Wytwarzanie ludzkich limfocytów T specyficznych dla alloantygenu z krwi obwodowej

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje metodę generowania i rozmnażania klonów ludzkich limfocytów T, które specyficznie reagują na zdefiniowany alloantygen. Protokół ten można dostosować do klonowania ludzkich limfocytów T specyficznych dla różnych ligandów peptyd-MHC.

Streszczenie

Badanie biologii ludzkich limfocytów T często obejmuje badanie reakcji na aktywację ligandów. Limfocyty T rozpoznają i reagują na przetworzone antygeny peptydowe prezentowane przez cząsteczki MHC (human ortholog HLA) przez receptor limfocytów T (TCR) w bardzo czuły i specyficzny sposób. Podczas gdy podstawową funkcją limfocytów T jest pośredniczenie w ochronnych odpowiedziach immunologicznych na obce antygeny prezentowane przez samo-MHC, limfocyty T silnie reagują na różnice antygenowe w tkankach allogenicznych. Odpowiedzi limfocytów T na alloantygeny można opisać jako alloreaktywność bezpośrednią lub pośrednią. W alloreaktywności limfocyt T reaguje poprzez wysoce specyficzne rozpoznawanie zarówno prezentowanego peptydu, jak i cząsteczki MHC. Silna odpowiedź oligoklonalna limfocytów T na stymulację allogeniczną odzwierciedla dużą liczbę potencjalnie stymulujących alloantygenów obecnych w tkankach allogenicznych. Chociaż zakres alloreaktywnych odpowiedzi limfocytów T jest ważnym czynnikiem inicjującym i pośredniczącym w patologii związanej z biologicznie istotnymi odpowiedziami alloreaktywnymi, takimi jak choroba przeszczep przeciwko gospodarzowi i odrzucenie przeszczepu allogenicznego, może to wykluczać analizę odpowiedzi limfocytów T na ligandy allogeniczne. W tym celu protokół ten opisuje metodę generowania alloreaktywnych limfocytów T z naiwnych ludzkich leukocytów krwi obwodowej (PBL), które reagują na znane alloantygeny peptydowo-MHC (pMHC). W protokole stosuje się znakowanie multimerem pMHC, wzbogacanie kulkami magnetycznymi i cytometrię przepływową do metod hodowli in vitro pojedynczych komórek w celu wytworzenia klonów limfocytów T specyficznych dla alloantygenu. Umożliwia to badania biochemii i funkcji limfocytów T reagujących na stymulację allogeniczną.

Wprowadzenie

T limfocyty są kluczowymi składnikami adaptacyjnego układu odpornościowego. Limfocyty T są odpowiedzialne nie tylko za bezpośrednie pośredniczenie w ochronnych odpowiedziach immunologicznych na patogeny poprzez różne mechanizmy efektorowe, ale także za aktywne utrzymywanie samotolerancji immunologicznej i kierowanie odpowiedziami innych komórek w układzie odpornościowym. Funkcje te są kierowane przez szereg zintegrowanych sygnałów, w tym ligację receptora limfocytów T (TCR), cytokiny i chemokiny oraz metabolity¹. Spośród tych sygnałów TCR ma szczególne znaczenie, ponieważ zapewnia charakterystyczną specyficzność, która określa rolę limfocytów T w odporności adaptacyjnej. TCR oddziałuje z liniowymi antygenami peptydowymi prezentowanymi przez cząsteczki MHC (ludzki ortolog HLA) (kompleksy pMHC) w wysoce specyficzny i czuły sposób, aby dostarczyć sygnały, które inicjują funkcję efektora limfocytów T. Parametry biochemiczne oddziaływań TCR z ligandami pMHC zapewniają nie tylko swoistość dla aktywacji limfocytów T, ale mają również jakościowy wpływ na późniejszą funkcję limfocytów T². W związku z tym badanie funkcji limfocytów T często wymaga zbadania odpowiedzi klonalnych limfocytów T o określonej swoistości antygenowej.

Przedział ludzkich limfocytów T, zawierający około 10¹²limfocytów T αβ, zawiera około 10^{7-10 8} różnych αβTCR^3-4. Ten różnorodny repertuar daje możliwość rozpoznania szerokiej gamy peptydów potencjalnych patogenów, które wymagałyby odpowiedzi limfocytów T w celu uzyskania odporności ochronnej. Szacuje się, że częstość odpowiedzi limfocytów T na dany obcy antygen prezentowany przez samo-MHC jest rzędu 10-4-10-7 przy braku wcześniejszej odpowiedzi immunologicznej na ten antygen⁵. Repertuar naiwnych limfocytów T jest kształtowany przez selekcję grasicy, aby zapewnić zdolność do rozpoznawania antygenów peptydowych prezentujących własne MHC i ograniczać reaktywność przeciwko antygenom samopeptydowym, maksymalizując potencjalną użyteczność pośredniczenia w odporności ochronnej². Jednakże, z naruszeniem tej zaprojektowanej reaktywności, stosunkowo duża częstotliwość, 10-3-10-4, limfocytów T od osób nieleczonych immunologicznie reaguje na stymulację komórkami allogenicznymi, rozpoznając zarówno obce cząsteczki MHC, jak i endogenne peptydy, które prezentują⁶. Rozpoznawanie allogenicznych ligandów pMHC jest strukturalnie podobne do rozpoznawania obcych antygenów prezentowanych przez samo-MHC; TCR zachodzi w krytycznych oddziaływaniach biochemicznych zarówno z allogeniczną cząsteczką MHC, jak i z prezentowanym peptydem⁷. Silny charakter odpowiedzi limfocytów T na stymulację allogeniczną wynika z różnorodności kompleksów pMHC obecnych na powierzchni komórek allogenicznych⁸. Szacuje się, że każdy MHC przedstawia około 2 x 10⁴ różnych endogennych antygenów peptydowych⁹. Ten zakres odpowiedzi na stymulację allogeniczną jest istotnym aspektem klinicznie istotnej patologii, takiej jak odrzucenie przeszczepu allogenicznego lub choroba przeszczep przeciwko gospodarzowi (GVHD), wynikająca z alloreaktywności limfocytów T.

Badanie alloreaktywnych odpowiedzi ludzkich limfocytów T tradycyjnie polegało na badaniu odpowiedzi poliklonalnych naiwnych limfocytów T po stymulacji komórkami allogenicznymi. Wielokrotna stymulacja tą samą allogeniczną linią komórkową w połączeniu z analizami rozcieńczeń ograniczających jest w stanie wygenerować klonalne limfocyty T ze zdefiniowanym rozpoznaniem allogenicznego HLA¹⁰. Podejście to jest jednak problematyczne w przypadku badania odpowiedzi na poszczególne allogeniczne ligandy pMHC, ponieważ duży i zróżnicowany repertuar endogennych kompleksów pMHC obecnych dla danego allogenicznego HLA stymuluje szeroki repertuar limfocytów T. To podejście polegające na masowej stymulacji populacji i ograniczaniu rozcieńczania wymagałoby badań przesiewowych dużej liczby klonów w celu wyizolowania limfocytów T o pożądanej reaktywności przeciwko pojedynczemu ligandowi pMHC. Ponadto częstość reakcji limfocytów T na pojedynczy allogeniczny ligand pMHC jest stosunkowo niska wśród naiwnych populacji komórek T, co stanowi barierę dla wydajnego generowania klonów ludzkich limfocytów T reagujących na dany antygen.

Identyfikacja i izolacja specyficznych dla antygenu limfocytów T z populacji poliklonalnych została umożliwiona dzięki rozwojowi znakowanych fluoroforem multimerów pMHC¹¹. Podejście to wykorzystuje specyficzne antygeny peptydowe załadowane do rekombinowanych, rozpuszczalnych, biotynylowanych cząsteczek MHC, które są znakowane przez wiązanie się z fluoroforem znakowanym streptawidyną. Multimeryzacja pMHC zwiększa awidność, kompensując wewnętrznie niskie (μM) powinowactwo TCR do rozpuszczalnych ligandów pMHC. Znakowane komórki można zidentyfikować i wyizolować za pomocą cytometrii przepływowej. Jednak podejście to jest nadal ograniczone przez niską częstość limfocytów T specyficznych dla antygenu wśród naiwnych populacji limfocytów T, które są zwykle o rzędy wielkości mniejsze niż granica dokładnej identyfikacji i kwantyfikacji na większości cytometrów przepływowych. Aby rozwiązać ten problem, opracowano metodę znakowania tetramerów pMHC, a następnie wzbogacania kulek magnetycznych dla komórek znakowanych tetramerem¹². Metoda ta wykazała wiarygodne wykrywanie, wyliczanie i izolację limfocytów T specyficznych dla antygenu o niskiej częstotliwości.

Ten protokół opisuje skuteczny protokół generowania klonów ludzkich limfocytów T, które specyficznie reagują na indywidualne allogeniczne ligandy pMHC. W protokole zastosowano znakowanie i wzbogacanie multimerów pMHC (HLA) w celu izolacji ludzkich limfocytów T specyficznych dla alloantygenu z sortowaniem komórek metodą cytometrii przepływowej oraz solidną metodą hodowli in vitro ludzkich komórek T w celu umożliwienia produkcji klonów komórek T z pojedynczych posortowanych komórek (przegląd na rysunku 1).

Protokół

UWAGA: Ten protokół wymaga użycia próbek krwi obwodowej od ochotników. Wszystkie badania z udziałem ludzi powinny zostać zweryfikowane i zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną ds. Badań nad Ludźmi w celu zapewnienia zgodności z Deklaracją Helsińską (2013) oraz Ustawą o przenośności i odpowiedzialności w ubezpieczeniach zdrowotnych z 1996 r.

1. Izolacja limfocytów T z krwi pełnej

1. Przed rozpoczęciem podgrzej podłoże o gradiencie gęstości do temperatury pokojowej. Podaniec 4 ml pożywki o gradiencie gęstości do 2-4 sterylnych stożkowych probówek wirówkowych o pojemności 15 ml (1 probówka zostanie użyta na każde 10 ml całkowitej objętości rozcieńczonej krwi).
2. Pobrać 10-20 ml krwi w 1-2 probówkach do pobierania krwi żylnej pokrytych heparyną sodową w sprayu (z zieloną górą). Zbieraj próbki ludzkie pod nadzorem przeszkolonych osób i zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną.
3. Przetrzyj zewnętrzną część tub 70% etanolem. Ostrożnie zdjąć górną część napełnionych probówek zbiorczych i zdekantować krew do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.
4. Dodać 10 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do każdej probówki do pobierania krwi. Zebrać PBS, dodać do zdekantowanej krwi pełnej i delikatnie wymieszać.
5. Dodać 25 μl koktajlu wzbogacającego ludzkie limfocyty T / 2 ml całkowitej objętości. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
6. Za pomocą pipety o pojemności 10 ml delikatnie nałożyć do 10 ml krwi rozcieńczonej w stosunku 1:1 na podłoże o gradiencie gęstości. Uważaj, aby nie naruszyć powierzchni ośrodka o gradiencie gęstości.
7. Odwirować warstwową krew i pożywkę o gradiencie gęstości o sile 1 200 x g przez 20 minut w temperaturze 20 ^oC.
8. Wyjąć probówki z wirówki, uważając, aby nie zakłócić granicy faz między pożywką o gradinie gęstości a warstwą leukocytów na granicy faz między pożywką o gradiencie gęstości a rozcieńczonym osoczem. Za pomocą pipety o pojemności 5 ml ostrożnie zebrać warstwę leukocytów i przenieść do nowej sterylnej probówki stożkowej o pojemności 50 ml.
9. Dodać PBS, aby doprowadzić objętość zebranego PBL do 50 ml i delikatnie wymieszać.
10. Wirować przy 600 x g przez 5 minut w temperaturze 20 ^oC. Zdekantować.
11. Zawiesić granulowane komórki w 10 ml sterylnego buforu sortującego do cytometrii przepływowej (sterylnie przefiltrowany PBS zawierający 1% BSA). Pobrać próbkę 10 μl zawiesiny komórkowej, rozcieńczyć w stosunku 1:10 (dodać do 90 μl) błękitu trypanowego, aby policzyć komórki za pomocą hemocytometru (oczekiwana wydajność 1 – 4 x 10⁶ komórek / probówka krwi pełnej).
    1. Usunąć 1 ml podwielokrotności, przenieść do probówki o pojemności 5 ml i przechowywać na lodzie do analizy limfocytów T nieznakowanych tetramerem. Utrzymuj zawiesinę komórkową na lodzie.

2. Magnetyczne wzbogacanie limfocytów T specyficznych dla alloantygenu

1. Rozcieńczyć tetramer alloantygenu pMHC w stosunku 1:100 w sterylnym buforze sortującym.
2. Zawiesinę komórek wirówki (9 ml od kroku 1.11) w dawce 600 x g przez 5 minut w temperaturze 20 ^oC. Zdekantować.
3. Dodać 50 μl rozcieńczonego tetrameru alloantygenu pMHC do komórek granulowanych (do 10,⁷ komórek). Wymieszać delikatnie pipetując. Przenieść do sterylnej probówki o pojemności 5 ml. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
4. Dodać 2 ml buforu sortującego. Wirować przy 600 x g przez 5 minut w temperaturze 20 ^oC. Zdekantować.
5. Zawieś komórki w buforze sortującym o pojemności 100 μl. Dodaj 10 μl koktajlu Biotin Selection i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
6. Dodać 5 μl nanocząstek magnetycznych i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
7. Dodać 2,5 ml buforu do sortowania i delikatnie wymieszać, pipetując. Usunąć 100 μl podwielokrotności, przenieść do probówki o pojemności 5 ml i przechowywać na lodzie do analizy komórek wstępnie wzbogacających.
8. Umieścić probówkę o pojemności 5 ml zawierającą zawiesinę komórek w magnesie do separacji komórek. Nasadka powinna być luźno na górze rurki. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
9. Delikatnie zdejmij nakrętkę z tubki. Trzymając probówkę i magnes razem, przelej zawartość probówki do świeżej probówki o pojemności 5 ml. Nie stukaj ani nie potrząsaj zawartością tubki, aby usunąć ostatnie krople płynu.
10. Wyjmij rurkę z magnesu. Dodać 2 ml buforu do sortowania na zimno i delikatnie wymieszać pipetując. Pobrać próbkę 10 μl zawiesiny komórek, rozcieńczyć w stosunku 1:2 (dodać do 10 μl) błękitu trypanowego, aby zliczyć komórki za pomocą hemocytometru.

3. Przygotowanie limfocytów T do sortowania komórek metodą cytometrii przepływowej jednokomórkowej

1. Dodać bufor do sortowania na zimno do wszystkich probówek komórek (tetramer nieznakowany, znakowany tetramerem niewzbogacony i wzbogacony znakowany tetramerem), aby zwiększyć objętość do 3 ml.
2. Wirować przy 600 x g przez 5 minut w temperaturze 4 ^oC i zdekantować bufor w celu odzyskania komórek.
3. Zawiesić granulowane komórki w 25 μl bufora do sortowania na zimno. Dodaj 5 μl ludzkiego bloku Fc. Inkubować na lodzie przez 20 minut.
4. Przygotuj przeciwciała do sortowania metodą cytometrii przepływowej. Wymieszaj 15 μl buforu sortującego, 15 μl anty-CD5, 15 μl anty-CD14 i 15 μl anty-CD19.
5. Dodać 20 μl mieszaniny przeciwciał do każdej probówki z komórkami. Inkubować na lodzie przez 20 minut.
6. Dodać 2 ml buforu do sortowania na zimno do każdej probówki.
7. Wirować przy 600 x g przez 5 minut w temperaturze 4 ^oC i zdekantować bufor w celu odzyskania komórek.
8. Zawiesić komórki w stężeniu 1 -2 x 10⁶ komórek/ml w buforze sortującym.
9. Podać 100 μl pożywki do hodowli ludzkich komórek T (DMEM Iscove'a uzupełniony 2 mM Glutamax, 10 mM HEPES, 50 μg/ml gentamycyny, 50 μM 2-merkaptoetanolu, 10% inaktywowanej termicznie ludzkiej surowicy AB i 2,5 ng/ml rekombinowanej ludzkiej IL-2) do każdego dołka 96-dołkowej płytki do hodowli komórek z okrągłym dnem. Trzymaj na lodzie.

4. Izolacja limfocytów T znakowanych tetramerem za pomocą sortowania metodą cytometrii przepływowej pojedynczej komórki

1. Ustal parametry bramkowania cytometrii przepływowej w celu identyfikacji limfocytów T znakowanych tetramerem alloantygenu-pMHC (ryc. 2.A). Użyj frakcji znakowanej tetramerem przed wzbogaceniem, aby ustalić strategie bramkowania w celu wyeliminowania dubletów, bramki na limfocytach, wykluczenia limfocytów z ekspresją CD19 i monocytów z ekspresją CD14 oraz identyfikacji limfocytów T na podstawie ekspresji CD5. Użyj próbki, która nie jest znakowana tetramerem, jako fluorescencji minus jedna kontrola, aby ustalić bramkowanie w celu identyfikacji limfocytów T wiążących tetramery (przy czym 0^{% komórek} CD5 ⁺ CD14-CD19 z próbki nieznakowanej tetramerem powinno mieścić się w tej bramce).
   UWAGA: Strategie bramkowania, które nie są odpowiednio rygorystyczne, spowodują izolację limfocytów innych niż T lub limfocytów T, które nie są specyficzne dla antygenu, podczas gdy zbyt restrykcyjne strategie bramkowania zmniejszą liczbę izolowanych limfocytów T.
2. Zaprogramuj parametry płytki dla sortowania pojedynczych komórek. Skieruj sorter tak, aby umieścił 1 komórkę CD5 ⁺ CD14-CD19-tetramer ⁺ w każdym dołku. Skierować zestaw płytek tak, aby zawierały 1 studzienkę kontroli ujemnej (żadne komórki nie zostały posortowane w studzince) i 1 studzienkę kontroli dodatniej (100 komórek tetramerowych CD5 ⁺ CD14-CD19⁾ w każdym rzędzie (rysunek 2.B).
3. Korzystając z ustalonej strategii bramkowania cytometrii przepływowej i konfiguracji płytki, wyizoluj poszczególne limfocyty T wiążące tetramery bezpośrednio na 96-dołkowej płytce za pomocą sortera komórek cytometrii przepływowej.

5. Hodowla i ekspansja klonów limfocytów T specyficznych dla alloantygenu

1. Po zakończeniu sortowania komórek, odwirować płytkę o masie 600 x g przez 5 minut w temperaturze 20 ^oC. Umieścić płytkę hodowlaną w temperaturze 37 ^oC w inkubatorze o stężeniu 6% CO_{2 .}
2. Mikrogranulki anty-CD3/anty-CD28 stymulujące wirowo przez 30 sekund w celu ponownego zawieszenia kulek.
3. Obliczyć objętość kulek aktywatora potrzebną do stymulacji pobranych limfocytów T (0,5 μl mikrokulek aktywatora / studzienkę). Przenieś obliczoną objętość kulek stymulatora do sterylnej probówki o pojemności 5 ml. Dodać 1 ml pożywki do hodowli ludzkich limfocytów T i odwirować.
4. Umieść rurkę z zawieszeniem mikrokulek w magnesie. Nasadka powinna być luźno na górze rurki. Inkubować przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
5. Delikatnie zdejmij nakrętkę z tubki. Trzymając probówkę i magnes razem, przelej zawartość probówki do świeżej probówki o pojemności 5 ml. Nie stukaj ani nie potrząsaj zawartością tubki.
6. Wyjmij rurkę z magnesu. Dodać pożywkę do hodowli ludzkich limfocytów T (początkowo dodano 100 μl pożywki / 0,5 μl mikrogranulek).
7. Podwielokrotność 100 μl zawiesiny kulki aktywatora do każdego dołka płytki 96-dołkowej. Inkubować płytkę hodowlaną w temperaturze 37 ^oC w inkubatorze o stężeniu 6% CO_{2 .}
8. Codziennie monitoruj wzrost komórek za pomocą badania mikroskopowego. Małe skupiska proliferujących komórek można obserwować pod mikroskopem po 5 – 7 dniach hodowli (ryc. 3.A).
   UWAGA: Wizualizacja kultur komórek T w tym momencie może być trudna, a brak obserwowalnych klastrów komórkowych na tym etapie może nie wskazywać na brak rosnących limfocytów T.
9. Po 14 dniach od izolacji komórek należy karmić hodowle, ostrożnie usuwając 100 μl pożywki z wierzchu hodowli i zastępując ją 100 μl świeżej pożywki do hodowli ludzkich komórek T. Kontynuować inkubację płytki hodowlanej w temperaturze 37 ^oC w inkubatorze z 6% CO_{2 .}
10. Codziennie monitoruj wzrost komórek za pomocą badania mikroskopowego i oceny koloru pożywki hodowlanej. Duże skupiska komórek powinny być widoczne pod mikroskopem 2 – 3 dni po zmianie podłoża. Makroskopowo osady komórkowe powinny stać się widoczne w ciągu 14 dni po zmianie pożywki.
11. Po 28 dniach od izolacji komórek zidentyfikuj rosnące klony za pomocą badania mikroskopowego. Przenieść objętość 200 μl 96-dołkowych kultur płytkowych z dodatnim wzrostem do indywidualnych dołków 48-dołkowej płytki do hodowli tkankowej zawierającej 200 μl pożywki do hodowli ludzkich limfocytów T.
12. Dodać 100 μl zawierających 12,5 μl stymulujących mikrogranulek anty-CD3/anty-CD28 (przygotowanych w sposób opisany w punktach 5.2 – 5.6). Inkubować płytkę hodowlaną w temperaturze 37 ^oC w inkubatorze o stężeniu 6% CO_{2 .}
13. Codziennie monitoruj wzrost kultury za pomocą badania mikroskopowego i oceny koloru pożywki hodowlanej. Gdy hodowla limfocytów T osiągnie >2x10⁶/ml (zwykle 3-5 dni po ponownej stymulacji, można oszacować na dzień, w którym pożywka zaczyna zmieniać kolor na słomkowożółty), przenieś hodowlę do dołka 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej i dodaj 500 μl pożywki z ludzkich komórek T.
14. Po 10-14 dniach od ponownej stymulacji należy pobrać 200 μl hodowli limfocytów T w celu oceny swoistości alloantygenu za pomocą analizy cytometrii przepływowej wiązania tetrameru pMHC (przy użyciu strategii znakowania i bramkowania opisanej w sekcjach 3 i 4.1).

6. Długotrwała restymulacja i hodowla klonów limfocytów T

1. Ciągłe ponowne stymulowanie i rozszerzanie klonalnych hodowli komórek T o pożądanej swoistości może odbywać się co 14 dni. Zebrać hodowle limfocytów T do sterylnej probówki o pojemności 5 ml w 14 dniu po ostatniej stymulacji mikrokulkami anty-CD3/CD28. Połącz wiele dołków tego samego klonu limfocytów T w jednej probówce, do objętości 2,5 ml.
2. Dodać pożywkę, aby doprowadzić końcową objętość do 2,5 ml i delikatnie wymieszać, pipetując.
3. Umieść probówkę o pojemności 5 ml zawierającą hodowlę limfocytów T w magnesie do separacji komórek, aby usunąć stare mikrogranulki z hodowli. Nasadka powinna być luźno na górze rurki. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
4. Delikatnie zdejmij nakrętkę z tubki. Trzymając probówkę i magnes razem, zdekantuj zawiesinę komórek do świeżej probówki o pojemności 5 ml. Nie stukaj ani nie potrząsaj zawartością tubki, aby usunąć ostatnie krople płynu.
5. Dodać pożywkę, aby doprowadzić końcową objętość do 4 ml. Pobrać próbkę 10 μl, aby policzyć komórki za pomocą hemocytometru.
6. Odzyskać limfocyty T przez odwirowanie przy 600 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
7. Dekantacja supernatantu. Zawiesić limfocyty T w 10⁶ komórkach / ml pożywki do hodowli ludzkich komórek T. Przenieść 1 ml podwielokrotności do każdego dołka z 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej.
8. Ponownie stymulować limfocyty T, dodając 100 μl pożywki zawierającej 12,5 μl stymulujących mikrogranulek anty-CD3/anty-CD28 (jak opisano w punktach 5.2 – 5.6). Inkubować w temperaturze 37 ^oC w inkubatorze o stężeniu 6% CO_{2 .}

Wyniki

Niniejszy protokół opisuje generowanie klonalnych kultur ludzkich limfocytów T o określonej swoistości wobec alloantygenów za pomocą strategii wzbogacania za pomocą kulek magnetycznych i sortowania przepływowego pojedynczych komórek. Rysunek 1 przedstawia schemat tego procesu.

Dyskusja

Alloreaktywność limfocytów T jest zjawiskiem od dawna badanym i istotnym klinicznie. Silna odpowiedź proliferacyjna i efektorowa limfocytów T na stymulację allogeniczną umożliwiła szeroko zakrojone analizy odpowiedzi ludzkich limfocytów T in vitro poprzez stosunkowo proste reakcje limfocytów mieszanych limfocytów krwi obwodowej przeciwko inaktywowanym komórkom allogenicznym. Jednak te pierwotne alloreaktywne odpowiedzi limfocytów T są oligoklonalne, składające się z dużej liczby pojedynczych limfocytów T reagują...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Probówka do pobierania krwi żylnej heparyny sodowej 16 x 100 mm	Becton, Dickenson and Company	366480
Lymphoprep	Stemcell Technologies	7801
Rozeta Sep Zestaw do wzbogacania ludzkich limfocytów T	Stemcell Technologies	15061
PBS firmy Dulbecco, 1x bez Ca lub Mg	Corning	21-031-CV
Albumina	surowicy bydlęcejSigma-Aldrich	A7906
EDTA	Sigma-Aldrich	E6635
Znakowany fluoroforem tetramer pMHC	NIH Tetramer Facility	NA
Zestaw do wyboru biotyny EasySep	Stemcell Technologies	18553
Magnes selekcyjny EasySep	Stemcell Technologies	18000
TruStain FcX Ludzkie rozwiązanie	blokujące FcBiolegend	422301
Anti-CD5 PE-Cy7 (klon UCHT2)	Biolegend	300621
Anti-CD14 FITC (klon HCD14)	Biolegend	325603
Iscove's DMEM, bez b-ME i L-glutaminy	Corning	15-016-CV
HEPES Corning		25-060-CI
b-merkaptoetanol	Life Technologies	21985-023
Glutamax	Life Technologies	35050061
Siarczan gentamycyny (50 mg/ml)	Omega Scientific	GT-50
Ludzka surowica AB, dawca męski	Omega Scientific	HS-30
Rekombinowany ludzki IL-2	Peprotech	AF 200-02
Dynabeads Ludzki T-Aktywator CD3/CD28	Life Technologie	11131D
Media
Bufor
PBS, pH 7,4	1 L
BSA	10 g
EDTA (0,5 M)	2 ml
			hodowli ludzkich limfocytów
T Iscove's DMEM	351,6 ml
Inaktywowana termicznie ludzka surowica AB	40 ml
HEPES (1 M)	4 ml
Glutamax (100x)	4 ml
Gentamycyna (50 mg/ml)	0,4 ml
b-merkaptoetanol (14,3 M)	1,4 ml
Rekombinowana ludzka IL-2 (1 mg/ml)	1 ml

Anti-CD19 FITC (klon HIB19)Biolegend 302205 do sortowania komórekPożywka do