Artykuł metodologiczny

Minimalnie inwazyjna technika wstrzykiwania do nerwu wzrokowego szczura

DOI:

10.3791/52249

⸱

19 maja 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, Johns Hopkins University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bezpośrednia iniekcja do nerwu wzrokowego szczura jest przydatna do badań regeneracyjnych. Demonstrujemy minimalnie inwazyjną technikę bezpośredniego wstrzykiwania do nerwu wzrokowego szczura, która nie wymaga otwierania czaszki. Dzięki tej metodzie powikłania chirurgiczne są zminimalizowane, a powrót do zdrowia jest szybszy.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nerw wzrokowy szczura jest użytecznym modelem do badań nad regeneracją komórek macierzystych. Bezpośrednie wstrzyknięcie do nerwu wzrokowego szczura umożliwia dostarczenie do ośrodkowego układu nerwowego w minimalnie inwazyjnej operacji bez usuwania kości. Technika ta opisuje podejście do wizualizacji i bezpośredniego wstrzyknięcia nerwu wzrokowego po niewielkim rozwarstwieniu powięzi od grzbietu oczodołu, przy użyciu szwu trakcyjnego spojówki, aby delikatnie pociągnąć oko w dół i na zewnątrz. Reprezentatywne przykłady wstrzykniętego nerwu wzrokowego pokazują udaną iniekcję barwionych koralików.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nerw wzrokowy stanowi idealne miejsce do badań regeneracyjnych ośrodkowego układu nerwowego (OUN), w tym schorzeń okulistycznych, takich jak zapalenie nerwu wzrokowego, jaskra i uraz. Wstrzyknięcia różnych komórek macierzystych wykazały skuteczność lub okazały się obiecujące w zastępowaniu utraconej mieliny, zwiększaniu liczby aksonów i/lub zapobieganiu chorobom zwyrodnieniowym. 1,2

Ludzki nerw wzrokowy zawiera około 1,2 miliona równoległych aksonów podróżujących od siatkówki do skrzyżowania o średnicy około 3,0-3,5 mm.3 Do modelowania ludzkich chorób w laboratorium, szczur był często wykorzystywany. Nerw wzrokowy dorosłego szczura zawiera około 100 000 aksonów o średnicy około 0,5 mm.4 Jednym z głównych ograniczeń w badaniach regeneracyjnych OUN jest bezpośredni dostęp bez kości. Powikłania i ryzyko chirurgiczne dla zwierzęcia są większe po usunięciu czaszki lub kręgów. Podobnie jak w przypadku korzyści płynących z minimalnie inwazyjnych metod leczenia kręgosłupa,5 bezpośrednie wstrzyknięcia nerwu wzrokowego bez otwierania czaszki zapewniają zmniejszenie powikłań i szybszy powrót do zdrowia.

Ta technika była używana w poprzednich badaniach. 6 W tym manuskrypcie i towarzyszącym mu filmie demonstrujemy minimalnie inwazyjną procedurę wstrzykiwania komórek macierzystych do nerwu wzrokowego szczura.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Wszystkie procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Johns Hopkins Animal Care and Use Committee. Aparaty anestezjologiczne wymagają corocznej kontroli i kalibracji w razie potrzeby.

1. Znieczulenie i pozycjonowanie

  1. znieczulenie.
    1. Wszystkie zabiegi chirurgiczne wykonuj w znieczuleniu z 2-3% izofluoranem. Potwierdź odpowiedni poziom znieczulenia poprzez uszczypnięcie palca u nogi i częstość oddechów. Sprawdź, czy szczur nie drga w odpowiedzi na uszczypnięcie palca.
      UWAGA: Drgnienie wskazuje na znieczulenie, które jest zbyt późne i może wymagać dłuższego znieczulenia przed rozpoczęciem lub wyższego stężenia izofluoranu. Częstość oddechów mniejsza niż 1 oddech co 2 sekundy jest zbyt wolna, co wskazuje, że znieczulenie jest zbyt wysokie i może wymagać zmniejszenia stężenia izofluoranu.
    2. W razie potrzeby zabezpiecz zwierzę, aby uniknąć ruchów głowy podczas zabiegu. Umieść kroplę lidokainy na oku chirurgicznym. Używaj sztucznych łez co 10 minut, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia. Wstrzyknąć buprenorfinę w dawce 0,01 mg/kg mc. podskórnie przed operacją, a następnie w razie potrzeby co 6-8 godzin.
  2. Pozycjonowania.
    1. Umieść szczury w stereotaktycznej ramce i utrzymuj ciepło za pomocą poduszki grzewczej. Zwilż sierść skóry głowy alkoholem, uważając, aby nie było odsłonięte na oczach. Używaj sterylnych narzędzi i sterylnej techniki, aby zminimalizować ryzyko infekcji pooperacyjnych.

2. Sterowanie wzrokiem

  1. Umieść szew 4-0 w bocznej spojówce i zawiąż go wystarczającym szwem, aby umożliwić delikatną przyczepność.

3. Sekcja

  1. Wstępna sekcja.
    1. Wykonaj nacięcie o średnicy ~ 1 cala w skórze nad grzbietem oczodołu za pomocą skalpela w rozmiarze 10, jak pokazano na rysunku 1. Cofnij skórę i leżącą pod nią powięź i ostrożnie wypreparuj powięź. Aby zapobiec nadmiernemu krwawieniu do zabiegu chirurgicznego, należy unikać przecinania naczyń krwionośnych podczas preparowania powięzi. Użyj strategicznie rozmieszczonych bawełnianych końcówek, aby zapewnić hemostazę.
  2. Głębsza sekcja.
    UWAGA: Przy delikatnym pociągnięciu spojówki, ciągnąc oko w dół i wysuwając się z oczodołu, pojawi się mięsień oczodołu górny. Aby odsłonić nerw wzrokowy, mięsień ten musi zostać przecięty, a tłuszcz zaoczodołowy usunięty. Tłuszcz można wyrzucić i nie należy go wymieniać po wstrzyknięciu. Od tego momentu powięź nerwu wzrokowego powinna być widoczna jako wiązka samego nerwu wzrokowego wraz z naczyniami krwionośnymi owiniętymi oponą twardą (ryc. 1).
    1. Wykonaj małe nacięcie w oponie twardej za pomocą skalpela lub igły ze skosem 31, aby przekłucie było mniej traumatyczne.

4. Wtryskiwacz do pipet

  1. Wyciągnąć szklaną mikropipetę do średnicy 50-100 μm. Aby zapewnić stabilność, zamontuj mikropipetę na mikromanipulatorze i podłącz do strzykawki Hamilton podłączonej do pompy infuzyjnej.
  2. Wyciągnij kulki (lub komórki macierzyste) rozpuszczone w objętości 0,5-1,0 μl do wstecznej mikropipety wraz z 0,5 μl objętości roztworu błękitu metylowego przed i po.
    UWAGA: Szybkość infuzji ustawiona na 0,5-2 μl na minutę zapobiega urazom nerwu wzrokowego.

5. Wtrysk

  1. Opuść końcówkę mikropipety na nerw wzrokowy tuż nad naciętym oponą twardą.
    UWAGA: Niewielki, ale energiczny ruch szklanej końcówki do nerwu wzrokowego powoduje najmniejsze uszkodzenia. Gdy pompa infuzyjna zaczyna działać, barwnik błękitu metylowego powinien uwydatnić obszar wstrzykniętego nerwu wzrokowego. Barwnik powinien pozostać zlokalizowany w nerwie wzrokowym bez wyciekania w przestrzeni podpajęczynówkowej.
  2. Postępuj zgodnie z drugim pasmem błękitu metylowego, aby określić, kiedy wstrzyknięcie komórek macierzystych zostało zakończone i wyłącz pompę infuzyjną podczas wstrzykiwania drugiej dawki błękitu metylowego. Mikropipetę należy trzymać nieruchomo w nerwie wzrokowym przez 2 minuty na każdą wstrzykniętą 1 μl objętości, aby zapobiec wyrzutowi pod wysokim ciśnieniem po wyjęciu mikropipety.
    UWAGA: Alternatywnym podejściem jest podłączenie końcówki pipety do strzykawki wypełnionej powietrzem, którą można manipulować ręcznie. Tak czy inaczej, unikaj nadmiernej siły, aby zminimalizować uszkodzenie nerwów wzrokowych. Zalecamy wstrzyknięcie nie więcej niż 2 μl objętości do każdego nerwu wzrokowego.

6. Kontynuacja

  1. bezpośredni.
    1. Po zakończeniu wstrzykiwania należy wyjąć mikropipetę wraz z bawełnianymi końcówkami używanymi do zapewnienia hemostazy. Zszyj skórę jedwabiem 3-0 i usuń szew spojówkowy.
    2. Utrzymuj szczury w cieple na poduszce grzewczej, aż wyjdą z narkozy. Nie pozostawiaj zwierzęcia bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą na mostku. Nie należy zwracać zwierzęcia, które przeszło operację, do towarzystwa innych zwierząt, dopóki nie wyzdrowieje.
    3. Jeśli zwierzę wykazuje oznaki bólu, w tym nadmierny letarg, ataksję lub trudności w oddychaniu, należy podać odpowiednią lek przeciwbólową z domięśniową buprenorfiną (0,05 mg/kg) do trzech razy na dobę.
  2. Długoterminowe.
    1. Przez następne 24-48 godzin obserwuj szczura pod kątem powikłań po operacji, w tym obrzęku lub wydzieliny z rany lub innych objawów bólu, takich jak wokalizacja, zgarbiony wygląd, brak pielęgnacji lub niejedzenie. W razie potrzeby rozważ konsultację z weterynarzem lub etyczną eutanazję.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Na zakończenie eksperymentu, szczury zostały złożone w ofierze i poddane perfuzji 4% paraformaldehydu. Nerwy wzrokowe zostały starannie wypreparowane i zamontowane w celu przeprowadzenia kriostatu. Rycina 2 przedstawia przykład całego nerwu wzrokowego szczura o niskiej mocy, do którego wstrzyknięto niebieski barwnik Evansa w celu uwidocznienia tego miejsca. Strzałka wskazuje dokładne miejsce wstrzyknięcia. To rozwarstwienie zostało wykonane w ciągu kilku minut od wstrzyknięcia, na co wskazuje ograniczona...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bezpośrednie wstrzyknięcie do nerwu wzrokowego komórek macierzystych lub innych produktów mających na celu ułatwienie regeneracji stanowi wygodny model w porównaniu z innymi sposobami iniekcji do OUN. Technika ta zajmuje mniej czasu, wymaga mniej całkowitego znieczulenia, pozwala uniknąć wiercenia lub usuwania tkanki czaszki lub kostnej, zmniejsza częstość powikłań i pozwala na szybszą rekonwalescencję po operacji.

Najważniejsze kroki w tym protokole obejmują: 1. Odpowiednią hemostazę w polu ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają żadnych istotnych ujawnień do przekazania.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez NeuralStem, Inc. i Johns Hopkins Project RESTORE.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Lewis ratCharles River4Każdy szczep szczura będzie działał.
Aparat anestezjologicznySurgivetCDS9000CDS 9000 Maszyna do znieczulenia małych zwierząt - Montaż na słupie
Pompa infuzyjnaStoelting53129
Mikroskop preparacyjnyNational Optical409-411-1105
Światłowodowe źródło światłaFisher Scientific12-562-21
Badanie preparacyjne i stereotaktyczne instrumentu51400
Ściągacz do pipetKopf750
PipetyWorld Precision Instruments18150-6
Jednorazowe ostrza skalpela AparatHarvarda810-15-021
Nożyczki do irydektomiiMikroskopia elektronowa NaukiUniband LA-4XF

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dahlmann-Noor, A., Vijay, S., Jayaram, H., Limb, A., Khaw, P. T. Current approaches and future prospects for stem cell rescue and regeneration of the retina and optic nerve. Canadian journal of ophthalmology Journal canadien d'ophtalmologie. 45 (4), 333-341 (2010).
  2. Quigley, H. A., Iglesia, D. S. Stem cells to replace the optic nerve. Eye. 18 (11), 1085-1088 (2004).
  3. Ghaffarieh, A., Levin, L. A. Optic nerve disease and axon pathophysiology. International review of neurobiology. 105, 1-17 (2012).
  4. Fukui, Y., Hayasaka, S., Bedi, K. S., Ozaki, H. S., Takeuchi, Y. Quantitative study of the development of the optic nerve in rats reared in the dark during early postnatal life. Journal of anatomy. 174, 37-47 (1991).
  5. Celestre, P. C., et al. Minimally invasive approaches to the cervical spine. The Orthopedic clinics of North America. 43 (1), 137-147 (2012).
  6. Hallas, B. H., Wells, M. R. A Novel Technique for Multiple Injections into the Mammalian Optic Nerve. Kopf Carrier. 54, (2001).
  7. Harvey, A. R., Hellstrom, M., Rodger, J. Gene therapy and transplantation in the retinofugal pathway. Progress in brain research. 175, 151-161 (2009).
  8. Adachi-Usami, E. Optic neuritis--from diagnosis to optic nerve transplantation. Nippon Ganka Gakkai zasshi. 104 (12), 841-857 (2000).
  9. Slater, B. J., Vilson, F. L., Guo, Y., Weinreich, D., Hwang, S., Bernstein, S. L. Optic nerve inflammation and demyelination in a rodent model of nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy. Investigative ophthalmology & visual science. 54 (13), 7952-7961 (2013).
  10. Zarbin, M. A., Arlow, T., Ritch, R. Regenerative nanomedicine for vision restoration. Mayo Clinic proceedings. 88 (12), 1480-1490 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Iniekcja do nerwu wzrokowegochirurgia ma oinwazyjnaszew trakcyjny spoj wkiiniekcja za pomoc szklanej mikropipetydostarczanie kom rek macierzystychbarwnik b kit Evansadyssekcja brzegu oczodo uusuwanie t uszczu zaoczodo owegowizualizacja mikroskopowa

Powiązane artykuły