Artykuł metodologiczny

Candida albicans (Candida albicans) Rozwój biofilmu na istotnych z medycznego punktu widzenia ciałach obcych w mysim modelu podskórnym, a następnie obrazowanie bioluminescencyjne

DOI:

10.3791/52239

⸱

27 stycznia 2015

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Microbiology, Laboratory of Molecular Cell Biology, Institute of Botany and Microbiology, VIB, KU Leuven, 2Biomedical MRI Unit/ MoSAIC, Department of Imaging & Pathology, KU Leuven

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy eksperymentalną procedurę rozwoju biofilmu Candida albicans w mysim modelu podskórnym. Biofilmy grzybów określono ilościowo, określając liczbę jednostek tworzących kolonie oraz nieinwazyjne obrazowanie bioluminescencyjne, w którym ilość wytwarzanego światła odpowiada liczbie żywotnych komórek.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozwój biofilmu Candida albicans na powierzchniach biotycznych i/lub abiotycznych stanowi szczególne zagrożenie dla hospitalizowanych pacjentów. Do tej pory biofilmy C. albicans badano głównie in vitro, ale istnieje pilna potrzeba lepszego zrozumienia tego dynamicznego procesu w warunkach in vivo. Opracowaliśmy podskórny model szczura in vivo do badania tworzenia biofilmu C. albicans. W naszym modelu do tylnej części zwierzęcia wszczepia się wiele (do 9) urządzeń zakażonych Candida. Daje nam to dużą przewagę nad systemem modelowania cewnika do żyły centralnej, ponieważ pozwala nam badać kilka niezależnych biofilmów u jednego zwierzęcia. Niedawno dostosowaliśmy ten model do badania rozwoju biofilmu C. albicans u myszy BALB/c. W tym modelu dojrzałe biofilmy C. albicans rozwijają się w ciągu 48 godzin i wykazują typową trójwymiarową architekturę biofilmu. Kwantyfikacja biofilmu grzybów jest tradycyjnie analizowana post mortem i wymaga poświęcenia gospodarza. Ponieważ wymaga to wykorzystania wielu zwierząt do przeprowadzenia badań kinetycznych, zastosowaliśmy nieinwazyjne obrazowanie bioluminescencyjne (BLI) do podłużnej obserwacji in vivo dojrzałych biofilmów C. albicans rozwijających się w naszym modelu podskórnym. Komórki C. albicans zostały zmodyfikowane tak, aby wyrażały gen lucyferazy Gaussia princeps (gLuc) przyczepiony do ściany komórkowej. Sygnał bioluminescencji jest wytwarzany przez lucyferazy, która przekształca dodany substrat koelennterazinę w światło, które można zmierzyć. Sygnał BLI przypominał liczbę komórek uzyskaną z eksplantowanych cewników. Nieinwazyjne obrazowanie do ilościowego określania powstawania biofilmu in vivo zapewnia natychmiastowe zastosowania w badaniach przesiewowych i walidacji leków przeciwgrzybiczych w warunkach in vivo, a także w badaniach opartych na interakcjach gospodarz-patogen, przyczyniając się w ten sposób do lepszego zrozumienia patogenezy zakażeń związanych z cewnikiem.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Candida albicans to organizm komensalny, który można znaleźć w różnych miejscach u zdrowych osób, na przykład na skórze lub jako część flory przewodu pokarmowego i pochwy. Jednak u pacjentów hospitalizowanych, a zwłaszcza z obniżoną odpornością, może powodować szeroki zakres zakażeń 1. U takich osób osłabiony układ odpornościowy umożliwia komórkom Candida rozprzestrzenianie się do krwiobiegu i atakowanie głębszych tkanek, powodując zagrażające życiu infekcje. Ponadto obecność substratów abiotycznych, takich jak centralne cewniki żylne i moczowe, sztuczne zastawki serca i stawy, może stanowić niszę dla przyczepu Candida 2. Adhezja do takich substratów jest warunkiem wstępnym dalszego rozwoju biofilmu, który stanowi warstwę komórek drożdży i strzępek osadzonych w zewnątrzkomórkowym materiale polimerowym, składającym się głównie z polisacharydów 2. Zakażenia związane z cewnikiem C. albicans wiążą się z wysoką śmiertelnością. Ogólną cechą biofilmów jest ich zmniejszona podatność na znane leki przeciwgrzybicze, takie jak azole 3,4. Tylko nowsze klasy leków przeciwgrzybiczych, takie jak echinokandyny i liposomalny preparat amfoterycyny B, okazały się aktywne przeciwko infekcjom związanym z cewnikiem 5-7. Ze względu na odporność biofilmu na leki przeciwgrzybicze, podejścia terapeutyczne są bardzo ograniczone, co często prowadzi do usunięcia cewnika, a następnie jego wymiany jako jedynego rozwiązania.

Większość naszej obecnej wiedzy na temat rozwoju biofilmu C. albicans pochodzi z badań in vitro na substratach abiotycznych, takich jak polistyren, czy tworzywa sztuczne używane do produkcji wyżej wymienionych urządzeń, np. silikon, poliuretan 2. Modele te są dość zaawansowane i starają się jak najwierniej naśladować sytuację in vivo. Jednak systemy te nie obejmują ciągłego przepływu krwi i układu odpornościowego gospodarza. Doprowadziło to do opracowania systemów modelowych in vivo, takich jak cewnik do żyły centralnej (CVC) model 8-10, model zapalenia jamy ustnej do dentycyjnego zapalenia jamy ustnej 11 oraz mysi model kandydurii związanej z cewnikiem 12. Dodatkowo badano rozwój biofilmu C. albicans in vivo na powierzchniach błon śluzowych, takich jak te z pochwy 13 i jamy ustnej 14. Nasze laboratorium przyczyniło się do stworzenia podskórnego modelu biofilmu C. albicans, który opiera się na wszczepieniu zakażonych fragmentów cewnika na grzbiecie szczurów Sprague Dawley 15. Model ten został z powodzeniem wykorzystany w naszym laboratorium do zbadania wrażliwości biofilmu na leki flukonazol i echinokandyna 5,16, do zbadania wpływu terapii skojarzonej diklofenaku i kaspofunginy 17. Niedawno dostosowaliśmy ten system do użytku w myszach BALB/c 18,19. W porównaniu z innymi modelami in vivo, główną zaletą tego modelu podskórnego jest możliwość badania wielu biofilmów na zwierzę, które rozwinęły się w świetle wszczepionych fragmentów cewnika.

Aby zmniejszyć liczbę zwierząt laboratoryjnych, dostosowaliśmy ten model do badania rozwoju biofilmów C. albicans nieinwazyjnie, korzystając z obrazowania bioluminescencyjnego (BLI) 18,19. Metoda ta okazała się potężną techniką, którą można wykorzystać do ilościowego oznaczania biofilmów poprzez pomiar specyficznego sygnału BLI w obszarze zainteresowania (w naszym przypadku w obszarze wszczepionych cewników), unikając składania ofiar ze zwierząt. W porównaniu z bakteriami, które mogą wyrażać zarówno gen, jak i substrat wymagany do reakcji bioluminescencji z powodu wprowadzenia specyficznego operonu luksa 20, większość organizmów eukariotycznych, w tym C. albicans, jest zależna od heterologicznej ekspresji genu lucyferazy w połączeniu z zewnętrznym podawaniem określonego substratu, takiego jak D-lucyferyna lub koelenterazyna 21. Prawdopodobnie ze względu na obecność ściany komórkowej grzyba i morfogenezy C. albicans, wewnątrzkomórkowe dostarczanie substratu dla enzymu lucyferazy było głównym wyzwaniem 21. Aby rozwiązać ten problem, Enjalbert i wsp. 22 zmodyfikowali szczep, w którym syntetyczna, zoptymalizowana pod kątem kodonu C. albicans wersja genu naturalnie wydzielanej lucyferazy Gaussia princeps (gLuc) została połączona z genem C. albicans PGA59, białkiem ściany komórkowej zakotwiczonym w GPI. Ze względu na obecność lucyferazy w ścianie komórkowej można uniknąć problemów związanych z wewnątrzkomórkową dostępnością substratu. Ten konkretny system został wykorzystany do badania powierzchownych infekcji wywołanych przez C. albicans 22. Całkiem niedawno BLI stosowano również do śledzenia progresji kandydozy jamy ustnej i gardła oraz jej możliwego leczenia 23. Takie odkrycia przemawiają za zastosowaniem BLI jako obiecującej techniki badania zakażeń wywołanych przez wolno żyjące komórki, ale także infekcji związanych z urządzeniem.

W tym badaniu opisujemy rozwój biofilmu C. albicans na fragmentach cewnika poliuretanowego u myszy BALB/c i jego ilościowe określenie za pomocą BLI. Zapewniamy szczegółowy protokół kolonizacji in vitro cewników poliuretanowych w okresie adhezji, po którym następuje implantacja u myszy i późniejsze tworzenie biofilmu u żywych zwierząt. Oprócz pomiaru sygnału BLI emitowanego przez komórki C. albicans, określamy również jednostki tworzące kolonie w celu porównania ze standardową techniką ilościowego oznaczania obciążenia biofilmem grzybów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez komisję etyczną KU Leuven (numer projektu 090/2013). Utrzymuj zwierzęta zgodnie z wytycznymi KU Leuven dotyczącymi opieki nad zwierzętami.

1. Wzrost C. albicans

  1. Dwadzieścia cztery godziny przed rozpoczęciem doświadczenia na zwierzętach należy przygotować płytki YPD, dodając 10 g granulowanego ekstraktu drożdżowego, 20 g peptonu bakteriologicznego i 15 g agaru granulowanego. Uzupełnić objętość do 900 ml wodą Milli-Q i przepić autoklawem.
  2. Dodać 50 ml sterylnej 40% glukozy. Dokładnie wymieszaj i wlej do szalek Petriego. Pozostaw płytki agarowe do ostygnięcia i zestalenia.
    UWAGA: W tym badaniu użyj dwóch szczepów, a mianowicie szczepu C. albicans SC5314 typu dzikiego – gLuc ujemnego (określanego jako WT) i szczepu C. albicans SKCA23, który jest dzikim typem C. albicans SC5314 transformowanym plazmidem Clp10::Act1p-gLUC59 22. W tym szczepie (nazwanym SKCA23-ACTgLuc) gLuc został połączony z endogennym genem PGA59 pod kontrolą promotora ACT1 (aktyny) (promotor ten jest aktywny w drożdżach, a także w strzępkowym stadium wzrostu grzybów). Szczep ten można zamówić w laboratorium prof. Patricka Van Dijcka, KU Leuven, Leuven, Belgia. Plazmid Clp10::Act1p-gLUC59 plazmid 22 został dzięki uprzejmości prof. C. d'Enfert z Instytutu Pasteura w Paryżu we Francji.
  3. Oba szczepy należy przechowywać w zapasie glicerolu i przechowywać w temperaturze -80 °C.
  4. Przed jakimkolwiek eksperymentem smuga napina się na płytkę YPD. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez noc.

2. Przygotowanie elementów cewnika

  1. Przed eksperymentem określ, ile cewników jest potrzebnych. Możliwe jest wszczepienie do 6 sztuk cewnika na mysz (3 cewniki po lewej stronie i 3 cewniki po prawej stronie zwierzęcia (ryc. 2A).
  2. Dwadzieścia cztery godziny przed operacją na zwierzętach otwórz opakowanie zawierające cewnik trójkanałowy pod szafką bezpieczeństwa biologicznego. Usuń wszystkie niepotrzebne części sterylną pęsetą i odetnij część przymocowaną do cewnika sterylnym skalpelem. Umieść linijkę pod plastikowym opakowaniem i wytnij kawałki cewnika poliuretanowego dokładnie o długości 1 cm zgodnie ze skalą na linijce (rysunek 1).
    UWAGA: Należy wspomnieć, że ten typ cewnika nie jest fosforyzujący i dlatego nadaje się do BLI 18,19.
  3. Umieścić maksymalnie 15 odciętych kawałków cewnika (krok 2.2) w probówkach do mikrowirówek o pojemności 2 ml. Zawsze przygotuj 3 dodatkowe sztuki, które służą do wyliczenia ilości przyczepionych komórek Candida na urządzeniu po okresie adhezji.
  4. Uzupełnij cewniki około 1,8 ml 100% płodowej surowicy bydlęcej (FBS).
  5. Energicznie zwiruj i dodaj dodatkowe 100-200 μl 100% FBS. Całkowicie pokryj wszystkie fragmenty cewnika surowicą.
  6. Inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.

3. Zwierzęta i tłumienie układu odpornościowego

  1. Samice myszy BALB/c (w wieku około 8 tygodni) należy przechowywać w indywidualnie wentylowanych górnych klatkach z filtrem ze swobodnym dostępem do standardowego pożywienia i wody ad libitum.
  2. Rozpocznij supresję układu odpornościowego na 24 godziny przed operacją na zwierzętach, dodając deksametazon (0,4 mg/l) do wody pitnej zwierząt. Aby uniknąć zanieczyszczenia bakteryjnego gospodarza, należy uzupełnić wodę pitną antybiotykiem, np. ampicyliną sodową w proszku (0,5 g/l).
  3. Utrzymuj immunosupresję zwierząt przez cały czas trwania eksperymentu (do 6 dni).

4. Ex vivo C. albicans Przyczepność do podłoży poliuretanowych pokrytych FBS

  1. Przenieść każdy fragment cewnika pokrytego surowicą do świeżej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.
  2. Zeskrobać niektóre komórki C. albicans wyhodowane na płytkach YPD (Krok 1) i zawiesić je w 1 ml PBS.
  3. Rozcieńczyć komórki Candida (1:100) w oddzielnej probówce do mikrowirówki. Pobrać 10 μl rozcieńczonej próbki i umieścić ją w komorze do liczenia komórek. Policz co najmniej 16 małych kwadratów.
  4. Przygotować komórki Candida (każdy szczep osobno) w pożywce RPMI 1640 do końcowego stężenia 5 x 104 komórek/ml.
  5. Dodać 1 ml zawiesiny komórkowej do każdego elementu cewnika pokrytego surowicą.
  6. Energicznie wirować i upewnić się, że cewniki są zanurzone w pożywce i nie unoszą się na górze.
  7. Inkubować cewniki w temperaturze 37 °C przez 90 minut (okres przylegania).
  8. Wyjmij cewniki sterylną pęsetą i umyj je dwukrotnie 1 ml PBS. Na tym etapie upewnij się, że płyn do płukania przechodzi przez światło, utrzymując cewnik w pozycji pionowej, jednocześnie bardzo delikatnie przepłukując cewniki. Co ważne, nie należy stosować silnego przepływu, który może prowadzić do usunięcia przyczepionych komórek.
  9. Przenieś każdy umyty cewnik do czystej probówki do mikrowirówki (po jednej sztuce na probówkę).
  10. Umieść na lodzie i trzymaj tam do operacji.

5. Znieczulenie

  1. Przygotować znieczulenie, mieszając 75 μl ketaminy (100 mg/ml) ze 100 μl medetomidyny (1 mg/ml) i 825 μl jałowej soli fizjologicznej. Podawać dootrzewnowo (i.p.) 60-80 μl koktajlu znieczulającego na 10 g masy ciała, co daje dawkę 45-60 mg/kg ketaminy i 0,6-0,8 mg/kg medetomidyny.
  2. W celu odwrócenia znieczulenia należy rozcieńczyć 50 μl atipamezolu (5 mg/ml) w 4,95 ml soli fizjologicznej, podać i.p. 100 μl na 10 g masy ciała jako antidotum, co daje dawkę 0,5 mg/kg.
  3. Po wstrzyknięciu znieczulenia umieść zwierzę w osobnej klatce i poczekaj, aż całkowicie zaśnie.
  4. Potwierdź prawidłowe znieczulenie zwierzęcia poprzez lekkie szczypanie skóry i szczypanie palców u stóp, które nie powodują żadnych uszkodzeń skóry. Każdy zaobserwowany ruch wskazuje, że zwierzę nie jest wystarczająco znieczulone, aby wykonać operację. Jeśli tak się stanie, odczekaj kilka minut dłużej, aż zwierzę nie będzie wykazywać żadnych oznak ruchu na skórze lub szczypnięciu palców.

6. Chirurgia zwierząt

  1. Przenieść znieczulone zwierzę z klatki na czystej chusteczce umieszczonej na poduszce grzewczej, wstępnie podgrzanej do 37 °C (Rysunek 2A, (1)).
    UWAGA: Tańszą alternatywą jest użycie podgrzewanych elektrycznie. Możliwe jest również użycie elektrod izotermicznych, które przed operacją na zwierzętach należy podgrzać w kuchence mikrofalowej.
  2. Nałóż maść okulistyczną na oczy.
  3. Ogol dolną część pleców zwierzęcia elektryczną maszynką do golenia. Usuń wszystkie sierść zwierząt i przenieś zwierzę na czystą chusteczkę. Zdezynfekuj skórę (np. 1% izopropanolem jodowym lub 0,5% chlorheksydyną w 70% alkoholu) i pozostaw zdezynfekowany obszar do wyschnięcia na około 1 minutę (Rysunek 2A, (2)).
  4. Wykonaj małe nacięcie na skórze (jedno po lewej i jedno po prawej stronie zwierzęcia) (około 0,5–1 cm) (ryc. 2A, (3)).
  5. Wypreparuj tkankę podskórną nożyczkami, aby utworzyć dwa podskórne tunele. Każdy tunel powinien mieć około 1,5 cm długości i 1 cm szerokości.
  6. Do każdego tunelu należy wprowadzić trzy kawałki cewnika, wcześniej zakażone Candida. Upewnij się, że cewniki leżą obok siebie w układzie poziomym i nie zakrywają się nawzajem, aby umożliwić wszczepienie łącznie sześciu fragmentów cewnika (Rysunek 2A, (4)).
  7. Zamknij nacięcia szwami. Alternatywnie, użyj Dermabond, aby zamknąć ranę.
  8. Bardzo delikatnie zdezynfekować ranę 0,5% chlorheksydyną w 70% alkoholu lub izopropanolem jodowym (1%).
  9. Znieczulenie miejscowe (żel ksylocainy, 2%) należy nałożyć bezpośrednio na ranę.
  10. Podać odwrócenie znieczulenia (protokół 5, krok 2): dootrzewnowo 100 μl na 10 g masy ciała.
  11. Przenieś zwierzę do czystej klatki umieszczonej wcześniej na płycie grzewczej. Trzymaj zwierzę oddzielnie i w cieple, dopóki zwierzę nie obudzi się całkowicie. W międzyczasie kontynuuj operację i implantację następnego zwierzęcia. Gdy wszystkie operowane zwierzęta są w pełni przytomne. Przenieś do jednej klatki. Regularnie monitoruj zwierzęta.

7. Obrazowanie bioluminescencyjne: przygotowanie celelenterazyny (CTZ), substratu dla lucyferazy G. princeps

  1. Przygotować świeży roztwór podstawowy coelenterazine (CTZ), rozpuszczając 5 mg/ml CTZ w zakwaszonym etanolu lub zgodnie z instrukcjami producenta.
  2. Przygotować roztwór roboczy o stężeniu 1,2 mM, rozcieńczając roztwór podstawowy w stosunku 1:10 w sterylnym PBS.
    UWAGA: Wstrzyknąć 100 μl roztworów roboczych CTZ podskórnie w okolice cewników. Do podskórnego wstrzykiwania CTZ należy używać strzykawek insulinowych.
  3. Zawsze przechowuj CTZ w ciemności (np. przykryj probówki do mikrowirówek zawierające CTZ folią aluminiową). Przechowywać roztwór podstawowy w temperaturze -80 °C przez czas trwania doświadczeń.

8. Obrazowanie bioluminescencyjne

  1. Zainicjuj kamerę BLI.
  2. Znieczulij zwierzęta za pomocą pudełka indukcyjnego. Użyj mieszaniny gazów izofluranu w tlenie, N2O/ O2 lub powietrza o stężeniu 2-3%.
  3. Po indukcji należy utrzymać znieczulenie w skrzynce indukcyjnej oraz w komorze obrazowania na poziomie 1,5-2%.
  4. Przed rozpoczęciem sesji obrazowania umieść płytkę obrazową w pozycji A, która odpowiada polu widzenia 10 cm. Upewnij się, że wyloty znieczulenia i zwierzę znajdują się we właściwej pozycji, umieszczając śpiące zwierzę w pudełku.
  5. Zrób kilka zdjęć, aż zwierzę znajdzie się w żądanej pozycji obrazowania, w polu widzenia tuż pod aparatem.
  6. Przygotować dwie strzykawki insulinowe, z których każda zawiera 100 μl roztworu roboczego CTZ.
  7. Połóż jedno zwierzę na ławce i utrzymuj je w uśpieniu za pomocą stożka nosowego zapewniającego znieczulenie gazowe.
  8. Umieścić igły strzykawek w miejscu otaczającym cewniki podskórnie i jednocześnie wstrzyknąć CTZ na cewniki.
  9. Natychmiast po wstrzyknięciu należy umieścić zwierzę na ciepłej płytce w pudełku z aparatem i rozpocząć akwizycję obrazu bioluminescencyjnego.
  10. Uzyskuj kolejne skany z czasem akwizycji od 20 do 60 sekund (w zależności od intensywności sygnału), aż do osiągnięcia maksymalnej intensywności sygnału. Podczas akwizycji następnej ramki zmierz intensywność sygnału BLI wcześniej pozyskanych ramek, umieszczając ROI na każdym trio cewników i mierząc strumień fotonów przez ten ROI.
  11. Powtórz czynności od kroku 7 dla następnego zwierzęcia (zwierząt).
  12. Po zobrazowaniu przywróć zwierzęta do ich klatki. Powtórz BLI w trakcie eksperymentu w celu podłużnej, nieinwazyjnej obserwacji tworzenia biofilmu.
  13. Analizuj dane BLI za pomocą oprogramowania Living Image. Umieść prostokątny zwrot z inwestycji o stałym rozmiarze na każdym trio cewnika i zmierz strumień fotonów (promieniowanie) przez każdy ROI. Powtórz to dla każdego zwierzęcia.
  14. Podaj intensywność sygnału BLI każdego trio cewnika jako strumień fotonów na sekundę. Przedstaw dane BLI w skali logarytmicznej, wykreślając średnią i SD strumienia fotonów na sekundę dla każdej grupy. Wykonaj analizę statystyczną na przekształconych danych z dziennika10.

9. Eksplantat cewnika

  1. Przygotować probówki do mikrowirówek zawierające 1 ml PBS, po jednej dla każdego urządzenia do cewnika i przechowywać je na lodzie.
  2. Poddaj zwierzęta eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy (ryc. 2B, (1)).
  3. Zdezynfekuj skórę pleców 0,5% chlorheksydyną w 70% alkoholu lub izopropanolem jodowym (1%).
  4. Wykonaj nacięcie (około 3 cm) nad cewnikami.
  5. Przeciąć tkankę podskórną i usunąć fragmenty cewnika jeden po drugim spod tkanki podskórnej za pomocą sterylnej pęsety (ryc. 2B, (2)).
  6. Delikatnie obchodź się z cewnikiem w pozycji pionowej i umyj go dwukrotnie 1 ml sterylnego PBS. Umieść każdy kawałek cewnika w osobnej probówce do mikrowirówki (przygotowanej w kroku 1).

10. Kwantyfikacja komórek związanych z biofilmem za pomocą liczby jednostek tworzących kolonie (CFU) i analizy statystyczne wyników

  1. Cewniki umieszczone wcześniej w 1 ml PBS należy poddać sonizacji na 10 minut przy 40 000 Hz w sonikatorze łaźni wodnej i umieścić je na lodzie.
  2. Po sonikacji energicznie wirować przez 30 sekund i ponownie umieścić na lodzie.
  3. Przygotować dwie dodatkowe probówki do mikrowirówek zawierające 900 μl PBS.
  4. Wykonaj rozcieńczenia w stosunku 1:10 i 1:100 z oryginalnej próbki (tej, która zawiera cewnik) i trzymaj wszystkie probówki do mikrowirówek na lodzie.
  5. Umieścić 100 μl oryginalnych próbek, rozcieńczenia w stosunku 1:10 i 1:100 na płytkach agarowych YPD w dwóch egzemplarzach.
  6. Inkubować płytki przez 2 dni w temperaturze 37 °C i policzyć jtk.
  7. Policz kolonie wyhodowane na płytkach agarowych YPD (policzalna ilość kolonii, maksymalnie 300 kolonii/płytkę) i pomnóż je przez odpowiedni współczynnik rozcieńczenia (1x pierwotne, 10x lub 100x rozcieńczenie). Następnie pomnóż każdy kawałek cewnika przez 10x, co odpowiada końcowej ilości kolonii w 1 ml probówce zawierającej cewnik. Doprowadź końcową ilość kolonii do logowania10 komórek/kawałek cewnika z odchyleniem standardowym (SD). Wyrażanie danych jako średniej ± SD.
  8. Umieść wszystkie wartości dla każdego cewnika i określonej grupy w arkuszu kalkulacyjnym i/lub programie statystycznym, aby wykonać wyżej wymienione obliczenia i analizy statystyczne. Wskaż konkretne grupy do porównania, np. WT vs. mutant lub 2 dni vs. 6-dniowe tworzenie biofilmu i wykonaj niesparowany test t i ANOVA z testem końcowym Tukeya na danych przekształconych w log10.
    1. Wyraź poziom istotności za pomocą wartości p. W tym badaniu wskaż istotność, jeśli wartość p <0,05, reprezentowana następująco: * p <0,05, **p <0,005, ***p <0,0005.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W niniejszym badaniu przedstawiamy procedurę chirurgiczną implantacji i eksplantacji cewnika podczas rozwoju biofilmu C. albicans in vivo u myszy. Ponadto prezentujemy ilościowe oznaczanie dojrzałych biofilmów nie tylko za pomocą klasycznego liczenia CFU, ale również przy użyciu BLI.

Jak pokazano na Rysunku 1A, niefosforyzujące fragmenty cewnika poliuretanowego zostały pocięte na urządzenia o długości 1 cm, a następnie powleczone surowicą. Ten krok jest bardzo ważny, ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykorzystanie modeli zwierzęcych, a zwłaszcza modeli gryzoni, do badań poświęconych biofilmom mikrobiologicznym jest bardzo ważne, ponieważ układ odpornościowy gospodarza jest istotnym czynnikiem w tworzeniu biofilmu, którego modele in vitro nie mogą uwzględnić. W tym badaniu opisujemy stosunkowo prosty podskórny model biofilmu myszy C. albicans , który można łatwo zaadoptować w laboratorium badawczym i nie wymaga dużych umiejętności technicznych. Model ten został pierwotnie opracowany do badania tworze...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez KU Leuven PF 'IMIR', społeczność badawczą FWO zajmującą się biologią i ekologią biofilmów bakteryjnych i grzybowych (FWO: WO.026.11N) oraz przez projekt FWO G.0804.11. SK z wdzięcznością dziękuje KU Leuven za stypendium PDMK 11/089 oraz FWO za stypendium podoktorskie. Jesteśmy wdzięczni Nico Vangoethemowi za pomoc w przygotowaniu figurek. Serdecznie dziękujemy Celii Lobo Romero za pomoc techniczną podczas procedur eksperymentalnych in vivo.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Ekstrakt drożdżowy granulowanyMerckMERC1.03753.0500
Pepton bakteriologicznyOxoidLP037B
Agar granulowanyDifco214530
D-(+)-glukozaFluka49159-5KG
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Przygotowane w laboratoriumna 1L 10x PBS: 80 g NaCl, 2 g KCl, 14,4 g Na2HPO4, 2,4 g KH2PO4
RPMI1640 z L-glutaminą i bez węglanu sodu SigmaR6504-1LPrzygotuj się zgodnie z protokołem do badania lekowrażliwości Candida albicans 
Kwas 3-(N-Morfolino)propanosulfonowy (MOPS)SigmaM1254MOPS służy do regulacji pH pożywki RPMI (pH 7,0)
płodowej surowicy bydlęcej (FBS)SigmaF7524
Poliuretanowy cewnik dożylny z flaków (średnica 2,4 mm, Certofix Trio S730) BBraunCV-15703Część poliuretanowa pocięta na 1 cm kawałki
DeksametazonFagron SAS, Francja611139Lek immunosupresyjny (roztwór podstawowy 10 mg/ml)
Ampicylina Duchefa Biochemie, HolandiaA0104Profilaktyka przeciwbakteryjna
Ketamina 1000Pfizer804 119Środek znieczulający
DomitorPfizer134737-1Znieczulający
środek przeciw spoczynkowiPfizer134783-2Odwrócenie znieczulenia
Żel Xylocaine (2%) - to jest LinisolAstraZeneca352 1206Znieczulenie miejscowe skóry
Terramycyna/ polimyxin-b maśćAby zapobiec wysuszeniu i infekcjom oczu
Coelenterazine Prolume (Nanolight)NF-CTZ-FBŚrodek wrażliwy na światło (należy przechowywać w ciemności)
Izopropanol jodowy (1%)3M&handel; DuraPrep i handel;  Środek dezynfekujący do skóry
0,5 % chlorheksydyny w 70 % alkoholu.  CediumŚrodek dezynfekujący do skóry
Sprzęt
Komora
Strzykawki insulinowe (0,3 ml)Terumo Myjector 29G324826Do wstrzykiwań coelenterazine
Elektryczna maszynkaDla małych zwierząt
Sterylne narzędziaNożyczki, 2 pary pęsety, skalpel
Poduszka grzewczaLeica14042321474
Szew do skóryJohnson& JohnsonK890HNić chirurgiczna, igła
Sonikator do kąpieli wodnejKamera BLI Branson 2210
(IVIS Spectrum) Perkin Elmer, oprogramowanie AlamedaIVISSPE
Living Image Perkin Elmer, Alameda(wersja 4.2) 
okulistyczna do liczenia komórek do golenia chirurgiczne

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yapar, N. Epidemiology and risk factors for invasive candidiasis. Ther Clin Risk Manag. 10, 95-105 (2014).
  2. Tournu, H., Van Dijck, P. Candida biofims and the host: models and new concepts for eradication. Int J Microbiol. 2012, 845352(2012).
  3. Taff, H. T., Mitchell, K. F., Edward, J. A., Andes, D. R. Mechanisms of Candida biofilm drug resistance. Future Microbiol. 8 (10), 1325-1337 (2013).
  4. Mathé, L., Van Dijck, P. Recent insights into Candida albicans biofilm resistance mechanisms. Curr Genet. 59 (4), 251-264 (2013).
  5. Kucharíková, S., et al. Activities of systematically administered echinocandins against in vivo mature Candida albicans. biofilms developed in a rat subcutaneous model. Antimicrob Agents Chemother. 57 (5), 2365-2368 (2013).
  6. Kuhn, D. M., George, T., Chandra, J., Mukherjee, P. K., Ghannoum, M. A. Antifungal susceptibility of Candida biofilms: Unique efficacy of amphotericin B lipid formulations and echinocandins. Antimicrob Agents Chemother. 46 (6), 1773-1780 (2002).
  7. Ramage, G., et al. Liposomal amphotericin B displays rapid dose-dependent activity against Candida albicans biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 57 (5), 2369-2371 (2013).
  8. Andes, D., et al. Development and characterization of an in vivo central venous catheter Candida albicans biofilm model. Infect Immun. 72 (10), 6023-6031 (2004).
  9. Schinabeck, M. K., et al. Rabbit model of Candida albicans biofilm infection: liposomal amphotericin B antifungal lock therapy. Antimicrob Agents Chemother. 48 (5), 1727-1732 (2004).
  10. Lazzell, A. L., et al. Treatment and prevention of Candida albicans biofilms with caspofungin in a novel central venous catheter murine model of candidiasis. J Antimicrob Chemother. 64 (3), 567-570 (2009).
  11. Nett, J. E., Marchillo, K., Spiegel, C. A., Andes, D. R. Development and validation of an in vivo Candida albicans biofilm denture model. Infect Immun. 78 (9), 3650-3659 (2010).
  12. Wang, X., Fries, B. A murine model for catheter associated Candiduria. J Med Microbiol. 60 (10), 1523-1529 (2011).
  13. Harriott, M. M., Lilly, E. A., Rodriguez, T. E., Fidel, P. L. J., Noverr, M. C. Candida albicans forms biofilms on the vaginal mucosa. Microbiology. 156 (12), 3635-3644 (2010).
  14. Dongari-Bagtzoglou, A., Kashleva, H., Dwivedi, P., Diaz, P., Vasilakos, J. Characerterization of mucosal Candida albicans biofilms. PloS One. 4, e7976(2009).
  15. Ricicová, M., Kucharíková, S., Tournu, H., Hendrix, J., Bujdáková, H., Van Eldere, J., Lagrou, K., Van Dijck, P. Candida albicans biofilm formation in a new in vivo rat model. Microbiol. 156, 909-919 (2010).
  16. Kucharíková, S., Tournu, H., Holtappels, M., Van Dijck, P., Lagrou, K. In vivo efficacy of anidulafungin against Candida albicans mature biofilms in a novel rat model of catheter-associated candidiasis. Antimicrob Agents Chemother. 54 (10), 4474-4478 (2010).
  17. Bink, A., et al. The nonsteroidal antiinflammatory drug diclofenac potentiates the in vivo activity of caspofungin against Candida albicans biofilms. J Infect Dis. 206 (11), 1790-1797 (2012).
  18. Van de Velde, G., Kucharíková, D., Schrevens, D., Himmelreich, U., Van Dijck, P. Towards non-invasive monitoring of pathogen-host interactions during Candida albicans biofilm formation using in vivo bioluminescence. Cell Microbiol. 16 (1), 115-130 (2014).
  19. Van de Velde, G., Kucharíková, S., Van Dijck, P., Himmelreich, U. Bioluminescence imaging of fungal biofilm development in live animals. Methods in Molecular Biology. 1098, 153-167 (2014).
  20. Gahan, C. G. The bacterial lux reporter system: applications in bacterial localisation studies. Curr Gene Ther. 12 (1), 12-19 (2012).
  21. Doyle, T. C., Nawotka, K. A., Kawahara, C. B., Francis, K. P., Contag, P. R. Visualizing fungal infections in living mice using bioluminescent pathogenic Candida albicans strains transformed with the firefly luciferase gene. Microb Pathog. 40 (2), 82-90 (2006).
  22. Enjalbert, B., et al. A multifunctional synthetic Gaussia princeps luciferase reporter for live imaging of Candida albicans infections. Infect Immun. 77 (11), 4847-4858 (2009).
  23. Mosci, P., et al. A novel bioluminescence mouse model for monitoring oropharyngeal candidiasis in mice. Virulence. 4 (3), 250-254 (2013).
  24. Van Wijngaerden, E., et al. Foreign body infection: a new rat model for prophylaxis and treatment. J. Antimicrob. Chemoth. 44 (5), 669-674 (1999).
  25. Nobile, C. J., Mitchell, A. P. Regulation of cell-surface genes and biofilm formation by the C. albicans transcription factor Bcr1p. Curr. Biol. 15 (12), 1150-1155 (2005).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Podsk rny model mysiimplantacja cewnikalucyferaza Gaussiamonitorowanie nieinwazyjnetworzenie biofilmu grzybiczegoprzesiewowe badanie lek w przeciwgrzybicznychoddzia ywania gospodarz patogenobrazowanie in vivo

Powiązane artykuły