Obrazowanie 3D i analiza neuronów zakażonych in vivo Toxoplasma gondii

Podsumowanie

Korzystając z tego protokołu, byliśmy w stanie zobrazować odcinki mózgu myszy zainfekowane pasożytem Toxoplasma gondii o grubości 160 μm, co umożliwia wizualizację i analizę przestrzennego związku między pasożytem otorbiającym a zainfekowanym neuronem.

Streszczenie

Toxoplasma gondii to obowiązkowy, wewnątrzkomórkowy pasożyt o szerokim zakresie żywicieli, w tym ludzi i gryzoni. Zarówno u ludzi, jak i u gryzoni Toxoplasma wywołuje trwającą całe życie trwałą infekcję w mózgu. Podczas gdy ta infekcja mózgu przebiega bezobjawowo u większości osób immunokompetentnych, u rozwijającego się płodu lub osób z obniżoną odpornością, takich jak pacjenci z zespołem nabytego niedoboru odporności (AIDS), to upodobanie i utrzymywanie się w mózgu może prowadzić do wyniszczającej choroby neurologicznej. Tak więc jasne jest, że interakcja mózg-toksoplazma ma kluczowe znaczenie dla objawowej choroby wywoływanej przez Toxoplasma, jednak niewiele wiemy o interakcji komórkowej lub molekularnej między komórkami ośrodkowego układu nerwowego (OUN) a pasożytem. W mysim modelu toksoplazmozy OUN wiadomo od ponad 30 lat, że neurony są komórkami, w których pasożyt trwa, ale niewiele jest dostępnych informacji na temat tego, która część neuronu jest ogólnie zainfekowana (soma, dendryt, akson) i czy ta relacja komórkowa zmienia się między szczepami. Po części ten brak jest wtórny do trudności w obrazowaniu i wizualizacji całych zainfekowanych neuronów zwierzęcia. Takie obrazy zazwyczaj wymagają seryjnego cięcia i zszywania tkanek obrazowanych za pomocą mikroskopii elektronowej lub mikroskopii konfokalnej po barwieniu immunologicznym. Łącząc kilka technik, opisana tutaj metoda umożliwia wykorzystanie grubych skrawków (160 μm) do identyfikacji i obrazowania całych komórek, które zawierają torbiele, umożliwiając trójwymiarową wizualizację i analizę pojedynczych, przewlekle zakażonych neuronów bez konieczności barwienia immunologicznego, mikroskopii elektronowej lub seryjnego cięcia i zszywania się. Korzystając z tej techniki, możemy zacząć rozumieć związek komórkowy między pasożytem a zainfekowanym neuronem.

Wprowadzenie

Ogólnym celem tej metody jest uzyskanie wysokiej rozdzielczości, trójwymiarowych obrazów pojedynczych neuronów, które są zainfekowane przez obligatoryjnego wewnątrzkomórkowego pasożyta Toxoplasma gondii.

Toxoplasma jest często uważana za jedną z najbardziej skutecznych pasożytów, ze względu na duży zakres pośrednich żywicieli, który obejmuje ludzi i gryzonie. Zarówno u ludzi, jak i gryzoni, po ostrym zakażeniu poprzez spożycie skażonej żywności lub wody, Toxoplasma jest w stanie wywołać trwałe zakażenie OUN poprzez przekształcenie się z szybko replikującej się formy (tachyzoitu) do formy wolno replikującej się i otorbiającej (bradyzoit). Uważa się, że u osób immunokompetentnych to utajone zakażenie OUN przebiega stosunkowo bezobjawowo, ale u osób z obniżoną odpornością, takich jak pacjenci z AIDS lub biorcy przeszczepów, nawrót pasożyta może prowadzić do śmiertelnego toksoplazmatycznego zapalenia mózgu^1,2. Ponadto ostatnie badania wykazały, że utajone zakażenie Toxoplasma może prowadzić do zmian w zachowaniu gryzoni^3,4, chociaż mechanizm pozostaje nieznany.

Zaskakująco, pomimo tych danych podkreślających znaczenie interakcji OUN-Toxoplasma, stosunkowo niewiele wiadomo o tym związku, zwłaszcza na poziomie komórkowym i molekularnym. Możliwość badania nawet prostych aspektów interakcji mózg-pasożyt została częściowo utrudniona przez ograniczenia technologiczne. Na przykład większość prac pokazujących, że neurony są komórkami, w których utrzymują się torbiele, została wykonana za pomocą mikroskopii elektronowej (EM)^5,6. Chociaż EM zapewnia wysoką rozdzielczość, jest czasochłonne, pracochłonne i drogie. Testy immunofluorescencyjne (IF) zostały ostatnio wykorzystane w połączeniu z mikroskopią konfokalną w celu potwierdzenia pracy wykonanej przez EM⁷. Testy IF są technicznie łatwe do wykonania i stosunkowo niedrogie, ale wykorzystanie tych technik do zrozumienia relacji przestrzennej między torbielą a zakażonym neuronem wymaga seryjnej rekonstrukcji, która jest czasochłonna, trudna technicznie i może prowadzić do utraty cennych informacji. W ten sposób opracowaliśmy metodę, która może być stosowana z mysim modelem toksoplazmozy OUN i pozwala nam obrazować całość zakażonych neuronów bez EM lub immunohistochemii (IHC). Opracowując taką technikę, możemy zacząć badać związek komórkowy między zakażoną komórką a torbielą w stosunkowo szybki i niedrogi sposób.

Metoda, którą opracowaliśmy, łączy nowsze techniki optycznego oczyszczania i obrazowania grubych fragmentów mózgu za pomocą mikroskopii konfokalnej⁸ z systemem, który oznacza in vivo komórki, którym wstrzyknięto białka pasożytów^9,10. W tym systemie zakażamy myszy Cre-reporter, które wyrażają zielone białko fluorescencyjne (GFP) dopiero po rekombinacji¹¹ za pośrednictwem Cre ze szczepami Toxoplasma, które eksprymują białko czerwonej fluorescencji (RFP) i wstrzykują rekombinazę Cre do komórek gospodarza⁹. Ta kombinacja pozwala nam pobrać zainfekowany mózg myszy po ustaleniu infekcji OUN, wyciąć grube fragmenty mózgu i szybko zidentyfikować odpowiednie obszary do zobrazowania, znajdując torbiele RFP⁺. Ważne jest, aby pamiętać, że ponieważ ekspresja GFP w komórkach gospodarza zależy wyłącznie od wstrzyknięcia Cre przez pasożyty, a nie od infekcji, wiele komórek GFP⁺ nie zawiera pasożytów¹⁰. Ponieważ celem tego protokołu jest możliwość obrazowania całych zainfekowanych neuronów, nacisk kładziony jest tylko na neurony GFP⁺, które również zawierają torbiel RFP⁺, ale protokół może być również używany do obrazowania neuronów GFP⁺/RFP^-.

Po pobraniu i podziale zainfekowanego mózgu, sekcje stają się przezroczyste przez usunięcie glicerolu. Odpowiednie obszary skrawków są następnie obrazowane za pomocą mikroskopii konfokalnej, co pozwala na niespotykaną dotąd wizualizację zakażonych komórek gospodarza i otorbionych pasożytów w całości. Tutaj przedstawiamy kompletny protokół identyfikacji, optycznego oczyszczania i obrazowania zainfekowanych neuronów.

Protokół

UWAGA: Myszy były hodowane i utrzymywane w pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze i wilgotności z 12-godzinnymi odwróconymi cyklami światła/ciemności z jedzeniem i wodą dostępną ad libitum na Uniwersytecie Arizony. Eksperymenty przeprowadzono zgodnie z wytycznymi i zgodą Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Uniwersytetu Arizony. Dołożono wszelkich starań, aby zminimalizować cierpienie. Myszy Cre-reporter są na tle C57BL/6¹¹ i są dostępne na rynku.

1. Zakażenie myszą

UWAGA: Opisana poniżej metoda zakażenia myszy Toxoplasma gondii została wykorzystana w badaniach opublikowanych wcześniej^10–12.

1. Hoduj szczepy Toxoplasma w ludzkich fibroblastach napletka (HFF) hodowanych w pożywce Dulbecco o wysokiej zawartości glukozy Modified Eagles Medium (DMEM) uzupełnionej 10% FBS, 100 U/ml penicyliny, 100 mg/ml streptomycyny i 2 mM L-glutaminy (cDMEM) w kolbie T-25 w inkubatorze o stężeniu 5% CO_{2 ,} aż pasożyty utworzą duże wakuole parazytoforyczne.
2. Pasożyty uwalniające się ze strzykawki poprzez zeskrobanie komórek z dna kolby i przepuszczenie otrzymanego roztworu przez igłę o rozmiarze 25 G podłączoną do strzykawki o pojemności 3 ml 2 razy wewnątrz kolby, a następnie przeniesienie całego roztworu do pojemnika na strzykawkę o pojemności 5 ml połączonego z igłą o rozmiarze 27, która została umieszczona do góry nogami w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Podłączyć tłok do strzykawki i przepuścić roztwór pasożyta do stożkowej rurki.
3. Odwirować probówkę przez 10 minut przy 300 x g. Odessać supernatant, a następnie ponownie zawiesić osad w 4-6 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem klasy USP 1x o pH 7,4 (roztwór podstawowy).
4. Załaduj hemocytometr 10 μl roztworu podstawowego, odczekaj 5-10 minut, aż pasożyty się uspokoją, a następnie policz liczbę pasożytów w czterech rogach i środkowych kwadratach środkowego dużego kwadratu.
5. Rozcieńczyć pasożyty do odpowiedniej wielkości inokulum 100K/200 μl 1x PBS, a następnie wstrzyknąć myszom dootrzewnowo (i.p.) o całkowitej objętości 200 μl.
   UWAGA: W tej procedurze myszy inokulowano 100K tachyzoitami typu III ()¹³ w 200 μl 1x PBS. W przypadku zakażania myszy innymi szczepami Toxoplasma może być konieczne dostosowanie stężenia inokulum w celu uwzględnienia poziomu zjadliwości.

2. Perfuzja i zbieranie mózgów

UWAGA: Ten protokół został przeprowadzony 21 dni po infekcji (dpi), ponieważ reprezentuje on punkt czasowy, w którym w mózgu myszy znajduje się szczytowa liczba torbieli, ale można użyć innych punktów czasowych. Wielkość, liczba, lokalizacja oraz obecność lub brak torbieli zależy od wielu czynników, w tym szczepu myszy, typu szczepu pasożyta, a także wielkości inokulum^7,14–17. Badacze będą musieli indywidualnie określić odpowiednie inokulum dla myszy i używanego przez nią szczepu Toxoplasma.

1. Ustaw wszystkie chirurgiczne narzędzia do zbierania (Rysunek 1).
2. Dla każdej myszy przygotuj i trzymaj na lodzie: strzykawkę o pojemności 20 ml wypełnioną 0,9% chlorkiem sodu (NaCl) + 10 U/ml heparyny w 1x sterylnym PBS (heparyna/sól fizjologiczna) klasy USP); strzykawka o pojemności 20 ml wypełniona 4% paraformaldehydem (PFA); Fiolka scyntylacyjna zawierająca 15 ml 4% PFA. W przypadku wielu myszy należy przygotować zlewkę wypełnioną całą ilością każdego roztworu potrzebną dla wszystkich myszy, a następnie pobrać nową strzykawkę pełną roztworu do każdej perfuzji.
3. Znieczulij mysz i.p. 200 μl/25 g masy ciała koktajlu ketaminy/ksylazyny (odpowiednio 24 mg/ml i 4,8 mg/ml) w dniu zainteresowania. Monitoruj mysz pod kątem poziomu znieczulenia, sprawdzając odruch szczypania palców u stóp. Kontynuuj protokół tylko wtedy, gdy mysz nie wykaże żadnej reakcji na mocne uszczypnięcie palca.
   UWAGA: Inne metody znieczulenia mogą być stosowane, o ile odpowiedni poziom znieczulenia zostanie osiągnięty przed przystąpieniem do protokołu.
4. Umieść mysz w pozycji leżącej na zakrytej platformie piankowej. Przypnij wszystkie cztery kończyny do stóp, a następnie spryskaj klatkę piersiową i brzuch 70% etanolem (EtOH) (ryc. 2A). Dodanie kilku sterylnych ręczników papierowych pod myszą może być użyte, aby pomóc wchłonąć nadmiar płynów perfuzyjnych.
5. Podnieś skórę tuż pod mostkiem za pomocą kleszczy, a następnie użyj nożyczek, aby wykonać nacięcie. Odciągnij skórę do tyłu, aby odsłonić klatkę piersiową (ryc. 2B).
6. Podnieś wyrostek mieczykowaty i wykonaj nacięcie brzucha tuż pod przeponą, odsłaniając wątrobę, która jest tępo wycięta z przepony. Wykonaj dwa nacięcia, jedno po lewej i jedno po prawej przez przeponę i spód żeber. Przedłuż lewe i prawe nacięcie około 1/2-2/3 w górę klatki piersiowej, która jest następnie odbijana z powrotem, aby otworzyć jamę klatki piersiowej (ryc. 2C).
   UWAGA: Należy uważać, aby podczas tej procedury nie przeciąć żadnych narządów ani głównych naczyń krwionośnych, ponieważ pogorszy to jakość perfuzji.
7. Wykonać perfuzję przezskórną z 10-20 ml heparyny/soli fizjologicznej, a następnie 10-20 ml 4% PFA.
   UWAGA: Jeśli perfuzja zostanie wykonana prawidłowo, wątroba zmieni kolor z czerwonego na brązowy (ryc. 2D). Jeśli nie zostanie to zrobione prawidłowo, naczynia krwionośne będą widoczne (ryc. 2E).
8. Odwróć mysz na brzuch, ponownie przypnij stopy, a następnie spryskaj głowę i szyję 70% EtOH. Podnieś skórę od podstawy szyi i wykonaj nacięcie. Usuń skórę, aby odsłonić czaszkę (ryc. 2F). Odetnij głowę na wysokości ramion. Usuń czaszkę, delikatnie usuń mózg i umieść go w fiolce scyntylacyjnej wypełnionej 4% PFA (ryc. 2G-H).
   UWAGA: Jeśli mózg jest dobrze ukrwiony, będzie wyglądał na biały bez widocznych naczyń krwionośnych (ryc. 2I). Jeśli mózg nie jest dobrze ukrwiony, naczynia krwionośne będą widoczne (ryc. 2J).
9. Umieścić fiolkę scyntylacyjną z mózgiem w 4% PFA w temperaturze 4 °C na noc, przykrytą światłem. Przepłucz mózg w 1x PBS klasy innej niż USP i przenieś do nowej fiolki scyntylacyjnej wypełnionej schłodzonym 1x PBS. Przechowywać mózg w 1x PBS w temperaturze 4 °C, przykryty przed światłem.
   UWAGA: Pomyślne oczyszczenie i obrazowanie zostało osiągnięte dzięki sekcjom przechowywanym w 1x PBS przez okres do jednego miesiąca, ale najlepiej jest przeciąć mózg w ciągu kilku dni, ponieważ długotrwałe przechowywanie w PBS odwróci fiksację PFA i może prowadzić do mniej niż optymalnych obrazów. Autofluorescencję i zwiększone rozmycie zaobserwowano w niektórych sekcjach sfotografowanych po przechowywaniu w 1x PBS przez miesiąc lub dłużej.

3. Sekcja mózgu

1. Usuń mózg z 1x PBS i umieść go w macierzy mózgowej (ryc. 3A), aby umożliwić bardziej precyzyjne i równomierne cięcia przez mózg. Odetnij móżdżek i opuszki węchowe, jeśli są obecne, a następnie przetnij mózg koronalnie na 2 lub 3 sekcje.
   UWAGA: Przycinanie i wycinanie mózgu może odbywać się bez pomocy macierzy mózgowej. Liczba sekcji ciętych koronalnie będzie zależeć od odległości cięcia używanego wibratomu. Mózg można podzielić na sekcje w dowolnej orientacji, chociaż sekcje strzałkowe i czołowe są najczęściej używane do identyfikacji neuroanatomicznej.
2. Przymocuj każdy fragment mózgu do bloku montażowego próbki za pomocą cyjanoakrylanu. Umieść mały blok 5% żelu agarozowego za sekcją mózgu w celu podparcia (ryc. 3B).
   UWAGA: Można zastosować inne mechanizmy wsparcia, ale bez wsparcia wibratom może naciskać na mózg, powodując nierówne podziały.
3. Pokrój tkankę na odcinki o grubości 160 μm (odległość robocza obiektywu używanego do obrazowania) z wibratomem ustawionym na prędkość 4 i amplitudę 9,
   UWAGA: Ustawienia prędkości i amplitudy można dostosować w zależności od używanej maszyny w celu uzyskania równych, gładkich odcinków. Jeśli ustawienia nie są prawidłowe, rezultatem mogą być nierówne przekroje, rozdarcie tkanki lub ślady karbowania.
4. Zbierz skrawki tkanek do fiolki scyntylacyjnej wypełnionej świeżym, schłodzonym 1x PBS, jeśli mają zostać usunięte w ciągu jednego tygodnia. Jeśli skrawki nie zostaną oczyszczone w ciągu jednego tygodnia, należy umieścić je w probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml wypełnionych roztworem kriokonserwującym i przechowywać w temperaturze -20 °C.

4. Optyczne oczyszczanie wycinków tkanki mózgowej

UWAGA: Ten protokół został zmodyfikowany w stosunku do poprzednio opublikowanej metody ⁸.

1. Przygotuj glicerol 25%, 50%, 75% i 90% obj. w 1x PBS + 2% Tween-20 (Gl/PBST).
2. Usunąć skrawki z 1x PBS lub, jeśli zawiera się kriokonserwant, spłukać w 1x PBS i przenieść do fiolki scyntylacyjnej zawierającej 10 ml 25% Gl/PBST. Umieścić fiolkę na wytrząsarce w temperaturze 4 °C, pod przykryciem przed światłem, na 12 godzin.
3. Upewnij się, że wszystkie sekcje opadły na dno fiolki. Odessać 25% Gl/PBST, pozostawiając tylko tyle, aby pokryć skrawki, a następnie napełnić fiolkę 10 ml 50% Gl/PBST i umieścić na wytrząsarce w temperaturze 4 °C, pod przykryciem przed wystawieniem na działanie światła, na 12 godzin. Powtórz ten proces dla 75% Gl/PBST, a następnie dla 90% Gl/PBST. Pozostaw sekcje w 90% Gl/PBST na 24 godziny, aby osiągnąć maksymalne oczyszczenie. W trakcie procesu oczyszczania obserwuj stopniowe oczyszczanie optyczne (Rysunek 4).
   UWAGA: Proces ten może być przyspieszony, jeśli roztwory zostaną zmienione natychmiast po zapadnięciu się skrawków na dno fiolki. W roztworach 75% i 90% skrawki nie opadają aż do dna fiolki, ale unoszą się w środku.

5. Montaż sekcji tkanki mózgowej

1. Wytnij szkiełko nakrywkowe nr 1,5 na 5 części, aby utworzyć przekładkę. Użyj linijki i ołówka z diamentową końcówką, aby naciąć i złamać szkiełko nakrywkowe wzdłuż linii przerywanych pokazanych na rysunku 5A. Wyrzuć środkową część, ułóż 4 zewnętrzne części na zwykłym szklanym szkiełku, aby utworzyć okno, a następnie nałóż przezroczysty lakier do paznokci na szwy, aby przykleić kawałki przekładki do szkiełka w odpowiedniej konfiguracji (Rysunek 5B).
   UWAGA: Przekładka posłuży do stworzenia niezbędnej przestrzeni między prowadnicą a szkiełkiem nakrywkowym do montażu oczyszczonych sekcji. Szkiełko nakrywkowe można przyciąć na różne sposoby, aby stworzyć okno o dowolnym rozmiarze. W handlu dostępne są również wstępnie przycięte przekładki piankowe. Aby lakier do paznokci całkowicie wyschł, najlepiej wykonać ślizgi z przekładkami co najmniej dzień przed montażem sekcji.
2. Przenieś skrawki na szkiełko za pomocą plastikowej pipety transferowej z odciętą końcówką. Upewnij się, że wypełniłeś okolicę 90% Gl/PBST. Ostrożnie opuść szkiełko nakrywkowe na sekcje, uważając, aby nie wprowadzić żadnych pęcherzyków. Nadmiar Gl/PBST można usunąć za pomocą niestrzępiącej się chusteczki.
3. Natychmiast zobrazuj neurony GFP⁺ zawierające torbiele RFP⁺ Toxoplasma gondii za pomocą mikroskopu konfokalnego (ryc. 7A-B), a następnie przechowuj szkiełka płasko i przykryte przed światłem w temperaturze 4 °C.
   UWAGA: Alternatywnie, uszczelka przesuwa się całkowicie wokół wszystkich krawędzi, aby przechowywać i obrazować w późniejszym czasie. Użycie przezroczystego lakieru do paznokci do uszczelnienia szkiełka jest opcjonalne i może utrudnić usunięcie szkiełka nakrywkowego, jeśli zostanie się usuniętym fragmentami szkiełka w późniejszym terminie w celu dalszej obróbki.

6. Obrazowanie

UWAGA: Można użyć dowolnego mikroskopu, który ma zdolność uzyskiwania stosów z o wysokiej rozdzielczości.

1. Po początkowym znalezieniu płaszczyzny ogniskowej przy 10X, zmień obiektyw na 20X i przeskanuj przekrój, aby zidentyfikować torbiel znajdującą się wewnątrz komórki GFP⁺. Wyśrodkuj obszar zainteresowania (ROI) w polu view.
2. Zmień obiektyw na 40X. Skoncentruj się w górę iw dół przez cały zwrot z inwestycji, aby upewnić się, że cała komórka i torbiel są widoczne.
   UWAGA: Obrazy uzyskano za pomocą mikroskopu konfokalnego z obiektywem 40X/1,30 Oil DIC M27.
3. Korzystając z zainstalowanego oprogramowania do obrazowania, uzyskaj stos z, który obejmuje całą komórkę z torbielą. Średnie ustawienia używane do uzyskiwania obrazów pokazano na rysunku 6.
   UWAGA: Ustawienia mogą wymagać dostosowania w zależności od sekcji tkanek każdego badacza i możliwości mikroskopu.
4. Uzyskaj maksymalny obraz projekcji stosu z, ustawiając liczbę projekcji na 1. Uzyskaj pełny widok obrotowy, ustawiając liczbę projekcji na 64,
   UWAGA: Dostępne są inne pakiety oprogramowania, które mogą być używane do uzyskiwania maksymalnej projekcji, obrotu i innych widoków obrazów z-stack
.
5. Analizuj obraz za pomocą oprogramowania do analizy obrazowania.

Wyniki

Rysunek 7 zawiera reprezentatywne obrazy dwóch neuronów GFP⁺ zawierających cysty z dwóch różnych przekrojów o grubości 160 µm, a także reprezentatywny pomiar odległości od cysty do ciała komórkowego dla Rysunku 7B. Rysunki 7 A oraz B ilustrują, że ten nowy protokół umożliwia wizualizację zainfekowanego neuronu w całości. Rysunek 7C pokazuje, że dzięki tej technice obrazowania możliwe jest teraz ilościowe określenie odległości ...

Dyskusja

Biorąc pod uwagę, że zmiany komórkowe w zakażonych komórkach gospodarza zostały powiązane z wynikami choroby w infekcjach innymi organizmami wewnątrzkomórkowymi, takimi jak HIV, wścieklizna i Chlamydia^18,19, opracowaliśmy technikę, która pozwoliłaby nam zbadać intymne interakcje zachodzące między komórką gospodarza OUN a Toxoplasma. Opisana tutaj metoda osiąga ten cel, umożliwiając skuteczne obrazowanie przewlekle zakażonych neuronów. Przed opracowaniem tej metody takie obrazowanie było czasochłonne, ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
System sekcyjny Vibratome Series 1000	Technical Products International, Inc.		Inne wibratory są kompatybilne
Glicerol	Fisher Scientific	BP229-1
Tween-20	Fisher Scientific	BP337-500
Premium Prowadnice	Fisher Scientific	12-544-2
#1.5 Szkiełka nakrywkowe	VWR	48393 251
Diamentowy rysik	VWR	52865-005
Zeiss LSM 510 Mikroskop konfokalny Meta	Zeiss	LSM 510
Ketaject® Ketamina HCl Inj., USP 100 mg / ml	Western Medical Supply, Inc.	4165
AnaSed® Ksylazyna do wstrzykiwań 20 mg/ml	Lloyd Inc.
ZsGreen Mice	Jackson Laboratories	7906	B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm6(CAG-ZsGreen1)Hze/J
Sprzęt			Kleszcze do kciuków; Cienkie nożyczki - ustawione pod kątem na bok, ostre-ostre; Ostre-ostre nożyczki; Hemostatyki Kelly'ego; Nożyczki majonezowe; Mikro szpatułka.
		komórki napletka (HFF)	Są to pierwotne komórki z ludzkiego napletka. Wykonujemy je we własnym zakresie, ale można je kupić od zewnętrznych dostawców.
Dulbecco's High Glucose Modified Eagles Medium (DMEM)	HyClone	SH30081.01
Penicylina Roztwór streptomycyny, 100x	Corning	30-002-Cl
200 mM L-alanylo-L-glutamina	Corning	25-015-Cl
25 cm2 Kolba z przechyloną szyjką	Fisher Scientific	1012639
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami, 1x Bez Wapń i magnez	VWR	45000-446
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami, 10x, USP Sterylna ultra czysta klasa	amresco	K813-500ml
Surowica bydlęca	płodu Gibco	26140-079
Hemocytometr jasnej linii	Sigma-aldrich	Z359629-1EA
Matryca do krajalnicy mózgu myszy	Zivic Instruments	BSMAS005-1
Chlorek sodu	Fisher Scientific	BP358-1
Sól sodowa heparyny z błony śluzowej jelit świń	Sigma-aldrich	H3393-100KU
Paraformaldehyd	Fisher Scientific	O4042-500
20 ml Jednorazowe fiolki scyntylacyjne	Fisher Scientific	FS74500-20
Alkohol, etylowy, 95%, 190 Proof	In-house	17212945	Ten produkt jest kupowany z własnego magazynu.  Inne firmy są kompatybilne.
Imaris Software	Bitplane
Lakier do paznokci			Inne marki są kompatybilne
Strzykawka 10 ml z Luer-Lok	VWR	BD309604	Inne strzykawki są kompatybilne
Trójdrożny kran			Kompatybilna jest każda marka
Igła			Każda marka jest kompatybilna - służy do przypinania myszy.
Skrobak			Każda marka jest kompatybilna
Rurka 25 G x 12 ", zestaw do bezpiecznego pobierania krwi, z adapterem Luer	Greiner Bio-One	450099	Inne marki są kompatybilne

chirurgiczny Ludzkie Clear podskórna do komórek