Wykonywanie iniekcji podsiatkówkowych u gryzoni w celu dostarczenia komórek nabłonka barwnikowego siatkówki w zawiesinie

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy akceptowany przez społeczność protokół w formacie multimedialnym do podsiatkówkowego wstrzykiwania bolusa komórek RPE szczurom i myszom. Podejście to można wykorzystać do określenia potencjałów ratunkowych, profili bezpieczeństwa i zdolności przeżycia przeszczepionych komórek RPE po implantacji w zwierzęcych modelach zwyrodnienia siatkówki.

Streszczenie

Zamiana światła na impulsy elektryczne zachodzi w zewnętrznej siatkówce i jest realizowana głównie przez fotoreceptory pręcików i czopków oraz komórki nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE). RPE stanowią krytyczne wsparcie dla fotoreceptorów, a śmierć lub dysfunkcja komórek RPE jest charakterystyczna dla zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem (AMD), głównej przyczyny trwałej utraty wzroku u osób w wieku 55 lat i starszych. Chociaż nie znaleziono lekarstwa na AMD, wszczepienie zdrowego RPE w chore oczy może okazać się skutecznym leczeniem, a duża liczba komórek RPE może być łatwo wygenerowana z pluripotencjalnych komórek macierzystych. Kilka interesujących kwestii dotyczących bezpieczeństwa i skuteczności dostarczania komórek RPE można nadal badać w modelach zwierzęcych i opracowano dobrze akceptowane protokoły stosowane do wstrzykiwania RPE. Opisana tutaj technika była stosowana przez wiele grup w różnych badaniach i polega najpierw na stworzeniu w oku za pomocą ostrej igły. Następnie przez otwór wprowadza się strzykawkę z igłą załadowaną komórkami i przechodzi przez ciało szkliste, aż delikatnie dotknie RPE. Stosując tę metodę iniekcji, która jest stosunkowo prosta i wymaga minimalnego sprzętu, osiągamy spójną i wydajną integrację komórek RPE pochodzących z komórek macierzystych między RPE gospodarza, co zapobiega znacznej ilości zwyrodnień fotoreceptorów w modelach zwierzęcych. Chociaż nie jest to część rzeczywistego protokołu, opisujemy również, jak określić zakres urazu wywołanego przez wstrzyknięcie i jak sprawdzić, czy komórki zostały wstrzyknięte do przestrzeni podsiatkówkowej za pomocą metod obrazowania in vivo. Wreszcie, zastosowanie tego protokołu nie ogranicza się do ogniw RPE; Może być stosowany do wstrzykiwania dowolnego związku lub komórki do przestrzeni podsiatkówkowej.

Wprowadzenie

Siatkówka czuciowa jest zorganizowana w funkcjonalne poziomy neuronów, komórek glejowych i śródbłonka. Fotoreceptory w tylnej części siatkówki są aktywowane przez światło; Poprzez fototransdukcję przekształcają fotony w sygnały elektryczne, które są oczyszczane przez interneurony i przekazywane do kory wzrokowej w mózgu. Fototransdukcja nie może zajść bez skoordynowanych wysiłków komórek glejowych Muellera i komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE). RPE są zorganizowane w monowarstwę bezpośrednio za fotoreceptorami i pełnią wiele różnorodnych funkcji integralnych z funkcją fotoreceptorów i homeostazą. W rzeczywistości RPE i fotoreceptory są tak współzależne, że uważa się je za jedną jednostkę funkcjonalną. Śmierć lub dysfunkcja RPE powoduje niszczący wtórny wpływ na fotoreceptory i jest związana ze zwyrodnieniem plamki żółtej związanym z wiekiem (AMD), główną przyczyną ślepoty u osób starszych^1,2.

Chociaż nie znaleziono lekarstwa na AMD, kilka badań klinicznych wykazało, że wymiana komórek RPE może być obiecującą opcją terapeutyczną^3-13. Wraz z pojawieniem się technologii komórek macierzystych, możliwe jest obecnie generowanie dużej liczby komórek RPE in vitro z embrionalnych i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hES i hiPS), które bardzo przypominają swoje somatyczne odpowiedniki pod względem funkcjonalnym i anatomicznym^14-26. Wykazano również, że RPE pochodzące z komórek macierzystych działa in vivo przez wiele niezależnych grup, w tym naszą, w celu znacznego spowolnienia zwyrodnienia siatkówki w liniach szczurów i myszy ze spontanicznym zwyrodnieniem siatkówki^{16,18,21,22,25,28,29}. To połączenie klinicznych i przedklinicznych dowodów potwierdzających jest tak przekonujące, że obecnie prowadzonych jest kilka badań klinicznych mających na celu zapobieganie zwyrodnieniu siatkówki przy użyciu komórek macierzystych RPE pochodzących z komórek macierzystych^30,31.

RPE można łatwo uzyskać z hES i/lub hiPS i wszczepić w przestrzeń podsiatkówkową gryzoni przy użyciu różnych technik derywacji i iniekcji^32,33. (Patrz Westenskow et al., aby zapoznać się z artykułem metodycznym w formacie multimedialnym demonstrującym stosowany przez nas protokół ukierunkowanego różnicowania)³⁴. Pozostają krytyczne pytania dotyczące bezpieczeństwa, przeżycia i zdolności funkcjonalnej egzogennie dostarczanych komórek RPE po implantacji, dlatego zdolność do wykonywania iniekcji podsiatkówkowych u gryzoni jest umiejętnością krytyczną^{16,18,21,29,36,37}. Podanie RPE nie jest trywialne, a pole jest podzielone co do najskuteczniejszej techniki iniekcji. Opisany tutaj protokół jest prostym i skutecznym sposobem dostarczania bolusa komórek RPE podsiatkówkowo i został wykorzystany w pierwszym badaniu klinicznym dotyczącym przeszczepu RPE pochodzącego z komórek macierzystych³¹. (Czytelnik może również zapoznać się z innym artykułem JoVE autorstwa Eberle et al., aby uzyskać alternatywny obraz zastrzyków podsiatkówkowych u gryzoni. ³⁸)

Technika opisana w tym manuskrypcie nie może być zobrazowana, a trauma jest nieunikniona (jak w przypadku każdej techniki iniekcji podsiatkówkowej). Wykonuje się go poprzez wykonanie otworu tuż pod naczyniami rąbka i wprowadzenie igły wzdłuż drogi przeztwardówkowej w celu wstrzyknięcia bolusa komórek pod diametralnie przeciwstawną siatkówkę. Osoba wykonująca wstrzyknięcie będzie odczuwać opór, gdy igła dotknie siatkówki. Komórki można jednak bezpośrednio uwidocznić po wstrzyknięciu, a stopień indukowanego odwarstwienia siatkówki można określić, znakując komórki RPE przejściowym markerem fluorescencyjnym i wykrywając je za pomocą konfokalnego skaningowego oftalmoskopu (cSLO). System optycznej koherentnej tomografii (OCT) może być również używany do monitorowania urazu i łatwej identyfikacji miejsca wstrzyknięcia.

Protokół

UWAGA: Wszystkie zwierzęta były traktowane zgodnie z wytycznymi etycznymi ustalonymi przez Instytut Badawczy Scripps.

1. Przygotowanie materiałów do iniekcji (~20 min)

1. Wstępnie podgrzany roztwór do dysocjacji komórek (najlepiej taki, który jest inaktywowany przez rozcieńczenie, a nie surowicą), sterylny PBS i pożywki hodowlane (Tabela 1).
2. Wysterylizuj strzykawkę igłą, rozkładając ją i gotując części w wodzie przez 15 minut.

2. Przygotowanie komórek RPE do iniekcji (~30 min do 1 godz.)

1. Odłączyć komórki RPE za pomocą wstępnie podgrzanego roztworu dysocjacyjnego komórek przez 5-8 minut w temperaturze 37 °C.
2. Delikatnie zeskrob komórki, aby uwolnić te, które są nadal przyczepione.
3. Rozcieńczyć komórki dużą objętością pożywki hodowlanej (napełnić probówkę o pojemności 15 ml) w celu dezaktywacji roztworu dysocjacyjnego i policzenia ich.
4. Wirować przy 800 x g przez 5 minut, aby granulować komórki.
5. Ponownie zawiesić komórki w ilości 200 000 komórek/μl (aby dostarczyć 100 000 komórek w objętości 0,5 μl) w sterylnym, wstępnie podgrzanym PBS i przenieść je do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
6. Opcjonalnie dodać marker fluorescencyjny żywej komórki przejściowej i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30-45 minut.
7. Naładować strzykawkę igłą z 0,5 μl komórek. Wstrzyknąć komórki tak szybko, jak to możliwe.

3. Wstrzyknięcie podsiatkówkowe (~5 min na wstrzyknięcie)

UWAGA: Jeśli to możliwe, naucz się techniki z dorosłymi szczurami albinosami, ponieważ naczynia limbus są znacznie łatwiejsze do wizualizacji. Wstrzyknij roztwór Fast Green podczas nauki (przed próbą wstrzyknięcia komórek), aby ułatwić wizualizację miejsca wstrzyknięcia.

1. Znieczulić gryzonia. Należy stosować wstrzyknięcia dootrzewnowe 100 mg/ml ketaminy i 10 mg/ml ksylazyny (20 μl/10 g masy ciała) zamiast inhalacji izofluoranu, ponieważ trudno jest manewrować gryzoniem i wstrzykiwać do oka pyskiem w inhalatorze.
   1. Upewnij się, że zwierzę jest głęboko znieczulone, szczypiąc jedną z jego łap. Jeśli się wzdrygnie, odczekaj jeszcze kilka minut i spróbuj ponownie przed rozpoczęciem wstrzyknięcia podsiatkówkowego.
2. Ustaw gryzonia na boku, tak aby oko, które ma zostać wstrzyknięte, było skierowane w stronę sufitu.
3. Pod mikroskopem preparacyjnym delikatnie rozciągnij skórę tak, aby oko lekko wyskoczyło z oczodołu (tymczasowa wytrzeszcz) i stało się bardziej dostępne, trzymając głowę dwoma palcami tuż nad uchem i za szczękę, a następnie delikatnie rozciągnij skórę równolegle do powiek, tak aby oko lekko wysunęło się z oczodołu (patrz ryc. 1C). Nie chwytaj gryzonia zbyt blisko gardła.
4. Za pomocą jednorazowej, wstępnie wysterylizowanej igły o wadze 30 g wykonaj otwór bezpośrednio pod rąbkiem (jeśli naczynia zostaną uderzone, krwawienie będzie znaczne i trudno będzie później znaleźć otwór) i pod kątem, aby uniknąć dotykania soczewki igłą (ryc. 1D). Unikaj dotykania soczewki ostrą (lub) igłą, w przeciwnym razie nastąpi natychmiastowe powstanie zaćmy.
   UWAGA: Zastrzyki działają lepiej w przypadku dwóch osób. W ten sposób jedna osoba może podać strzykawkę z igłą osobie wykonującej wstrzyknięcie po utworzeniu pierwszego otworu za pomocą ostrej jednorazowej igły, aby utrzymać ostrość na miejscu, w którym znajduje się otwór.
5. Wycofaj jednorazową ostrą igłę z oka, utrzymując uchwyt na głowie. Pamiętaj dokładnie, gdzie jest.
6. Po zamontowaniu wstępnie załadowanej strzykawki z igłą na mikromanipulatorze lub trzymaniu jej w ręku, włóż końcówkę strzykawki z igłą przez otwór, ponownie uważając, aby nie dotknąć soczewki i delikatnie wepchnij ją przez oko bardzo delikatnie, aż poczujesz opór (Rysunek 1D).
7. Ograniczając wszystkie ruchy do minimum, ostrożnie wstrzyknij komórki RPE powoli do przestrzeni podsiatkówkowej.
   UWAGA: Zostanie wywołane odwarstwienie RPE/siatkówki; Jest to nieuniknione. Jednak czystszy wtrysk minimalizuje odklejanie i znacznie zwiększa szanse na ponowne przymocowanie (ryc. 1E). Wszelkie przesadne ruchy mogą przesunąć igłę z powrotem do siatkówki, a ruchy boczne mogą uszkodzić siatkówkę. Zastosowanie pompy wtryskowej jest opcjonalne, ale pozwala na bardzo precyzyjne podawanie.
8. Powoli wycofać strzykawkę. Stosuj krople nawilżające do oczu, aby utrzymać nawilżenie oka.
9. Kontynuuj monitorowanie zwierzęcia, aż odzyska pozycję leżącą mostka. Nie pozostawiaj zwierzęcia bez opieki ani nie wracaj do klatki z innymi czujnymi zwierzętami, dopóki nie odzyska pozycji mostka.

Wyniki

Szybko i spójnie możemy wprowadzić zawiesinę komórek RPE do przestrzeni podsiatkowej gryzoni, stosując technikę opisaną w niniejszej pracy. Choć nie jest to wymagane, urazy można znacznie zminimalizować, korzystając z zestawu z mikromanipulatorem przedstawionego na Rysunku 1A&B. Aby uzyskać tymczasowe wypadnięcie gałki ocznej (proptosję), należy trzymać gryzonia w sposób pokazany na Rysunku 1C. Kroki postępowania są takie same, niezależnie od tego, czy są wykonywane za pomocą mikroma...

Dyskusja

W tym artykule opisujemy stosunkowo prostą metodę wykonywania podsiatkówkowych iniekcji komórek RPE w zawiesinie u szczurów i myszy. Protokół jest łatwy do nauczenia, a większe doświadczenie w tej technice przełoży się na mniejszą liczbę urazów (ryc. 3; jest to jedno z lepszych wstrzyknięć), zwłaszcza jeśli stosuje się mikromanipulator (ryc. 1A). Każdy uraz może być monitorowany in vivo za pomocą systemu cSLO i OCT (ryc. 2), jeśli jest dostępny. Jeśli pożądane s...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
2-merkaptoetanol (55 mM)	Gibco	21985-023	50 ml x 1
Cell Scapers	VWR	89260-222	Case x 1
Sondy molekularne	CellTracker Green CMFDA	C34552	50 µ g x 20
DPBS, bez wapnia, bez magnezu	Gibco	14190-144	500 ml x 1
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7258	25 g x 1
Genteal Geldrops Umiarkowane do silnych lubrykantów Krople do oczu	Walmart	4060941	25 ml x 1
Hamilton Model 62 RN SYR	Hamilton	87942	Strzykawka x 1
Igła Hamilton 33 G, 0,5", punkt 3 (stal nierdzewna 304)	Hamilton	7803-05	Igły x 6
Knockout DMEM	Gibco	10829-018	500 ml x 1
KnockOut Serum Zamiennik	Gibco	10828-028	500 ml x 1
L-Glutamina 200 mM	Gibco	25030-081	100 ml x 1
Podstawka magnetyczna	Stojak do 39430216 Leica Biosystems		x 1
Roztwór aminokwasów endogennych MEM 100X	Gibco	11140-050	100 ml x 1
Mikromanipulator	Leica Biosystems	3943001	Manipulator x 1
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)	Gibco	15140-122	100 ml x 1
Strzykawka z końcówką ślizgową bez igieł BD  (3 ml)	VWR		BD309656 Pack x 1
Igły do zastosowań specjalistycznych BD  (30 g, 1")	VWR	BD305128	Box x 1
TrypLE Express Enzyme (1X), bez czerwieni fenolowej	Gibco	12604013	100 ml x 1