Artykuł metodologiczny

Badania przesiewowe interakcji białko-białko w całym genomie za pomocą testu komplementacji fragmentów białka (PCA) w żywych komórkach

18K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52255

⸱

3 marca 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Département de Biologie, Institut de biologie intégrative et des systémes & PROTEO, Université Laval

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Białka oddziałują na siebie nawzajem i te interakcje determinują w dużej mierze ich funkcje. Partnerzy interakcji białkowych można zidentyfikować przy wysokiej przepustowości in vivo za pomocą testu sprawności drożdży opartego na teście komplementacji fragmentów białka reduktazy dihydrofolianu (DHFR-PCA).

Streszczenie

Białka są budulcem, efektorami i mediatorami sygnałów procesów komórkowych. Funkcja, regulacja i lokalizacja białka często zależą od jego interakcji z innymi białkami. W tym miejscu opisujemy protokół testu komplementacji fragmentów białek drożdży (PCA), potężnej metody wykrywania bezpośrednich i proksymalnych powiązań między białkami w żywych komórkach. Interakcja między dwoma białkami, z których każde jest połączone z fragmentem białka reduktazy dihydrofolianowej (DHFR), przekłada się na wzrost szczepów drożdży w obecności leku metotreksatu (MTX). Zróżnicowane dopasowanie, wynikające z różnych ilości odtworzonego enzymu DHFR, można określić ilościowo na układach kolonijnych o dużej gęstości, co pozwala na odróżnienie interakcji od nieoddziałujących par przynęta-zdobycz. Przedstawiony tutaj protokół o wysokiej przepustowości jest wykonywany przy użyciu platformy robotycznej, która równolegle łączy krzyżowanie szczepów przynęty i ofiary przenoszących komplementarne białka fuzyjne fragmentów DHFR oraz test przeżycia na MTX. Protokół ten pozwala na systematyczne testowanie tysięcy interakcji białko-białko (IPP) obejmujących interesujące białka przynęty i oferuje kilka zalet w porównaniu z innymi testami wykrywania IPP, w tym badanie białek wyrażanych z ich endogennych promotorów bez konieczności modyfikowania lokalizacji białek i składania złożonych konstruktów reporterowych.

Wprowadzenie

Sieci interakcji białek (PINs) oferują mapę o niskiej rozdzielczości, jak funkcjonalnie zorganizowane są białka w komórce1. Każde fizyczne połączenie między dwoma białkami lub interakcja białko-białko (PPI) może reprezentować asocjację, która jest stabilna w czasie, taką jak te znajdujące się w kompleksach białkowych i przyczyniające się do strukturalnej organizacji komórki. Połączenia te mogą również reprezentować przejściowe skojarzenia, które regulują aktywność, stabilność, lokalizację i interakcje dwóch partnerów. Identyfikacja fizycznych partnerów interakcji danego białka dostarcza zatem bogatych informacji na temat funkcji i regulacji tego białka2,3. Z tych powodów włożono wiele wysiłku w mapowanie PIN w organizmach modelowych, w tym Escherichia coli4-6, Arabidopsis thaliana7, Saccharomyces cerevisiae8-12, Drosophila melanogaster13, Caenorhabditis elegans14 i Homo sapiens15. Badania te dostarczyły ważnych informacji na temat organizacji białek w komórce, a tym samym kluczowych informacji na temat białek o nieznanych wcześniej funkcjach.

Na przestrzeni lat opracowano kilka strategii badania PIN-ów. Technologie te można ogólnie podzielić na trzy kategorie w zależności od rodzaju dostarczanych przez nie informacji na temat IPP (przegląd w16-18) . Pierwsza z nich oparta jest na drożdżach dwuhybrydowych i ich pochodnych19. Technologie te dostarczają informacji na temat bezpośredniego związku między parami białek, co pozwala na konstruowanie sieci binarnych. Druga rodzina opiera się na oczyszczaniu powinowactwa białek przynęty i identyfikacji powiązanych z nimi partnerów, takich jak oczyszczanie powinowactwa, a następnie spektrometria mas20. Podejścia te identyfikują grupy białek, które są bezpośrednio lub pośrednio powiązane, na ogół w stabilny sposób, i są niezwykle skuteczne w identyfikacji kompleksów białkowych. Trzecie podejście opiera się na testach komplementacji fragmentów białek (PCA)11,21. Podejście to zapewnia pośredni poziom rozdzielczości między dwoma pierwszymi podejściami, ponieważ umożliwia wykrywanie bezpośrednich i proksymalnych powiązań między białkami. Każda technika ma swoje mocne i słabe strony, jak ostatnio zrecenzowano18.

Zdecydowanie najlepiej opisanym eukariotycznym PIN jest ten z pączkujących drożdży Saccharomyces cerevisiae, po części dlatego, że jego proteom jest stosunkowo mniej skomplikowany niż u innych modelowych eukariontów i dlatego, że testy o wysokiej przepustowości do wykrywania IPP zostały najpierw przetestowane i są bardziej efektywnie wdrażane w tym organizmie modelowym9-12. Szczególnie skuteczną metodą dla układu drożdży jest test komplementacji fragmentów białka reduktazy dihydrofolianu (DHFR-PCA), test, który był używany w różnych kontekstach do badania drożdży PIN w warunkach standardowych i zaburzonych11,22-26. Metoda ta opiera się na teście przeżycia, który umożliwia wykrycie bezpośrednich i prawie bezpośrednich IPP dla danego białka przynęty zarówno na endogennych poziomach ekspresji, jak i natywnych lokalizacjach subkomórkowych partnerów interakcji11,21 w sposób ilościowy27. Sygnał uzyskany za pomocą tego testu (tj. wielkość kolonii na układach kolonii o dużej gęstości) odzwierciedla zatem ilość kompleksów białkowych utworzonych między przynętą a zdobyczą w środowisku komórkowym prawie równym tej, jaką ma się w komórkach typu dzikiego. Test opiera się na odtworzeniu enzymu reporterowego biorącego udział w metabolizmie kwasu foliowego, reduktazy dihydrofolianowej (DHFR), w wyniku której dwa komplementarne fragmenty DHFR, które są połączone z dwoma białkami będącymi przedmiotem zainteresowania, zbliżają się do siebie, gdy te dwa białka wchodzą w interakcję, co z kolei prowadzi do odwracalnej rekonstytucji aktywności enzymu11 i wzrostu szczepu na pożywce zawierającej metotreksat (MTX; Rysunek 1). Związek ten hamuje endogenny enzym DHFR, ale nie zmutowany enzym stosowany w teście28. Dwie kolekcje szczepów PCA, jedna zawierająca ~4,300 szczepów MATa z ORF połączonym z fragmentem DHFR F[1,2] i jedna zawierająca ~4,800 szczepówMAT α z ORF połączonym z fragmentem DHFR [3], można zakupić w celu wdrożenia DHFR-PCA na małą lub dużą skalę w dowolnym laboratorium. Tutaj opisujemy ogólny, ale szczegółowy protokół badań przesiewowych pod kątem IPP między jednym białkiem przynęty a ~ 4,800 białkami ofiary przy użyciu tego testu.

Protokół

1. Budowa/weryfikacja szczepów przynęt

  1. Jeśli interesujący nas szczep przynęty jest dostępny w kolekcji MATa DHFR F[1,2], pobierz go z kolekcji zgodnie z opisem w kroku 1.1.1, w przeciwnym razie zbuduj szczep zgodnie z opisem w kroku 1.1.2.
    UWAGA: Opisany tutaj protokół wykorzystuje szczep DHFR F[1,2] jako przynętę, a kolekcję DHFR F[3] jako zdobycz, ponieważ ta kolekcja zawiera więcej szczepów niż kolekcja DHFR F[1,2]. Możliwe jest jednak przeprowadzenie badania przesiewowego w drugą stronę, jeśli szczep przynęty jest dostępny tylko w kolekcji DHFR F[3] lub w obu orientacjach, jeśli wymaga się większego pokrycia interaktomu.
    1. Rozmrażaj na lodzie płytkę podstawową z glicerolem zawierającą szczep przynęty przez godzinę. Wysterylizuj folię aluminiową pokrywającą płytkę przy użyciu 95% etanolu. Przekłuć folię sterylną końcówką, pipetować w górę i w dół, aby ponownie zawiesić komórki i rozprowadzić 2-3 μl glicerolu na selektywnym ekstrakcie drożdżowym dekstroza peptonowa (YPD) + 100 μg/ml Nourseothricin (Nat) w celu wyizolowania pojedynczych kolonii. Inkubować przez dwa dni w temperaturze 30 °C.
    2. Budowa szczepu przynęty PCA (MATa DHFR F[1,2]).
      1. Używając polimerazy o wysokiej wierności i standardowego protokołu PCR, amplifikuj kasetę DHFR F [1,2] z plazmidu pAG25-linker-DHFR F [1,2]-ADHterm za pomocą oligonukleotydów z zwisającymi końcami homologicznymi do ostatnich 40 pz końca 3' ORF, z wyłączeniem kodonu stop (starter do przodu) i do pierwszych 40 pz 3'-UTR (starter odwrócony) genu (Figura 1A).
      2. Przekształć produkt PCR w kompetentne komórki drożdży (zwykle w szczepie BY4741) przy użyciu standardowego protokołu transformacji drożdży LiOAc/PEG, jak w29 (Figura 1A).
      3. Płytka na selektywnym pożywce YPD + Nat do izolacji transformantów dodatnich.
      4. Wykonaj diagnostyczny PCR kolonii na izolowanych koloniach, aby potwierdzić prawidłową fuzję DHFR F[1,2]. Użyj starterów wyżarzających 1) w sekwencji kodującej gen (oligo do przodu) około 100 pz przed fuzją DHFR i 2) w terminatorze ADH kasety (odwrócony oligo) (figura 1B).
      5. Sekwencjonuj produkt PCR za pomocą sekwencjonowania Sangera, aby potwierdzić prawidłową fuzję genów.
      6. Zarchiwizuj potwierdzony szczep przynęty w 25% glicerolu w temperaturze -80 °C.
        UWAGA: Na tym etapie protokół może zostać wstrzymany.

2. Procedury sterylizacji i drukowania za pomocą narzędzi do szpilek

UWAGA: Procedura sterylizacji opisana poniżej została zoptymalizowana dla narzędzi pinowych manipulowanych przez platformę robotyczną BM3-BC (S&P Robotics), ale może być również dostosowana do innych platform. W tej sekcji opisano procedury sterylizacji i drukowania za pomocą narzędzi Pin-tool, które są używane do przenoszenia komórek z jednego podłoża na drugie w pozostałej części protokołu. Wewnętrzne skrypty używane do wykonywania tych procedur można uzyskać na żądanie. Należy pamiętać, że wszystkie kroki można wykonać bez konieczności korzystania z platformy robotycznej za pomocą ręcznego narzędzia pin-tool30.

  1. Zamontuj odpowiedni przyrząd do kołków na platformie robota.
  2. Przygotuj stacje czyszczące i mokre w następujący sposób:
    1. Dodać 500 ml sterylnej wody do stacji łaźni wodnej.
    2. Dodaj 320 ml sterylnej wody do stacji szczotek.
    3. Dodać 380 ml 70% etanolu do sonikatora podczas replikacji z płytki agarowej (taca zbiorcza 86 x 128 mm, zawierająca 35 ml zestalonej pożywki) na płytkę agarową lub 400 ml podczas replikacji z płytki mikromiareczkowej zawierającej ciekłe kultury na płytkę agarową.
    4. Dodać 35 ml sterylnej wody do stacji mokrej (składającej się ze sterylnej pustej tacki zbiorczej).
  3. Na początku każdego dnia, który wymaga platformy robotycznej, sterylizuj narzędzia do szpilek pięć razy przez jedną minutę w kąpieli sonicatora. W międzyczasie włącz lampę UV na pięć minut, aby wysterylizować obudowę robota.
    UWAGA: Nie jest to wymagane, jeśli robot jest umieszczony pod sterylnym kapturem.
  4. Pomiędzy każdą rundą replikacji narzędzia do szpilek, wysterylizuj narzędzie do szpilek w następujący sposób:
    1. Namocz szpilkę pięć razy przez 10 sekund w stacji kąpieli wodnej, aby usunąć grudki komórek.
    2. Namocz szpilkę dwukrotnie w przód iw tył w stacji szczotkowej.
      UWAGA: Obrotowa szczotka usunie resztki komórek.
    3. Namocz szpilkę dwukrotnie na 20 sekund w stacji sonikatora.
      UWAGA: Pozostałe komórki na szpilkach zostaną usunięte przez sonikację lub zabite przez etanol.
    4. Upewnij się, że głębokość zanurzania szpilek zwiększa się przy każdej kolejnej kąpieli, aby zapewnić prawidłową sterylizację.
  5. Wysuszyć szpilkę w stacji osuszania powietrza przez 25 sekund.
  6. Przed pobraniem komórek z płytek źródłowych należy zwilżyć szpilki w stacji mokrej, która zawiera 35 ml sterylnej wody na tacy zbiorczej.
  7. Zanurz szpilki dwukrotnie w koloniach z płytki źródłowej.
  8. Drukować na świeżo wylanej płycie docelowej, dotykając dwukrotnie powierzchni agaru (zwane dalej działaniem "drukowania" tablicy).

3. Kondensacja kolekcji DHFR F[3] w 1 536 tablicach przy użyciu zautomatyzowanej platformy robotycznej

  1. Rozmrozić na lodzie kolekcję DHFR F[3] (60 płytek 96-dołkowych) i dodatkową 96-dołkową płytkę wypełnioną szczepem kontrolnym L-DHFR F[3] (Rysunek 1C), który zawiera fragment DHFR F[3] i łącznik znajdujący się przed nimi, wyrażony samodzielnie jako kontrola ujemna.
    UWAGA: Zasadniczo ten fragment nie powinien wchodzić w interakcje z żadnym białkiem fuzyjnym fragmentu DHFR (szczegóły w dyskusji).
  2. Odwiruj płytki (szybkie wirowanie) przed wyjęciem folii aluminiowej, aby uniknąć ryzyka zanieczyszczenia krzyżowego między studzienkami.
  3. Skondensuj kolekcję na 16 tablicach 384 szczepów (rysunek 2A). Aby to zrobić, dla każdej tablicy 384 wydrukuj cztery płytki glicerolu na czterech kwadrantach selektywnej omnitacki YPD + 250 μg/ml Hygromycyny B (HygB) za pomocą narzędzia 96 pin-tool (tutaj tablicę 384 można podzielić na cztery równomiernie rozmieszczone ćwiartki, z których każda składa się z 96 pozycji w układzie matrycy 2 x 2). Umieścić cztery 96-dołkowe płytki zawierające kontrolę ujemną L-DHFR F[3] pomiędzy 60 innych płytek, aby uzyskać końcowy zestaw 64 płytek, które dokładnie wypełniają cztery 1,536 tablice. Wysterylizuj narzędzie do szpilek między każdym cyklem replikacji zgodnie z opisem w kroku 2.
    UWAGA: Włóż płytki L-DHFR F[3], aby mieć jedną taką płytkę na każdej z czterech końcowych 1,536 tablic.
  4. Inkubować płytki przez dwa dni w temperaturze 30 °C. UWAGA: Na tym etapie kolekcja DHFR może być przechowywana w formacie 384 w temperaturze 4 °C przez okres do jednego miesiąca na płytkach agarowych.
  5. Skondensuj kolekcję w czterech tablicach po 1,536 szczepów (Rysunek 2A). Aby to zrobić, dla każdej tablicy 1,536 wydrukuj cztery tablice 384 odkształceń na czterech kwadrantach płytki tego samego nośnika, co w kroku 3.2, używając narzędzia 384 pin-tool (tutaj tablica 1,536 może być podzielona na cztery równomiernie rozmieszczone ćwiartki, z których każdy składa się z 384 pozycji w układzie macierzy 2 x 2).
  6. Inkubować płytki przez dwa dni w temperaturze 30 °C. UWAGA: Na tym etapie kolekcja DHFR może być przechowywana w formacie 1,536 w temperaturze 4 °C przez okres do jednego miesiąca na płytkach agarowych.
  7. Zreplikuj cztery tablice na tym samym podłożu, aby ustandaryzować rozmiar kolonii za pomocą narzędzia 1,536 pin-tool.
  8. Inkubować płytki przez dwa dni w temperaturze 30 °C.

4. Procedura DHFR-PCA o wysokiej przepustowości

  1. Zaszczepić kulturę szczepu przynęty (fuzja DHFR F[1,2]) uzyskaną z etapu 1.1.1 lub 1.1.2 w 20 ml płynu YPD + Nat w probówce o pojemności 50 ml (ryc. 2B).
  2. Inkubować przez dwa dni w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem przy 250 obr./min, aby kultura osiągnęła nasycenie.
  3. Po dwóch dniach inkubacji umieścić na płytce 5 ml kultury na omnitacy YPD + Nat. Pozwól komórkom adsorbować się na powierzchni przez 5-10 minut i usuń nadmiar płynu (ryc. 2B). Powtórz dwukrotnie, aby wykonać trzy powtórzenia.
  4. Inkubować przez dwa dni w temperaturze 30 °C.
  5. Wydrukuj szczep przynęty z kroków 4.3 i 4.4 na 12 płytkach YPD (wystarczających do połączenia czterech płytek z kolekcji DHFR F[3] × trzech powtórzeń) za pomocą narzędzia do szpilek 1,536, używając każdego trawnika komórkowego nie więcej niż cztery razy.
  6. Wydrukuj odpowiednią tablicę kolekcji DHFR F[3] na wierzchu komórek przynęty za pomocą narzędzia do szpilek 1,536 (Rysunek 2C).
  7. Pozwól szczepom połączyć się w pary, inkubując przez dwa dni w temperaturze 30 °C.
  8. Wybierz komórki diploidalne, drukując kolonie na tacach zbiorczych zawierających YPD + HygB + Nat (Figura 2C).
  9. Inkubować przez dwa dni w temperaturze 30 °C.
  10. Powtórz selekcję diploidalną zgodnie z opisem w krokach 4.8 i 4.9 (Rysunek 2B).
  11. Przygotuj płytki z podłożem zawierającym MTX (MTX medium) dzień przed użyciem, postępując zgodnie z poniższymi krokami21 (UWAGA: zachowaj ostrożność podczas pracy z MTX, ponieważ jest to toksyczny związek. Podczas obchodzenia się z nim zawsze noś rękawice, okulary ochronne i fartuch laboratoryjny) (Rysunek 2C):
    1. Przygotuj 10-krotny drop-out aminokwasów –lys/met/ade w wodzie dejonizowanej. Przefiltruj i wysterylizuj kroplę w sterylnej butelce za pomocą sterylnego filtra strzykawkowego 0,2 μm lub, w razie potrzeby w dużych ilościach, lejka filtracyjnego 0,2 μm (tabela 1).
    2. Przygotować roztwór podstawowy MTX o stężeniu 10 mg/ml w dimetylosulfotlenku (DMSO). Stosować natychmiast po przygotowaniu roztworu, a pozostałą część zamrozić w temperaturze -20 °C. Chronić przed światłem, ponieważ jest światłoczuły. Nie zamrażaj ponownie MTX po jego rozmrożeniu.
    3. Przygotuj pożywkę w następujący sposób (składniki i ilości podłoża są takie same, jak te użyte w Tarassov i wsp.(zob. art. 11):
      1. Na jeden litr pożywki wymieszać w dwóch oddzielnych kolbach: 1) 6,69 g drożdżowej zasady azotowej bez aminokwasów i bez siarczanu amonu oraz 330 ml wody dejonizowanej; 2) 25 g szlachetnego agaru i 500 ml wody dejonizowanej.
      2. Kolby w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 20 min.
      3. Utrzymywać temperaturę w łaźni wodnej w temperaturze 55 °C przez co najmniej jedną godzinę.
      4. Wymieszać ze sobą obie kolby i dodać 50 ml sterylnego 40% glukozy, 100 ml 10x sterylnego drop-out i 20 ml MTX 10 mg/ml.
      5. Wlać 35 ml (patrz uwaga poniżej) pożywki do tacek zbiorczych. Pozostaw do zestalenia się na co najmniej półtorej godziny. Płyty osłonowe przed światłem.
        UWAGA: W tym przypadku wlanie 35 ml pożywki na tacę zbiorczą ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia równej grubości płyty, co jest ważne dla wszystkich dalszych etapów.
  12. Płytki obrazowe z drugiej rundy selekcji diploidalnej za pomocą platformy robotycznej lub za pomocą zwykłej kamery cyfrowej z równomiernym oświetleniem płyty. Obrazy te służą do identyfikowania pustych pozycji w tablicach podczas przeprowadzania dalszej analizy. Upewnij się, że parametry kamery są zawsze takie same i że światło robota jest włączone.
  13. Drukuj komórki diploidalne na nośnikach MTX za pomocą narzędzia 1,536 pin-tool.
  14. Inkubować przez cztery dni w temperaturze 30 °C w plastikowych torebkach, aby zapobiec wysuszeniu.
  15. Przygotować drugą partię tacek zbiorczych zawierających podłoże MTX, jak opisano w kroku 4.11.
  16. Po czterech dniach inkubacji płytki obrazowe za pomocą platformy robotycznej lub zwykłej kamery cyfrowej. Upewnij się, że parametry kamery są zawsze takie same i że światło robota jest włączone.
  17. Wykonaj drugą rundę selekcji MTX, replikując komórki w drugiej partii pożywki MTX.
    UWAGA: Zmniejszy to wzrost tła szczepów PCA i zwiększy rozdzielczość ilościową.
  18. Inkubować przez cztery dni w temperaturze 30 °C w plastikowych torebkach, aby zapobiec wysuszeniu.
  19. Płyty pamięciowe zgodnie z opisem w kroku 4.16.

5. Analiza obrazu

  1. Analizuj obrazy tablic kolonii za pomocą niestandardowych skryptów ImageJ31 lub za pomocą opublikowanych programów, takich jak Colonizer, Ht colony grid analyzer, Cell profiler, Colony Imager, ScreenMill, YeastXtract i gitter (skompilowane w 32). Analiza obrazu powinna wyprowadzać jeden lub kilka arkuszy kalkulacyjnych zawierających rozmiary kolonii dla każdej pozycji każdej tablicy, używaj tych rozmiarów kolonii do wszystkich dalszych analiz.
    UWAGA: W tym badaniu użyliśmy niestandardowego skryptu ImageJ opisanego w Leducq i wsp.33 (więcej szczegółów w sekcji Dyskusja).

6. Analiza danych

UWAGA: Wyniki analizy obrazu mogą być przetwarzane w tabulatorze, takim jak excel, lub przy użyciu języka skryptowego, takiego jak R34. W poniższych krokach opisano procedurę przy użyciu niestandardowego skryptu ImageJ31.

  1. Korzystając z niestandardowego skryptu, połącz pliki wyjściowe z analizy obrazu i dodaj adnotacje do każdego wiersza z informacjami o płycie i odkształceniu, jak w tabeli uzupełniającej 1.
  2. Log2 przekształca wartości wielkości kolonii (Zintegrowana gęstość lub obszar kolonii; tutaj użyto kolumny "IntDenBackSub" z Tabeli Uzupełniającej 1).
    UWAGA: Rozkład wartości będzie wyglądał jak na rysunku 3A.
  3. Znormalizuj te wartości, odejmując medianę wartości każdej płytki.
    UWAGA: Ten krok kontroluje odchylenie płytki, które może wynikać z nierównej ilości nośnika lub zmienności w automatycznej akwizycji obrazu, i zmniejsza wariancję między replikacjami (Rysunek 3B).
  4. Sprawdzić, czy kontrpróby są ze sobą skorelowane (rysunek 3C), aby ocenić odtwarzalność doświadczeń.
  5. Aby odróżnić interakcje od nieoddziałujących par przynęta-zdobycz, ustaw próg wysokiego ufności odpowiadający 95. percentylowi rozkładu kontrolek L-DHFR F[3].
    UWAGA: W tym eksperymencie odpowiada to 3,39 (Rysunek 3D). Alternatywnie można zastosować próg oparty na nakładaniu się ze znanymi interaktorami fizycznymi, takimi jak te zgłoszone w BioGRID35. Zobacz dyskusję, aby uzyskać więcej informacji.
  6. Dla każdej przynęty należy przefiltrować zdobycze zidentyfikowane jako zaangażowane w fałszywie dodatnie interakcje w badaniach przesiewowych DHFR-PCA (więcej szczegółów w dyskusji) i wymienione w tabeli uzupełniającej 2 (oznaczone jako "1" w kolumnie "filtrowane").
  7. Uśrednić znormalizowane rozmiary kolonii Log2 z trzech powtórzeń każdej interakcji (kolumna "Średni wynik" w tabeli uzupełniającej 2).

7. Walidacja fizycznych interakcji za pomocą eksperymentów na małą skalę

UWAGA: Każdy PPI o szczególnym znaczeniu, którego wynik jest wyższy lub bliski zastosowanemu progowi, może być zweryfikowany za pomocą testu DHFR-PCA w małym eksperymentalnym projekcie przy użyciu testu wzrostu na stałym lub płynnym podłożu MTX. Poniższe kroki pokazują procedurę ręcznego konstruowania diploidalnych szczepów PCA i wykonywania testów punktowych na pożywce MTX. Eksperymentator powinien wykonać te kroki dla wszystkich niezbędnych kontroli (Bait-DHFR F[1,2] x L-DHFR F[3], szczepy diploidalne Zipper-linker-DHFR i szczepy diploidalne łącznika-DHFR).

  1. Płytka 2-3 μl zapasu glicerolu szczepu przynęty wytworzonego w ppkt 1.1.2.6), szczepu kontrolnego L-DHFR F[3], diploidalnych szczepów Zipper-linker-DHFR i linker-DHFR odpowiednio na pożywkach YPD+Nat, YPD+HygB i dwukrotnie YPD+Nat+HygB.
  2. Odzyskaj interesującą Cię zdobycz z kolekcji DHFR F[3] i postępuj zgodnie z instrukcjami w kroku 1.1.1, ale przenieś obciążenie na podłoże YPD+HygB zamiast na pożywkę YPD+Nat.
  3. Przeprowadzić diagnostyczny PCR, jak w 1.1.2.4, aby potwierdzić fuzję DHFR F[3] w miejscu ofiary i zsekwencjonować produkt.
  4. Zaszczepić 1 ml płynnej pożywki YPD szczepami haploidalnymi do kojarzenia (Bait x Prey, Bait x L-DHFR F[3] control) i hodować przez co najmniej dwa dni w temperaturze 30 °C, aby umożliwić utworzenie się diploidów.
  5. Selekcjonować diploidy, rozpylając 4-5 μl kultury w 7,4 na stałym podłożu YPD+HygB+Nat. Rosnąć dwa dni w temperaturze 30 °C.
  6. Wybierz jedną izolowaną kolonię i hoduj przez noc w płynnej kulturze (1 ml), aby przeprowadzić test wzrostu.
  7. Przygotuj talerze MTX i DMSO (te same składniki co MTX medium, ale bez MTX) dzień przed użyciem. Zobacz krok 4.11, aby uzyskać więcej informacji.
  8. Przeprowadzić test wzrostu, wykrywając seryjne rozcieńczenia różnych kultur na płytkach kontrolnych (DMSO) i selekcyjnych (MTX).
    1. Rozcieńczyć prekultury do średnicy zewnętrznej = 1.
    2. Wykonać pięciokrotne rozcieńczenia (do współczynnika rozcieńczenia 625) na sterylnej płytce 96-dołkowej.
    3. Umieścić 4 μl każdego rozcieńczenia na pożywce PCA (DMSO i MTX).
    4. Inkubować w temperaturze 30 °C w plastikowych torebkach, aby zapobiec wysuszeniu.
    5. Płytki pamięciowe od 1 do 7 dnia inkubacji za pomocą platformy robotycznej lub zwykłej kamery cyfrowej.

Wyniki

Uzupełniająca Tabela 2 przedstawia przykład reprezentatywnych wyników uzyskanych przy użyciu białka drożdżowego Nup82 połączonego z fragmentem DHFR F[1,2] jako przynęty. Próg określony za pomocą kontroli L-DHFR F[3] może służyć jako próg empiryczny do wyznaczania hitów o wysokiej pewności (Ryciny 3D i 3E). Alternatywnie, ranking wyników może być wykorzystany do przeprowadzenia analiz wzbogacenia Gene Ontology lub innych analiz funkcjonalnych36 w oparciu o złote standardy37. Znane fizyczne interaktory przynęty można pobrać z baz danych, takich jak BioGRID35, i nanieść na dane (Ryciny 3E i 3F). W tym przykładzie pięć z ośmiu hitów o wysokiej pewności zostało wcześniej opisanych jako interaktory Nup82, a dwa są częścią podkompleksu Nup82: Nup116 i Nup159 (Ryciny 3F i 3G). Pozostały członek kompleksu, Nsp1, nie wykazuje żadnej interakcji w naszym eksperymencie. Dwa białka ofiary, Ade17 i Tef2 (niewykazane na Rycini 3F), uzyskały wyniki powyżej zastosowanego sztywnego progu, jednak prawdopodobnie są to wyniki fałszywie dodatnie, ponieważ w przeprowadzonych przez nas badaniach PCA wchodzą one w interakcje z niemal każdym białkiem przynęty (wyniki niepublikowane). Z drugiej strony, Pex30 może reprezentować nowy fizyczny interaktor Nup82, a interakcję tę udało nam się potwierdzić za pomocą DHFR-PCA w niskiej przepustowości (Rycina 3G). Pex30 jest białkiem błony peroksysomalnej i opisano kilka bezpośrednich interakcji między kompleksem porów jądrowych (NPC) a tym organellum. Przesiewanie dwuhybrydowe zidentyfikowało dwa inne białka NPC, Nup53 i Asm4 (Nup59), jako fizyczne interaktory Pex3038, a interakcję genetyczną między Pex30 a Nup170 opisano w literaturze39. Dwa inne wykryte partnerzy interakcji, Nup120 i Nup85 (Ryciny 3F i 3G), nie są częścią podkompleksu Nup82, co ilustruje zdolność metody DHFR-PCA do wykrywania interakcji wewnątrz i pomiędzy podkompleksami w obrębie większych kompleksów11.

Schemat procesu testu drożdżowego systemu dwuhybrydowego z fuzjami DHFR w szczepach haploidalnych i diploidalnych do wykrywania PPI.
Rysunek 1: Inżynieria szczepów drożdży dla wysokoprzepustowego DHFR-PCA (rysunek zaadaptowany z Leducq et al. 201233). (A) Konstrukcja haploidalnych szczepów MATa i MATα w celu fuzji Gene1 (G1) i Gene2 (G2) odpowiednio z kasetami DHFR F[1,2]-NatMX oraz DHFR F[3]-HPH . Kasety są amplifikowane z plazmidów pAG25-DHFR F[1,2] i pAG32-DHFR F[3] przy użyciu starterów przednich G1-5’ i G2-5’ oraz starterów odwrotnych G1-3’ i G2-3’, a następnie wstawiane do genomu na końcu 3’ genu docelowego poprzez rekombinację homologiczną. Powstające białka, P1 i P2, są odpowiednio połączone z fragmentem DHFR F[1,2] (MATa) i fragmentem DHFR F[3] (MATα) za pomocą elastycznego łącznika. (B) Weryfikacja konstrukcji z (A) jest przeprowadzana poprzez sekwencjonowanie złączy między ORF-ami Gene1 i Gene2 a kasetami DHFR. Skonstruowane szczepy PCA przeciwstawnych typów kojarzenia są następnie kojarzone w celu utworzenia diploida. Szczepy diploidalne rosną na medium MTX, jeśli dwa komplementarne fragmenty DHFR zostaną zbliżone do siebie w wyniku oddziaływania między P1 a P2, co przywraca aktywność enzymu DHFR. (C) Konstrukcja kontrolnych diploidalnych szczepów PCA dla przesiewów DHFR-PCA. Kontrole negatywne (L-DHFR) są konstruowane poprzez oddzielną transformację haploidalnych szczepów MATa i MATα plazmidami odpowiednio p41-linker-DHFR F[1,2] oraz p41-linker-DHFR F[3]11. Dwa szczepy są kojarzone, co skutkuje powstaniem diploidalnego szczepu kontroli negatywnej, w którym fragmenty DHFR nie są w stanie się uzupełnić (góra). Kontrole pozytywne są konstruowane przy użyciu tego samego podejścia co kontrole negatywne, jednak plazmidy wprowadzone do szczepów haploidalnych (p41-zipper-linker-DHFR F[1,2] (p41-ZL-DHFR F[1,2]) i p41-zipper-linker-DHFR F[3] (p41-ZL-DHFR F[3])) zawierają dwa równoległe fragmenty suwakowca leucynowego GCN4 połączone z komplementarnymi fragmentami DHFR, co prowadzi do silnego i konstytutywnego oddziaływania, które przywraca aktywność DHFR (dół). Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Schemat eksperymentu wzrostu kolonii drożdży; płytki agarowe YPD, selekcja diploidów, rekombinacja mitotyczna.
Rycina 2: Wysokoprzepustowa procedura DHFR-PCA (rycina zaadaptowana z Leducq et al.33). (A) Kolekcja MATα DHFR F[3] jest kondensowana do formatu 1536 poprzez dwie kolejne rundy kondensacji. Po pierwsze, płytki z zapasami w glicerolu są łączone w grupy po cztery na selektywnym podłożu YPD + HygB w formacie 384 przy użyciu narzędzia pin-tool 96. Po drugie, macierze 384 są łączone w grupy po cztery na selektywnym podłożu YPD + HygB w formacie 1536 przy użyciu narzędzia pin-tool 384. (B) Trawniki komórkowe szczepu przynęty (bait) MATa PCA są przygotowywane poprzez hodowlę nasyconej kultury szczepu przynęty na selektywnym podłożu YPD + Nat i wysiewanie kultury na omnitray YPD + Nat. (C) Trawniki te są wykorzystywane do krzyżowania szczepu przynęty z kolekcją DHFR F[3] na podłożu YPD. Komórki są następnie przenoszone dwukrotnie na podłoże YPD + HygB + Nat w celu selekcji diploidów oraz dwukrotnie na podłoże MTX w celu przeprowadzenia PCA. Wzrost będzie obserwowany na podłożu MTX tylko wtedy, gdy fragmenty DHFR będą się uzupełniać po interakcji między białkiem przynęty a białkiem ofiary (prey). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Wykresy gęstości oddziaływań białkowych, mapa ciepła korelacji, diagram sieci i wyniki testu kropelkowego (spot assay).
Rysunek 3: Analiza danych obejmująca etapy normalizacji, wyznaczenia progu istotności oraz identyfikacji pozytywnych oddziaływań. (A) Rozkład gęstości wielkości kolonii na każdej płytce (log2). (B) Normalizacja względem mediany każdego obrazu koryguje błędy związane z efektami między płytkami. (C) Mapa ciepła przedstawiająca współczynnik korelacji Spearmana pomiędzy płytkami, potwierdzająca powtarzalność procedury. (D) Rozkład wyników dla testowanych PPI oraz kontroli L-DHFR F[3]. Sztywny próg można wyznaczyć na poziomie 95tego percentyla rozkładu L-DHFR F[3] w celu identyfikacji PPI o wysokim stopniu pewności (przedstawiony jako przerywana linia pionowa). (E) Rozkład rang średniego wyniku dla każdego białka prey. Wcześniej zgłoszeni fizyczni partnerzy interakcji Nup82p w bazie BioGRID35 są oznaczeni kółkami, a partnerzy zgłoszeni w niniejszym badaniu czerwonymi kropkami. Próg zdefiniowany w (D) pokazano jako linię przerywaną. (F) Sieć przedstawiająca zidentyfikowane w niniejszym badaniu PPI o wysokim stopniu pewności. Niebieskie krawędzie wskazują wcześniej zgłoszone fizyczne interaktory (BioGRID35), a żółte krawędzie wskazują wcześniej nieopisaną interakcję z Pex30. (G) Test kropelkowego rozcieńczenia (spot-dilution assay) diploidalnych szczepów PCA obejmujący pary Nup82-DHFR F[1,2] oraz prey-DHFR F[3] zidentyfikowane jako fizyczne interaktory Nup82p w niniejszym badaniu. Test wzrostu przeprowadzono w medium z DMSO (rozpuszczalnik MTX, panel lewy) oraz w medium z MTX (panel prawy). Uwzględniono kontrole negatywne składające się z Nup82-DHFR F[1,2] – Linker-DHFR F[3] oraz Linker-DHFR F[1,2] – Linker-DHFR F[3], a także kontrolę pozytywną składającą się z silnej interakcji pomiędzy dwiema domenami suwaka leucynowego (zipper-DHFR F[1,2] – zipper-DHFR F[3]). Wzrost komórek przekraczający wzrost kontroli negatywnych w medium z MTX należy interpretować jako oddziaływanie fizyczne. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

AminokwasIlość (g)
Siarczan adeniny0.2
L-tryptofan0.4
L-tyrozyna0.3
L-fenyloalanina0.5
Kwas L-glutaminowy (sól jednosodowa)1.0
L-asparagina1.0
L-walina1.5
L-treonina2.0
L-seryna3.75
Uracyl0.2
L-histydyna HCl0.2
L-arginina HCl0.2
L-metionina*0.2
L-lizyna*0.2
L-leucyna0.6
* Pomijane podczas przeprowadzania standardowej analizy PCA (zgodnie z niniejszym protokołem), lecz mogą zostać dodane w innych celach.

Tabela 1: Skład 10-krotnego podłoża niedoborowego -lys/met/ade w medium MTX. Ilości podano dla jednego litra 10-krotnego podłoża niedoborowego. Gwiazdkami oznaczono związki, które powinny zostać pominięte w standardowym medium MTX, ale mogą zostać dodane w innych celach.

Tabela uzupełniająca 1: Połączone dane z 12 płytek testowych. Tabela 1 zawiera zestawione dane z analizy w programie ImageJ, przeprowadzonej przy użyciu niestandardowego skryptu ImageJ, gdzie każdy wiersz odpowiada pojedynczej pozycji na każdym macierzu 1 536. Dodatkowo każdy wiersz został opatrzony informacjami o pliku obrazu, płytce kolekcyjnej DHFR, powtórzeniu, ORF oraz nazwie białka.

Tabela uzupełniająca 2: Średnio znormalizowany wzrost dla poszczególnych szczepów. Tabela 2 zawiera średnią znormalizowaną wartość Log2 wzrostu dla każdego szczepu z kolekcji wraz z odchyleniem standardowym. Przefiltrowane białka łup (preys), trafienia (hits) oraz znane interaktory fizyczne zostały zidentyfikowane w osobnych kolumnach.

Dyskusja

Opisujemy protokół oparty na teście DHFR-PCA, umożliwiający systematyczną identyfikację fizycznych interakcji dla dowolnego białka przynęty przy wysokiej przepustowości. Protokół ten można dostosować poprzez badanie przesiewowe pod kątem większej liczby przynęt, i to na dowolnym pożądanym poziomie replikacji. Wykazujemy wiarygodność tego protokołu poprzez identyfikację partnerów interakcji fizycznych dla białka przynęty zaangażowanego w kompleks porów jądrowych: Nup82. Nasza analiza pozwoliła na znalezienie pięciu wcześniej raportowanych interaktorów i jednego wcześniej nieraportowanego interaktora (ryc. 3F i 3G), podkreślając zdolność metody do badania interaktomii białek drożdży.

Opisany tutaj protokół zawiera kilka krytycznych kroków, na które eksperymentator powinien zwrócić uwagę. Zalecamy: 1) Upewnij się, że fuzja przynęty DHFR F[1,2] jest prawidłowa (Rysunek 1B); można to osiągnąć poprzez sekwencjonowanie budowy i pomiar prawidłowej ekspresji białka za pomocą przeciwciała anty-DHFR F[1,2] lub anty-DHFR F[3]; 2) Przed rozpoczęciem badania przesiewowego zaleca się sprawdzenie, czy jakakolwiek przynęta będąca przedmiotem zainteresowania wykazuje rozwiązłe interakcje w ekranach PCA. Można to zrobić, wykonując badania kontrolne z przynętami skrzyżowanymi z odpowiednim środkiem kontrolnym L-DHFR lub ręcznie łącząc przynętę z odpowiednią kontrolą L-DHFR i przeprowadzając test wzrostu na pożywce MTX. 3) Płyty należy wylać dzień przed ich użyciem, aby wilgotność była optymalna dla przylegania komórek do powierzchni agaru podczas procesu drukowania; 4) Płytki źródłowe nie powinny być używane więcej niż cztery razy, aby przenieść wystarczającą liczbę komórek na płytce docelowej. Zwiększanie liczby egzemplarzy tabliczki docelowej może odbywać się poprzez kolejne kroki rozbudowy (np. 4 egzemplarze -> 16 egzemplarzy -> 64 egzemplarze). Alternatywnie, komórki można wybierać w różnych miejscach na trawnikach lub w kolonii między różnymi rundami replikacji; 5) Jeżeli po selekcji diploidalnej brakuje kilku pozycji, należy upewnić się, że płytki źródłowe nie zostały użyte zbyt wiele razy na etapie łączenia (kroki od 4.5 do 4.7); 6) Upewnij się, że podłoże MTX zawiera wszystkie niezbędne składniki w odpowiednich stężeniach. Rzeczywiście, jeśli nie obserwuje się żadnego wzrostu na pożywce MTX, może to być spowodowane albo tym, że PCA nie wykrywa żadnej interakcji dla białek będących przedmiotem zainteresowania, albo dlatego, że pożywka MTX nie została odpowiednio przygotowana. Aby zapewnić, że pożywka umożliwia wzrost szczepów wykazujących komplementację fragmentów DHFR, można dodać konstytutywną interakcję w pustych miejscach kolekcji i użyć jako kontroli pozytywnej, takiej jak fragmenty DHFR połączone z leucynowymi ugrupowaniami zamka błyskawicznego33 (Figura 1C). Równoległe testy z wykorzystaniem fragmentów łącznika-DHFR lub fragmentów zipper-linker-DHFR pozwolą na rozróżnienie między warunkami, które umożliwiają wzrost wszystkich komórek (niskie stężenie MTX lub białko przynęty, które ma tendencję do tworzenia fałszywie dodatnich interakcji, jak opisano poniżej) a warunkami, które uniemożliwiają wzrost wszystkich szczepów (zbyt wysokie stężenie MTX lub brak niezbędnego składnika w pożywce); 7) Biorąc pod uwagę, że PCA jest wykonywany poprzez kolejne rundy replikacji z jednej pożywki do drugiej, zanieczyszczenie krzyżowe między szczepami między różnymi płytkami może wystąpić, jeśli na przykład narzędzie do szpilek nie jest prawidłowo sterylizowane między rundami replikacji i/lub ostatnia kąpiel wodna (tj. stacja mokra) w procedurze sterylizacji jest zanieczyszczona koloniami z poprzednich rund replikacji. Kilka pozycji na matrycach jest pustych i dlatego mogą być wykorzystywane jako pozycje kontrolne, w których nie należy obserwować wzrostu w celu wykrycia zanieczyszczeń krzyżowych.

Analiza obrazu może być wykonywana przy użyciu kilku opublikowanych programów (patrz sekcja 5 protokołu) lub dowolnego niestandardowego skryptu. W tym badaniu skrypt niestandardowy wykonuje następujące kroki: 1) Skrypt odejmuje wartości pikseli pustej płyty do wartości pikseli każdej płyty w celu skorygowania odchyleń oświetlenia. 2) Skrypt konwertuje każdy obraz z korekcją tła na binarny przy użyciu progu wartości piksela 10. 3) Dla każdych 1,536 pozycji każdej płytki, określonych przez nałożenie prostokąta na kolonie krawędzi, skrypt uruchamia ImageJ "Analizuj cząstki ... " w zaznaczeniu okrężnym. Zaznaczenie kołowe jest ustawiane z promieniem równym interwałowi między dwiema pozycjami pomniejszonymi o 10 pikseli. 4) Skrypt wybiera najbliższą cząstkę ze środka zaznaczenia i potwierdza ją jako kolonię, jeśli jej położenie nie przekracza połowy odstępu między dwiema koloniami od środka zaznaczenia. 5) Skrypt mierzy wartości pikseli wybranej cząstki na obrazie skorygowanym tłem. 6) Aby jeszcze bardziej skorygować wszelkie pozostałe odchylenia oświetlenia tła, skrypt odejmuje średnią wartość wszystkich pikseli z okrągłego zaznaczenia, które nie były częścią cząstki, do wartości pikseli kolonii. Suma tych skorygowanych wartości pikseli, przechowywana w kolumnie "IntDenBackSub" w tabeli uzupełniającej 1, jest używana jako miara wielkości kolonii.

Krytycznym krokiem w ramach części analitycznej jest wybór progu istotności. W tym przypadku wybraliśmy próg oparty na rozkładzie ujemnych kontrolek L-DHFR F[3], ale w zależności od celu ekranu taki próg może być zbyt rygorystyczny. Rzeczywiście, kontrole L-DHFR F[3] są nadmiernie eksprymowane (silny promotor TEF), tak że komplementarne fragmenty mogą spontanicznie się uzupełniać, a zatem nie są reprezentatywne dla ekspresji większości białek. Podkreśla to fakt, że rozkład kontroli L-DHFR F[3] jest wyższy niż średnia wzrostu tła (rysunek 3D). W związku z tym niektóre interakcje, których wyniki są poniżej tego rygorystycznego progu, ale które wyraźnie znajdują się poza rozkładem wzrostu tła, można uznać za domniemane trafienia, które mogą reprezentować, na przykład, przejściowe lub słabe interakcje. Można je dalej badać i walidować krzyżowo, jeśli na przykład te dwa białka nie ulegają ekspresji na poziomach, które mogą umożliwić spontaniczną komplementację fragmentów DHFR, tak jak w przypadku kontroli L-DHFR. Alternatywnie można ustawić próg istotności w oparciu o proporcję pokrywania się ze zgłoszonymi interakcjami fizycznymi w bazach danych, takich jak BioGRID35 , aby zmaksymalizować proporcję wyników prawdziwie dodatnich w stosunku do wyników fałszywie dodatnich. Jednak w przeciwieństwie do zastosowania rozkładu L-DHFR, ta alternatywa może nie zawsze być wykonalna, jeśli na przykład liczba znanych interakcji fizycznych nie jest wystarczająco wysoka. Ponadto wybór progu istotności ma wpływ na odsetek wyników fałszywie dodatnich i fałszywie ujemnych w końcowym zbiorze danych. Rzeczywiście, podobnie jak w przypadku każdego innego testu wykrywania IPP, wyniki fałszywie dodatnie mogą wynikać z niespecyficznej interakcji białka z białkiem fuzyjnym DHFR, jeśli na przykład białko występuje w dużych ilościach, jak wspomniano wcześniej. Świadczy o tym fakt, że niektóre ofiary systematycznie wchodzą w interakcje ze wszystkimi białkami przynęty w badaniach przesiewowych PCA, a zatem muszą zostać usunięte z analizy11 (np. Tef2 i Ade17 oraz tabela uzupełniająca 2). Aby obejść ten problem, w specyficznych warunkach każdej siatki można przeprowadzić kontrolne badanie PCA dwóch kolekcji w stosunku do odpowiedniej kontroli L-DHFR (F[1,2] lub F[3]) w celu identyfikacji przynęt i ofiar wykazujących spontaniczną komplementację fragmentów DHFR. Co więcej, przeprowadzenie analizy wzbogacenia ontologii genów może zwiększyć zaufanie do danych, jeśli funkcja danej przynęty jest znana. Z drugiej strony, DHFR-PCA może powodować wyniki fałszywie ujemne z kilku powodów: 1) nie wszystkie białka mogą być połączone z fragmentami DHFR, ponieważ mogą one destabilizować białka lub modyfikować ich lokalizację, jeśli na przykład fuzja DHFR z C-końcem zakłóca sygnał lokalizacji; 2) Rekonstytucja DHFR w niektórych przedziałach komórkowych może nie wytwarzać kwasu foliowego, jeśli na przykład niezbędny prekursor do syntezy kwasu foliowego nie jest dostępny; 3) C-końce muszą znajdować się w odległości 8 nm, aby nastąpiła komplementacja DHFR11. W związku z tym dobrze znana interakcja może nie zostać wykryta, jeśli ich C-końce nie znajdują się wystarczająco blisko w przestrzeni. Ilustruje to tutaj fakt, że duża część oddziaływań fizycznych Nup82 zgłaszanych w bazach danych, z których większość jest pośrednia, nie została wykryta w naszym teście. Podobnie, interakcje między białkami błonowymi, dla których C-końce znajdują się w trans względem błony, nie doprowadzą do komplementacji fragmentów DHFR i nie zostaną wykryte11. Ograniczenia 1) i 3) można obejść stosunkowo prosto poprzez fuzję fragmentu DHFR z N-końcami białka. Może to zapobiec zakłóceniom sygnału lokalizacyjnego w pobliżu C-końców i może pozwolić na wykrycie interakcji między białkami błonowymi, których N i C-koniec znajdują się w cis względem błony.

W badaniu PIN pozostaje kilka wyzwań (omówionych w2,3). Opracowane do tej pory mapy PIN zostały w dużej mierze opisane w jednym warunku eksperymentalnym dla każdego gatunku, a tym samym oferują pojedynczy obraz tego, jak mogą być zorganizowane sieci białkowe. W związku z tym istnieje potrzeba zbadania innych warunków eksperymentalnych, aby zobaczyć, w jaki sposób PIN mogą być reorganizowane w odpowiedzi na zmiany środowiskowe, określone bodźce, w trakcie rozwoju lub po mutacjach. Wyzwania te zostaną przezwyciężone dzięki opracowaniu nowych technologii badania IPP w czasie rzeczywistym, w żywych komórkach oraz dzięki dostosowaniu obecnych technik tak, aby mogły być wykorzystywane przez większą społeczność laboratoriów. Jako technika ilościowa, która może wykrywać zmiany w ilości kompleksów komplementacji DHFR27, DHFR-PCA może być dostosowana do przezwyciężenia tych wyzwań i została wykorzystana do zbadania, w jaki sposób na IPP wpływa czynnik uszkadzający DNA22, czynniki chemiczne25, delecje genów23,26 lub w innych gatunkach drożdży i ich hybrydach33. Odkrywanie tych nowych wymiarów będzie stawało się coraz ważniejsze dla ujawnienia dynamiki PIN.

Oświadczenia

Część opłat za publikację tego artykułu w otwartym dostępie została pokryta przez S&P Robotics.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty Kanadyjskiego Instytutu Badań nad Zdrowiem (CIHR) 191597, 299432 i 324265, grant Discovery Kanadyjskiej Rady ds. Nauk Przyrodniczych i Inżynierii oraz grant Human Frontier Science Program dla CRL. CRL jest nowym badaczem CIHR. Guillaume Diss jest wspierany przez stypendium PROTEO. Samuel Rochette jest wspierany przez stypendia NSERC i FRQNT.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Robot BioMatrix, konfiguracja stacjonarnaS& P Robotics Inc.BM5-BC
Narzędzie pinowe w formacie 96S& P Robotics Inc.PH-96-10Standardowe narzędzie do kołków w formacie 96 z 96 precyzyjnymi pływającymi kołkami
Narzędzie do pinów w formacie 384S& P Robotics Inc.PH-384-10Standardowy pin-tool w formacie 384 z 384 precyzyjnymi pływającymi kołkami
Narzędzie do pinów w formacie 1536S& P Robotics Inc.PH-1536-05Niestandardowe narzędzie do szpilek w formacie 1536 z precyzyjnymi pływającymi kołkami 0,5 mm
Zautomatyzowany moduł obrazowania S& P Robotics Inc.IMG-02
Metotreksat Bioshop Kanada Inc.MTX440 UWAGA: związek toksyczny
Higromycyna B Bioshop Kanada Inc.HYG003
Diwodorosiarczan nourseotrycynyWerner BioAgents5010000
Kolekcja drożdży Interactome Thermo ScientificYSC5849
Omni Tray z pokrywką sterylną Przeciwciało
 Przeciwciało Sigma-AldrichD1067
anty-DHFR F[3]   Sigma-AldrichD0942
anty-DHFR F[1,2] Thermo Scientific 242811 powiedział:

Bibliografia

  1. Alberts, B. The cell as a collection of protein machines: preparing the next generation of molecular biologists. Cell. 92, 291-294 (1998).
  2. Diss, G., et al. Integrative avenues for exploring the dynamics and evolution of protein interaction networks. Curr Opin Biotechnol. 24, 775-783 (2013).
  3. Vidal, M., Cusick, M. E., Barabasi, A. L. Interactome networks and human disease. Cell. 144, 986-998 (2011).
  4. Hu, P., et al. Global functional atlas of Escherichia coli encompassing previously uncharacterized proteins. PLoS biology. 7, e96(2009).
  5. Arifuzzaman, M., et al. Large-scale identification of protein-protein interaction of Escherichia coli K-12. Genome Res. 16, 686-691 (2006).
  6. Rajagopala, S. V., et al. The binary protein-protein interaction landscape of Escherichia coli. Nature biotechnology. 32, 285-290 (2014).
  7. Arabidopsis-Interactome-Mapping-Consortium. Evidence for network evolution in an Arabidopsis interactome map. Science. 333, 601-607 (2011).
  8. Babu, M., et al. Interaction landscape of membrane-protein complexes in Saccharomyces cerevisiae. Nature. 489, 585-589 (2012).
  9. Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440, 637-643 (2006).
  10. Gavin, A. C., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415, 141-147 (2002).
  11. Tarassov, K., et al. An in vivo map of the yeast protein interactome. Science. 320, 1465-1470 (2008).
  12. Uetz, P., et al. A comprehensive analysis of protein-protein interactions in Saccharomyces cerevisiae. Nature. 403, 623-627 (2000).
  13. Guruharsha, K. G., et al. A protein complex network of Drosophila melanogaster. Cell. 147, 690-703 (2011).
  14. Li, S., et al. A map of the interactome network of the metazoan C. elegans. Science. 303, 540-543 (2004).
  15. Rual, J. F., et al. Towards a proteome-scale map of the human protein-protein interaction network. Nature. 437, 1173-1178 (2005).
  16. Landry, C. R., Levy, E. D., Abd Rabbo, D., Tarassov, K., Michnick, S. W. Extracting insight from noisy cellular networks. Cell. 155, 983-989 (2013).
  17. Berggard, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions. Proteomics. 7, 2833-2842 (2007).
  18. Wodak, S. J., Vlasblom, J., Turinsky, A. L., Pu, S. Protein-protein interaction networks: the puzzling riches. Current opinion in structural biology. 23, 941-953 (2013).
  19. Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340, 245-246 (1989).
  20. Dunham, W. H., Mullin, M., Gingras, A. C. Affinity-purification coupled to mass spectrometry: basic principles and strategies. Proteomics. 12, 1576-1590 (2012).
  21. Michnick, S. W., Ear, P. H., Landry, C., Malleshaiah, M. K., Messier, V. A toolkit of protein-fragment complementation assays for studying and dissecting large-scale and dynamic protein-protein interactions in living cells. Methods Enzymol. 470, 335-368 (2010).
  22. Rochette, S., Gagnon-Arsenault, I., Diss, G., Landry, C. R. Modulation of the yeast protein interactome in response to DNA damage. Journal of proteomics. 100, 25-36 (2014).
  23. Diss, G., Dube, A. K., Boutin, J., Gagnon-Arsenault, I., Landry, C. R. A systematic approach for the genetic dissection of protein complexes in living cells. Cell Rep. 3, 2155-2167 (2013).
  24. Gagnon-Arsenault, I., et al. Transcriptional divergence plays a role in the rewiring of protein interaction networks after gene duplication. Journal of proteomics. 81, 112-125 (2013).
  25. Schlecht, U., Miranda, M., Suresh, S., Davis, R. W., St Onge, R. P. Multiplex assay for condition-dependent changes in protein-protein interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 9213-9218 (2012).
  26. Lev, I., et al. Reverse PCA, a systematic approach for identifying genes important for the physical interaction between protein pairs. PLoS Genet. 9, e1003838(2013).
  27. Freschi, L., Torres-Quiroz, F., Dube, A. K., Landry, C. R. qPCA: a scalable assay to measure the perturbation of protein-protein interactions in living cells. Mol Biosyst. 9, 36-43 (2013).
  28. Pelletier, J. N., Campbell-Valois, F. X., Michnick, S. W. Oligomerization domain-directed reassembly of active dihydrofolate reductase from rationally designed fragments. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 12141-12146 (1998).
  29. Gietz, R. D., Woods, R. A. Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method. Methods Enzymol. 350, 87-96 (2002).
  30. Schuldiner, M., Collins, S. R., Weissman, J. S., Krogan, N. J. Quantitative genetic analysis in Saccharomyces cerevisiae using epistatic miniarray profiles (E-MAPs) and its application to chromatin functions. Methods. 40, 344-352 (2006).
  31. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature methods. 9, 671-675 (2012).
  32. Wagih, O., Parts, L. gitter: A Robust and Accurate Method for Quantification of Colony Sizes From Plate Images. G3 (Bethesda). 4 (3), 547-552 (2014).
  33. Leducq, J. B., et al. Evidence for the robustness of protein complexes to inter-species hybridization. PLoS Genet. 8, e1003161(2012).
  34. Development Core Team: A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. (2008).
  35. Stark, C., et al. BioGRID: a general repository for interaction datasets. Nucleic Acids Res. 34, D535-D539 (2006).
  36. Vinayagam, A., et al. Protein complex-based analysis framework for high-throughput data sets. Science signaling. 6, rs5(2013).
  37. Jansen, R., Gerstein, M. Analyzing protein function on a genomic scale: the importance of gold-standard positives and negatives for network prediction. Current opinion in microbiology. 7, 535-545 (2004).
  38. Ito, T., et al. A comprehensive two-hybrid analysis to explore the yeast protein interactome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 4569-4574 (2001).
  39. Costanzo, M., et al. The genetic landscape of a cell. Science. 327, 425-431 (2010).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Metoda PCA z u yciem dro d yfuzja fragmentu DHFRselekcja metotreksatemwysokog sto ciowe macierze koloniikojenie na platformie robotycznejilo ciowe oznaczanie rekonstytucji DHFRanaliza wielko ci koloniiekspresja promotora endogennego
Badania przesiewowe interakcji białko-białko w całym genomie za pomocą testu komplementacji fragmentów białka (PCA) w żywych komórkach
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.