzęcia.

  1. Iniekcje podskórne
    1. Schwytać i znieczulić zwierzę (punkt 4).
    2. Ogolić miejsce wstrzyknięcia za pomocą maszynki do strzyżenia. Bawełniane futro szczura jest grube i wymaga ostrego trymera, aby uzyskać gładką powierzchnię do wstrzykiwań. Oczyść miejsce wstrzyknięcia 70% etanolem za pomocą bawełnianego wacika i pozwól mu całkowicie odparować przed kontynuowaniem.
    3. Naładować strzykawki (29 G x 1/2', 0,3 ml) komórkami, powoli i równomiernie. Jeśli widoczne są pęcherzyki, należy przesunąć strzykawkę z pewną siłą. Gdy bąbelki znajdą się na górze, naciskaj tłok, aż płyn znajdzie się na górze igły.
    4. Unieść skórę w miejscu wstrzyknięcia (tzw. naciągnięcie skóry) i wprowadzić igłę skośnie do góry. Upewnij się, że igła swobodnie przesuwa się pod skórą, aby uniknąć wstrzykiwania domięśniowego.
    5. Zawartość strzykawki należy usunąć równomiernie i powoli. Wycofać igłę skośną stroną do dołu.
  2. Iniekcje donowotworowe
    1. Schwytać i znieczulić zwierzę (punkt 4).
    2. Oczyść miejsce wstrzyknięcia 70% etanolem za pomocą bawełnianego wacika i pozwól mu całkowicie odparować przed kontynuowaniem.
    3. Załadować strzykawki (29 G x 1/2', 0,3 ml) inokulum wirusa, powoli i równomiernie, trzymając igłę w pozycji pionowej. Jeśli widoczne są pęcherzyki, należy przesunąć strzykawkę z pewną siłą. Gdy bąbelki znajdą się na górze, naciskaj, a następnie tłok, aż płyn znajdzie się na górze igły.
    4. Wprowadzić igłę skośną stroną do góry do guza i równomiernie i powoli wydalić zawartość strzykawki, przesuwając igłę w kształcie wachlarza, częściowo wycofując igłę przed każdym ruchem, aby zapobiec skaleczeniu guza. Wycofać igłę skośną stroną do dołu.
      UWAGA: Podskórne guzy LCRT szybko rosną, osiągając około 100 mm3 w ciągu 5-7 dni. Ponadto ośrodki martwicze i krwotoczne często tworzą się na powierzchni guza w ciągu kilku dni i wymagają starannego monitorowania (ryc. 4).
  3. Iniekcje dootrzewnowe
    1. Schwytać i znieczulić zwierzę (punkt 4).
    2. Oczyść miejsce wstrzyknięcia 70% etanolem za pomocą bawełnianych wacików i pozwól mu całkowicie odparować przed kontynuowaniem.
    3. Naładować strzykawki (29 G x 1/2', 0,3 ml) lekiem, powoli i równomiernie. Jeśli widoczne są pęcherzyki, należy przesunąć strzykawkę z pewną siłą. Gdy bąbelki znajdą się na górze, naciskaj, a następnie tłok, aż płyn znajdzie się na górze igły.
    4. Wbić igłę w prawy dolny kwadrant brzucha. Pociągnąć tłok do tyłu, aby upewnić się, że krew lub kał nie są zasysane, co wskazuje na nieprawidłowe ułożenie igły. W takim przypadku należy wyjąć igłę i przygotować nową strzykawkę. Po prawidłowym umieszczeniu igły należy równomiernie i powoli usunąć zawartość strzykawki.

7. Wycięcie guza i sekcja zwłok

  1. Zbierz i wyczyść wszystkie narzędzia 70% etanolem przed eutanazją zwierzęcia.
  2. Poddać zwierzę eutanazji pożądaną metodą, zaleca się wdychanie CO2 (2 l/min przez 5-10 min). Zbadaj zwierzę pod kątem wszelkich nieprawidłowości w stanie ciała.
  3. Umieść zwierzę w pozycji grzbietowej na desce rozbiorowej i oczyść zwierzę 70% etanolem.
  4. Użyj pęsety, aby unieść skórę w dolnej części brzucha. Przetnij skórę i mięśnie nożyczkami i wykonaj przyśrodkowe nacięcie biegnące wzdłuż zwierzęcia (od odbytu do podbródka).
  5. Przetnij klatkę piersiową, wykonując dwa cięcia, jedno z boku klatki piersiowej, a drugie w poprzek mostka, aby odsłonić serce i płuca. Zbadaj płaty płuc pod kątem przerzutów 27,29.
  6. Zbadaj wszystkie narządy pod kątem nieprawidłowości i zapisz wszelkie zmiany w kolorze, rozmiarze i konsystencji. W razie potrzeby naciąć narządy skalpelem, aby zbadać tkanki wewnętrzne. W szczególności zbadaj wątrobę, nerki, śledzionę i przewód pokarmowy.
  7. Zbadaj węzły chłonne pod kątem przerzutów i powiększenia 27,29.
  8. Aby zebrać guz, wykonaj nacięcia po bokach powyżej i poniżej guza, tak aby skórę można było odciągnąć od ciała za pomocą pęsety. Mocno trzymając skórę pęsetą, użyj skalpela, aby ostrożnie usunąć guz, przecinając między guzem a skórą właściwą (ryc. 5).
  9. Natychmiast umieść guz w oznakowanym pojemniku z 10% neutralną buforowaną formaliną.
  10. W zależności od wielkości guza, należy odczekać 1-2 dni (≤ 2 mm, małe) lub 5-6 dni (> 2 mm, duże) na utrwalenie przed przygotowaniem skrawków do analizy histologicznej (ryc. 6).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Ze względu na niezwykle pobudliwą naturę szczurów bawełnianych, znajomość i stosowanie procedur zoptymalizowanych pod kątem redukcji stresu zwierząt ułatwi ich wykorzystanie jako przedklinicznego modelu zwierzęcego. Stosowanie odpowiednich technik manipulacji zminimalizuje również ryzyko dla badacza.

Podczas pracy ze szczurami bawełnianymi niezbędne jest zachowanie spokoju. Szczury te są bardzo pobudliwe i będą próbowały uciec z klatki. Zastosowanie rury wzbogacającej oraz materiałów gniazdowy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Szczury bawełniane są bardzo pobudliwe i mają silną reakcję na lot. Dlatego należy zachować szczególną ostrożność, aby zminimalizować nadmierny stres zwierzęcia. Opisana konfiguracja klatki pozwoli na bezpieczne i łatwe chwytanie zwierząt, przy czym umieszczenie rurki urozmaicającej warunki urozmaicenia ma ogromne znaczenie. Podczas ustawiania koszyków należy upewnić się, że rurki wzbogacające spełniają wymagania dotyczące rozmiaru i kształtu oraz są umieszczone we właściwej orientacji w klatce. Ważne jest również, aby u...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy przyznają, że nie ma finansowych konfliktów interesów związanych z tymi badaniami.

Podziękowania

Breanne Cuddington jest stypendystką Kanadyjskiej Fundacji Raka Piersi. Praca ta była sponsorowana przez granty operacyjne Towarzystwa Badań nad Rakiem i Instytutu Badawczego Kanadyjskiego Towarzystwa Onkologicznego (dawniej Canadian Breast Cancer Research Alliance). Dziękujemy Ann Tollefson (Saint Louis University School of Medicine) za komórki LCRT oraz dr Kathleen Delaney i Marion Corrick za pomoc techniczną w trzymaniu szczurów bawełnianych i sedacji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s średni Gibco11965-092Może używać dowolnej marki 
1X sól fizjologiczna buforowana fosforanami Można przygotować w laboratorium, przefiltrować do sterylizacji
200 mM L-glutaminyGibco25030164Może używać dowolnej marki
100x Antybiotyk-Antybiotyk Przeciwgrzybiczy Gibco15240-062Może używać dowolnej marki
Płodowa surowica bydlęcaQuality Biological Inc.110-001-101HIMoże używać dowolnej marki
T-150cm2 kolba do hodowli tkankowychFisher Scientific14-826-80Może używać dowolnej marki
1X TypLE ExpressLife Technologies12604-013
12-dołkowa płytka do hodowli komórkowej, płaskie dnoFisher Scientific08-772-29Może używać dowolnej marki, musi być poddana hodowli tkankowej
alamarBlueLife TechnologieDAL1025Może wykorzystywać alternatywny odczynnik do oznaczania żywotności komórek
8640 Teklad 22/5 Dieta dla gryzoniHarlan 8640
1/8" Ściółka dla gryzoni z kolb kukurydzyHarlan7092
NestletsAncare-Wykonanaz pulpowanego włókna bawełnianego z pierwszego tłoczenia, bezpyłowa i autoklawowalna
50 ml Probówki stożkoweFisher Scientific14-432-22Może używać dowolnej marki, musi być sterylna
Isoflurane USP, 99,9%, znieczulenie wziewnePharmaceutical Partners of Canada Inc.M60302
70% etanoluMożna przygotować w laboratorium
10% neutralna buforowana formalinaSigma-AldrichHT501128Może używać dowolnej marki
NAPCO NapFlow 1200 Klasa II A/B3 Bezpieczeństwo biologiczne Komora bezpieczeństwa mikrobiologicznego (kaptur do hodowli komórkowych)NAPCOModel używany nie jest obecnie dostępnyMoże używać dowolnej marki
Thermo Fisher Naukowa precyzyjna podgrzewana kąpiel wodnaFisher Używany model naukowynie jest obecnie dostępny Może używać dowolnej marki
[nagłówek]
Reichert Bright-line HemacytometerSigma-AldrichZ359629Może korzystać z dowolnej marki
Typhoon Trio BioAnalyzer Używany model nauk przyrodniczych GE Healthcarenie jest obecnie dostępny Można korzystać z dowolnego czytnika płytek fluorescencyjnych
Tecan Safire2 Czytnik mikropłytek z wieloma detekcjami UżywanyTecannie jest obecnie dostępny Można korzystać z dowolnego czytnika płytek fluorescencyjnych
Wirówka stołowa Allegra 6RBeckman Coulter366816Może używać dowolnej marki
Stołowe urządzenie do znieczuleniaVetEquipModel używany obecnie niedostępny Może używać dowolnej marki, musi być przenośny
Mini maszynki do strzyżenia Wahl PeanutWahlMoże używać dowolnej marki małych maszynek do strzyżenia
Strzykawki insulinowe 29 G x 1/2', 0,3 mlBD329464Może używać dowolnej marki. Zalecane są strzykawki z insuliną, ponieważ ułatwiają one wstrzykiwanie przez szczura. s twarda skóra. 
Waciki bawełnianeMedPro018-425Może używać dowolnej marki
Nożyczki preparacyjne z ostrymi końcówkamiFisher Scientific8940Może używać dowolnej marki
Kleszcze do tkanek preparacyjnychFisher Scientific13-812-41Może używać dowolnej marki
model

Bibliografia

  1. Cervantes-Garcia, D., Ortiz-Lopez, R., Mayek-Perez, N., Rojas-Martinez, A. Oncolytic virotherapy. Ann Hepatol. 7 (1), 34-45 (2008).
  2. Vaha-Koskela, M. J., Heikkila, J. E., Hinkkanen, A. E. Oncolytic viruses in cancer therapy. Cancer Lett. 254 (2), 178-216 (2007).
  3. Abril, C., et al. Both viral and host factors contribute to neurovirulence of bovine herpesviruses 1 and 5 in interferon receptor-deficient mice. J Virol. 78 (7), 3644-3653 (2004).
  4. Nakamichi, K., Matsumoto, Y., Otsuka, H. Defective infection of bovine herpesvirus 1 in non-permissive murine cells. J Vet Med Sci. 63 (10), 1139-1142 (2001).
  5. Boukhvalova, M. S., Blanco, J. C. The cotton rat sigmodon hispidus model of respiratory syncytial virus infection. Curr Top Microbiol Immunol. 372, 347-358 (2013).
  6. Papp, Z., Babiuk, L. A., Baca-Estrada, M. E. Induction of immunity in the respiratory tract and protection from bovine herpesvirus type 1 infection by different routes of immunization with recombinant adenovirus. Viral Immunol. 11 (2), 79-91 (1998).
  7. Hughes, T. C. R., Lilley, C. E., Ponce, R., Kaufman, H. L. Critical analysis of an oncolytic herpesvirus encoding granulocyte-macrophage colony stimulating factor for the treatment of malignant melanoma. Journal of Oncolytic Virotherapy. 3, 11-20 (2014).
  8. Jones, C., Chowdhury, S. A review of the biology of bovine herpesvirus type 1 (BHV-1), its role as a cofactor in the bovine respiratory disease complex and development of improved vaccines. Anim Health Res Rev. 8 (2), 187-205 (2007).
  9. Jones, C., Chowdhury, S. Bovine herpesvirus type 1 (BHV-1) is an important cofactor in the bovine respiratory disease complex. Vet Clin North Am Food Anim Pract. 26 (2), 303-321 (2010).
  10. Hushur, O., Takashima, Y., Matsumoto, Y., Otsuka, H. Restriction of bovine herpesvirus 1 (BHV-1) growth in non-permissive cells beyond the expression of immediate early genes. J Vet Med Sci. 66 (4), 453-455 (2004).
  11. Cuddington, B. P., Dyer, A. L., Workenhe, S. T., Mossman, K. L. Oncolytic bovine herpesvirus type 1 infects and kills breast tumor cells and breast cancer-initiating cells irrespective of tumor subtype. Cancer Gene Ther. 20 (5), 282-289 (2013).
  12. Cuddington, B. P., Mossman, K. L. Permissiveness of Human Cancer Cells to Oncolytic Bovine Herpesvirus 1 Is Mediated in Part by KRAS Activity. J Virol. 88 (12), 6885-6895 (2014).
  13. Small, E. J., et al. A phase I trial of intravenous CG7870, a replication-selective, prostate-specific antigen-targeted oncolytic adenovirus, for the treatment of hormone-refractory, metastatic prostate cancer. Mol Ther. 14 (1), 107-117 (2006).
  14. Freytag, S. O., et al. Phase I study of replication-competent adenovirus-mediated double suicide gene therapy for the treatment of locally recurrent prostate cancer. Cancer Res. 62 (17), 4968-4976 (2002).
  15. Benjamin, R., Helman, L., Meyers, P., Reaman, G. A phase I/II dose escalation and activity study of intravenous injections of OCaP1 for subjects with refractory osteosarcoma metastatic to lung. Hum Gene Ther. 12 (12), 1591-1593 (2001).
  16. Prince, G. A. The Cotton Rat in Biomedical Research. Animal Welfare Information Center Newsletter. 5 (2), Available from: http://www.nal.usda.gov/awic/newsletters/v5n2/5n2princ.htm 3-5 (1994).
  17. Tsai, J. C., Garlinghouse, G., McDonnell, P. J., Trousdale, M. D. An experimental animal model of adenovirus-induced ocular disease. The cotton rat. Arch Ophthalmol. 110 (8), 1167-1170 (1992).
  18. Ginsberg, H. S., et al. A mouse model for investigating the molecular pathogenesis of adenovirus pneumonia. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (5), 1651-1655 (1991).
  19. Russell, S. J., Peng, K. W., Bell, J. C. Oncolytic virotherapy. Nat Biotechnol. 30 (7), 658-670 (2012).
  20. Mossman, K. L., Saffran, H. A., Smiley, J. R. Herpes simplex virus ICP0 mutants are hypersensitive to interferon. J Virol. 74 (4), 2052-2056 (2000).
  21. Mossman, K. L., Smiley, J. R. Herpes simplex virus ICP0 and ICP34.5 counteract distinct interferon-induced barriers to virus replication. J Virol. 76 (4), 1995-1998 (2002).
  22. Hummel, J. L., Safroneeva, E., Mossman, K. L. The role of ICP0-Null HSV-1 and interferon signaling defects in the effective treatment of breast adenocarcinoma. Mol Ther. 12 (6), 1101-1110 (2005).
  23. Papp, Z., Middleton, D. M., Mittal, S. K., Babiuk, L. A., Baca-Estrada, M. E. Mucosal immunization with recombinant adenoviruses: induction of immunity and protection of cotton rats against respiratory bovine herpesvirus type 1 infection. J Gen Virol. 78 (11), 2933-2943 (1997).
  24. Papp, Z., Babiuk, L. A., Baca-Estrada, M. E. The effect of pre-existing adenovirus-specific immunity on immune responses induced by recombinant adenovirus expressing glycoprotein D of bovine herpesvirus type 1. Vaccine. 17 (7-8), 933-943 (1999).
  25. Mittal, S. K., et al. Induction of systemic and mucosal immune responses in cotton rats immunized with human adenovirus type 5 recombinants expressing the full and truncated forms of bovine herpesvirus type 1 glycoprotein gD. Virology. 222 (2), 299-309 (1996).
  26. Steel, J. C., et al. Syngeneic Cotton Rat Cancer Model for Replicating Adenoviral Vectors. Molecular Therapy. 13 (1), 123(2006).
  27. Toth, K., et al. Cotton rat tumor model for the evaluation of oncolytic adenoviruses. Hum Gene Ther. 16 (1), 139-146 (2005).
  28. Toth, K., Spencer, J. F., Wold, W. S. Immunocompetent, semi-permissive cotton rat tumor model for the evaluation of oncolytic adenoviruses. Methods Mol Med. 130, 157-168 (2007).
  29. Steel, J. C., et al. Immunocompetent syngeneic cotton rat tumor models for the assessment of replication-competent oncolytic adenovirus. Virology. 369 (1), 131-142 (2007).
  30. Workenhe, S. T., et al. Immunogenic HSV-mediated oncolysis shapes the antitumor immune response and contributes to therapeutic efficacy. Mol Ther. 22 (1), 123-131 (2014).
  31. Sobol, P. T., et al. Adaptive antiviral immunity is a determinant of the therapeutic success of oncolytic virotherapy. Mol Ther. 19 (2), 335-344 (2011).
  32. Prince, G. A. The Cotton Rat in Biomedical Research. Animal Welfare Information Center Newsletter. 5 (2), http://www.nal.usda.gov/awic/newsletters/v5n2/5n2princ.htm (1994).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Obs uga szczura bawe nianegoonkolityczna wiroterapiaocena przedklinicznaredukcja stresu u zwierz tmetoda rurek wzbogacaj cychkomora indukcyjna do znieczuleniainiekcja kom rek nowotworowychpodsk rne tworzenie guzawstrzykni cie wewn trzguzowewstrzykni cie dosytnieniowe
Postępowanie ze szczurem bawełnianym w badaniach nad oceną przedkliniczną wirusów onkolitycznych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.