Method Article

Protokoły cytometrii przepływowej do powierzchniowych i wewnątrzkomórkowych analiz antygenowych typów komórek nerwowych

DOI:

10.3791/52241

⸱

December 18th, 2014

 ,  ,  ,  , 
1Emmy Noether-Group for Stem Cell Biology, Department of Molecular Embryology, Institute of Anatomy and Cell Biology, University of Freiburg, 2Spemann Graduate School of Biology and Medicine and Faculty of Biology, University of Freiburg, 3School of Life Sciences, Keele University, 4Center for Biological Signaling Studies (BIOSS), University of Freiburg

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dostarczamy szczegółowy opis protokołu analizy cytometrycznej powierzchni i/lub antygenów wewnątrzkomórkowych w typach komórek nerwowych. Wyjaśniono kluczowe aspekty planowania eksperymentalnego, procedury metodologiczne krok po kroku i podstawowe zasady cytometrii przepływowej, aby umożliwić neurobiologom wykorzystanie tej potężnej technologii.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cytometria przepływowa była szeroko stosowana do definiowania populacji komórek w immunologii, hematologii i onkologii. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy opis protokołów analizy cytometrii przepływowej antygenów powierzchniowych klastrów różnicowania (CD) i antygenów wewnątrzkomórkowych w typach komórek nerwowych. Nasz opis procedur metodologicznych krok po kroku obejmuje: pobieranie kultur neuronalnych in vitro, opcjonalny etap znakowania estrem sukcynimidylu karboksyfluoresceiny (CFSE), a następnie barwienie antygenu powierzchniowego za pomocą sprzężonych przeciwciał CD (np. CD24, CD54), a następnie wewnątrzkomórkowe wykrywanie antygenu za pomocą przeciwciał pierwszorzędowych/drugorzędowych lub znakowanych fluorescencyjnie fragmentów Fab (znakowanie zenon). Film pokazuje najważniejsze kroki. Ponadto pokrótce wyjaśniono zasady planowania eksperymentalnego, włączenie krytycznych kontroli oraz podstawy analizy cytometrii przepływowej (identyfikacja populacji docelowej i wykluczenie zanieczyszczeń; strategia bramkowania; kompensacja nakładania się spektralnego), aby umożliwić neurobiologom z ograniczoną wcześniejszą wiedzą lub specjalistycznym szkoleniem w zakresie cytometrii przepływowej ocenę jej użyteczności i lepsze wykorzystanie tej potężnej metodologii.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cytometria przepływowa była szeroko wykorzystywana w immunologii, hematologii i onkologii do definiowania populacji komórek poprzez wewnętrzne właściwości rozpraszania, ekspresję antygenu na powierzchni komórki i inne parametry fluorescencji1-3. Nasze spostrzeżenia na temat rozwoju linii krwi i chorób są w znacznym stopniu wynikiem ciągłego udoskonalania tej metodologii po jej początkowym wdrożeniu4,5. Rosnąca świadomość ilościowego i ogólnego potencjału analitycznego cytometrii przepływowej zachęciła ostatnio do jej szerszego stosowania w badaniach nad komórkami macierzystymi i może umożliwić podobnie głęboki postęp w krótszym czasie6. Jednak zastosowanie cytometrii przepływowej do specyficznej analizy i izolacji populacji neuronów od dawna jest postrzegane jako wyzwanie. W przeciwieństwie do komórek krwiotwórczych, które naturalnie występują w zawiesinie, typy komórek nerwowych są zwykle zbierane z nadmiernie złożonych źródeł, które mogą obejmować komórki glejowe i różne inne otaczające komórki, a także skomplikowaną sieć neuronów przenoszących proces. W związku z tym neurobiologia musi jeszcze w pełni wykorzystać wszechstronność cytometrii przepływowej w codziennych rutynowych badaniach. Jednak tak długo, jak można wytworzyć żywotną zawiesinę pojedynczej komórki (a protokoły zostały opracowane i zoptymalizowane w tym celu7), cytometria przepływowa i sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) mogą być uważane za cenny element repertuaru analitycznego w neurobiologii8-11.

Diagram cytometrii przepływowej; zawiesina jednokomórkowa, wzbudzenie laserowe, detekcja rozproszenia, fluorescencja.
Rysunek 1. Zasada analizy cytometrii przepływowej i elementy cytometru przepływowego. Cytometry przepływowe składają się z trzech głównych systemów: fluidyki, optyki i elektroniki. Usprawniony przepływ komórek w zawiesinie (przygotowanej z tkanki pierwotnej lub hodowli in vitro) jest osiągany przez płyn osłonki poprzez ogniskowanie hydrodynamiczne, ograniczając próbkę do jej środkowego rdzenia. Części optyczne składają się z laserów, które oświetlają strumień komórek oraz filtrów optycznych, które kierują sygnał do odpowiednich detektorów. Wykryte sygnały świetlne są przekształcane w sygnały elektroniczne, a następnie przetwarzane przez komputer i wizualizowane na monitorze w celu analizy danych i bramkowania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Użytkownicy metod cytometrii przepływowej korzystają z przynajmniej podstawowej wiedzy na temat podstaw, w tym elementów składowych cytometru (dla przeglądu patrz12,13; zobacz także Rysunek 1). Wiązka laserowa przecina się z hydrodynamicznie skupionym strumieniem płynu, który zawiera komórki w zawiesinie, które z kolei przechodzą przez wiązkę laserową w "jednym pliku" jedna po drugiej. Przechwycenie komórki (lub jakiejkolwiek innej cząstki) za pomocą lasera powoduje rozproszenie światła z tego punktu przesłuchania. Światło rozproszone może być wykrywane w kontynuacji kierunku lasera (rozproszenie do przodu, związane z wielkością cząstki), a także prostopadłe do jej kierunku (rozproszenie boczne; odzwierciedlające ziarnistość cząstki/komórki). Te wyżej wymienione właściwości rozproszenia nie wymagają specjalnego etykietowania, dlatego nieoznakowana próbka (lub również szczątki komórkowe, pęcherzyki powietrza itp.) wygeneruje sygnał (zdarzenie) na dwuwymiarowym wykresie rozproszenia do przodu w stosunku do bocznego wykresu punktowego, powszechnie używanego do początkowego bramkowania. Stosując odpowiednie lasery i filtry specyficzne dla odpowiednich widm wzbudzenia i emisji, komórka może być analizowana pod kątem jej pozytywności, poziomu intensywności lub braku markerów fluorescencyjnych. Większość zastosowań cytometrii przepływowej koncentrowała się na charakterystyce za pomocą antygenów powierzchniowych komórek. W przeciwieństwie do linii hematopoetycznej, linia neuronalna pozostała mniej szczegółowo zdefiniowana zgodnie z wzorcami ekspresji epitopów powierzchniowych5. Jedną z zalet wykorzystania antygenów powierzchniowych jest to, że żywe komórki można poddać paradygmatom sortowania komórek, takim jak FACS. W przeciwieństwie do tego, wewnątrzkomórkowe barwienie antygenu wymaga etapów utrwalania i przepuszczalności, aby pośredniczyć w interakcji epitop-przeciwciało, co wyklucza dalsze zastosowania, które wymagają żywotnych komórek. Warto zauważyć, że takie podejścia nadal pozwalają na liczne testy ilościowe14, a także dalsze analizy ekspresji RNA i białek15. Hematologia, immunologia i onkologia często wykorzystywały łącznie więcej niż tuzin markerów do definiowania poszczególnych subpopulacji16. Dodatkowo, cytometria masowa lub CyTOF może być teraz używana do jednoczesnej analizy do 30 parametrów17,18.

Dla zastosowań neuronalnych komórek macierzystych, jak również w hodowlach pierwotnych14,19,20, niejednorodność komórek in vitro jest powszechnym zjawiskiem21-23. Komórki niereprezentujące populacji docelowej będącej przedmiotem zainteresowania ucieleśniają potencjalnie czynnik zakłócający odczyt eksperymentalny24,25. Dogodnie, różne podzbiory komórkowe obecne w heterogenicznej zawiesinie komórkowej mają odrębne (znane lub jeszcze nie rozszyfrowane) profile ekspresji antygenu, które można wykorzystać do zdefiniowania tych różnych populacji. Cytometria przepływowa może zatem odgrywać kluczową rolę w rozwiązywaniu niejednorodności komórkowej, a tym samym ułatwiać zastosowania biomedyczne (testy in vitro, terapia komórkowa) i optymalizować odczyt ilościowy, koncentrując się na najbardziej odpowiednim podzbiorze24,26. W ciągu ostatnich kilku lat zidentyfikowano różne kombinacje antygenów powierzchniowych, aby umożliwić ilościowe określenie i izolację określonych typów komórek nerwowych. Obejmuje to CD133 do wzbogacania nerwowych komórek macierzystych27, kombinację antygenów powierzchniowych CD15 / CD24 / CD29 do izolacji NSC, zróżnicowanych neuronów i komórek grzebienia nerwowego28 lub CD15 / CD24 / CD44 / CD184 / CD271 w celu wyizolowania podzbiorów nerwowych i glejowych25, wśród innych sygnatur29,30. Poza neuronami, markery glejowe obejmują A2B531, CD4425, NG232 i GLAST33. W niedawnej publikacji wykorzystano marker prekursorowy płytki podłogowej śródmózgowia CORIN34,35 w celu wzbogacenia o prekursory dopaminergiczne w paradygmatach przeszczepu komórek Parkinsona36. Cząsteczki CD są nie tylko markerami, ale funkcjonalnie istotnymi mediatorami interakcji komórka-komórka oraz zdolności komórki do reagowania na sygnały z cząsteczek macierzy zewnątrzkomórkowej i czynników wzrostu37. Jedną ze strategii dalszego wzmacniania arsenału kombinatorycznych antygenów CD w celu scharakteryzowania rozwoju linii neuronalnej jest wykorzystanie znanych markerów wewnątrzkomórkowych do badań przesiewowych i zdefiniowania kombinacji antygenów CD dla określonego typu komórek będących przedmiotem zainteresowania. Niedawno wykorzystaliśmy takie podejście i zidentyfikowaliśmywysokie kombinatoryczne wzorce ekspresji CD49f–/CD200 jako nowatorskie podejście do wzbogacania podzbiorów neuronów z indukowanych nerwowo pluripotencjalnych systemów hodowli komórek macierzystych38. W tym miejscu uwzględniamy i omawiamy ten ostatni protokół (i jego opcjonalne odmiany), w którym barwienie powierzchni i barwienie wewnątrzkomórkowe mogą być stosowane jednocześnie do definiowania subpopulacji komórek nerwowych za pomocą cytometrii przepływowej.

Diagram procesu sortowania komórek nerwowych dla FACS z wykorzystaniem znakowania barwnikiem CFSE i analizy cytometrii przepływowej.
Rysunek 2. Diagram przepływu opcji protokołu eksperymentalnego. Rysunek przedstawia schematyczne przedstawienie głównych kroków związanych z protokołem. Opcjonalne kroki (barwnik CFSE lub wewnątrzkomórkowe znakowanie antygenu) są oznaczone jasnoszarymi polami. Po zbiorach należy ocenić żywotność i liczbę zawiesin komórek nerwowych przed barwieniem powierzchni komórek. Oprócz próbek będących przedmiotem zainteresowania należy uwzględnić zarówno kontrole pozytywne, jak i ujemne. Próbki mogą być analizowane za pomocą analizy cytometrycznej przepływowej i/lub wykorzystywane w paradygmatach sortowania komórek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Podczas gdy wcześniej używaliśmy przeciwciała pierwotnego w połączeniu z przeciwciałem drugorzędowym do barwienia wewnątrzkomórkowego38, teraz wprowadzamy niekowalencyjne znakowanie przeciwciała pierwotnego za pomocą fluorescencyjnych fragmentów Fab (znakowanie Zenon) jako niewielką odmianę, zmniejszając w ten sposób etapy manipulacji komórkami39. Ponadto, jako kolejny przykład wszechstronności protokołu, stosujemy opcjonalne znakowanie jednego podzbioru eksperymentalnego estrem sukcynimidylu karboksyfluoresceiny (CFSE) przed barwieniem antygenu powierzchniowego. Takie wstępne znakowanie CFSE umożliwia natychmiastowe bezpośrednie porównanie dwóch linii komórkowych lub warunków eksperymentalnych (znakowane CFSE i nieznakowane) w jednej probówce z próbką, zmniejszając wariancję lub subtelne różnice w czasie inkubacji i oszczędzając przeciwciała. CFSE jest uznanym barwnikiem fluorescencyjnym, który jest powszechnie stosowany do śledzenia komórek40, w eksperymentach z proliferacją41,42 i kodami kreskowymi43,44. Wreszcie, chociaż rzeczywiste etapy sortowania (FACS, immunomagnetyczna separacja komórek lub immunopanning) nie są częścią tego protokołu, w zasadzie opisane tutaj procedury zbierania i etykietowania dają próbki, które można poddać aplikacjom sortowania opartym na antygenach powierzchniowych lub etykietowaniu wewnątrzkomórkowym15 25,28.

W tym artykule dążymy do: podsumowania możliwego do użycia protokołu barwienia antygenem powierzchniowym25,28, podsumowania protokołu wykrywania celów wewnątrzkomórkowych, jak również połączonej analizy antygenów powierzchniowych i wewnątrzkomórkowych38, przedstawienia etapu wewnątrzkomórkowego znakowania barwnikiem CFSE41,45 jako eksperymentalnej opcji do analiz porównawczych populacji komórek nerwowych oraz podsumowania podejść do analizy cytometrycznej przepływowej (odpowiednie kontrole13,46, strategia bramkowania i prezentacja danych47).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Zbieranie komórek nerwowych

  1. Ocena pod mikroskopem:
    1. Przed rozpoczęciem eksperymentu należy sprawdzić stan hodowli za pomocą mikroskopii w jasnym polu lub mikroskopii z kontrastem fazowym.
      UWAGA: Podczas gdy pierwotna tkanka nerwowa uzyskana z sekcji jest w zasadzie równie podatna na analizę cytometryczną przepływową14,28, należy pamiętać, że protokół koncentruje się na komórkach uzyskanych z systemów komórek nerwowych in vitro.
  2. Pobieranie komórek7:
    1. Delikatnie umyć naczynie/kolbę przylegających komórek solą fizjologiczną (PBS) buforowaną fosforanem (PBS) w temperaturze pokojowej (np. 5 ml dla kolby T75, 3 ml na dołek dla płytki 6-dołkowej lub 10 ml dla naczynia 10 cm).
      UWAGA: PBS używany w całym protokole jest wolny od Mg2 + / Ca2+.
      1. W przykładzie wideo użyj kolby T75 z komórkami nerwiaka zarodkowego SH-SY5Y przy 80% zbiegu. Zastosuj dodatkowe etapy mycia w przypadkach, gdy w naczyniu znajduje się znaczna ilość zanieczyszczeń.
      2. Należy rozważyć przemywanie gradientami wirowania PBS48, Percoll lub Ficoll49 zawierającymi albuminę surowicy i/lub dostępnymi w handlu kulkami50,51. Usunięcie mieliny i innych lipidów lub innych zanieczyszczeń ma kluczowe znaczenie, szczególnie gdy wykorzystywane są pierwotne źródła tkanek dorosłych.
    2. Dodać wstępnie podgrzaną (37 °C) trypsynę zastępującą trypsynę w odpowiedniej objętości, która pokrywa całą powierzchnię naczynia do hodowli tkankowej.
      UWAGA: Alternatywnie rozważ Accutazę lub inne opcje trawienia enzymatycznego. Ten krytyczny etap może negatywnie wpłynąć na ekspresję epitopów powierzchniowych (patrz 7).
    3. Inkubować naczynie/kolbę w temperaturze 37 °C przez 2-5 minut (w zależności od typu komórek), aby umożliwić oderwanie komórek. Delikatnie postukaj w naczynie hodowli tkankowej lub przepłucz pipetą serologiczną, aby usunąć komórki. Unikaj nadmiernego trawienia (ponieważ może to spowodować utratę komórek i krzepnięcie na późniejszych etapach).
    4. Ugasić substytucję trypsyny, dodając dwukrotność objętości buforu przepływowego (2% FBS w PBS) i zebrać komórki w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.
    5. Delikatnie rozprowadzić zawiesinę komórkową za pomocą pipety mikrolitrowej (100 - 1 000 μl) lub pipety serologicznej o pojemności 5 ml w celu przygotowania zawiesiny jednokomórkowej.
    6. Odwirować komórki przy 220 x g przez 5 minut w temperaturze 25 °C. Ostrożnie odessać supernatant, pozostawiając osad.
    7. Ponownie zawiesić osad w odpowiedniej objętości bufora przepływowego, w zależności od wielkości osadu (np. dla jednej zlewającej się kolby T75 komórek SH-SY5Y typowa wydajność wynosi co najmniej 10 x 106 komórek, w którym to przypadku komórki są ponownie zawieszane w 5 ml buforu przepływowego).
      UWAGA: Jeśli zaobserwuje się większe kawałki lub skrzepy, przefiltruj przez siatkę 30 - 100 μm.
  3. Liczenie komórek52:
    1. Przenieść małą porcję zawiesiny komórek do probówki mikrowirówkowej i rozcieńczyć w określonym stosunku w objętości błękitu trypanowego lub alternatywnego barwnika żywotności przed przeniesieniem do hemocytometru lub automatycznego systemu liczenia komórek.
    2. Rozcieńczyć zawiesinę komórek do stężenia 1 x 106 żywotnych komórek/ml, dodając odpowiednią objętość buforu przepływowego lub PBS z 0,1% BSA (w przypadku znakowania CFSE).
      UWAGA: Jodek propidyny, 7-aminoaktynomycyna D, aneksyna V i dostępne w handlu zestawy do oznaczania żywotności stanowią alternatywne opcje w celu oceny żywotności komórek. Można również zastosować testy apoptozy z użyciem fluorescencji kaspazy-3, jak opisano wcześniej53. Kanały fluorescencyjne będą "zajęte" przez te odczynniki, co może ograniczyć możliwości kolejnych kroków, jeśli zostaną uwzględnione we wszystkich próbkach.

2. Wewnątrzkomórkowe etykietowanie barwników za pomocą CFSE (Rysunek 3)

  1. Rozcieńczyć CFSE do pożądanego stężenia podstawowego, które można łatwo wykorzystać.
    UWAGA: W tych eksperymentach użyto stężenia zapasowego 0,01 mM. Określ empirycznie optymalne stężenie robocze CFSE.
  2. Dodać 10 μl 0,01 mM roztworu CFSE na ml komórek (sekcja 1.3.2, stężenie 1 x 106 komórek/ml w PBS + 0,1% BSA) dla końcowego stężenia 0,1 μM. Krótko zwirować, aby dobrze wymieszać.
    UWAGA: Stężenia CFSE stosowane tutaj są około dziesięciokrotnie niższe niż te powszechnie stosowane w testach proliferacji, stąd toksyczność komórkowa barwnika jest minimalna. Nie obserwujemy negatywnego wpływu na żywotność komórek.
  3. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej ze stałym wytrząsaniem (200 obr./min). Chronić przed światłem.
  4. Ugasić barwnik, dodając do probówek 5 objętości buforu przepływowego. Wirować przy 94 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Odrzucić supernatant, pozostawiając osad. Ponownie zawieś komórki za pomocą 5 objętości bufora przepływowego.
  6. Wirować przy 94 x g przez 5 minut w suchej temperaturze ciesnej. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w buforze przepływowym o stężeniu 1 x 106 komórek/ml.
  7. Dodać równą liczbę niebarwionych komórek będących przedmiotem zainteresowania do zawiesiny barwionych komórek. Przejdź do protokołu barwienia antygenem powierzchniowym (sekcja 3).

Wykresy punktowe cytometrii przepływowej; Barwienie CFSE, CD24-APC, CD54-PE w analizie komórek; Porównanie eksperymentalne.
Rysunek 3. Wykrywanie zróżnicowanej ekspresji antygenu powierzchniowego CD między dwiema liniami komórkowymi za pomocą znakowania barwnikiem CFSE. Komórki nerwiaka zarodkowego SH-SY5Y są wstępnie znakowane CFSE w celu późniejszej identyfikacji w porównaniu z nieznakowanymi fibroblastami BJ. Współbarwienie zmieszanej próbki (prawe panele) markerami powierzchniowymi CD24 lub CD54 (oba sprzężone z APC) pokazuje, że linie komórkowe są łatwe do odróżnienia dzięki barwieniu CFSE (strzałki = SH-SY5Y; groty strzałek = fibroblasty BJ). Większość komórek SH-SY5Y wykazuje ekspresję CD24, ale nie CD54 (ICAM-1). Natomiast fibroblasty BJ (CFSE-ujemne) są dodatnie dla CD54, ale w dużej mierze ujemne dla CD24. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Barwienie powierzchni komórki

  1. Oznaczyć probówki, w tym próbki i krytyczne kontrole (patrz tabela 1).
Rura nr.Przykładowa nazwaAntygen-fluoroforRozcieńczeniu
1Niebarwione komórki-
cyfra arabskaPojedynczo barwioneCD24-APC1:50
3Pojedynczo barwioneTUJ1-Alexa fluor 488nm1:2 000
4Podwójnie barwioneCD24-APC1:50
TUJ1-Alexa fluor 488nm1:2 000
5Pojedynczo barwioneTylko wtórny: Alexa fluor 488nm1:2 000

Tabela 1. Ilośćprobówek, które mają być włączone do typowego doświadczenia z cytometrią przepływową. Tabela przedstawia minimalny zestaw probówek z próbkami wymaganych do eksperymentu ze współbarwieniem opisanego w tym artykule wideo. Idealny eksperyment musi obejmować wszystkie niezbędne kontrole (kontrole negatywne, dodatnie, a także kompensacyjne) w celu dokładnej interpretacji uzyskanych wyników.

  1. Dodać 100 μl zawiesiny komórkowej (z sekcji 2.7 lub 1.3.2) do każdej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.
    UWAGA: Upewnij się, że na 100 μl zawiesiny komórek przypada co najmniej 0,1 x 106 komórek.
  2. Dodać przeciwciało sprzężone z fluoroforem do próbki w odpowiednim rozcieńczeniu.
    UWAGA: Przed eksperymentem należy określić robocze rozcieńczenie dla każdego przeciwciała. Tabela 2 zawiera listę antygenów powierzchni neuronów.
]
antygenTyp komórkiodniesienie
Płyta CD15Nerwowe komórki macierzyste [28, 67]
Płyta CD24Komórki neuronalne[28, 68]
Płyta CD29Nerwowe komórki macierzyste[28, 69, 70]
Płyta CD44Komórki glejowe[25] Zob.
Płyta CD49fNerwowe komórki macierzyste [38] Zob.
CD56 (NCAM)Komórki neuronalne[71] Wolna Wiśnia
Płyta CD133Nerwowe komórki macierzyste [27] Zob.
Płyta CD184Nerwowe komórki macierzyste i komórki glejowe[25] Zob.
Płyta CD200Komórki neuronalne[38] Zob.
Płyta CD271Komórki macierzyste grzebienia nerwowego[25] Zob.
A2B5Komórki glejowe[31] Zob.
CorinPrekursory dopaminergiczne[35, 36]
FORSE1Nerwowe komórki macierzyste (NSC)[72
GLASTKomórki glejowe[33] Zob.
Zobacz materiał NG2Komórki glejowe[32] Zob.

Tabela 2. Selekcja antygenów powierzchniowych neuronów. Poniższa tabela zawiera listę epitopów powierzchniowych, które wykazują ekspresję w różnych typach komórek nerwowych, aby zilustrować rosnący panel antygenów powierzchniowych używanych do scharakteryzowania linii neuronalnej. Należy zauważyć, że ta selekcja jest daleka od kompletności i że większość tych markerów jest również wyrażana przez szereg innych komórek nerwowych i nieneuronalnych. W związku z tym konieczne będą kombinacje kilku markerów, aby lepiej zdefiniować i wyizolować wskazane podzbiory neuronalne.

  1. Inkubować przez 30 minut na wytrząsarce orbitalnej (200 obr./min) w ciemności.
  2. Przepływowe mycie buforowe
    1. Dodać 1 ml buforu przepływowego do probówek. Wirować przy 380 x g przez 4 minuty w temperaturze 4 °C.
    2. Odrzucić supernatant, pozostawiając osad.
  3. Powtórz ponownie krok prania.
  4. Po drugim przemyciu zdekantować supernatant i ponownie zawiesić komórki w buforze przepływowym do końcowej objętości 100 μl.
  5. Użyj próbki do analizy cytometrii przepływowej. Alternatywnie przejdź do sekcji 4 i 5.
    UWAGA: Jeśli komórki mają być sortowane i ponownie umieszczane w hodowli po FACS (tj. zawiesina komórek żywotnych bez utrwalania lub przepuszczalności), należy stosować techniki aseptyczne podczas pobierania, barwienia i etapów analitycznych.

4. Utrwalenie i przepuszczalność38

  1. Utrwalanie za pomocą paraformaldehydu (PFA):
    1. Przygotować bufor utrwalający zawierający 2% PFA w PBS.
      UWAGA: PFA jest szkodliwy dla ludzi i środowiska. Używaj odpowiednich środków ochrony osobistej i wyrzucaj odpady zgodnie z lokalnymi przepisami.
    2. Dodać 500 μl buforu utrwalającego do 100 μl zawiesiny komórek.
    3. Inkubuj probówki w temperaturze pokojowej przez 15 minut na wytrząsarce orbitalnej (100 obr./min) w ciemności.
  2. Mycie PBS:
    1. Dodać 1 ml PBS do probówki. Wirować przy 380 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C.
    2. Odlać/zdekantować supernatant, pozostawiając około 100 μl w probówce.
  3. Przepuszczalność za pomocą Tween-20:
    1. Przygotować bufor permeabilizacyjny zawierający 0,7% Tween-20 w PBS.
    2. Dodać 500 μl buforu przepuszczalnego do 100 μl zawiesiny komórek.
    3. Inkubuj probówki w temperaturze pokojowej przez 15 minut na wytrząsarce orbitalnej (100 obr./min) w ciemności.
  4. Przemyć ogniwa raz PBS (jak opisano w sekcji 4.2) i całkowicie usunąć supernatant z probówek, pozostawiając tylko osad.

5. Wewnątrzkomórkowe barwienie antygenów38 (Rysunek 4)

  1. Przygotowanie pierwszorzędowych roztworów przeciwciał:
    1. Rozcieńczyć pierwszorzędowe przeciwciała w buforze rozcieńczającym zawierającym 1% albuminy surowicy bydlęcej, 10% surowicy (np. normalnej surowicy osła lub kozy) i 0,5% Tween-20 w PBS.
      UWAGA: Wybierz surowicę do użycia w zależności od gatunku, w którym wyhodowano przeciwciała drugorzędowe.
    2. Alternatywnie, można zastosować znakowanie fluoresceiną przez oprogramowanie zenon przeciwciała pierwszorzędowego zgodnie z instrukcjami producenta.
      1. Przygotować 1 μg przeciwciała pierwszorzędowego w PBS w odpowiednim rozcieńczeniu (objętość całkowita ≤ 20 μl).
      2. Dodać 5 μl odczynnika do znakowania fluoresceiny IgG (składnik A) firmy zenon do roztworu przeciwciała.
      3. Inkubować mieszaninę przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
      4. Dodać 5 μl odczynnika blokującego Zenon (składnik B) do mieszaniny reakcyjnej.
      5. Inkubować mieszaninę przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Nałożyć przeciwciało na próbkę w ciągu 30 minut.
  2. Barwienie przeciwciałami pierwotnymi:
    1. Dodać 100 μl roztworu przeciwciała pierwszorzędowego do osadu komórkowego i delikatnie rozetrzeć do wymieszania.
    2. Alternatywnie, należy dodać przeciwciało znakowane fluoresceiną Zenon do zawiesiny komórkowej w odpowiednim rozcieńczeniu.
    3. Inkubować probówki w temperaturze pokojowej przez 30 minut na wytrząsarce orbitalnej (200 obr./min), chronionej przed światłem. Przemyć komórki raz PBS (jak opisano w sekcji 4.2) i całkowicie usunąć supernatant z probówek, pozostawiając tylko osad.
  3. Barwienie przeciwciałami wtórnymi (nie jest wymagane w przypadku przeciwciał znakowanych fluoresceiną Zenon):
    1. Rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe w PBS w odpowiednim stężeniu.
    2. Dodać 100 μl roztworu przeciwciała wtórnego do osadu komórkowego i delikatnie rozcierać w celu wymieszania. Inkubować probówki w temperaturze pokojowej przez 30 minut na wytrząsarce (200 obr./min) w ciemności.
  4. Przemyć próbki dwa razy PBS (zgodnie z opisem w sekcji 4.2).
  5. Przemyć raz buforem przepływowym (patrz sekcja 3.5).
  6. Ponownie zawiesić komórki w około 150 μl bufora przepływowego i przeanalizować na cytometrze przepływowym.

Wykresy punktowe cytometrii przepływowej komórek niebarwionych i barwionych, wykazujące różnicowanie markerów fluorescencyjnych.
Rysunek 4. Współbarwienie białek powierzchniowych i wewnątrzkomórkowych. Dane z cytometrii przepływowej stanowią przykład porównania między barwieniem wewnątrzkomórkowym opartym na przeciwciałach pierwotnych + drugorzędowych a barwieniem wewnątrzkomórkowym opartym na fluoresceinie w systemie Zenon w połączeniu z barwieniem powierzchniowym. Wyłączna dodatniość na osi y (lewy górny kwadrant) i osi x (prawy dolny ćwiartka) pokazuje komórki wybarwione odpowiednio pod kątem MAP2 i CD24. Po wspólnym barwieniu w prawym górnym kwadrancie (prawe panele) można zaobserwować wspólną ekspresję MAP2 i CD24. Porównanie korzystania z Alexa fluor 488 (góra; AF488) w porównaniu z fluoresceiną Zenon (na dole) do znakowania MAP2 daje podobne wyniki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

6. Analiza cytometryczna przepływowa

  1. Analizę cytometryczną przepływową należy przeprowadzić natychmiast po zakończeniu protokołu barwienia przy użyciu cytometru przepływowego z odpowiednimi filtrami do wykrywania sygnału. Używaj niebieskiego lasera 488 nm i czerwonego 640 nm z filtrami pasmowoprzepustowymi FL-1 (533/30), FL-2 (585/40) i FL-4 (675/25).
  2. Ustaw bramki główne w oparciu o rozproszenie z przodu i z boku, z wyłączeniem gruzu i martwych komórek.
  3. Ustaw bramki fluorescencyjne dla antygenu powierzchniowego i wewnątrzkomórkowego na ≤0,5% w oparciu o niebarwione próbki i kompensację nakładania się widma za pomocą pojedynczych barwionych kontroli.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiony tutaj protokół pozwala na wszechstronne podejścia eksperymentalne (Rysunek 2). W swojej najkrótszej wersji (kroki 1, 3 i 6) można go uznać za przewodnik po prostym barwieniu antygenów powierzchniowych. W swojej bardziej złożonej formie można dążyć do osiągnięcia szeregu paradygmatów współznakowania z szeregiem antygenów wewnątrzkomórkowych (opcjonalne kroki 2 i/lub 4 do 5). Co więcej, etap znakowania CFSE i...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiony tutaj protokół jest dobrze znany dla hodowli komórek nerwowych pochodzących z ludzkich komórek macierzystych, ale może być równie dobrze stosowany do innych źródeł komórek nerwowych, w tym tkanek pierwotnych lub linii komórek nerwowych. Oprócz źródeł embrionalnych, nerwowe komórki macierzyste lub progenitorowe mogą być ekstrahowane z neurogennych obszarów dorosłego mózgu27. Co więcej, cytometria przepływowa i FACS mogą być wykorzystywane do ilościowego określania, analizowania i izolowania różnyc...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak potencjalnych konfliktów interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nasz program badawczy jest finansowany przez Emmy Noether-Program Niemieckiej Fundacji Badawczej (DFG), grant PR1132/3-1. Z wdzięcznością dziękujemy za dalsze wsparcie ze strony Fundacji Müller-Fahnenberg Uniwersytetu we Fryburgu. Badanie to było częściowo wspierane przez Inicjatywę Doskonałości Niemieckiej Fundacji Badawczej (GSC-4, Spemann Graduate School).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

figure-materials-27 eBioscience 17-0247-42 Rozcieńczenie robocze 1:50 figure-materials-28 eBioscience 12-0549-42 Rozcieńczenie robocze 1:50 Neuronalne przeciwciało poliklonalne klasy III β-tubuliny (Tuj1)figure-materials-29 Covance PRB-435P Rozcieńczenie robocze 1:2,000 Alexa Fluor 488 figure-materials-31 Life Technologies Z-25342 Neubauer-Ulepszona komora liczącafigure-materials-32 Marienfeld 0640010 Vortexfigure-materials-35 Becton Dickinson (BD)2

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM/F12 (1:1) (Zmodyfikowana pożywka Eagle firmy Dulbecco F-12)figure-materials-1 Life Technologies11330057
DPBS bez Ca2+ Mg2+figure-materials-2 Life Technologies
Płodowa surowica bydlęca, kwalifikowana, zatwierdzona przez UE, pochodząca z Ameryki Południowej (FBS)figure-materials-3 Life Technologies10270-106
MEM Aminokwasy endogenne (100x)figure-materials-4 Life Technologies11140035
TrypLE Expressfigure-materials-5 Life Technologies12604013
roztwór błękitu trypanowego, 0,4%figure-materials-6 Life Technologies15250061
Paraformaldehydfigure-materials-7 Carl Roth335.3
Albumina surowicy bydlęcej (BSA) Frakcja Vfigure-materials-8 PAA Laboratories, CoelbeK41-001
Tween-20 Detergentfigure-materials-9 Calbiochem655205
Karboksyfluoresceina succinimidylowa ester (CFSE)figure-materials-10 eBioscience65-0850-84
DMSOfigure-materials-11 AppliChemA1584
Filtry butelkowe express plus 0,22 µ m, 250 mlfigure-materials-12 MilliporeSCGPU02RE
Kolby poddane działaniu hodowli komórkowej (T 25)figure-materials-13 NUNC156367
Kolby poddane działaniu hodowli komórkowej (T 75)figure-materials-14 NUNC
Probówki stożkowe (15 ml)figure-materials-15 Probówki stożkowe Greiner Bio-One188271
50 ml)figure-materials-16 Greiner Bio-One227261
pipeta Pasteura, szklana (150 mm)figure-materials-17 STEIN Labortechnik, Remchingen
Końcówki do pipet (0,1-10 &mikro; l)figure-materials-18 Końcówki4125
(1-200 &mikro; l)figure-materials-19 Corning4126
Końcówki do pipet (100-1000 &mikro; l)figure-materials-20 Corning4129
Pipety serologiczne, 5 mlfigure-materials-21 Corning4051
Pipety serologiczne, 10 mlfigure-materials-22 Corning4101
Pipety serologiczne, 25 mlfigure-materials-23 Corning4251
Probówki do mikrowirówek (0,5 ml)figure-materials-24 Sarstedt72,699
Probówki do mikrowirówek (1,5 ml)figure-materials-25 Greiner Bio-One616201
Probówki do mikrowirówek (2,0 ml)figure-materials-26 Sarstedt72,695,500
Przeciwciało monoklonalne antyludzkie CD24 APC
Przeciwciało monoklonalne anty-ludzkie CD54 PE
Donkey anti Rabbitfigure-materials-30 Life TechnologiesA21206Rozcieńczenie robocze 1:2,000
Zenon® Zestaw do znakowania fluoresceiny IgG królika
figure-materials-33 Przemysł naukowyG560E
Termomikser comfortfigure-materials-34 Eppendorf5355 000.001
przepływowy Accuri C6653118
Mikrowirówka chłodzona, PerfectSpin 24 Rfigure-materials-36 Peqlab91-PSPIN-24R
Wytrząsarka orbitalna, Unimax 1010figure-materials-37 Heidolph543-12310-00
Wirówka chłodzona, Rotanta 96 RCa href="http://www.hettichlab.com" target="_blank">figure-materials-38 Hettich4480-50
Klasa II Szafa bezpieczeństwa biologicznego Safe 2020figure-materials-39 Inkubator
, Heracell 240ifigure-materials-40 Thermo Scientific51026331
System próżniowy, Vacusafe comfortfigure-materials-41 Mikroskop Integra Biosciences158320
, Axiovert 40 CFLfigure-materials-42 Kontroler Zeiss451212
Pipet, accu-jet profigure-materials-43 Marka26303
Mikropipeta, Pipetman z P20N (2-20 &mikro; l)figure-materials-44 GilsonF144563
Micropipet, Pipetman neo P200N (20-200 µ l)figure-materials-45 GilsonF144565
Micropipet, Pipetman neo P1000N (100-1000 µ l)figure-materials-46 GilsonF144566
14190169 156499 (S03710150 do pipet Corning Cytometr < CO Thermo 51026640Scientific

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Herzenberg, L. A., et al. The History and Future of the Fluorescence Activated Cell Sorter and Flow Cytometry: A View from. 48 (10), 1819-1827 (2002).
  2. Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Cytometry: today’s technology and tomorrow's horizons. Methods (San Diego, Calif). 57 (3), 251-258 (2012).
  3. Jaye, D. L., Bray, R. A., Gebel, H. M., Harris, W. A. C., Waller, E. K. Translational applications of flow cytometry in clinical practice). J. Immunol. 188 (10), 4715-4719 (2012).
  4. Henel, G., Schmitz, J. Basic Theory and Clinical Applications of Flow Cytometry. Lab Med. 38 (7), 428-436 (2007).
  5. Seita, J., Weissman, I. L. Hematopoietic stem cell: self-renewal versus differentiation. Wiley Interdiscip. Rev. Syst. Biol. Med. 2 (6), 640-653 (2010).
  6. Ulrich, H., Bocsi, J. Phenotypes of stem cells from diverse origin. Cytometry. A. 77 (1), 6-10 (2010).
  7. Panchision, D. M., et al. Optimized flow cytometric analysis of central nervous system tissue reveals novel functional relationships among cells expressing CD133, CD15, and CD24. Stem cells. 25 (6), 1560-1570 (2007).
  8. Meyer, R. A., Zaruba, M. E., McKhann, G. M. Flow cytometry of isolated cells from the brain. Anal. Quant. Cytol. 2 (1), 66-74 (1980).
  9. Junger, H., Junger, W. G. CNTF and GDNF, but not NT-4, support corticospinal motor neuron growth via direct mechanisms. Neuroreport. 9 (16), 3749-3754 (1998).
  10. McLaren, F. H., Svendsen, C. N., Vander Meide, P., Joly, E. Analysis of neural stem cells by flow cytometry: cellular differentiation modifies patterns of MHC expression. J. Neuroimmunol. 112 (1-2), 35-46 (2001).
  11. Wang, S., Roy, N. S., Benraiss, A., Goldman, S. A. Promoter-based isolation and fluorescence-activated sorting of mitotic neuronal progenitor cells from the adult mammalian ependymal/subependymal. 22 (1-2), 167-176 (2000).
  12. Tanke, H. J., vander Keur, M. Selection of defined cell types by flow-cytometric cell sorting. Trends Biotechnol. 11 (2), 55-62 (1993).
  13. Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J. Immunol. Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
  14. Sergent-Tanguy, S., Chagneau, C., Neveu, I., Naveilhan, P. Fluorescent activated cell sorting (FACS): a rapid and reliable method to estimate the number of neurons in a mixed population. J. Neurosci. Methods. 129 (1), 73-79 (2003).
  15. Ernst, A., et al. Neurogenesis in the striatum of the adult human brain. Cell. 156 (5), 1072-1083 (2014).
  16. Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system. Nat. Rev. Immunol. 4 (8), 648-655 (2004).
  17. Bandura, D. R., et al. Mass cytometry: technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma time-of-flight mass spectrometry. Anal. Chem. 81 (16), 6813-6822 (2009).
  18. Bendall, S. C., et al. Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum. Science. 332 (6030), 687-696 (2011).
  19. Neveu, I., Rémy, S., Naveilhan, P. The neuropeptide Y receptors, Y1 and Y2, are transiently and differentially expressed in the developing cerebellum. Neuroscience. 113 (4), 767-777 (2002).
  20. Pruszak, J., Just, L., Isacson, O., Nikkhah, G. Isolation and culture of ventral mesencephalic precursor cells and dopaminergic neurons from rodent brains. Curr. Protoc. Stem Cell Biol. 2 (Unit 2D.5), (2009).
  21. Suslov, O. N., Kukekov, V. G., Ignatova, T. N., Steindler, D. A. Neural stem cell heterogeneity demonstrated by molecular phenotyping of clonal neurospheres. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (22), 14506-14511 (2002).
  22. Bez, A., et al. Neurosphere and neurosphere-forming cells: morphological and ultrastructural characterization. Brain Res. 993 (1-2), 18-29 (2003).
  23. Pruszak, J., Isacson, O. Molecular and cellular determinants for generating ES-cell derived dopamine neurons for cell therapy. Adv. Exp. Med. Biol. 651, 112-123 (2009).
  24. Carson, C. T., Aigner, S., Gage, F. H. Stem cells: the good, bad and barely in control. Nat. Med. 12 (11), 1237-1238 (2006).
  25. Yuan, S. H., et al. Cell-surface marker signatures for the isolation of neural stem cells, glia and neurons derived from human pluripotent stem cells. PloS One. 6 (3), e17540(2011).
  26. Roy, N. S., Cleren, C., Singh, S. K., Yang, L., Beal, M. F., Goldman, S. Functional engraftment of human ES cell-derived dopaminergic neurons enriched by coculture with telomerase-immortalized midbrain astrocytes. Nat. Med. 12 (11), 1259-1268 (2006).
  27. Uchida, N., et al. Direct isolation of human central nervous system stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97 (26), 14720-14725 (2000).
  28. Pruszak, J., Ludwig, W., Blak, A., Alavian, K., Isacson, O. CD15, CD24, and CD29 define a surface biomarker code for neural lineage differentiation of stem cells. Stem Cells. 27 (12), 2928-2940 (2009).
  29. Peh, G. S. -L., Lang, R. J., Pera, M. F., Hawes, S. M. CD133 expression by neural progenitors derived from human embryonic stem cells and its use for their prospective isolation. Stem Cells Dev. 18 (2), 269-282 (2009).
  30. Golebiewska, A., Atkinson, S. P., Lako, M., Armstrong, L. Epigenetic landscaping during hESC differentiation to neural cells. Stem Cells. 27 (6), 1298-1308 (2009).
  31. Dietrich, J., Noble, M., Mayer-Proschel, M. Characterization of A2B5+ glial precursor cells from cryopreserved human fetal brain progenitor cells. Glia. 40 (1), 65-77 (2002).
  32. Nishiyama, A. NG2 cells in the brain: a novel glial cell population. Hum. Cell. 14 (1), 77-82 (2001).
  33. Jungblut, M., et al. Isolation and characterization of living primary astroglial cells using the new GLAST-specific monoclonal antibody ACSA-1. Glia. 60 (6), 894-907 (2012).
  34. Ono, Y., et al. Differences in neurogenic potential in floor plate cells along an anteroposterior location: midbrain dopaminergic neurons originate from mesencephalic floor plate cells. Development. 134 (17), 3213-3225 (2007).
  35. Chung, S., et al. ES cell-derived renewable and functional midbrain dopaminergic progenitors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (23), 9703-9708 (2011).
  36. Doi, D., et al. Isolation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Dopaminergic Progenitors by Cell Sorting for Successful Transplantation. Stem Cell Reports. 2 (3), 337-350 (2014).
  37. Solozobova, V., Wyvekens, N., Pruszak, J. Lessons from the embryonic neural stem cell niche for neural lineage differentiation of pluripotent stem cells. Stem Cell Rev. 8 (3), (2012).
  38. Turaç, G., et al. Combined flow cytometric analysis of surface and intracellular antigens reveals surface molecule markers of human neuropoiesis. PloS One. 8 (6), e68519(2013).
  39. Buchwalow, I. B., Böcker, W. Chapter 2. Immunohistochemistry: Basics and Methods. , 9-17 (2010).
  40. Tario, J. D., et al. Optimized staining and proliferation modeling methods for cell division monitoring using cell tracking dyes. J. Vis. Exp. (70), e4287(2012).
  41. Lyons, A. B., Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. J. Immunol. Methods. 171 (1), 131-137 (1994).
  42. Hawkins, E. D., et al. Measuring lymphocyte proliferation, survival and differentiation using CFSE time-series data. Nat. Protoc. 2 (9), 2057-2067 (2007).
  43. Quah, B. J. C., Parish, C. R. The use of carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to monitor lymphocyte proliferation. J. Vis. Exp. 44, (2010).
  44. Sukhdeo, K., et al. Multiplex flow cytometry barcoding and antibody arrays identify surface antigen profiles of primary and metastatic colon cancer cell lines. PloS One. 8 (1), e53015(2013).
  45. Jiang, L., et al. Daucosterol promotes the proliferation of neural stem cells. The J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 140, 90-99 (2014).
  46. Hulspas, R., et al. Considerations for the control of background fluorescence in clinical flow cytometry. Cytometry. B. 76 (6), 355-364 (2009).
  47. Moloney, M., Shreffler, W. G. Basic science for the practicing physician: flow cytometry and cell sorting. Annals of Allergy, Asthm., & Immunology: Official Publication of the American College of Allergy, Asthma., & Immunology. 101 (5), 544-549 (2008).
  48. Siebzehnrubl, F. A., et al. Isolation and characterization of adult neural stem cells. Methods Mol. Biol. 750, 61-77 (2011).
  49. Guez-Barber, D., et al. FACS purification of immunolabeled cell types from adult rat brain). J. Neurosci. Methods. 203 (1), 10-18 (2012).
  50. Tham, C. -S., Lin, F. -F., Rao, T. S., Yu, N., Webb, M. Microglial activation state and lysophospholipid acid receptor expression. Int. J. Dev. Neurosci. 21 (8), 431-443 (2003).
  51. Nguyen, H. X., Beck, K. D., Anderson, A. J. Quantitative assessment of immune cells in the injured spinal cord tissue by flow cytometry: a novel use for a cell purification method. J. Vis. Exp. (50), e2698(2011).
  52. Marchenko, S., Flanagan, L. Counting human neural stem cells. J. Vis. Exp. (7), 262(2007).
  53. Brunlid, G., Pruszak, J., Holmes, B., Isacson, O., Sonntag, K. C. Immature and neurally differentiated mouse embryonic stem cells do not express a functional Fas/Fas ligand system. Stem Cells. 25 (10), 2551-2558 (2007).
  54. Brewer, G. J. Isolation and culture of adult rat hippocampal neurons. J. Neurosci. Methods. 71 (2), 143-155 (1997).
  55. Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat. Protoc. 1 (4), 1947-1951 (2006).
  56. Nielsen, J. A., Maric, D., Lau, P., Barker, J. L., Hudson, L. D. Identification of a novel oligodendrocyte cell adhesion protein using gene expression profiling. J. Neurosci. 26 (39), 9881-9891 (2006).
  57. Daneman, R., et al. The mouse blood-brain barrier transcriptome: a new resource for understanding the development and function of brain endothelial cells. PloS One. 5 (10), e13741(2010).
  58. Gräbner, R., Till, U., Heller, R. Flow cytometric determination of E-selectin, vascular cell adhesion molecule-1, and intercellular cell adhesion molecule-1 in formaldehyde-fixed endothelial cell monolayers. Cytometry. 40 (3), 238-244 (2000).
  59. Quah, B. J. C., Parish, C. R. New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes. J. Immunol. Methods. 379 (1-2), 1-14 (2012).
  60. Lathia, J. D., et al. High-throughput flow cytometry screening reveals a role for junctional adhesion molecule a as a cancer stem cell maintenance factor. Cell Rep. 6 (1), 117-129 (2014).
  61. Ganat, Y. M., et al. Identification of embryonic stem cell-derived midbrain dopaminergic neurons for engraftment. J. Clin. Invest. 122 (8), 2928-2939 (2012).
  62. Hedlund, E., et al. Embryonic stem cell-derived Pitx3-enhanced green fluorescent protein midbrain dopamine neurons survive enrichment by fluorescence-activated cell sorting and function in an animal model of Parkinson’s disease. Stem Cells. 26 (6), 1526-1536 (2008).
  63. Maroof, A. M., et al. Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12 (5), 559-572 (2013).
  64. Chivet, M., Hemming, F., Pernet-Gallay, K., Fraboulet, S., Sadoul, R. Emerging role of neuronal exosomes in the central nervous system. Front. Physiol. 3, 145(2012).
  65. Graner, M. W., et al. Proteomic and immunologic analyses of brain tumor exosomes. FASEB J. 23 (5), 1541-1557 (2009).
  66. Eldh, M., Lötvall, J. Isolation and characterization of RNA-containing exosomes. J. Vis. Exp. (59), e3037(2012).
  67. Capela, A., Temple, S. LeX is expressed by principle progenitor cells in the embryonic nervous system, is secreted into their environment and binds Wnt-1. Dev. Biol. 291 (2), 300-313 (2006).
  68. Nieoullon, V., Belvindrah, R., Rougon, G., Chazal, G. mCD24 regulates proliferation of neuronal committed precursors in the subventricular zone. Mol. Cell. Neurosci. 28 (3), 462-474 (2005).
  69. Nagato, M., et al. Prospective characterization of neural stem cells by flow cytometry analysis using a combination of surface markers. J. Neurosci. Res. 80 (4), 456-466 (2005).
  70. Hall, P. E., Lathia, J. D., Miller, N. G. A., Caldwell, M. A., French-Constant, C. Integrins are markers of human neural stem cells. Stem Cells. 24 (9), 2078-2084 (2006).
  71. Hargus, G., et al. Differentiated Parkinson patient-derived induced pluripotent stem cells grow in the adult rodent brain and reduce motor asymmetry in Parkinsonian rats. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (36), 15921-15926 (2010).
  72. Elkabetz, Y., et al. Human ES cell-derived neural rosettes reveal a functionally distinct early neural stem cell stage. Genes Dev. 22 (2), 152-165 (2008).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Flow CytometrySurface AntigensIntracellular AntigensNeural Cell TypesCFSE LabelingAntibody StainingCell HarvestingFlow BufferCentrifugationGating Strategy

Related Articles