Wykonywanie iniekcji podsiatkówkowych u gryzoni w celu dostarczenia komórek nabłonka barwnikowego siatkówki w zawiesinie

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy akceptowany przez społeczność protokół w formacie multimedialnym do podsiatkówkowego wstrzykiwania bolusa komórek RPE szczurom i myszom. Podejście to można wykorzystać do określenia potencjałów ratunkowych, profili bezpieczeństwa i zdolności przeżycia przeszczepionych komórek RPE po implantacji w zwierzęcych modelach zwyrodnienia siatkówki.

Streszczenie

Zamiana światła na impulsy elektryczne zachodzi w zewnętrznej siatkówce i jest realizowana głównie przez fotoreceptory pręcików i czopków oraz komórki nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE). RPE stanowią krytyczne wsparcie dla fotoreceptorów, a śmierć lub dysfunkcja komórek RPE jest charakterystyczna dla zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem (AMD), głównej przyczyny trwałej utraty wzroku u osób w wieku 55 lat i starszych. Chociaż nie znaleziono lekarstwa na AMD, wszczepienie zdrowego RPE w chore oczy może okazać się skutecznym leczeniem, a duża liczba komórek RPE może być łatwo wygenerowana z pluripotencjalnych komórek macierzystych. Kilka interesujących kwestii dotyczących bezpieczeństwa i skuteczności dostarczania komórek RPE można nadal badać w modelach zwierzęcych i opracowano dobrze akceptowane protokoły stosowane do wstrzykiwania RPE. Opisana tutaj technika była stosowana przez wiele grup w różnych badaniach i polega najpierw na stworzeniu w oku za pomocą ostrej igły. Następnie przez otwór wprowadza się strzykawkę z igłą załadowaną komórkami i przechodzi przez ciało szkliste, aż delikatnie dotknie RPE. Stosując tę metodę iniekcji, która jest stosunkowo prosta i wymaga minimalnego sprzętu, osiągamy spójną i wydajną integrację komórek RPE pochodzących z komórek macierzystych między RPE gospodarza, co zapobiega znacznej ilości zwyrodnień fotoreceptorów w modelach zwierzęcych. Chociaż nie jest to część rzeczywistego protokołu, opisujemy również, jak określić zakres urazu wywołanego przez wstrzyknięcie i jak sprawdzić, czy komórki zostały wstrzyknięte do przestrzeni podsiatkówkowej za pomocą metod obrazowania in vivo. Wreszcie, zastosowanie tego protokołu nie ogranicza się do ogniw RPE; Może być stosowany do wstrzykiwania dowolnego związku lub komórki do przestrzeni podsiatkówkowej.

Wprowadzenie

Siatkówka czuciowa jest zorganizowana w funkcjonalne poziomy neuronów, komórek glejowych i śródbłonka. Fotoreceptory w tylnej części siatkówki są aktywowane przez światło; Poprzez fototransdukcję przekształcają fotony w sygnały elektryczne, które są oczyszczane przez interneurony i przekazywane do kory wzrokowej w mózgu. Fototransdukcja nie może zajść bez skoordynowanych wysiłków komórek glejowych Muellera i komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE). RPE są zorganizowane w monowarstwę bezpośrednio za fotoreceptorami i pełnią wiele różnorodnych funkcji integralnych z funkcją fotoreceptorów i homeostazą. W rzeczywistości RPE i fotoreceptory są tak współzależne, że u....

Protokół

UWAGA: Wszystkie zwierzęta były traktowane zgodnie z wytycznymi etycznymi ustalonymi przez Instytut Badawczy Scripps.

1. Przygotowanie materiałów do iniekcji (~20 min)

1. Wstępnie podgrzany roztwór do dysocjacji komórek (najlepiej taki, który jest inaktywowany przez rozcieńczenie, a nie surowicą), sterylny PBS i pożywki hodowlane (Tabela 1).
2. Wysterylizuj strzykawkę igłą, rozkładając ją i gotując części w wodzie przez 15 minut.

2. Przygotowanie komórek RPE do iniekcji (~30 min do 1 godz.)

1. Odłącz....

Wyniki

Szybko i spójnie możemy wprowadzić zawiesinę komórek RPE do przestrzeni podsiatkowej gryzoni, stosując technikę opisaną w niniejszej pracy. Choć nie jest to wymagane, urazy można znacznie zminimalizować, korzystając z zestawu z mikromanipulatorem przedstawionego na Rysunku 1A&B. Aby uzyskać tymczasowe wypadnięcie gałki ocznej (proptosję), należy trzymać gryzonia w sposób pokazany na Rysunku 1C. Kroki postępowania są takie same, niezależnie od tego, czy są wykonywane za pomocą mikroma.......

Dyskusja

W tym artykule opisujemy stosunkowo prostą metodę wykonywania podsiatkówkowych iniekcji komórek RPE w zawiesinie u szczurów i myszy. Protokół jest łatwy do nauczenia, a większe doświadczenie w tej technice przełoży się na mniejszą liczbę urazów (ryc. 3; jest to jedno z lepszych wstrzyknięć), zwłaszcza jeśli stosuje się mikromanipulator (ryc. 1A). Każdy uraz może być monitorowany in vivo za pomocą systemu cSLO i OCT (ryc. 2), jeśli jest dostępny. Jeśli pożądane s.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
2-merkaptoetanol (55 mM)	Gibco	21985-023	50 ml x 1
Cell Scapers	VWR	89260-222	Case x 1
Sondy molekularne	CellTracker Green CMFDA	C34552	50 µ g x 20
DPBS, bez wapnia, bez magnezu	Gibco	14190-144	500 ml x 1
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7258	25 g x 1
Genteal Geldrops Umiarkowane do silnych lubrykantów Krople do oczu	Walmart	4060941	25 ml x 1
Hamilton Model 62 RN SYR	Hamilton	87942	Strzykawka x 1
Igła Hamilton 33 G, 0,5", punkt 3 (stal nierdzewna 304)	Hamilton	7803-05	Igły x 6
Knockout DMEM	Gibco	10829-018	500 ml x 1
KnockOut Serum Zamiennik	Gibco	10828-028	500 ml x 1
L-Glutamina 200 mM	Gibco	25030-081	100 ml x 1
Podstawka magnetyczna	Stojak do 39430216 Leica Biosystems		x 1
Roztwór aminokwasów endogennych MEM 100X	Gibco	11140-050	100 ml x 1
Mikromanipulator	Leica Biosystems	3943001	Manipulator x 1
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)	Gibco	15140-122	100 ml x 1
Strzykawka z końcówką ślizgową bez igieł BD  (3 ml)	VWR		BD309656 Pack x 1
Igły do zastosowań specjalistycznych BD  (30 g, 1")	VWR	BD305128	Box x 1
TrypLE Express Enzyme (1X), bez czerwieni fenolowej	Gibco	12604013	100 ml x 1